Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Kristallstruktur von [Fe]-Hydrogenase Hmd
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem Fachbereich Biologie der
Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Oliver Pilak
geboren in Lebach
Marburg/Lahn, April 2007
Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden in der Zeit von April 2004 bis
März 2007 am Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie in Marburg/Lahn
unter der Leitung von Professor Dr. Rudolf K. Thauer durchgeführt.
Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universtität in Marburg als Dissertation
angenommen am:
Erstgutachter: Prof. Dr. Rudolf K. Thauer
Zweitgutachter: Prof. Dr. Wolfgang Buckel
Tag der mündlichen Prüfung: 02. Mai 2007
Die Ergebnisse der Doktorarbeit sind in zwei Publikationen zusammengefasst, von
denen eine bereits erschienen ist und die andere als Veröffentlichungsentwurf
vorliegt. Die beiden Publikationen bilden den Ergebnisteil der Dissertationsschrift.
Pilak, O., Mamat, B., Vogt, S., Hagemeier, C. H., Thauer, R. K., Shima, S., Vonrhein,
C., Warkentin, E., Ermler, U., The Crystal Structure of the Apoenzyme of the Iron-
Sulphur Cluster-free Hydrogenase, Journal of Molecular Biology, 2006, 358 (3):
p. 798-809.
Pilak, O., Vogt, S., Schick, M., Warkentin, E., Thauer, R. K., Ermler, U. & Shima, S.,
The Active Site Crystal Structure of the Iron-Sulfur-Cluster-free Hydrogenase at
1.75 Å resolution (to be submitted)
Inhaltsverzeichnis 1
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis................................................................................................. 1
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 2
1. Zusammenfassung............................................................................... 3
2. Einleitung.............................................................................................. 5
2.1. [FeFe]-Hydrogenase ............................................................................ 6
2.2. [NiFe]-Hydrogenase ............................................................................. 7
2.3. [Fe]-Hydrogenase (Hmd) ..................................................................... 8
3. Material und Methoden ...................................................................... 17
3.1. Verwendete Materialien ..................................................................... 17
3.2. Molekularbiologische Methoden ........................................................ 20
3.3. Sequenzierung der hmd-Gene aus Methanothermus fervidus und
Methanobrevibacter arboriphilus........................................................ 22
3.4. Reinigung von [Fe]-Hydrogenase ...................................................... 32
3.5. Reinigung von FeGP-Kofaktor ........................................................... 38
3.6. Rekonstitution von [Fe]-Hydrogenase ............................................... 39
3.7. Kristallografische Methoden............................................................... 41
4. Ergebnisse / Publikationen ................................................................ 45
4.1. The Crystal Structure of the Apoenzyme of the Iron-Sulfur-Cluster-
Free Hydrogenase ............................................................................. 47
4.2. The Active Site of [Fe]-Hydrogenase (Iron-Sulfur-Cluster-Free
Hydrogenase) at 1.75 Å Resolution................................................... 59
5. Diskussion.......................................................................................... 75
6. Literatur .............................................................................................. 88
Lebenslauf.......................................................................................................... 94
Danksagung ....................................................................................................... 95
Erklärung............................................................................................................ 96
Abkürzungsverzeichnis 2
Abkürzungsverzeichnis [Fe]-Hydrogenase H2-bildende Methylentetrahydromethanopterindehydro-
genase (Hmd) oder Eisen-Schwefel-Cluster-freie
Hydrogenase
Hmd
aHmd
fHmd
jHmd
kHmd
mHmd
[Fe]-Hydrogenase von
Methanobrevibacter arboriphilus
Methanothermus fervidus
Methanocaldococcus jannaschii
Methanopyrus kandleri
Methanothermobacter thermolithotrophicus
GP Guanylylpyridon
FeGP-Kofaktor Eisen-Guanylylpyridon-Kofaktor
H4MPT 5,6,7,8,-Tetrahydromethanopterin
Methenyl- H4MPT+ N5,N10-Methenyl- H4MPT
Methylen- H4MPT N5,N10-Methylen- H4MPT
Mtd F420-abhängige N5,N10-Methylentetrahydromethan-
opterin-Dehydrogenase
DTT Dithiotreitol
Zusammenfassung 3
1. Zusammenfassung
Hydrogenasen sind Enzyme, die die heterolytische Spaltung von H2
katalysieren. Man unterscheidet drei phylogenetisch nicht verwandte Typen von
Hydrogenasen, nämlich [NiFe]-Hydrogenase, [FeFe]-Hydrogenase und [Fe]-
Hydrogenase (Hmd). Während Kristallstrukturen von [NiFe]-Hydrogenase und
[FeFe]-Hydrogenase bereits seit einigen Jahren vorliegen, basieren die bisherigen
Kenntnisse zur Struktur des aktiven Zentrums von [Fe]-Hydrogenase im
Wesentlichen auf Infrarot-, Mössbauer- und Röntgenabsorptions-spektroskopischen
Untersuchungen, aus denen hervorgeht, dass im aktiven Zentrum von [Fe]-
Hydrogenase ein "Low Spin"-Eisen (0) oder -Eisen (II) von einem Schwefel-, zwei
CO- und einem oder zwei N/O-Liganden komplexiert wird. Das Eisen ist mit einem
Guanylylpyridon (GP) fest verbunden, mit dem es zusammen einen festen Komplex
(FeGP) bildet, der ein essentieller Kofaktor der [Fe]-Hydrogenase ist. Der FeGP-
Kofaktor kann in Gegenwart von Mercaptoethanol reversibel vom Enzym getrennt
werden, was es ermöglicht, aktives Holoenzym aus Apoenzym und FeGP-Kofaktor
zu rekonstituieren. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren weder die Struktur des
FeGP-Kofaktors noch die des Apo- und Holoenzyms bekannt.
Es gelang als erstes, die Kristallstruktur von in E. coli heterolog produziertem
[Fe]-Hydrogenase-Apoenzym von Methanocaldococcus jannaschii bis zu 1.75 Å
Auflösung zu erhalten. Die Struktur zeigt, dass das Apoenzym ein funktionelles
Homodimer (2 x 38 kDa) mit einer zentralen Dömäne, in der die beiden C-terminalen
Hälften der beiden Untereinheiten sich umwinden, und zwei peripheren Domänen ist,
die jeweils nur von einer N-terminalen Hälfte der beiden Untereinheiten gebildet
werden und die eine Nukleotidbindestelle („Rossmann Fold“) enthalten. Zwischen
den drei Domänen finden sich zwei Taschen in einem Abstand von 50 Å, in deren
Tiefe die Thiolgruppe von Cystein176 zugänglich ist. Aus Mutationsanalysen war
bekannt, dass Cys176 essentiell für die Enzymaktivität ist, weshalb postuliert worden
war, dass die Seitengruppe dieser Aminosäure den Schwefel-Liganden zum Eisen im
aktiven Zentrum stellt. Anhand der Lage von Cys176 und der Nukleotidbindestelle
wurden Eisen und Guanylylpyridon in die Apoenzymstruktur modelliert.
Zusammenfassung 4
Geeignete Kristalle des [Fe]-Hydrogernase-Holoenzyms, die bis zu 1.75 Å
beugen, wurden erst ganz am Ende dieser Arbeit erhalten und zwar vom Holoenzym,
das aus Apoenzym von M. jannaschii und dem FeGP-Kofaktor des Enzyms von
Methanothermobacter marburgensis rekonstituiert worden war. Ebenfalls bis 1.75 Å
Auflösung konnte die Struktur des Cyanid-inhibierten Fe-Hydrogenase-Holoenzyms
von M. jannaschii gelöst werden. Aus den Elektronendichten lässt sich erkennen,
dass das Eisen im aktiven Zentrum mononuklear und quadratisch-pyramidal
koordiniert ist. Im Enzym ohne Cyanid bilden der Stickstoff des Pyridons die Spitze
der Pyramide und Schwefel von Cys176, zwei CO, die einen Winkel von 90o bilden,
und ein unbekannter Ligand (wahrscheinlich extrinsisches CO) die vier Ecken des
Quadrates. Im cyanidinhibiertem Enzym nimmt Cyanid die Stelle des unbekannten
Liganden ein. Diese Stelle dürfte daher auch die H2-Bindungsstelle sein. In der Nähe
des Eisens bietet die Enzymstruktur ausreichend Platz für die Bindung des zweiten
Substrats Methenyltetrahydromethanopterin, auf das im aktiven Zentrum ein Hydrid
vom H2 übertragen wird. Die genaue Bindestelle für Methenyltetrahydro-
methanopterin muss allerdings noch durch Kokristallisationsversuche verifiziert
werden.
Einleitung 5
2. Einleitung
Wasserstoff ist das häufigste Element der Biosphäre der Erde, aber nur wenig
Wasserstoff liegt in Form von Wasserstoffgas vor. Der überwiegende Teil ist in Form
von Wasser und Kohlenwasserstoffen gebunden. Wasserstoff wird seit einiger Zeit
als möglicher sekundärer Energieträger im Konzept einer Wasserstoffökonomie in
Betracht gezogen. In diesen Überlegungen würde Wasserstoff als Energieträger
beispielsweise in Brennstoffzellen eingesetzt [1].
Die Dissoziationsenergie der H-H-Bindung des Wasserstoffmoleküls beträgt
435 kJ/mol [2]. Wegen dieser starken Bindung ist das Wasserstoffmolekül unter
gewöhnlichen Bedingungen nicht reaktiv. Kann die Spaltung nicht unter hohem
Druck und hoher Temperatur durchgeführt werden, wird ein Katalysator benötigt. In
Brennstoffzellen ist dies Platin, das allerdings sehr teuer und nur in begrenzten
Mengen verfügbar [3] ist, weshalb die Suche nach einer günstigen Alternative zu
Platin große Bedeutung hat. Neue Wasserstoffkatalysatoren sollten günstig, effizient
und stabil gegenüber häufig auftretenden Verunreinigungen in einer Brennstoffzelle
wie beispielsweise Kohlenmonoxid sein. Als zum Nachbau geeignete Modelle
könnten daher die aktiven Zentren von wasserstoffspaltenden Enzymen, dienen [4-
7].
In anaeroben Ökosystemen entstehen durch Fermentation von organischen
Verbindungen und andere Prozesse etwa 108 Tonnen Wasserstoff pro Jahr. Die
Wasserstoffkonzentration anoxischer Lebensräume beträgt allerdings nur 0,1 µM [8],
da der überwiegende Teil des produzierten Wasserstoffs durch methanogene
Archäen, sulfatreduzierende oder azetogene Bakterien sofort wieder verbraucht wird.
In aeroben Lebensräumen wird Wasserstoff durch Knallgasbaktrien und Nitrifizierer
verbraucht. Alle genannten Organismen enthalten Hydrogenasen,
wasserstoffspaltende Enzyme.
Hydrogenasen werden entsprechend dem Aufbau ihrer aktiven Zentren in drei
phylogenetisch nicht miteinander verwandte Klassen eingeteilt: [NiFe]-Hydrogenase,
[FeFe]-Hydrogenase und [Fe]-Hydrogenase (früher: Eisen-Schwefel-Cluster-freie
Hydrogenase). [NiFe]- und [FeFe]-Hydrogenase katalysieren die Reduktion von
Einelektronenakzeptoren wie Methylviologen mit H2 [9] und in Abwesenheit eines
Elektronenakzeptors sowohl den einfachen als auch den doppelten
Einleitung 6
Isotopenaustausch zwischen H2 und H2O als auch die Umwandlung von para-H2 in
ortho-H2, weshalb für beide Hydrogenasen ein Ping-Pong-Reaktionsmechanismus
angenommen wird. Hydrogenasen dieser beiden Klassen besitzen neben einem
dinuklearen Zentrum (Nickel und Eisen bzw. Eisen und Eisen) auch immer
mindestens einen [4Fe-4S]-Cluster. Hydrogenasen der dritten Klasse, [Fe]-
Hydrogenase, hingegen besitzen ein mononukleares Fe-Zentrum und keine Eisen-
Schwefel-Cluster und katalysieren einen Hydridtransfer. [Fe]-Hydrogenase reduziert
kein Methylviologen. Sowohl die Umwandlung von para-H2 in ortho-H2 [10] als auch
der einfache und doppelte Isotopenaustausch von H2 mit H2O finden nur in
Anwesenheit des Hydridakzeptors Methenyltetrahydromethanopterin statt [11, 12].
2.1. [FeFe]-Hydrogenase
Die Kristallstrukturen von [FeFe]-Hydrogenase von Clostridium pasteurianum
[13] bei 1,8 Å und von Desulfovibrio desulfuricans [14] bei 1,6 Å zeigten das als H-
Cluster bezeichnete aktive Zentrum (Abb. 1). Der H-Cluster besteht aus einem
dinuklearen Eisenzentrum und einem [4Fe-4S]-Cluster, die über ein Cystein
miteinander verbunden sind. Die beiden Eisenatome des dinuklearen Zentrums
tragen Cyanid- und CO-Liganden und sind über zwei S-Atome eines noch
unbekannten kleinen Moleküls verbunden. Bei diesem Brückenliganden könnte es
sich um Di-(Thiomethyl)-Amin handeln, wobei anstelle des zentralen Stickstoffatoms
auch ein Kohlenstoff- oder Sauerstoffatom diskutiert werden [15]. Das vom [4Fe-4S]-
Cluster aus gesehen distale Eisenatom ist nicht redoxaktiv, stellt vermutlich die H2-
Bindestelle dar und verbleibt im Low-Spin-Fe(II)-Zustand während des
Reaktionszyklus [16]. An dieses distale Eisen bindet auch extrinsisches CO, das
[FeFe]-Hydrogenase inhibiert. Das proximale Eisen ist redoxaktiv. Die Hydrogenasen
der Clostridien enthalten zusätzlich zum [4Fe-4S]-Cluster des H-Clusters noch drei
[4Fe-4S]-Cluster und einen [2Fe-2S]-Cluster. Diese dienen dem Elektronentransport
vom aktiven Zentrum zu Ferredoxin [13]. Diese zusätzlichen Cluster finden sich nicht
in [FeFe]-Hydrogenase von Chlorella und Chlamydomonas [17]. Gaskanäle von der
Oberfläche des Enzyms führen zum aktiven Zentrum [18].
