Kolorymetria biochemia

5/11/2018 Kolorymetria biochemia - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/kolorymetria-biochemia 1/6

1

5. KOLORYMETRIA

1. Wyznaczanie widma absorpcyjnego

Zasada:

Absorpcjometria wykorzystuje zdolność substancji chemicznych pozostają cych

w roztworze do pochłaniania światła całą swą objętością . Zwykle róŜne sub-

stancje pochłaniają promieniowanie świetlne o odmiennej długości fali. Jeśli jednak pochłaniają fale tej samej długości, to z róŜną intensywnością . Absorp-

cję światła w zakresie widzialnym wykazują zwią zki nieorganiczne, przede

wszystkim jony mają ce niecałkowicie zapełniony orbital d osłonięty wyŜszymi

orbitalami zapełnionymi elektronami, zwią zki kompleksowe wszystkich pier-

wiastków przejściowych z niecałkowicie zapełnionym orbitalem d oraz barwne

zwią zki organiczne, np. wskaźniki pH stosowane w alkacymetrycznej analizie

miareczkowej. Absorpcję światła w zakresie ultrafioletu wykazują bezbarwne

zwią zki organiczne, zawierają ce np. wią zania podwójne. Wielkością pozwalają -cą ocenić spadek natęŜenia wią zki światła po przejściu przez warstwę roztworu

substancji pochłaniają cej światło jest absorbancja (A), zwana teŜ ekstynkcją lub gęstością optyczną . Jest ona równa logarytmowi stosunku natęŜenia pro-

mieniowania padają cego (Io) do natęŜenia promieniowania przepuszczonego (I).

Podstawowym prawem absorpcjometrii jest prawo Bouguera-Lamberta-

-Beera, zgodnie z którym absorbancja substancji pochłaniają cej światło jest

wprost proporcjonalna do stęŜenia i grubości warstwy roztworu.

A = εεεε⋅⋅⋅⋅c⋅⋅⋅⋅l

gdzie:ε – współczynnik absorpcji,

c – stęŜenie,

l – grubość warstwy roztworu.

Krzywa, określają ca zaleŜność absorpcji promieniowania od długości fali, sta-

nowi widmo absorpcyjne. Widmo absorpcyjne danej substancji pozwala okre-

ślić długości fal promieniowania, które są przez nią absorbowane, oraz długość



2

fali, przy której absorbancja ma największą wartość (Amax). Następnie przy tejdługości fali mierzy się zarówno absorbancję wzorcowych roztworów danej

substancji o znanych stęŜeniach (sporzą dzają c wykres kalibracyjny) – jak rów-

nieŜ absorbancję roztworu oznaczanego o nieznanym stęŜeniu.

Wykonanie:

• Wykonujemy widmo absorpcyjne fenoloftaleiny w środowisku zasadowym,

w zakresie długości fal 400–600 nm, mierzą c absorbancję co 10 nm.

Włą czyć spektrofotometr i nastawić pierwszą długość fali.

• Do jednej kuwety wprowadzić roztwór fenoloftaleiny, a do drugiej jej roz-

puszczalnik (etanol i 0,1 M NaOH w stosunku 1:40 – próba ślepa, czyli od-czynnikowa).

• Obie kuwety wstawić do spektrofotometru i aparat wykalibrować wobec pró-

by ślepej, ustawiają c najpierw na transmitancję, która powinna wynosić

100%, po czym przełą czyć na absorbancję, która powinna mieć wartość 0,00.

• Zmierzyć absorbancję roztworu fenoloftaleiny przy danej długości fali, zapi-

sać wynik, po czym nastawić długość fali większą o 10 nm. KaŜdorazowo po

zmianie długości fali nastawić zero absorbancji wobec próby ślepej. Mierzyć

absorbancję, jak opisano wcześniej, aŜ do długości fali 600 nm.

• Wykreślić na papierze milimetrowym widmo absorpcyjne roztworu

fenoloftaleiny i podać długość fali, której odpowiada maksimum absorpcji

światła.

2. Wyznaczanie wykresu kalibracyjnego i oznaczanie stęŜenia

zwią zku barwnego

Zasada:

Największą zaletą absorbancji jest jej wprost proporcjonalna zaleŜność od stę-

Ŝenia. Wykres zaleŜności absorbancji od stęŜenia w dostatecznie szerokim za-

kresie ma kształt krzywej logarytmicznej. Prawo Bouguera-Lamberta-Beera

stosuje się tylko do począ tkowego odcinka wykresu, który jest prostoliniowy

i nazywa się wykresem kalibracyjnym. MoŜna z niego odczytać szukane stę-

Ŝenie roztworu po zmierzeniu wartości jego absorbancji. W wykresie kalibra-cyjnym mogą zdarzać się ujemne lub dodatnie odchylenia od prostoliniowej za-

leŜności. Odchylenia od prawa Lamberta-Beera mogą być spowodowane zbyt

wysokim stęŜeniem substancji, które powoduje, Ŝe jedne czą steczki są „przesła-

niane” przez inne, co daje efekt zmniejszonego pochłaniania światła. Innymi

przyczynami odchyleń od tego prawa mogą być takie zjawiska, jak: dimeryza-

cja, dysocjacja lub asocjacja zwią zków chemicznych, które wpływają na ich

własności optyczne.