Einleitung 7
[FeFe]-Hydrogenase findet sich in anaeroben Bakterien und Eukrayoten, nicht
jedoch in Archäen [19]. Im Allgemeinen dient dieses Enzym der Bildung von
Wasserstoff als Endprodukt der Fermentation.
Abb. 1: Aktives Zentrum (H-Cluster) von [FeFe]-Hydrogenase aus Clostridium pasteurianum. Das dinukleare Eisenzentrum ist über ein Cystein mit einem [4Fe-4S]-Cluster verbunden. Beide Eisen
tragen intrinsische Cyanid- und CO-Liganden. Die chemische Struktur des Dithiolliganden zwischen
den beiden Eisenatomen ist noch unklar.
2.2. [NiFe]-Hydrogenase
[NiFe]-Hydrogenase wurde zuerst in methanogenen Archäen entdeckt [20, 21].
Mit Ausnahme von [Fe]-Hydrogenase Hmd sind alle Hydrogenasen der Archäen
Nickelenzyme. [NiFe]-Hydrogenase findet sich auch in gramnegativen Bakterien wie
beispielsweise E. coli [19].
[NiFe]-Hydrogenase besteht im Allgemeinen aus einer großen Untereinheit, die
das binukleare [NiFe]-Zentrum enthält, und einer kleinen Untereinheit mit drei [4Fe-
4S]-Clustern [22]. Die Kristallstrukturen von [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio
gigas bei 2,85 Å [23], Desulfovibrio vulgaris bei 1,4 Å [24, 25] Desulfomicrobium
baculatum bei 2,15 Å [26] und Desulfovibrio desulfuricans bei 1,85 Å [27] enthüllten
das binukleares [NiFe]-Zentrum (Abb. 2). Die Kristallstruktur der [NiFe]-Hydrogenase
aus Desulfovibrio gigas zeigte, dass im binuklearen [NiFe]-Zentrum das Nickel- und
das Eisenatom über Cysteinyl-Schwefel-Liganden miteinander verbunden sind [23,
25, 28]. Das Nickelatom trägt noch zwei weitere Cysteinyl-Schwefel-Liganden und
das Eisenatom zwei CO- und einen Cyanid-Liganden [29]. Das Nickelatom ist
redoxaktiv und stellt vermutlich die H2-Bindestelle dar. Das Eisenatom ist nicht
redoxaktiv und verbleibt wie das distale Eisenatom des H-Clusters von [FeFe]-
Hydrogenase im Low-Spin-Fe(II)-Zustand während des Reaktionszyklus [22]. Der
Einleitung 8
Abstand zwischen [NiFe]-Zentrum und dem nächstgelegenen [4Fe-4S]-Cluster
beträgt 10 Å [23]. Ähnlich wie bei [FeFe]-Hydrogenase dienen die [4Fe-4S]-Cluster
von [NiFe]-Hydrogenase dem Elektronentransport zum Elektronenakzeptor. Es
konnte gezeigt werden, dass Wasserstoff über Gaskanäle durch konservierte
Aminosäurereste kontrolliert zum [NiFe]-Zentrum gelangt [30, 31].
Im Allgemeinen dient [NiFe]-Hydrogenase der Aufnahme und Spaltung von
Wasserstoff, wie beispielsweise bei Knallgasbakterien [32, 33]. Eine Ausnahme bildet
Hydrogenase 3 von E. coli in der Formiat-Hydrogen-Lyase-Reaktion [34].
Schon wegen ihrer Katalyse der Knallgasreaktion ist [NiFe]-Hydrogenase
weniger sauerstoffempflich als [FeFe]-Hydrogenase, die nur unter strikt anaeroben
Bedingungen arbeitet. Die spezifische Aktivität von [FeFe]-Hydrogenase ist allerdings
zehnmal höher als die von [NiFe]-Hydrogenase [22].
Abb. 2: Aktives Zentrum von [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio gigas. Das Nickelatom trägt
vier Cysteinyl-Schwefel-Liganden. Zwei dieser Cysteinyl-Schwefel-Liganden verbinden das Nickel- mit
dem Eisenatom, das zusätzlich ein CO- und zwei Cyanidliganden besitzt. Der nächstgelegene [4Fe-
4S]-Cluster befindet sich in der kleinen Untereinheit des Enzyms und ist 10 Å vom binuklearen [NiFe]-
Zentrum entfernt.
2.3. [Fe]-Hydrogenase (Hmd)
Aus Methanothermobacter marburgensis isolierte [Fe]-Hydrogenase Hmd
konnte bereits bei ihrer Entdeckung keiner der beiden anderen
Hydrogenasenklassen zugeordnet werden, da sie als einzige Hydrogenase nicht die
Reduktion von Methylviologen katalysiert [12]. In [Fe]-Hydrogenase-Reinigungen
wurden zunächst stöchiometrische Mengen Eisen nachgewiesen [12]. Da die
Einleitung 9
Eisenmengen aber nicht mit der spezifischen Aktivität korrelierten, wurde später die
Anwesenheit von Eisen als Kontamination angesehen [11]. Auch die UV/Vis-
Spektrum gereinigter [Fe]-Hydrogenase zeigte bei 280 nm eine 2,8-mal höhere
Absorption als berechnet [11], weshalb schon früh die Anwesenheit einer
prosthetischen Gruppe nicht ausgeschlossen wurde.
2.3.1. Katalytische Eigenschaften
[Fe]-Hydrogenase katalysiert die reversible Reduktion von
Methenyltetrahydromethanopterin (Methenyl-H4MPT+) mit H2 zu
Methylentetrahydromethanopterin (Methylen-H4MPT) und H+ (∆G°’ = -5,5 kJ/mol)
(Abb. 3). Diese Reaktion ist an der Methanogenese aus H2 und CO2 beteiligt [35]
(Abb. 4). Die freie Energie der Reaktion unter Standardbedingungen liegt nahe null.
Die Standardreduktionspotentiale (E°’) sind für das H+/H2-Paar -414 mV und für das
Methenyl-H4MPT+ / Methylen-H4MPT-Paar -390 mV [12].
Abb. 3: Reaktion von [Fe]-Hydrogenase Hmd. [Fe]-Hydrogenase katalysiert die reversible
Reduktion von Methenyltetrahydromethanopterin mit H2 zu Methylentetrahydromethanopterin und H+.
Dabei wird nach heterolytischer Spaltung das Hydrid des Wasserstoffs in die pro-R-Position von
Methylentetrahydromethanopterin übertragen.
Das pH-Optimum der Hinreaktion liegt bei 7,5, dasjenige der Rückreaktion bei
6,5. Salzkonzentrationen von mindestens 100 mM sind nötig [12]. Der apparente Km-
Wert für Methylen-H4MPT beträgt 40 µM, der app. Km-Wert für Methenyl-H4MPT+
beträgt 50 µM. Der app. Vmax-Wert für Methylen-H4MPT beträgt 2040 U/mg und
Einleitung 10
derjenige für Methenyl-H4MPT+ 1360 U/mg. Der app. Km-Wert für H2 ist mit 60 %
oder 0,2 mM relativ hoch [11, 36].
2.3.2. Physiologische Rolle
Abb. 4: Stoffwechselweg der Methanogenese aus H2 und CO2 in Methanothermobacter marburgensis. CO2 wird schrittweise bis zum Methan reduziert. Während der Reduktion sind die C1-
Körper an die Coenzyme Methanofuran (MFR), Tetrahydromethanopterin (H4MPT) und Coenzym M
(HS-CoM) gebunden. Als Elektronenüberträger dienen Ferredoxin, Coenzym F420 und Coenzym B
(HS-CoB). Abkürzungen: Fd: Ferredoxin; Energie konvertierende Hydrogenasen: Eha und Ehb
([NiFe]-Hydrogenasen); Fmd: Formylmethanofurandehydrogenase; Hmd: H2-bildende N5,N10-
Methylen-H4MPT-Dehydrogenase; Mtd: F420-abhängige N5,N10-Methylen-H4MPT-Dehydrogenase; Frh:
F420-reduzierende Hydrogenase ([NiFe]-Hydrogenase); Mer: N5,N10-Methylen-H4MPT-Reduktase;
Mvh: Methylviologen reduzierende Hydrogenase ([NiFe]-Hydrogenase); Hdr: Heterodisulfidreduktase;
Mcr: Methyl-Coenzym-M-Reduktase. Grün: Nickelhaltige Enzyme, braun: Eisen-Schwefel-Protein, rot:
Hmd.
Einleitung 11
Die relativ hohe Km(H2) von [Fe]-Hydrogenase ist ein Grund dafür, dass unter
normalen Wachstumsbedingungen, insbesondere bei ausreichend Nickel im Medium,
die oben genannte Reduktion von Methenyl-H4MPT+ nicht von Hmd sondern von Mtd
(F420-abhängige Methylentetrahydromethanopterindehydrogenase), einem metall-
freien Enzym [37], und nicht mit H2 sondern mit reduziertem F420 durchgeführt wird.
F420 wird von Frh (F420-reduzierende Hydrogenase), einer [NiFe]-Hydrogenase,
reduziert. Der Km(H2) von Frh beträgt lediglich 0,01 mM und ist somit etwa
zwanzigmal niedriger als derjenige von Hmd [38]. Unter Nickellimitierung wird in
M. marburgensis keine Frh produziert. In diesem Fall übernehmen Mtd und Hmd
gemeinsam die Reduktion von F420 und ersetzen somit das Nickelenzym Frh [36].
Der höhere Km(H2) von Hmd im Vergleich zu Frh wird durch eine fünffach höhere
Hmd-Konzentration in M. -marburgensis-Zellen bei Wachstum unter Ni-Limitierung im
Vergleich zu unlimitiertem Wachstum kompensiert [36, 39]. Diese Entdeckung
ermöglichte die Reinigung von großen Mengen [Fe]-Hydrogenase aus Zellen von
M. marburgensis nach Wachstum unter Nickellimitierung.
2.3.3. Reaktionsmechanismus
[Fe]-Hydrogenase aus M. marburgensis ist ein Dimer aus zwei identischen
38 kDa großen Untereinheiten und enthält keine Eisen-Schwefel-Cluster [11]. [Fe]-
Hydrogenase katalysiert per se weder den einfachen noch den doppelten
Isotopenaustausch zwischen H2 und H2O und auch nicht die Umwandlung von para-
H2 in ortho-H2. Bei Anwesenheit des Substrates Methenyl-H4MPT+ katalysiert [Fe]-
Hydrogenase allerdings die genannten Reaktionen [10, 11]. Isotopenexperimente
zeigten, dass die H2-Aktivierung nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der
Reaktion ist [40, 41]. Aufgrund dieser Ergebnisse und der
Konzentrationsabhängigkeit der Methenyl-H4MPT+-Reduktionsrate mit H2
(„intersecting reciprocal plots“) [40, 41] wurde als Katalysemechanismus ein ternärer
Komplexmechanismus und kein Ping-Pong-Mechanismus vorgeschlagen [42]. Mittels
Isotopenmarkierungs- und NMR-spektroskopischen Experimenten konnte
nachgewiesen werden, dass [Fe]-Hydrogenase den Re-seitenspezifischen Transfer
des Hydrids von H2 zum C14 von Methenyl-H4MPT+ katalysiert [43, 44]. Darüber
hinaus katalysiert [Fe]-Hydrogenase den Austausch des pro-R-Wasserstoffatoms der
Einleitung 12
Methylengruppe von Methylen-H4MPT mit Protonen des Wassers [43]. Durch
Nukleare Overhausereffektspektroskopie konnte gezeigt werden, dass sich die
Konformation des Substrates Methylen-H4MPT bei Bindung an [Fe]-Hydrogenase
ändert und das pro-R-Wasserstoffatom der Methylengruppe das reaktivere
Wasserstoffatom wird. In Lösung ist hingegen das pro-S-Wasserstoffatom der
Methylengruppe das reaktivere [45]. Aufgrund der genannten Ergebnisse wurde ein
Reaktionsmechanismus auf Basis der Carbokationenchemie von Alkanen in
supersauren Bedingungen vorgeschlagen [46, 47]. Dabei verhält sich das
Carbokation Methenyl-H4MPT+ wie eine Lewissäure (Elektronenpaarakzeptor) bei
der heterolytischen Spaltung von H2, sodass als Intermediat ein pentakoordinierter
Kohlenstoff in der Position C14 entsteht. Dieser Reaktionsmechanismus erfordert
keine Anwesenheit eines Metalls der Übergangsgruppen, weshalb der Name
metallfreie Hydrogenase eingeführt wurde [47].
Heterolog in E. coli produzierte [Fe]-Hydrogenase ist inaktiv. Wird jedoch native
[Fe]-Hydrogenase in Anwesenheit von Mercaptoethanol denaturiert und ultrafiltriert,
so aktiviert das dabei gewonnene Ultrafiltrat das heterolog produzierte Apoenzym.
Aufgrund dieser Entdeckung wurde die Anwesenheit eines [Fe]-Hydrogenase-
Kofaktors postuliert. Nach Bindung dieses Kofaktors an heterolog produziertes
Apoenzym kann aktives [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym rekonstituiert werden [48].