3

Metodą kolorymetryczną moŜna oznaczać ilościowo substancje barwne, któ-rych stęŜenie w 1 ml roztworu jest rzędu kilkunastu nanomoli. Czułość metody

pozwala określić najniŜsze stęŜenie roztworu wzorcowego, które naleŜy przygo-

tować do sporzą dzenia wykresu kalibracyjnego. Natomiast ustalenie zakresu

stęŜeń (od najniŜszego do najwyŜszego) naleŜy rozpocząć od określenia stęŜe-

nia maksymalnego, tzn. najmniejszego stęŜenia, które przy pomiarze absorban-

cji powoduje maksymalne wychylenie wskazówki galwanometru lub wyświe-

tlenie wartości maksymalnej na wskaźniku cyfrowym. W przypadku roztworu

KMnO4, stęŜeniem, przyjmowanym jako maksymalne, jest 0,4 µmol/ml lub

nieznacznie wyŜsze, ostateczna wartość zaleŜy od jakości spektrofotometru

i rodzaju substancji barwnej.

Wykonanie:

• Przygotować 11 ponumerowanych probówek (ostatnią opisać jako próbę ślepą ).• Z wodnego roztworu roboczego KMnO4 o stęŜeniu 0,4 µmol/ml sporzą dzić

szereg roztworów wzorcowych o róŜnych stęŜeniach, postępują c zgodnie

z danymi przedstawionymi w tabeli 1.

• Spektrofotometr nastawić na długość fali 530 nm. Do jednej kuwety wlać

próbę ślepą , do drugiej roztwór KMnO4 o najniŜszym stęŜeniu. Aparat wyka-

librować wobec próby ślepej, ustawiają c najpierw na transmitancję, która

powinna wynosić 100%, po czym przełą czyć na absorbancję, która powinna

mieć wartość 0,00.

• Odczytać absorbancję wszystkich roztworów wzorcowych KMnO4 oraz roz-tworu o nieznanym stęŜeniu.

• Wykreślić na papierze milimetrowym krzywą kalibracyjną , z której odczytać

stęŜenie oznaczanego roztworu na podstawie zmierzonej absorbancji.

Tabela 1. Przygotowanie stęŜeń wzorcowych roztworu KMnO4 w celu sporzą dze-nia wykresu kalibracyjnego

Nr probówkiIlość roztworu

roboczego[ml]

Ilość wodydestylowanej

[ml]

StęŜenieKMnO4

[µmol/ml]

Absorbancjaprzy

530 nm

1 0,2 1,8 0,04

2 0,4 1,6 0,08

3 0,6 1,4 0,12

4 0,8 1,2 0,16

5 1,0 1,0 0,20

6 1,2 0,8 0,24

7 1,4 0,6 0,28

8 1,6 0,4 0,32

9 1,8 0,2 0,36



4

10 2,0 – 0,40

Próba ślepa – 2,0 –

3. Wyznaczanie wykresu kalibracyjnego i oznaczanie stęŜenia

zwią zku bezbarwnego

Zasada:

Kolorymetrycznie moŜna oznaczać równieŜ zwią zki bezbarwne, lecz po prze-

prowadzeniu ich w barwne pochodne, na drodze stechiometrycznej reakcji che-

micznej. Czułość tych metod jest równa lub większa od czułości oznaczaniazwią zków barwnych. Postępowanie przy ustalaniu zakresu stęŜeń substancji

bezbarwnej i przy sporzą dzaniu wykresu kalibracyjnego jest podobne, jak

w przypadku roztworów barwnych, poszerzone jednak o reakcję chemiczną z odczynnikiem wybarwiają cym, po której dopiero moŜna mierzyć absorbancję

roztworu wobec próby ślepej. Skład próby ślepej róŜni się od jej składu w me-

todach oznaczania substancji barwnych, poniewaŜ poza rozpuszczalnikiem mu-

si zawierać odczynnik wybarwiają cy. Metodą tą moŜna oznaczać zarówno

zwią zki nieorganiczne, jak i organiczne.