2.3.4. [Fe]-Hydrogenase-Kofaktor
Die Entdeckung des [Fe]-Hydrogenase-Kofaktors und die Möglichkeit [Fe]-
Hydrogenase in großen Mengen aus Zellen von M. marburgensis nach Wachstum
unter Ni-Limitierung zu gewinnen und die Entdeckung der Lichtempfindlichkeit von
sowohl [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym als auch -Kofaktor bei UV- und Blaulicht (320 –
500 nm) [49], ermöglichten eine Charakterisierung von [Fe]-Hydrogenase im Hinblick
auf den Metallgehalt und ihre Empfindlichkeit gegenüber Inhibtoren. Es zeigte sich,
dass [Fe]-Hydrogenase unempfindlich gegenüber Sauerstoff ist, jedoch durch O2-
und Kupferionen rasch inaktiviert wird. Pro mol [Fe]-Hydrogenase-Monomer wurde
ein mol Eisen nachgewiesen, das bei Lichtinaktivierung freigesetzt wird. Der Verlust
des Eisens korreliert mit dem Verlust der Aktivität. [Fe]-Hydrogenase wird durch CO
(Ki (CO) = 20 % (v/v)) und Cyanid (Ki (CN-)= 0,1 mM) inhibiert, wobei die Bindung
eines der beiden Inhibitoren die Bindung des jeweils anderen ausschließt [49]. Der Ki
Einleitung 13
(CO) ist etwa 100-mal höher als derjenige von [FeFe]-Hydrogenase und etwa 10-mal
höher als derjenige von [NiFe]-Hydrogenase.
Abb. 5: Photolyseprodukt des [Fe]-Hydrogenase-Kofaktors (FeGP-Kofaktors) nach Hitze- oder Lichtinaktivierung: Carboxymethyl-3,5-dimethyl-2-pyridon-4-yl)-(5’-guanosyl)-Phosphat (kurz:
Guanylylpyridon oder GP). Pro mol [Fe]-Hydrogenase-Kofaktor werden bei der Inaktivierung ein mol
Eisen und zwei mol CO freigesetzt.
Die Struktur des aktiven [Fe]-Hydrogenase-Kofaktors wurde nicht gelöst.
Jedoch bildete sich bei Lichtinaktivierung des Kofaktors ein stabiles
Photolyseprodukt, dessen Struktur mittels NMR und Massenspektroskopie aufgeklärt
wurde [50]. Es handelt sich dabei um (6-Carboxymethyl-3,5-dimethyl-2-pyridon-4-yl)-
(5’-guanosyl)-Phosphat oder kurz: Guanylylpyridon (GP) (Abb. 5). Pro mol [Fe]-
Hydrogenase-Kofaktor, der ab hier FeGP-Kofaktor genannt wird, wurden bei
Inaktivierung ein mol Eisen und zwei mol CO abgegeben [50].
2.3.5. Spektroskopische Untersuchungen
Mittels Fouriertransformationsinfrarotspektroskopie (FT-IR) wurde
nachgewiesen, dass zwei CO-Moleküle das Eisen des FeGP-Kofaktors sowohl in der
freien als auch in der enzymgebundenen Form ligieren. Beide CO-Moleküle stehen
im Abstand von 90 ° zueinander [51]. Bei Inhibition von [Fe]-Hydrogenase mit CO
oder Cyanid waren jeweils drei Banden im IR-Spektrum nachweisbar, die
charakteristisch gegeneinander verschoben waren. Daraus wurde geschlossen, dass
die beiden intrinsischen CO-Moleküle und die Inhibitoren an dasselbe Eisenatom
binden. Freier FeGP-Kofaktor bindet kein extrinsisches CO. Extrinsisches CO wird
Einleitung 14
nicht mit intrinsischem CO ausgetauscht. Die Affinität von [Fe]-Hydrogenase
gegenüber Cyanid ist höher als gegenüber CO [51]. Die Tatsache, dass drei CO-
Moleküle an das Eisen binden können, zeigt, dass das Eisen in einer stark
reduzierten Form vorliegen muss. Da [Fe]-Hydrogenase kein EPR-Signal zeigte,
kann Fe(I) ausgeschlossen werden. Die Mössbauerspektren von 57Fe-markierter
[Fe]-Hydrogenase und freiem Kofaktor sind am ehesten durch ein mononukleares
Eisenzentrum erklärbar und sagen aus, dass das Eisen diamagnetisch ist. Daher
liegt das Eisen vermutlich entweder im Low-Spin-Fe(0)- oder im Low-Spin-Fe(II)-
Zustand vor [52].
Abb. 6: Mononukleares Fe-Zentrum der [Fe]-Hydrogenase Hmd gemäß den FT-IR-, Mössbauer- und XAS-Messungen. Das Eisen hat im Fall von rekonstituiertem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus
M. jannaschii und freiem FeGP-Kofaktor fünf Liganden: zwei CO, ein oder zwei O oder N und einen
Schwefel. Mutationsanalysen zeigten, dass Cystein176 wahrscheinlich den Schwefelliganden stellt.
XAS-Messungen und Mutationsanalysen bestätigten die Mössbauer- und FT-
IR-Daten. Zwei CO-Moleküle wurden als Liganden des Eisens des Kofaktors
nachgewiesen. Der Abstand von CO zu Fe beträgt jeweils 1,8 Å. Als zusätzliche
Liganden des Eisens bei Bindung des FeGP-Kofaktors an das [Fe]-Hydrogenase-
Apoenzym wurden ein Schwefel im Abstand von 2,3 Å und im Fall von
rekonstituiertem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus M. jannaschii (jHmd) zwei N-
oder O-Liganden im Abstand von 2,0 Å nachgewiesen. Das Eisen des jHmd-
Holoenzyms trägt also fünf Liganden (Abb. 6). Das Gleiche gilt für freien Kofaktor.
Natives [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus M. marburgensis (mHmd) hat hingegen
vier Liganden, einen N/O-Liganden weniger als das rekonstituierte jHmd-Holoenzym
Einleitung 15
[53]. Mutationsanalysen waren ein Hinweis darauf, dass Cystein176 den
Schwefelliganden bei jHmd-Holoenzym stellt, da jHmd keine Aktivität zeigt, wenn das
konservierte Cystein176 durch Alanin ersetzt wird. Werden andere konservierte
Cysteine durch Alanin ersetzt, ist noch Teilaktivität vorhanden [53, 54].
2.3.6. Vorkommen
[Fe]-Hydrogenase Hmd findet sich nur in einigen hydrogenotrophen
methanogenen Archäen der Ordnungen Methanobacteriales, Methanopyrales und
Methanococcales [42]. Neben M. marburgensis wurde native [Fe]-Hydrogenase noch
aus Methanothermobacter thermoautotrophicus [55], Methanopyrus kandleri [56],
Methanothermobacter wolfei [11], Methanothermus fervidus, Methanococcus igneus
[40], Methanothermococcus thermolithotrophicus [57] und Methanocaldococcus
jannaschii (Seigo Shima, Oliver Pilak, unveröffentlicht) gereinigt. [Fe]-Hydrogenase-
Aktivität wurde darüber hinaus in Methanobacterium thermoformicicum
nachgewiesen [55]. Neben den genannten Organismen sind noch die Gensequenzen
von hmd aus Methanococcus voltae [42] und Methanococcus maripaludis [58]
bekannt.
2.3.7. Bisherige Kristallisationsversuche
Die Informationen über die aktiven Zentren der [NiFe]- und [FeFe]-
Hydrogenasen beruhen überwiegend auf Kristallstrukturen der jeweiligen Enzyme. Im
Fall von [Fe]-Hydrogenase erwies sich die Kristallisation aus vielerlei Gründen als
schwierig. Bereits kurz nach der Entdeckung von [Fe]-Hydrogenase Hmd wurde
natives Holoenzym aus M. marburgensis kristallisiert [59]. Die Kristalle waren für
Messungen allerdings zu klein. Während der nächsten Jahre wurde native [Fe]-
Hydrogenase aus M. marburgensis immer wieder unter verschiedenen Bedingungen
mit und ohne Methenyl-H4MPT+ sowohl aerob als auch anaerob und bei
verschiedenen Temperaturen kristallisiert. Trotz guter Reproduzierbarkeit und
ausreichender Größe der Kristalle erwies sich die Strukturlösung als unmöglich [60].
[Fe]-Hydrogenase aus M. marburgensis lag immer als perfekt merohedral
verzwillingte Kristalle vor. Native [Fe]-Hydrogenase konnte auch aus M. kandleri
Einleitung 16
gereinigt werden [56], ließ sich jedoch nicht kristallisieren. Nachdem die [Fe]-
Hydrogenase-Apoenzyme aus M. jannaschii und M. kandleri in E. coli heterolog
produziert werden konnten, wurde auch versucht, diese beiden Apoenzyme zu
kristallisieren. MAD-Experimente mit Selenomethionin-markierten Kristallen von
aerob produziertem [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. kandleri lieferten eine
vorläufige Struktur. Die Rcryst- und Rfree-Werte der Struktur betrugen 38 bzw. 40 und
eine weitere Verfeinerung erwies sich als unmöglich. Hohe B-Faktoren von 60
wiesen auf eine hohe thermische Flexibilität des kHmd-Apoenzyms hin. Die aerobe
Kristallisation von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. jannaschii führte vereinzelt
zu Mikrokristallen, die für eine Strukturaufklärung zu klein waren [60]. Erst später
wurde die Sauerstoffempfindlichkeit des [Fe]-Hydrogenase-Apoenzyms aus
M. jannaschii erkannt [54]. Daher wurden im Verlauf dieser Arbeit auch alle
Reinigungen und alle Kristallisationsversuche zu den Apoenzymen anaerob
durchgeführt.
2.3.8. Ziel der vorliegenden Arbeit
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Strukturaufklärung von [Fe]-
Hydrogenase Hmd und ihres FeGP-Kofaktors mittels Röntgenstrukturanalyse. [Fe]-
Hydrogenase-Apoenzyme aus verschiedenen Organismen lassen sich mit dem leicht
zu präparierenden FeGP-Kofaktor aus M. marburgensis zu aktiven Holoenzymen
rekonstituieren. Daher wurden in dieser Arbeit möglichst viele Apo- und Holoenzyme
für Kristallisationsexperimente benutzt. Neben nativer [Fe]-Hydrogenase aus
M. marburgensis und M. jannaschii waren dies die Apoenzyme von [Fe]-
Hydrogenase aus M. jannaschii, M. kandleri und Methanothermococcus
thermolithotrophicus und die zugehörigen rekonstituierten Holoenzyme. Die hmd-
Gene von Methanobrevibacter arboriphilus und Methanococcus fervidus wurden im
Rahmen dieser Arbeit kloniert und die entsprechenden Apoenzyme heterolog
produziert.
Letztendlich gelang ausschließlich die Kristallisation und Strukturaufklärung von
[Fe]-Hydrogenase-Apoenzym und rekonstituiertem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym
aus M. jannaschii und dadurch auch die Strukturaufklärung des FeGP- Kofaktors.
Material und Methoden 17
3. Material und Methoden
3.1. Verwendete Materialien
3.1.1. Chemikalien und Biochemikalien
Soweit nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Reagentien in der
höchsten erhältlichen Reinheit von den Firmen Sigma-Aldrich (München) und Merck
(Darmstadt) bezogen. Die verwendeten Kristallisationsmaterialien wie
Kristallisationskollektionen („Screens“), Platten und Zubehör stammten von den
Firmen Jena Bioscience (Jena) und Hampton Research (Aliso Viejo, USA).
Synthetische Oligonukleotide stammten von Thermoelectron (Ulm).
Restriktionsendonukleasen und sonstige DNA-modifizierende Enzyme stammten von
GE Healthcare (Freiburg), New England Biolabs (Frankfurt am Main), Roche
(Mannheim) und Stratagene (Amsterdam, Niederlande).
Die Koenzyme H4MPT und Methenyl-H4MPT+ wurden aus Zellen von
Methanothermobacter marburgensis von Herrn Reinhard Böcher und Frau Johanna
Moll gereinigt [61]. Methylen-H4MPT entstand durch spontane Reaktion von H4MPT
mit Formaldehyd und anschließende Lyophilisierung zur Abtrennung überschüssigen
Formaldehyds.
3.1.2. Gase, Anaerobenzelte, anaerobe Lösungen
Alle Gase wurden von Messer-Griesheim (Siegen) bezogen. H2 und N2 wurden
in Reinheiten von 99,999 % bez. 99,996 % eingesetzt.
Anaerobe Lösungen und Wasser wurden durch Membranfilter (0,45 µm, Pall,
Dreieich) filtriert und unter N2-Begasung gekocht. Die abgefüllten Flüssigkeiten
wurden danach über Nacht im Anaerobenzelt gerührt. Die Aufbewahrung erfolgte
unter 100% N2.
Material und Methoden 18
3.1.3. Mikroorganismen, Genbänke und Plasmide
Methanothermobacter marburgensis (DSMZ 2133) wurde von der Deutschen
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig bezogen. [Fe]-
Hydrogenase von M. marburgensis wurde aus unter Nickellimitierung gewachsenen
Zellen von Frau Manuela Kauß gereinigt [49]. Zellen von Methanocaldococcus
jannaschii wurden von Herrn Dr. Huber (Universität Regensburg) bezogen.
Escherichia coli BL21 (DE3) mit dem Plasmid pET24b(+) und dem hmd-Gen
aus Methanopyrus kandleri stammte von Frau Sonja Vogt. E. coli BL21 (DE3) mit
dem Plasmid pET24b(+) und dem hmd-Gen aus M. jannaschii stammte von Herrn
Dr. Seigo Shima [50].
Die Phagengenbank des Genoms von Methanothermus fervidus und die
Gensonde für den konservierten Bereich des hmd-Gens aus M. fervidus wurden von
Frau Sonja Vogt, die Phagengenbank des Genoms von Methanobrevibacter
arboriphilus und die Gensonde für den konservierten Bereich des hmd-Gens aus
M. arboriphilus wurden von Herrn Dr. Seigo Shima zur Verfügung gestellt.
Chromosomale DNA von M. fervidus und M. arboriphilus wurde von Herrn Dr.
Seigo Shima bereitgestellt.
Tabelle 1: Verwendete Plasmide
Plasmid Beschreibung Referenz
pET-24b(+) Expressionsvektor mit optionalem, C-
terminalem His-Tag, Kanr
Novagen (Heidelberg)
pET-24d(+) Expressionsvektor mit optionalem, C-
terminalem His-Tag, Kanr
Novagen (Heidelberg)
pET-24b(+)-jHmd pET-24b(+), in den das hmd-Gen aus
M. jannschii kloniert wurde
[48]
pET-24b(+)-kHmd pET-24b(+), in den das hmd-Gen aus
M. kandleri kloniert wurde
[54]
pET-24b(+)-fHmd pET-24b(+), in den das hmd-Gen aus
M. fervidus kloniert wurde
Diese Arbeit
pET-24d(+)-aHmd pET-24d(+), in den das hmd-Gen aus
M. arboriphilus kloniert wurde
Transmit (Marburg)
ZAP Express λ-Vektor, enthält pBK-CMV, Kanr Stratagene (Amsterdam)
pBK-CMV Klonierungsvektor für DNA-Einschübe
bis 12 kb, Kanr
Stratagene (Amsterdam)
Material und Methoden 19
Tabelle 2: Verwendete E.-coli-Stämme
Stamm Genotyp Referenz
DH5α supE44 ∆lac U169 (Φ80lacZ∆M15)
HsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
Invitrogen (Groningen)
XL1 Blue MRF’ ∆mcrA183 ∆(mcrCD-hsdSMR-mrr)173
endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1
lac [F’ proABlacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)] Su-
(nonsuppressing)λr (lambda resistant)
Stratagene (Amsterdam)
XLOLR ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173
endA1 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F’
proAB lacIqZM∆15 Tn10 (Tetr)] Su-
(nonsuppressing)λr (lambda resistant)
Stratagene (Amsterdam)
BL21 (DE3) F- ompT hsdS (rB-mB
-) gal dcm (DE3) Novagen (Heidelberg)
HMS 174 (DE3) RecA1 hasdR rifr (DE3) Novagen (Heidelberg)
3.1.4. Medien
Tabelle 3 : Medien zur Stammhaltung und Kultivierung der E.-coli-Stämme
Name Komponente Menge pro Liter
Trypton 10 g
Hefeextrakt 5 g
LB-(Luria Bertani)-
Medium
NaCl 10 g
Trypton 20 g
Hefeextrakt 15 g
NaCl 8 g
Na2HPO4 2 g
TP-(Trypton-
Phosphat)- Medium
KH2PO4 1 g
Trypton 2 (w/v) %
Hefeextrakt 0,5 (w/v) %
NaCl 10 mM
KCl 2,5 mM
MgCl2 10 mM
MgSO4 10 mM
SOC-Medium
Glukose 20 mM
NZ-Amine 10 g
Hefeextrakt 5 g
NaCl 5 g
NZY-Medium
MgSO4 2 g
Material und Methoden 20
Alle in Tabelle 3 genannten Nährmedien wurden 20 min bei 121 °C und 2 bar
autoklaviert. Zur Herstellung fester Nährböden erfolgte die Zugabe von 20 g
Agar/Liter. Selektionsmedien wurden je nach Resistenz mit folgenden Antibiotika
versehen:
Ampicillin: 100 µg/ml
Kanamycin: 50 µg/ml
Chloramphenicol: 34 µg/ml
3.2. Molekularbiologische Methoden
3.2.1. Kultivierung von E. coli
Die verwendeten E.-coli-Stämme wurden bei 37 °C in den angegebenen
Medien kultiviert (3.1.4). Übernachtkulturen wurden in Reagenzgläsern in einem
Roller, Flüssigkulturen in Erlenmeyerkolben wurden auf einer Rundschüttelmaschine
bei etwa 130 UpM schüttelnd inkubiert. Agarplatten wurden über Nacht bei 37 °C
inkubiert und anschließend bei 4 °C gelagert. Zur Stammhaltung der Bakterien
wurden Flüssigkulturen mit 20 % (v/v) Glyzerin versetzt und bei -80 °C gelagert.
3.2.2. Herstellung elektrokompetenter Zellen und Elektroporation
Zur Herstellung elektrokompetenter Zellen wurde E. coli in 0,5 l LB-Medium bis
zu einer ∆OD578 von 0,6 bis 0,8 gezogen. Die Kultur wurde anschließend für 15 min
auf Eis gekühlt. Die Zellernte erfolgte mittels Zentrifugation für 20 min bei 4 °C und
5000 UpM. Die sedimentierten Zellen wurden in sterilem, 4 °C kaltem Wasser
resuspendiert und dreimal mit jeweils 500 ml des genannten Wassers gewaschen.
Nach Überführung in ein 50-ml-Reaktionsgefäß wurde das Zellpellet in 50 ml sterilem
Wasser aufgenommen. Nach einem abschließenden Zentrifugationsschritt (20 min,
4 °C, 5000 rpm) wurden die Zellen je nach Größe des Pellets in 1 – 3 ml 20%igem
Glyzerin resuspendiert und zu jeweils 60 µl aliquotiert. Die Lagerung erfolgte bis zur
Transformation bei -80 °C.
Material und Methoden 21
Zur Transformation wurden elektrokompetente Zellen zu je 60 µl auf Eis
aufgetaut. Die zu transformierende DNA (1 – 5 µl) wurde zuvor auf einem
Membranfilter für 30 min dialysiert und dann zu den Zellen gegeben. Die Zellen
wurden zusammen mit der DNA in sterile Elektroporationsküvetten (BioRad,
München) mit 1 mm Spaltenbreite überführt. Die Transformation erfolgte im
GenePulserII (BioRad, München) bei 1,8 kV, 225 Ω und 25 µF. Im direkten
Anschluss wurden 250 µl, auf 37 °C erwärmtes SOC-Medium zugegeben. Die
Suspension wurde 1 h bei 37 °C im Thermoblock schüttelnd inkubiert. Nach der
Inkubation wurden die Zellen auf Selektivagarplatten plattiert und über Nacht bei
37 °C inkubiert. Zur Kontrolle der Transformanden wurden am Folgetag je 4 ml LB-
Medium mit Kolonien beimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag
wurde die Plasmid-DNA isoliert und mit PCR überprüft.
3.2.3. Plasmidpräparation, Restriktion und Gelelektrophorese
Plasmid-DNA wurde aus 4-ml-Kulturen mit Hilfe des Qiagen-Spin-Miniprep-Kits
(Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert. Die Konzentration und
Reinheit der DNA wurde fotometrisch mit einem LKB-Ultrospec-II-Fotometer
(Pharmacia, Freiburg) bei 260 nm und 280 nm bestimmt. Ein ∆A260-Wert von 1
entspricht einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml. Die Restriktion von Plasmid-DNA
erfolgte in einem Ansatz von 60 µl. Je nach Plasmidgröße wurden 1 – 5 µg DNA mit
Restriktionsenzym und Puffer entsprechend der Herstellerangaben gemischt und für
3 h bei 37 °C inkubiert.
Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte mittels 1%iger Agarosegele in
TAE-Puffer (40 mM Tris/Azetat, pH 8,0, 1 mM EDTA). Als Größenstandard diente der
Smart-Ladder-Marker (Eurogentec, Seraing, Belgien). Nach der Elektrophorese
wurden die DNA-Fragmente in Ethidiumbromidlösung (2 µg/ml Wasser) gefärbt, kurz
gewässert und im UV-Durchlicht bei 302 nm fotografiert. Zur Extraktion der DNA-
Fragmente aus den Agarosegelen wurde das QIAquick-Extraktionskit genutzt
(Qiagen, Hilden). Für die Ligation wurde T4-DNA-Ligase nach Angaben des
Herstellers verwendet (Fermentas, St. Leon).
Material und Methoden 22
3.2.4. Polymerasekettenreaktion (PCR)
In der vorliegenden Arbeit diente die PCR häufig zur Kontrolle des
Vorhandenseins langer DNA-Sequenzen (4000 bis 5000 Basenpaare). Daher wurde
eine besonders lange Elongationszeit gewählt.
Tabelle 4: PCR-Programm zur Amplifikation von 4 – 5 kb großen Sequenzen
Zyklenzahl Reaktion Temperatur (°C) Zeit (s)
1 Denaturierung 95 300
30 Denaturierung 95 30
Hybridisierung 55 30
Elongation 72 900
1 Elongation 72 1800
1 Aufbewahrung 4 _
3.3. Sequenzierung der hmd-Gene aus Methanothermus fervidus und Methanobrevibacter arboriphilus
Zur Durchsicht der Phagenbänke der chromosomalen DNA von M. fervidus und
M. arboriphilus wurde das ZAP-Express-Vektor-Kit (Stratagene, Amsterdam) benutzt.
3.3.1. Plattierung der Phagengenbank und Membrantransfer
50 ml LB-Medium mit Tetrazyklin wurde mit 500 µl 1 M MgSO4, 500 µl 20%iger
Glucoselösung und 50 µl XL-1-Blue-MRF’-Vorkultur versetzt und bis zu ∆OD578 = 0,5
schüttelnd bei 37 °C inkubiert. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation für 15 min
bei 5000 UpM. Die Zellen wurden in 10 mM MgSO4 bis zu ∆OD578 = 0,5
resuspendiert.
Die Phagengenbank besteht aus einer Phagensuspension, wobei ein Phage
etwa 8 kb der partiell verdauten genomischen DNA von M. fervidus oder
M. arboriphilus trägt. Die Phagengenbank wurde auf eine Konzentration von
250 pfu/µl mit SM-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,01 % Gelatine, 0,1 M NaCl,
0,008 M MgSO4) verdünnt. Es wurden 4 µl Phagensuspension mit 600 µl XL-1-Blue-
MRF’-Suspension vermischt und für 15 min bei 37 °C inkubiert. Die Zell-Phagen-
Material und Methoden 23
Suspension wurde mit 6,5 ml NZY-Top-Agar (0,7 % Agarose in NZY-Medium, auf
50 °C erwärmt), 60 µl 1 M MgSO4 und 60 µl 20 % (w/v) Maltose vermischt und sofort
auf NZY-Agarplatten gegossen. Nach dem Erhärten des NZY-Topagars wurden die
Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag zeigte sich ein
gleichmäßiger Bakterienrasen mit etwa 1000 Löchern pro Platte. Am Folgetag
wurden die Platten zwei Stunden bei 4 °C gekühlt und für 2 min mit einer Hybond-N-
Membran (GE Healthcare, Freiburg) bedeckt. Die Membran wurde für 2 min mit
Denaturierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH), für 5 min mit
Neutralisierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris/HCl, pH 8,0) und dann zweimal 2 min
mit Waschlösung (0,3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, 0,2 M Tris/HCl, pH 7,5) bedeckt. Die
Membran wurde getrocknet und im UV-Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, USA)
mit zweimal 120000 µJ bestrahlt. Die Membran wurde dann in 25 ml
Prähybridisierungslösung (0,75 M NaCl, 0,075 M Na-Citrat, 0,1 % Laurylsarkosin,
0,02 % SDS) und 1 % (w/v) Blockierungslösung (1 % (w/v) Blockierungsreagenz,
0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) für 1,5 h bei 70 °C inkubiert. Zur
Hybridisierung wurden 2,5 µl Digoxigenin-markierte Sonde (10 pmol/ml) zugegeben
und über Nacht bei 70 °C inkubiert. Am Folgetag wurde die Membran zweimal für
15 min bei 70 °C in 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat, danach für 5 min in Waschpuffer
(0,3 % Tween 20, 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) und dann 30 min in 1 %
(w/v) Blockierungslösung bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde 5 µl mit
alkalischer Phosphatase konjugierter Antidigoxygenin-Antikörper zugegeben und für
weitere 30 min inkubiert. Danach wurde die Membran zweimal für 15 min mit
Waschpuffer gewaschen und anschließend in alkalischem Puffer (0,1 M Tris/HCl,
pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2) aufbewahrt.
3.3.2. Detektion der hybridisierten DNA
Zur Detektion wurde die Membran auf Klarsichtfolie gelegt, mit 1 ml 0,25 mM
CSPD-Lösung (Roche, Mannheim) und einer zweiten Lage Klarsichtfolie bedeckt und
für 5 min bei 37 °C inkubiert. CSPD wird von alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert, wobei ein metastabiles Intermediat entsteht, das langsam zerfällt
und dabei Licht emitiert. Die Lumineszenz wurde durch 40-minütiges Auflegen von
Biomax-XAR-Röntgenfilm (Kodak, Stuttgart) bei Raumtemperatur detektiert. Nach
dem Entwickeln wurden die Röntgenfilme (Abb. 7) mit den NZY-Topagarplatten
Material und Methoden 24
verglichen, um die Löcher zu ermitteln, die den Flecken auf den Röntgenfilmen
entsprachen. Sogenannte positive Plaques entsprachen also jeweils einem
Phagenklon, dessen eingebaute DNA mit der Sonde für das konservierte hmd-Gen
des jeweiligen Organismus hybridisierte.