Przykładem zwią zku nieorganicznego, który moŜna oznaczać ilościowo meto-

dami kolorymetrycznymi, są ortofosforany (PO43–

). Reagują z odczynnikiem

wybarwiają cym, którym jest molibdenian amonowy w środowisku kwaśnym.

Powstałe fosfomolibdeniany w obecności zwią zków redukują cych (eikonogenu,czyli kwasu 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowego lub chlorku cyny (II) lub amidoli

i hydrochinonu) przechodzą w niebieskie połą czenia zwane błękitem molibde-

nianowym (mieszanina niŜszych tlenków molibdenu), którego absorbancję

moŜna mierzyć przy 660 nm. Błękit molibdenianowy jest podstawą koloryme-

trycznego oznaczania nieorganicznych ortofosforanów w metodzie Fiske-Sub-

barowa. Przykładem bezbarwnych zwią zków organicznych, które mogą być

oznaczane ilościowo metodami kolorymetrycznymi są białka. Istnieje wiele me-

tod kolorymetrycznych słuŜą cych do ich ilościowego oznaczania, róŜnią cych

się czułością i specyficznością reakcji. Podstawową wśród nich jest metoda biu-

retowa, której zasada sprowadza się do reakcji barwnej pomiędzy atomami azo-

tu wią zań peptydowych a jonami miedzi w środowisku zasadowym:

C u2 +

C

N

O

H C

C H

C

H C

R 1

R 2

O

R 3

N

C

N

O

C H

C H

C

C H

R 1

R 2

O

R 3

N



5

Reakcję tę dają wszystkie zwią zki, mają ce co najmniej dwa wią zania peptydo-we – w tym równieŜ biuret – i stą d nazwa metody. Środowisko zasadowe, które

jest konieczne dla reakcji wybarwiają cej, sprzyja wytrą caniu jonów miedzi

w postaci wodorotlenku miedziowego. Aby tego uniknąć, do mieszaniny reak-

cyjnej wprowadza się winian sodowo-potasowy, który kompleksuje jony mie-

dzi. Intensywność powstałego zabarwienia jest proporcjonalna do liczby wią zań

peptydowych w czą steczkach białkowych obecnych w analizowanym roztwo-

rze, a zatem do stęŜenia białka.

Tabela 2. Przygotowanie stęŜeń wzorcowych roztworu białka w celu sporzą dzenia

wykresu kalibracyjnego do metody biuretowej

Nr probówki

Ilość roztworu

wzorcowego

[ml]

Ilość soli

fizjologicznej

[ml]

StęŜenie

białka

[mg/ml]

Absorbancja przy

540 nm

1 0,2 0,8 2

2 0,4 0,6 4

3 0,6 0,4 6

4 0,8 0,2 8

5 1,0 – 10

P. ślepa – 1,0 –

Wykonanie:

• Przygotować 6 ponumerowanych probówek (ostatnią opisać jako próba śle-

pa). Z roboczego 1% roztworu wzorcowego białka w soli fizjologicznej przy-

gotować szereg roztworów wzorcowych o róŜnych stęŜeniach, postępują czgodnie z danymi przedstawionymi w tabeli 2.

• Do wszystkich probówek dodać po 4 ml odczynnika biuretowego. Do 1 ml

próby o nieznanym stęŜeniu białka wprowadzić 4 ml odczynnika biuretowe-

go. Wszystkie próby wymieszać i pozostawić na 15 minut w temperaturze

pokojowej. Po tym czasie zmierzyć absorbancję wobec próby ślepej przy

540 nm.

• Sporzą dzić krzywą kalibracyjną do metody biuretowej.

• Ze sporzą dzonej krzywej kalibracyjnej odczytać stęŜenie białka w próbieo nieznanym stęŜeniu na podstawie jej wartości absorbancji.

ODCZYNNIKI

0,1% roztwór fenoloftaleiny w etanolu rozcieńczony 40-krotnie 0,1 M NaOH,

sporzą dzić tuŜ przed wyznaczaniem widma (ostateczne stęŜenie 0,0025%);

0,1 M roztwór NaOH; etanol; 0,4 µmol/ml wodny roztwór KMnO4; 1% roztwór



6

białka w soli fizjologicznej; sól fizjologiczna (0,9% roztwór NaCl); odczynnik biuretowy: 1,5 g CuSO4⋅5H2O i 6 g winianu sodowo-potasowego (czterowod-

nego) rozpuścić w 500 ml H2O destylowanej, po czym mieszają c dodać 300 ml

10% roztworu NaOH wolnego od węglanów i uzupełnić wodą do 1000 ml, na-

leŜy przechowywać w ciemnej butelce (jest trwały przez kilka miesięcy, dopóki

nie pojawi się osad).

NOTATKI

Documents

Kolorymetria biochemia