Abb. 7: Detektion von Phagen, die das hmd-Gen tragen mittels Röntgenfilm. Die schwarzen
Flecken stammen von Phagen, deren DNA mit der DNA-Sonde für das hmd-Gen aus M. fervidus oder
M. arboriphilus hybridisierte. Durch Vergleich des Röntgenfilms und der urspünglichen Agarplatte mit
den Phagenplaques konnten diejenigen Plaques identifiziert werden, die für die Hybridisierung
verantwortlich waren und somit das hmd-Gen enthielten.
3.3.3. Phagenisolation
Positive Plaques wurden samt Agar mit einer sterilen Plastikspitze
ausgestochen und in 500 µl SM-Puffer und 20 µl Chloroform überführt. Das Gemisch
wurde für 30 s geschüttelt und dann für 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
nochmaligem Schütteln wurde die Suspension für 5 min in der Tischzentrifuge bei
Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand, die Phagensuspension, wurde
bei 4 °C aufbewahrt.
Material und Methoden 25
3.3.4. Ausschneiden des Phagemids pBK-CMV und Transformation
E.-coli-XL1-Blue-MRF’- und E.-coli-XLOLR-Zellen wurden, wie in 3.3.1 für
E. coli XL1-Blue-MRF’ beschrieben, kultiviert und mit 10 mM MgSO4 auf
∆OD578 = 1,0 resuspendiert. In einem sterilen Plastikgefäß wurden 200 µl XL1-Blue-
MRF’-Zellsuspension und 250 µl Phagensuspension (siehe 3.3.3) mit 1 µl ExAssist-
Helferphagensuspension gemischt und für 15 min bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe
von 3 ml LB-Medium, 30 µl 1 M MgSO4 und 30 µl 20 % (w/v) Maltose wurde die
Suspension weitere 3 h bei 37 °C inkubiert und danach für 20 min auf 65 °C erwärmt.
Dann wurde die Suspension für 15 min bei Maximalgeschwindigkeit in der
Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand wurde in ein steriles Gefäß überführt.
Während der Inkubation bei 37° C fand eine Koinfektion von Phage und Helferphage
statt. Der Helferphage schnitt das Phagemid pBK-CMV samt eingebauter DNA aus
dem Phagenvektor ZAP Express aus. Bei 65 °C lysierten die Zellen und setzten das
Phagemid frei. Zu jeweils 100 µl der Phagemidlösung wurden 200 µl XLOLR-
Zellsuspension gegeben und das Gemisch wurde für 15 min bei 37 °C inkubiert.
Dann wurden 300 µl NZY-Medium zugegeben und es wurde weitere 45 min bei
37 °C inkubiert. Jeweils 100 µl der Zellsuspension wurden auf LB-Kanamyzin-Platten
plattiert und die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Das Phagemid pBK-
CMV mit eingebauter DNA wurde aus den Zellen, wie in 3.2.3 beschrieben, mittels
Plasmidpräparation gereinigt.
3.3.5. Kontroll-PCR zur Überprüfung der eingebauten DNA und Sequenzierung
Zur Kontrolle des Vorhandenseins des hmd-Gens im Phagemid pBK-CMV
wurde eine PCR mit Primern für die konservierte Region des hmd-Gens
durchgeführt. Pro Reaktion (Reaktionsvolumen = 50 µl) wurden 50 pmol jedes
Primers, 1,35 U Taq-Polymerase, 2 mM MgCl2, 0,2 mM jedes dNTPs und 100 ng
Plasmid-DNA eingesetzt. Für diese Kontroll-PCR wurde die in 3.2.4 genannte
Elongationszeit auf 90 s reduziert. Die amplifizierte DNA wurde mittels
Agarosegelelektrophorese detektiert und entsprach der erwarteten Größe
(400 Basenpaare). Zur Lokalisation des hmd-Gens (etwa 1000 Basenpaare) in der
eingebauten DNA (etwa 8000 Basenpaare) wurden die flankierenden Sequenzen zu
Material und Methoden 26
beiden Seiten des hmd-Gens amplifiziert. Hierzu wurden Primerpaare verwendet,
von denen ein Primer mit einem Ende der konservierten Region des hmd-Gens, aus
dem Gen herauszeigend, hybridisierte und der andere mit der bekannten
Vektorsequenz vor oder hinter der eingebauten DNA. Das PCR-Programm entsprach
dem in 3.2.4 genannten Programm. Die amplifizierte DNA wurde durch
Agarosegelelektrophorese detektiert. Anhand der Größe der amplifizierten DNA
konnte die Position des hmd-Gens in der eingebauten DNA bestimmt werden. Es
wurden jeweils drei Klone für jedes der beiden hmd-Gene untersucht. Bei jeweils
einem Klon war die PCR der flankierenden Bereiche erfolgreich. Die Länge betrug
3000 und 4500 Basenpaare (fhmd) (Abb. 8) bzw. jeweils 4000 Basenpaare (ahmd).
Die Klone wurden sequenziert (Agowa, Berlin).
Abb. 8: PCR zur Amplifikation des fhmd-Gens und seiner flankierenden Regionen zur Lokalisation des fhmd-Gens. M: Markerspur, Spur 1: Amplifikation der eingebauten DNA
einschließlich des fhmd-Gens im Phagemid pBK-CMV (7500 Basenpaare). Spur 3: Amplifikation der in
Leserichtung vor dem fhmd-Gen liegenden Region (3000 Basenpaare). Spur 4: Amplifikation der in
Leserichtung hinter dem fhmd-Gen liegenden Region (4500 Basenpaare). Die beiden amplifizierten
Regionen sind in der Summe genauso groß wie die insgesamt eingebaute DNA.
3.3.6. Vergleich aller bekannten hmd-Gensequenzen
Die Sequenzierung und Klonierung der hmd-Gene aus M. fervidus und
M. arboriphilus erfolgte nicht aus praktischen Erwägungen, also wegen des
Vorhandenseins von Genbänken, sondern wegen der nahen Verwandtschaft der
Material und Methoden 27
beiden Organismen zu M. marburgensis. Natives mHmd-Holoenzym konnte seit
Jahren reproduzierbar kristallisiert werden. Jedoch verhinderten die perfekte
merohedrale Zwillingskristallbildung sowie eine hohe thermische Flexibilität die
Strukturlösung [60]. Es wurde postuliert, dass die Aminosäuresequenzen von aHmd
und fHmd ähnlich derjenigen von mHmd seien, sodass möglicherweise die
entsprechenden rekonstituierten Hmd-Holoenzyme sich ähnlich gut kristallisieren
ließen wie mHmd-Holoenzym, aber wegen der Unterschiede in der
Aminosäuresequenz nicht die gleichen kristallografischen Probleme auftreten würden
wie im Fall von mHmd.
Abb. 9 zeigt die Abgleichung der Hmd-Aminosäuresequenzen aus
M. marburgensis, M. jannaschii, M. kandleri, M. thermolithotrophicus, M. maripaludis,
M. voltae, M. fervidus und M. arboriphilus. Alle für die Bindung des Hmd-Kofaktors
wichtigen Aminosäuren (siehe Ergebnisteil) sind auch in den beiden neuen Hmd-
Sequenzen konserviert: Das GAG-Motif zur Bindung des Mononukleotides (rot
gefärbt), Cystein 176 (gelb), das den Schwefelliganden des Eisens stellt, Aspartat 64,
Prolin 65, Aspartat 135, Leucin 149 (Phenylalanin bei mHmd und aHmd) und
Prolin 150 (alle rot), die mit dem GMP des Guanylylpyridons interagieren, sowie
Tryptophan 148 (rot), das in π-Wechselwirkung mit dem Pyridon steht. Es finden sich
darüber hinaus zwei konservierte Histidine (His14 und His201) und ein konserviertes
Lysin (Lys151) (alles grün gefärbt), die als mögliche Basen bei der Reaktion von [Fe]-
Hydrogenase in Frage kommen könnten (siehe Ergebnisteil).
Bei den Vertretern der Methanococcales (M. jannaschii, M. maripaludis,
M. voltae und M. thermolithotrophicus) finden sich die konservierten Cysteine 66,118
und 322 (nicht eingefärbt). Die [Fe]-Hydrogenase-Apoenzyme der Methanococcales
sind sauerstoffempfindlich. Es ist denkbar, dass diese zusätzlichen Cysteine im Fall
der Methanococcales Disulfidbrücken ausbilden könnten, die zu einer Präzipitation
der Apoenzyme führen (siehe Diskussion).
Alle Zahlenangaben beziehen sich auf die hmd-Sequenz von M. jannaschii.
Material und Methoden 28
Abb. 9: Vergleich der Aminosäuresequenzen von [Fe]-Hydrogenase aus verschiedenen Organismen. Rot: Konservierte Aminosäuren, die an der Bindung des GMP-Teils von
Guanylylpyridon beteiligt sind; gelb: konserviertes Cystein 176, das den Liganden an das Eisen stellt
(siehe Ergebnisteil); grün: konservierte Histidin 14 und 201 sowie Lysin 151, die mögliche
Protonenakzeptoren bei der Reaktion darstellen (siehe Ergebnisteil); dunkelgrau: alle übrigen
konservierten Aminosäuren. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen von aHmd und fHmd zeigt,
dass alle zuvor bekannten konservierten Aminosäuren auch in diesen Sequenzen zu finden sind.
Material und Methoden 29
Tabelle 5 listet die paarweisen Sequenzidentitäten der Aminosäuresequenzen
von [Fe]-Hydrogenase aus den oben genannten Organismen auf. Hierbei zeigt sich,
dass die Hmd-Sequenzen sich umso mehr ähneln je näher die Organismen
phylogenetisch miteinander verwandt sind. Beispielweise zeigt die
Aminosäuresequenz von Hmd aus M. kandleri nur wenig mehr als 50 %
Übereinstimmung zu allen anderen Hmd-Aminosäuresequenzen auf, da M. kanderli
der einzige Vertreter der Methanopyrales ist. Die Hmd-Sequenzen von
M. marburgensis, M. fervidus und M. arboriphilus sind dagegen zu mehr als 70 %
identisch. Alle gehören zu den Methanobacteriales. Ebenfalls hohe
Sequenzidentitäten von über 70 % ihrer Hmd-Gene zeigen die Vertreter der
Methanococcales: M. maripaludis, M. voltae, M. thermolithotrophicus und
M. jannaschii.
Tabelle 5: Paarweise Sequenzidentitäten der Aminosäuresequenzen von [Fe]-Hydrogenase aus mehreren Organismen (Prozent identische Aminosäuren)
3.3.7. Klonierung der hmd-Gene in Expressionsvektoren
Das hmd-Gen aus M. arboriphilus wurde von Transit (Marburg) in den
Expressionsvektor pET-24d(+) kloniert. Das hmd-Gen aus M. fervidus wurde in
dieser Arbeit in den Expressionsvektor pET-24b(+) kloniert. Hierzu wurde folgendes
Primerpaar (Thermoelectron, Ulm) verwendet:
Organismus M. arbori-
philus
M. fervidus M. jannaschii M. maripa
-ludis
M. voltae M. thermo
-litho.
M. kandleri M. marbur
-gensis
M. arboriphilus 100 73 61 58 63 61 53 78 M. fervidus 100 64 60 63 63 55 78 M. jannaschii 100 73 73 78 57 62 M. maripaludis 100 83 83 52 58 M. voltae 100 82 56 62 M. thermolitho. 100 55 60 M. kandleri 100 54 M. marburgensis 100
Material und Methoden 30
Primer in Kodierungsrichtung:
5’-GGATCCTTATTTCTTTTCTTTTTCTAAGTATTTAAATACAGTAGG-3’
Primer in Antikodierungsrichtung:
5’-CATATGGAAATAAAAAAAGTTGCAATATTAGGAGC-3’
Der Primer in Kodierungsrichtung enthielt eine BamHI-Schnittstelle und der
Primer in Antikodierungsrichtung eine NdeI-Schnittstelle (rot markiert). Die PCR-
Reaktion zur Amplifikation des fhmd-Gens (Reaktionsansatz = 50µl) enthielt 50 pmol
jedes Primers, 1,25 U Phusion-Polymerase (BioCat, Heidelberg), 0,2 mM jedes
dNTPs und einfach konzentrierten Phusionpuffer. Phusion-Polymerase erzeugt glatte
Enden und hat eine 3’-5’-Exonukleaseaktivität. Das PCR-Programm entsprach dem
in 3.2.4 beschriebenen Programm, wobei die Elongationszeit auf 120 s reduziert
wurde. Das PCR-Produkt wurde mittels Agarosegelelektrophorese detektiert und mit
dem QIAquick-Extraktionskit (Qiagen, Hilden) aus dem Gel extrahiert. Mittels des Kits
Zero Blunt PCR Cloning (Invitrogen, Groningen) wurde das PCR-Produkt in den
Vektor pCR Blunt kloniert. Hierzu wurde 1 µl der Vektor mit 1,5 µl PCR-Produkt
(entsprach 70 ng DNA), 4 U T4-DNA-Ligase und einfach konzentriertem
Ligationspuffer in einem Gesamtvolumen von 10 µl 1 h bei 18 °C inkubiert. Zu 50 µl,
auf Eis aufgetauten, E.-coli-TOP-10-Zellen (Invitrogen, Groningen) wurde 2 µl
Ligationsreaktion gegeben, durch kurzes Rühren mit der Pipettenspitze vermengt
und 30 min auf Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen für 45 s bei 42 °C einem
Hitzeschock unterzogen und danach sofort 2 min auf Eis gekühlt. Es wurde 250 µl
TP-Medium zu den Zellen gegeben und die Zellsuspension wurde für 1 h bei 37 °C
inkubiert. Dann wurden je 10 µl und 100 µl der Zellsuspension auf LB-Platten mit
Kanamyzin plattiert und die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am
Folgetag wurde je 4 ml LB-Medium mit Kanamyzin mit Kolonien der Platten beimpft
(siehe 3.2.1). Mittels Plasmidpräparation (siehe 3.2.3) wurde der Vektor pCR Blunt
mit dem hmd-Gen isoliert. Dann wurden der Vektor pCR-Blunt mit hmd-Gen und der
Vektor pET-24b(+) mit den Restriktionsenzymen BamHI und NdeI geschnitten.
Hierzu wurden 4 U BamHI, 4 U NdeI, zweifach konzentrierter Tango-Puffer, 1 U
Antarktische Phosphatase, einfach konzentrierter Phophatasepuffer (Fermentas,
St. Leon) und 3 µg Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 50 µl für 3 h bei
37 °C inkubiert. Phosphatase und Phosphatasepuffer wurden nur im Fall von pET-
Material und Methoden 31
24b(+) eingesetzt. Mittels des QIAquick-Extraktionskits (Qiagen, Hilden) wurden der
geschnittene und dephosphorylierte Vektor pET-24b(+) und das hmd-Gen aus einem
Agarosegel extrahiert. Dann wurden 10 ng Vektor, 150 ng hmd-Gen, 4 U T4-DNA-
Ligase und einfach konzentrierter Ligationspuffer in einem Gesamtvolumen von 20 µl
über Nacht bei 18 °C inkubiert. Am Folgetag wurden der ligierte Vektor pET24b(+)-
fhmd durch Transformation, wie in 3.2.2 beschrieben, in elektrokompetente E.-coli-
Bl21-(DE3)-Zellen eingebracht.
3.3.8. Überexpression der fhmd- und ahmd-Gene
Es wurden 5 ml LB-Medium mit Kanamyzin und E. coli BL21 (DE3) mit
pET24b(+)-fhmd oder pET24d(+)-ahmd beimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Am Folgetag wurden 100 ml TP-Medium mit Kanamyzin mit der Vorkultur beimpft
und bis zu einer ∆OD578 = 1 kultiviert. Durch Zugabe von IPTG
(Endkonzentration = 1 mM) wurde die Expression des hmd-Gens induziert. Zu den
Zeitpunkten 0 h, 1 h, 2 h und 3 h wurde jeweils 1 ml Kultur entnommen und mittels
der Tischzentrifuge bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert. Die Zellpellets wurden
in jeweils so viel 50 mM Kaliumphophatpuffer, pH 7,0, aufgenommen, dass eine
OD578 = 4 erzielt wurde. Drei Stunden nach Induktion wurden die restlichen Zellen
der Kultur durch Zentrifugation für 20 min bei 12000 UpM sedimentiert, in anaerobem
Tris/HCl-Puffer, 50 mM, pH 7,8, 1 mM DTT resuspendiert und im Anaerobenzelt
mittels Ultraschall geöffnet. Der Zellextrakt wurde dann für 45 min bei 40000 UpM
zentrifugiert. Das Ultrazentrifugationspellet wurde im oben genannten Tris/HCl-Puffer
resuspendiert. Weder im Ultrazentrifugationsüberstand noch im resuspendierten
Ultrazentrifugationspellet noch im Zellextrakt konnte [Fe]-Hydrogenase-Aktivität
(siehe 3.4.4) nachgewiesen werden. Die verschiedenen Proben wurden mittels SDS-
Gelelektrophorese analysiert. Dabei zeigte sich eine deutliche Überproduktion von
fHmd und aHmd. Allerdings lag das [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym ausschließlich im
resuspendierten Ultrazentrifugationspellet und somit als unlösliche Einschlusskörper
vor. Auf Experimente zur Rückfaltung der Proteine aus den Einschlusskörpern wurde
verzichtet, da zur gleichen Zeit die Strukturaufklärung der rekonstituierten [Fe]-
Hydrogenase aus M. jannaschii gelang, womit die Rekonstitution von [Fe]-
Hydrogenase aus M. arboriphilus und M. fervidus im Rahmen dieser Arbeit keine
Bedeutung mehr hatte (siehe auch Error! Reference source not found.).
Material und Methoden 32
Abb. 10: Heterologe Produktion von aHmd-Apoenzym in E. coli. Spur M: Marker, Spur 1:
Zellextrakt vor Induktion, Spur 2: Zellextrakt 4 h nach Induktion; Spur 3:
Ultrazentrifugationsniederschlag; Spur 4: Ultrazentrifugationsüberstand.
3.4. Reinigung von [Fe]-Hydrogenase
3.4.1. SDS-Polyakrylamidgelelektrophorese
Zur denaturierenden Auftrennung von Proteingemischen wurde die
diskontinuierliche Polyakrylamidgelektrophorese nach Laemmli [62] verwendet. Dazu
wurden 12%ige SDS-Polyakrylamidgele benutzt. Die Elektrophorese wurde in der
Elektrophoreseapparatur Mini Protean II (Biorad, München) durchgeführt.
Tabelle 6: Zusammensetzung der SDS-Gele.
Lösung Trenngel Sammelgel
1 M Tris/HCl, pH 8,8, 1 % SDS 1850 µl -
1 M Tris/HCl, pH 6,8, 1 % SDS - 193,5 µl
Wasser 1000 µl 1200 µl
40 % Akrylamid / 1,1 % Bisakrylamid 1350 µl 255 µl
100 % TEMED 5 µl 5 µl
10 % APS 21 µl 6 µl
Die Proteinproben wurden vor der Elektrophorese mit SDS-Probenpuffer
(63 mM Tris/HCl, pH 6,8, 2 % (w/v) SDS, 10 % (w/v) Glyzerin, 16 mM Dithiothreitol,
0,01 % (w/v) Bromphenolblau) 1:2 verdünnt und für 5 min bei 95 °C denaturiert. Von
Material und Methoden 33
jeder Probe wurden 10 – 20 µl pro Geltasche aufgetragen und eine Spannung von
150 – 200 V angelegt bis der Marker das untere Ende des Gels erreichte. Als
Elektrolyt diente ein Tris/Glyzerin-Puffersystem (25 mM Tris/HCl, pH 8,8, 192 mM
Glyzin, 0,1 % (w/v) SDS). Als Molekularmassenstandard wurde der HMW-SDS
Marker (GE Healthcare, Freiburg) verwendet. Nach Beendigung der Elektrophorese
wurden die Gele für 2 h bei Raumtemperatur in 0,05 % (w/v) Coomassie Brillantblue
R250, 0,05 % (w/v) Crocein Scarlet 7B und 0,5 % (w/v) CuSO4, 25 % (v/v)
Isopropanol und 10 % Eisessig gefärbt. Das Entfärben erfolgte mit 0,5 % (w/v)
CuSO4, 12 % Isopropanol und 7 % Eisessig.
3.4.2. Reinigung von heterologem [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym
E.-coli-Stämme mit den in 3.1.3 genannten Plasmiden und den darin geklonten
hmd-Genen wurden in 1,5 l TP-Medium mit Kanamyzin aerob kultiviert. Bei
∆OD578 = 1 wurde durch Zugabe von IPTG die Expression des hmd-Gens induziert.
Nach 3,5 h wurden die Zellen geerntet durch Zentrifugation für 20 min bei 5000 UpM
sedimentiert und in Anaerobenzelte überführt. Dort wurden die Zellen in anaerober
0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert und nochmals wie oben beschrieben
sedimentiert. Dann wurden die Zellen in 50 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,8, 1 mM
DTT resuspendiert und es wurden 0,8 ml DNase-I-Lösung (1 mg/ml) und 0,2 ml 2 M
MgCl2-Lösung zugegeben. Die Zellen wurden dann mittels Ultraschall im
Anaerobenzelt geöffnet. Der Zellextrakt wurde zur Abtrennung der
Membranbestandteile für 45 min bei 40000 UpM zentrifugiert. Auch die folgenden
Reinigungsschritte wurden unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Der
Ultrazentrifugationsüberstand wurde im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus
M. jannaschii (jHmd-Apoenzym) im Wasserbad für 20 min bei 70 °C erhitzt. Im Fall
von Hmd aus M. kandleri (kHmd-Apoenzym) wurde der Zellextrakt zunächst mit
Ammoniumsulfat versetzt (Endkonzentration = 2 M) und dann für 30 min bei 80 °C
erhitzt. Präzipitiertes E.-coli-Protein wurde anschließend durch Zentrifugation für
20 min bei 12000 UpM sedimentiert. Im Falle von jHmd-Apoenzym wurde der
Überstand nach der Hitzefällung mit Ammoniumsulfat versetzt
(Endkonzentration = 2 M) und durch einen 0,45-µm-Filter filtriert. Die Proteinlösung
wurde bei beiden Apoenzymen auf die mit 50 mM MOPS/KOH, pH 7,0 und 2 M
Ammoniumsulfat, 1 mM DTT äquilibrierte Säule Hi Load Phenylsepharose (GE
Material und Methoden 34
Healthcare, Freiburg) aufgetragen. Die Säule wurde zunächst solange mit dem
Auftragspuffer gewaschen, bis keine erhöhte UV-Absorption durch Nukleinsäuren
mehr erkennbar war. Das adsobierte Protein wurde bei einer Flussrate von 5 ml/min
mit einem linear abnehmenden Salzgradienten (2 M NH4SO4 bis 0 M NH4SO4)
eluiert. Die Fraktionsgröße betrug 5 ml. jHmd-Apoenzym und kHmd-Apoenzym
eluierten zwischen 0,7 M und 0,2 M NH4SO4. Die Fraktionen wurden mittels SDS-
Polyakrylamidgelelektrophorese auf ihre Reinheit überprüft (Abb. 11). Die spezifische
Aktivität wurde durch Rekonstitution mit FeGP-Kofaktor gemessen (siehe 3.4.4).
Fraktionen, die den höchsten [Fe]-Hydrogenase-Apoenzymanteil zeigten, wurden
anschließend vereinigt und in einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer
Ausschlussgrenze von 10 kDa (Amicon, Witten) zu einer Endkonzentration von etwa
80 mg/ml konzentriert. Dabei wurde in 10 mM MOPS/KOH, pH 7,0, 1 mM DTT
umgepuffert. Gereinigtes [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym wurde aliquotiert und bis zur
Rekonstitution bei -80 °C aufbewahrt.
Abb. 11: SDS-PAGE zur Reinigung von heterologem [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. jannaschii. Spur M: Marker; Spur 1: Ultrazentrifugationsüberstand; Spur 2: Überstand nach
Hitzefällung; Spur 3: Vereinigte Fraktionen nach Phenylsepharose
3.4.3. Reinigung von nativem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus M. jannaschii
Pro Reinigung wurden 40 g Zellen von M. jannaschii in etwa 150 ml anaerobem
50 mM Kaliumphophatpuffer, pH 7,0, 0,8 ml DNase-I-Lösung (1 mg/ml) und 0,2 ml
2 M MgCl2-Lösung resuspendiert und im Anaerobenzelt mittels Ultraschall geöffnet.
Zur Abtrennung von Membranbestandteilen und Zelltrümmern wurde für 45 min bei
40000 UpM zentrifugiert. Der Ultrazentrifugationsüberstand wurde mit
Material und Methoden 35
Ammoniumsulfat versetzt (Endkonzentration = 40 % Sättigung). Präzipitiertes Protein
wurde durch Zentrifugation für 20 min bei 12000 UpM abgetrennt. Der
Zentrifugationsüberstand wurde dann mit Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration
von 53 % Sättigung versetzt. Es folgte ein zweiter Zentrifugationsschritt wie oben
beschrieben. Der Zentrifugationsüberstand wurde dann auf die mit 50 mM Tris/HCl-
Puffer und 1 M Ammoniumsulfat äquilibrierte Säule Phenyl-Sepharose (GE
Healthcare, Freiburg) gegeben. Adsorbiertes Protein wurde mit einer Flussrate von
5 ml/min mit linear fallendem Salzgradienten (1 M bis 0 M Ammoniumsulfat) eluiert.
[Fe]-Hydrogenase-Holoenzym eluierte zwischen 0,8 M und 0,4 M Ammoniumsulfat.
Die Fraktionen (Fraktionsgröße 5 ml) wurden auf [Fe]-Hydrogenase-Aktivität getestet.
Die Fraktionen, die [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym enthielten, wurden vereinigt.
Mittels einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa
(Amicon, Witten) wurde in 20 mM Mes/NaOH-Puffer, pH 6,0 umgepuffert. Die
Proteinlösung wurde dann auf die mit 20 mM Mes/NaOH-Puffer, pH 6,0, äquilibrierte
Säule Resource Q (GE Healthcare, Freiburg) aufgetragen. Adsorbiertes Protein
wurde mit einer Flussrate von 5 ml/min und linear steigendem Salzgradienten (0 M
NaCl bis 1 M NaCl) eluiert. [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym eluierte zwischen 0,4 M
und 0,6 M NaCl. Die Fraktionen, die [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym enthielten,
wurden vereinigt. Mittels einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer Ausschluss-
grenze von 10 kDa (Amicon, Witten) wurde in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0,
umgepuffert. Die Proteinlösung wurde dann auf die mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer,
pH 7,0, äquilibrierte Säule Hydroxyapatit (GE Healthcare, Freiburg) aufgetragen.
Adsorbiertes Protein wurde mit einer Flussrate von 2 ml/min und linear steigender
Puffermolarität (10 mM bis 500 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0) eluiert. [Fe]-
Hydrogenase-Holoenzym eluierte zwischen 200 mM und 300 mM Kaliumphophat-
puffer.
Material und Methoden 36
Abb. 12: SDS-PAGE zur Reinigung von nativem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym aus M. jannaschii. Spur M: Marker, Spur 1: Ultrazentrifugenüberstand, Spur 2: Überstand nach 40%iger
Ammoniumsulfatfällung, Spur 3: Überstand nach 53%iger Ammoniumsulfatfällung, Spur 4: Vereinigte
Fraktionen nach Phenylsepharose-Säule, Spur 5: Vereinigte Fraktionen nach Resource-Q-Säule,
Spur 6: Vereinigte Fraktionen nach Hydroxyapatit-Säule, Spur 7: Vereinigte Fraktionen nach
Superdex-200-Säule.
Tabelle 7: Reinigungstabelle zur Reinigung von nativem [Fe]-Hydrogenase–Holoenzym aus M. jannaschii.
Probe Aktivität [U]
Proteinkonzentration[mg/ml]
Spezifische Aktivität [U/mg]
Reinheit Ausbeute [%]
Ultrazentrifugen-Überstand
9850 18,3 8 1 100
Ammoniumsulfatfällung, 40 %, Überstand
6300 15,7 11 1,4 64
Ammoniumsulfatfällung, 53 %, Überstand
5400 10,5 12 1,5 55
Phenylsepharose 4900 3,1 46 6 50
Resource Q 3700 2,3 110 14 38
Hydroxyapatit 2500 1,9 158 20 25
Superdex 200 1950 14,9 190 24 19
Die Fraktionen, die [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym enthielten, wurden vereinigt,
auf etwa 1 ml konzentriert und auf die mit 50 mM MOPS/KOH, pH 7,0, 150 mM NaCl
äquilibrierte Säule Superdex 200 (GE Healthcare, Freiburg) aufgetragen. Protein
wurde mit einer Flussrate von 0,5 ml/min ohne Gradient mit dem
Äquilibrierungspuffer eluiert. Die Fraktionen, die [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym
enthielten, wurden vereinigt. Mittels einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit einer
Material und Methoden 37
Ausschlussgrenze von 10 kDa (Amicon, Witten) wurde die Proteinlösung in 10 mM
Kaliumphophatpuffer, pH 7,0 umgepuffert und schließlich auf etwa 0,5 ml konzen-
triert. Die Reinheit wurde durch SDS-Gelelektrophorese und Messung der spezifi-
schen Aktivität überprüft (Abb. 12).
3.4.4. Bestimmung der spezifischen [Fe]-Hydrogenase-Aktivität
Bestimmung der Proteinkonzentration Die Proteinbestimmung wurde mit dem Roti-Nanoquant-Mikroassay (Roth,
Karlsruhe) durchgeführt. Das Testprinzip beruht auf der Verschiebung des
Absorptionsmaximums von Coomassie Brillantblau G250 in saurer Lösung von
465 nm zu 595 nm durch die Bindung des Farbstoffs an Protein [63]. Die
Proteinproben (0 – 10 µg Protein/0,8 ml) und Rinderserumalbuminlösung als
Standard wurden mit 0,2 ml Farbstofflösung versetzt. Die Absorption bei 595 nm
wurde nach 15 – 30 min Inkubation bei Raumtermperatur mit dem Spektrometer
Ultrospec III (GE Healthcare, Freiburg) gemessen.
[Fe]-Hydrogenase-Aktivitätsmessung Zur Messung von Enzymaktivität wurden die verwendeten Quarzküvetten mit
einer Schichtdicke von 1 cm und einem Volumen von 1,5 ml mit Gummistopfen
verschlossen. Die Gasphase wurde durch mehrmaliges Ent- und Begasen mit
Stickstoffgas anaerobisiert. Die Zugabe von anaeroben Testkomponenten erfolgte
mit Hilfe von Mikroliterspritzen (Macherey-Nagel, Düren). Der Testansatz von 0,7 ml
enthielt 120 mM Kaliumphospatpuffer, pH 6,0, 1 mM EDTA und 20 µl Methylen-
H4MPT. Die Aktivität von nativem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde anhand der
Oxidation von Methylen-H4MPT zu Methenyl-H4MPT+ und molekularem Wasserstoff
bei 40 °C gemessen. Bei [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym wurde zusätzlich zu den
oben genannten Komponenten noch FeGP-Kofaktor in zehnfachem Überschuss zum
Apoenzym zu dem Testansatz gegeben. Die Reaktion wurde in beiden Fällen durch
Zugabe von Methylen-H4MPT gestartet. Die Bildung von Methenyl-H4MPT+ wurde
durch die Absorptionszunahme bei 336 nm (∆ε336 = 21,6 mM-1 x cm-1) fotometrisch
verfolgt [61]. Dabei entspricht 1 Unit der Umsetzung von 1 µmol Methylen-H4MPT zu
Methenyl-H4MPT+ pro Minute.
Material und Methoden 38
Zur Messung der Aktivität von heterologem [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus
M. kandleri wurde die Molarität des oben genannten Kaliumphophatpuffers im
Testansatz auf 1,5 M erhöht.
3.5. Reinigung von FeGP-Kofaktor
Alle Reinigungsschritte erfolgten, soweit nicht anders angegeben, anaerob bei
Rotlicht oder in braunen Glasflaschen und bei 4 °C.
3.5.1. Denaturierung von [Fe]-Hydrogenase und Kofaktorfreisetzung
Je Ansatz wurden 50 mg gereinigte [Fe]-Hydrogenase aus M. marburgensis in
einem Gesamtvolumen von 10 ml unter anaeroben Bedingungen und Rotlicht in
60 % (v/v) Methanol, 1 % Ammoniak und 1 mM Mercaptoethanol im Anaerobenzelt
bei 10 °C gemischt und über Nacht bei 4 °C anaerob außerhalb des Zeltes
denaturiert. Unter diesen Bedingungen wird der FeGP-Kofaktor von [Fe]-
Hydrogenase freigesetzt. Am Folgetag wurde die Lösung für 3 h bei 4 °C in einem
Filterröhrchen mit einer Ausschlussgröße von 10 kDa (Amicon, Witten) bei 5000 UpM
anaerob zentrifugierend filtriert. Die Lösung wurde dann bei 4 °C auf etwa 3 ml durch
Evaporation konzentriert und nochmals für 1 h wie oben beschrieben zentrifugierend
filtriert. Dann wurde die Lösung durch anaerobe Evaporation auf ein Restvolumen
von etwa 50 µl konzentriert und in 500 µl Ammoniumhydrogencarbonatpuffer, pH 9,0
und 10 mM Mercaptoethanol aufgenommen. Bis zur Rekonstitution wurde die FeGP-
Kofaktorlösung bei -80 °C aufbewahrt.
3.5.2. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von FeGP-Kofaktor
UV/Vis-Spektroskopie zur Konzentrationsbestimmung UV/Vis-Spektren zur Konzentrationsbestimmung des FeGP-Kofaktors wurden
an dem Diodenarray-Fotometer Specord (Zeiss, Jena) bei Raumtemperatur
gemessen. Dazu wurde FeGP-Kofaktorlösung (mit Ammoniumhydrogenkarbonat-
puffer, pH 9,0 und 10 mM Mercaptoethanol verdünnt) in anaerobisierte Quarzküvet-
Material und Methoden 39
ten mit einer Schichtdicke von 0,3 cm überführt. Die UV/Vis-Spektren wurden in
einem Bereich von 200 – 650 nm aufgenommen. Anhand der Extinktionsdifferenz bei
300 nm, ε300 = 5,56 mM-1xcm -1, Schichtdicke und Verdünnungsfaktor wurde die
FeGP-Kofaktorkonzentration errechnet.
Bestimmung des Eisengehaltes des FeGP-Kofaktors Im Kofaktor gebundenes Eisen wurde duch Inkubation der FeGP-
Kofaktorlösung mit salzsaurer Kaliumpermanganatlösung freigesetzt, mit
Ascorbinsäure zu Fe2+ reduziert und anschließend als Ferrospektralkomplex
nachgewiesen. Im Test wurden 0,4 ml Probe oder Standardlösung (0,1 – 2,5 µg
Eisen) mit 0,2 ml Lösung A versetzt und für 2 h bei 60 °C inkubiert. Nach dem
Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Reaktionsansatz mit 40 µl Lösung B
versetzt und für weitere 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde
die Extinktion bei 562 nm bestimmt. Als Standard wurde eine 1%ige Fe-Lösung
verwendet [64].
Lösung A: 2,25%ige Kaliumpermanganatlösung in 0,6 M HCl
Lösung B: 6,5 mM Ferrospektral
13,1 mM Neocuproin
2 M Ascorbinsäure
5 M Ammoniumacetat
3.6. Rekonstitution von [Fe]-Hydrogenase
Alle Rekonstitutionsschritte erfolgten, soweit nicht anders angegeben, anaerob
bei Rotlicht oder in braunen Glasflaschen.
3.6.1. Rekonstitution ohne Inhibitor
Heterologes [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym von M. jannaschii und M. kandleri
bindet den FeGP-Kofaktor aus M. marburgensis, wodurch rekonstituiertes [Fe]-
Hydrogenase-Holoenzym entsteht, dessen Aktivität genauso hoch ist wie die Aktivität
von nativem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym [48]. Die Bindungsaffinität ist sehr hoch,
Material und Methoden 40
da der extrapolierte, apparente Ks-Wert von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym zu FeGP-
Kofaktor 10 nM [54] beträgt. In der vorliegenden Arbeit wurde [Fe]-Hydrogenase-
Apoenzym mit FeGP-Kofaktor im Verhältnis 1 : 3 ([Fe]-Hydrogenase-Monomer zu
FeGP-Kofaktor) im Anaerobenzelt bei 10 °C in 10 mM MOPS/KOH, pH 7,0, 1 mM
Dithiothreitol gemischt und mit einem Filterröhrchen mit einer Ausschlussgröße von
10 kDa (Amicon, Witten) auf ein Zehntel des Ausgangsvolumens konzentriert (2 ml
auf 200 µl). Dann wurde das Volumen des Konzentrates mit 10 mM MOPS/KOH,
pH 7,0, 1 mM Dithiothreitol wieder auf 2 ml erhöht und wieder konzentriert wie
beschrieben. Nach drei Durchgängen wurde das Volumen mit 10 mM MOPS/KOH,
pH 7,0, 1 mM Dithiothreitol soweit erhöht, dass die Konzentration des rekonstituierten
Holoenzyms 30 mg/ml betrug. Rekonstituiertes [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde
aliquotiert und bei -80 °C aufbewahrt. Das mehrmalige Ankonzentrieren diente dem
Entfernen von möglicherweise vorhandenen niedermolekularen Kontaminationen aus
der ursprünglichen FeGP-Kofaktorpräparation. Nach jedem Durchgang wurde die
spezifische Aktivität des rekonstituierten Holoenzyms gemessen. Die Aktivität blieb
immer konstant und lag immer höher als die Aktivität des nativen [Fe]-Hydrogenase-
Holoenzyms. Somit konnte von einer vollständigen Rekonstitution des [Fe]-
Hydrogenase-Holoenzyms ohne Verlust von einmal gebundenem FeGP-Kofaktor bei
den Waschschritten ausgegangen werden. Bis zur weiteren Verwendung wurde die
[Fe]-Hydrogenase-Lösung bei -80 °C aufbewahrt.
3.6.2. Rekonstitution mit den Inhibitoren CN- oder Cu2+
Die Rekonstitution erfolgte wie in 3.6.1 beschrieben. Rekonstituiertes [Fe]-
Hydrogenase-Holoenzym in einer Endkonzentration von 30 mg/ml entspricht etwa
0,8 mM [Fe]-Hydrogenase-Monomer. Der extrapolierte, apparente Ki von [Fe]-
Hydrogenase-Holoenzym zu Cyanid beträgt 0,1 mM [51]. Daher wurde zum
rekonstituierten, 0,8-millimolaren [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym 100 mM KCN-
Lösung, pH 11,0, in einer Endkonzentration von 3 mM gegeben. Rekonstituiertes,
CN--inhibiertes [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde aliquotiert und bei -80 °C
aufbewahrt. Der extrapolierte, apparente Ki von [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym zu
Cu2+ beträgt 1 µM (Seigo Shima, persönliche Mitteilung). Daher wurde zum
rekonstituierten 0,8-millimolaren [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym 100 mM CuSO4-
Lösung in einer Endkonzentration von 2,4 mM gegeben. Die so hergestellte Lösung
Material und Methoden 41
von [Fe]-Hydrogenase mit Inhibitor (Cu2+ oder CN-) wurde aliquotiert und bei -80 °C
aufbewahrt.
3.6.3. Rekonstitution mit Methenyl-H4MPT+ oder Imidazol
Die Rekonstitution erfolgte wie in 3.6.1 beschrieben. [Fe]-Hydrogenase-
Holoenzym in einer Endkonzentration von 30 mg/ml entspricht etwa 0,8 mM [Fe]-
Hydrogenase-Monomer. Der extrapolierte, apparente Km von [Fe]-Hydrogenase-
Holoenzym zu Methenyl-H4MPT+ beträgt 50 µM [11]. Daher wurde zum
rekonstituierten, 0,8-millimolaren [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym Methenyl-H4MPT+ in
einer Endkonzentration von 3 mM gegeben. Rekonstituiertes, mit Methenyl-H4MPT+
vesetztes [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde aliquotiert und bei -80 °C aufbewahrt.
Der extrapolierte, apparente Ki von Imidazol beträgt etwa 50 – 100 mM (Sonja
Vogt, persönliche Mitteilung). Da Imidazol selbst Pufferkapazität besitzt wurde zur
Kristallisation von mit Imidazol inhibiertem Enzym, das in 3.6.1 beschriebene
rekonstituierte [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym unter den in 3.7.1 beschriebenen
Bedingungen kristallisiert, wobei statt 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 nun 0,05 – 0,2 M
Imidazol/HCl, pH 8,5 eingesetzt wurde.
3.7. Kristallografische Methoden
3.7.1. Proteinkristallisation
Alle Kristallisationsexperimente wurden als Dampfdiffusionsexperimente nach
der Methode des sitzenden Tropfens bei 10 °C im Anaerobenzelt durchgeführt (im
Fall von [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym unter Rot- statt Weißlicht). Zur Durchsicht
einer größeren Anzahl bekannter Kristallisationslösungen wurden die Kollektionen
Cristallization Basic & Extension Kit (Sigma-Aldrich, München), JBScreen Classic 1 –
10 (Jena Bioscience, Jena) und MPD Suite (Qiagen, Hilden) verwendet. Die
Reservoirlösungen wurden aerob in die Vertiefungen von 24-Loch-Platten gegeben
und in das Anaerobenzelt überführt. Hier wurden je 2 µl Proteinlösung mit je 2 µl
Reservoirlösung gemischt und in eine dafür vorgesehene kleine Vertiefung mit
Material und Methoden 42
Kontakt zur Reservoirlösung pipettiert. Die 24-Loch-Platten wurden mit
dazugehöriger Klarsichtklebefolie verschlossen und im Anaerobenzelt bei 10 °C
inkubiert. Zur Verfeinerung der Kristallisationsbedingungen wurden eigene, anaerobe
Lösungen benutzt. Im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. jannaschii
erschienen nach etwa fünf Tagen, im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym (mit und
die Inhibitoren CN- oder Imidazol) nach etwa zehn Tagen unter den unten
angeführten Bedingungen Kristalle (Abb. 13).
[Fe]-Hydrogenase-Apoenzym: 20 % (w/v) Polyethylenglykol 4000
0,1 M HEPES/NaOH, pH 7,5
5 % (v/v) Isopropanol
10 % Glyzerin
[Fe]-Hydrogenase-Holoenzym: 50 % (v/v) Methylpentandiol
0,1 M Tris/HCl, pH 8,5 (0,1 M Imidazol/HCl, pH 8,5
im Fall von imidazolinhibierten Kristallen)
50 mM Ammoniumdihydrogenphosphat
In beiden Fällen konnte auf die Herstellung eines kryoprotektiven Puffers
verzichtet werden, da diese Funktion bereits durch Glyzerin bez. Methylpentandiol
erfüllt wurde.
Abb. 13: Kristalle von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym (a) und -Holoenzym (b). Im Fall von [Fe]-
Hydrogenase-Apoenzym ließen sich die besten Kristalle bei 20 % (w/v) Polyethylenglykol 4000, 0,1 M
HEPES/NaOH, pH 7,5, 5 % (v/v) Isopropanol und 10 % Glyzerin gewinnen, im Fall von [Fe]-
Hydrogenase-Holoenzym bei 50 % (v/v) Methylpentandiol, 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5, 50 mM
Ammoniumdihydrogenphosphat. [Fe]-Hydrogenase-Apoenzymkristalle erschienen nach etwa 5 Tagen,
[Fe]-Hydrogenase-Holoenzymkristalle nach etwa 10 Tagen.
Material und Methoden 43
Zum Einfrieren wurden die Kristalle in eine auf einer Stahlnadel mit
Magnethalter fixierten Faserschlinge (Hampton Research, Aliso Viejo, USA) überführt
und in einen durch einen Kryostaten erzeugten tiefkalten Stickstoffstrahl gestellt. Die
Kristalle wurden für die weitere Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.
3.7.2. Strukturbestimmung durch Molekularen Ersatz
Zur Durchsicht der Kristalle wurden Einzelbilder am Max-Planck-Institut für
Biophysik, Frankfurt am Main, mit Hilfe eines MSC-Rigaku-Ru-200-
Röntgengenerators, der mittels einer rotierenden Anode CuKα–Strahlung erzeugt,
und eines Mar345-Imageplatedetektors aufgenommen. Datensätze bis zu einer
Auflösung von 1,75 Å im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym, [Fe]-Hydrogenase-
Holoenzym und CN--inhibiertem [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurden an der
Synchroton-Strahlenquelle PSII, SLS (Swiss Light Source), in Brugg (Schweiz)
aufgenommen. Nach einer ersten Aufnahme wurden auf der Basis von Mosaizität
und Beugungsgrenze der Kristalldetektorabstand und der Oszillationswinkel gewählt.
Um Daten in einem möglichst kleinen Oszillationsbereich zu sammeln und später zu
skalieren, wurden mit dem Programm STRATEGY die Mindestanzahl von
Einzelaufnahmen und der optimale Startwinkel berechnet [65]. Die
Datenprozessierung und Skalierung wurde mit den Programmen HKL [65] und XDS
[66] durchgeführt. Im Fall von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym wurden Reflexionen bis
zu 1,75 Å Auflösung einbezogen, obwohl der Datensatz bei 1,9 Å Auflösung einen
Rsym-Wert unter 30 % und eine Durchschnittsintensität höher als 5 σ aufwies.
Die Phase für die Struktur von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus M. jannaschii
wurde durch Molekularen Ersatz mit der vorläufigen Struktur von [Fe]-Hyrogenase-
Apoenzym aus M. kandleri [60] als Suchmodell (EPMR [67]). Für die Berechnung der
Phasen für die Strukturen von [Fe]-Hyrogenase Holoenzym und cyanidinhibiertem
[Fe]-Hydrogenase-Holoenzym wurde dann das Modell von [Fe]-Hydrogenase-
Apoenzym aus M. jannaschii als Suchmodell eingesetzt. Die Verfeinerung erfolgte
mit den Programmen O [68] und CNS [69]. Wassermoleküle wurden mit den Skripten
WATER-PRICK und WATER-DELETE in CNS eingefügt. Die weitere Verfeinerung
erfolgte mit dem TLS-Modell in REFMAC [70]. Letzte Modellfehler wurden mit den
Programmen CNS und PROCHECK [71] behoben
Material und Methoden 44
Die Datenprozessierung und die Strukturaufklärung wurden von Herrn Dr. Ulrich
Ermler und Herrn Dr. Eberhard Warkentin im Max-Planck-Institut für Biophysik,
Frankfurt am Main, durchgeführt.
Ergebnisse/Publikationen 45
4. Ergebnisse / Publikationen
Wie am Ende der Einleitung beschrieben (2.3.8) wurde [Fe]-Hydrogenase aus
folgenden Organismen für die Kristallisationsversuche in Betracht gezogen:
Methanothermobacter marburgensis (Wachstumstemperaturoptimum 65 °C),
Methanothermus fervidus (83 °C), Methanobrevibacter arboriphilus (37 °C) (alle
Methanobacteriales), Methanocaldococcus jannaschii (85 °C), Methanothermo-
coccus thermolithotrophicus (65 °C), Methanococcus voltae (37 °C) (alles
Methanococcales) und Methanopyrus kandleri (98 °C) (Methanopyrales).
Ziel war es, die Apoenzyme dieser Organismen heterolog in E. coli zu
produzieren, zu reinigen und anschließend direkt oder nach Rekonstitution zu
Holoenzym mit FeGP-Kofaktor des Enzyms aus M. marburgensis zu kristallisieren.
Dieser Weg wurde gegangen, da die Reinigung von [Fe]-Hydrogenase aus den
angesprochenen methanogenen Archaea außer aus M. marburgensis nur
unvollständig und in nicht-ausreichenden Mengen gelang. Außerdem wachsen die
hyperthermophilen Methanbildner nur zu niedrigen Zelldichten heran, was eine
Reinigung von nativer [Fe]-Hydrogenase aus diesen Organismen schwierig macht.
Das hmd-Gen aus den unterschiedlichen methanogenen Archaea ließ sich mit
Ausnahme des Gens aus M. marburgensis ohne Probleme in E. coli exprimieren.
Nach Anpassung des Codon-Gebrauchs gelang auch die Expression des hmd-Gens
aus M. marburgensis (Sonja Vogt, persönl. Mitteilung). Aber nur bei Expression des
hmd-Gens aus M. kandleri, M. jannaschii und M. thermolithotrophicus war das
gebildete Apoenzym löslich. In allen anderen Fällen kam es zur Ausbildung von
unlöslichen Einschlusskörpern.
Erste gute Kristalle von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzyms gelangen im Fall von
M. jannaschii, weshalb die Kristallisation von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus
diesem Organismus intensiv weiterverfolgt wurde. Die Kristallstruktur des [Fe]-
Hydrogenase-Apoenzyms bei 1,75 Å zeigte die Lage und die beteiligten
Aminosäurereste des aktiven Zentrums (siehe 4.1.). Durch einen Vergleich der
Struktur mit bekannten Nukleotidbindemotiven wurde eine mögliche FeGP-Kofaktor-
Bindestelle identifiziert. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen aller bekannten
[Fe]-Hydrogenasen wurden konservierte Aminosäurereste ermittelt, die
wahrscheinlich an der Bindung des FeGP-Kofaktors beteiligt sind.
Ergebnisse/Publikationen 46
Nach Erhalt der Kristallstruktur des Apoenzyms von [Fe]-Hydrogenase aus
M. jannaschii konzentrierte sich die Arbeit auf die Kristallisation des rekonstituierten
Holoenzyms, wobei parallel die Holoenzyme aus M. jannaschii, M. kandleri und
M. thermolithotrophicus untersucht wurden. Mit den verwendeten Kristallisations-
screens wurden erst gegen Ende der Doktorarbeit Holoenzymkristalle erhalten und
zwar von dem Enzym aus M. jannaschii. Die Struktur konnte mit dem Modell des
Apoenzyms durch Molekularen Ersatz gelöst werden. Die Auflösung von 1,75 Å
ermöglichte es, die Struktur des FeGP-Kofaktors in allen Einzelheiten zu sehen
(siehe 4.2.).
Ergebnisse/Publikationen 47
4.1. The Crystal Structure of the Apoenzyme of the Iron-Sulfur-Cluster-Free Hydrogenase
Ergebnisse/Publikationen 48
Ergebnisse/Publikationen 49
Ergebnisse/Publikationen 50
Ergebnisse/Publikationen 51
Ergebnisse/Publikationen 52
Ergebnisse/Publikationen 53
Ergebnisse/Publikationen 54
Ergebnisse/Publikationen 55
Ergebnisse/Publikationen 56
Ergebnisse/Publikationen 57
Ergebnisse/Publikationen 58
Ergebnisse/Publikationen 59
4.2. The Active Site of [Fe]-Hydrogenase (Iron-Sulfur-Cluster-Free Hydrogenase) at 1.75 Å Resolution
Ergebnisse/Publikationen 60
Ergebnisse/Publikationen 61
Ergebnisse/Publikationen 62
Ergebnisse/Publikationen 63
Ergebnisse/Publikationen 64
Ergebnisse/Publikationen 65
Ergebnisse/Publikationen 66
Ergebnisse/Publikationen 67
Ergebnisse/Publikationen 68
Ergebnisse/Publikationen 69
Ergebnisse/Publikationen 70
Ergebnisse/Publikationen 71
Ergebnisse/Publikationen 72
Ergebnisse/Publikationen 73
Ergebnisse/Publikationen 74
Diskussion 75
5. Diskussion
Durch die Strukturaufklärung von [Fe]-Hydrogenase Hmd ist es gelungen, einen
Einblick in das aktive Zentrum dieses Enzyms zu gelangen (siehe Ergebnisteil). [Fe]-
Hydrogenase ist ein mononukleares Eisenenzym. Die durch NMR und
Massenspektroskopie bestimmte Struktur von Guanylylpyridon [50] passt genau in
die Elektronendichte und auch die Anzahl und die Art der Liganden des Eisens
stimmen mit den spektroskopischen Untersuchungen überein [51-53]. Das Eisen ist
in der Struktur von [Fe]-Hydrogenase pentakoordiniert, wobei eine Ligandenstelle
vermutlich durch niedrig besetztes CO eingenommen wird (siehe Diskussion des
Publikationsentwurfes). Die Ligandenzahl von fünf und die quadratisch-pyramidale
Koordination von Eisen sprechen für Fe(0) im aktiven Zentrum [72]. Eisen würde
dann als Lewisbase in der Reaktion fungieren. Das Vorhandensein einer Base im
aktiven Zentrum wurde schon vor der Entdeckung von Eisen in [Fe]-Hydrogenase
vorgeschlagen [47]. Fe(0)-Komplexe mit CO-Liganden sind bekannt [73], allerdings
keine mit zusätzlichen Schwefelliganden. Eisen im Oxidationszustand Fe(II) in [Fe]-
Hydrogenase kann nicht ausgeschlossen werden, da Fe(II)-Komplexe mit CO und S-
Liganden existieren [74]. Im Folgenden werden einige Punkte des Diskussionsteils
des Publikationsentwurfes aufgegriffen und zusätzliche Aspekte angesprochen.
Sauerstoffempfindlichkeit von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym
[Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus Methanocaldococcus jannaschiii konnte bis
auf Kristalle eines Proteolysefragmentes nie aerob kristallisiert werden [60]. Erst mit
der Möglichkeit [Fe]-Hydrogenase-Holoenzym zu rekonstituieren und Enzymaktivität
zu messen, wurde die Sauerstoffempfindlichkeit des [Fe]-Hydrogenase-Apoenzyms
aus M. jannaschii erkannt [54]. Unter aeroben Bedingungen erwies sich das
Apoenzym aus M. jannaschii nur unter Zugabe von DTT stabil. Ohne Zugabe eines
Reduktionsmittels präzipitiert das Apoenzym in kurzer Zeit und ist inaktiv. [Fe]-
Hydrogenasen der Methanococcales haben zusätzlich zu den drei konservierten
Cysteinen 10, 176 und 250 noch zwei weitere, nur innerhalb ihrer Ordnung
konservierte Cysteine (66 und 118) (Abb. 9, 3.3.6). In der Struktur von [Fe]-
Hydrogenase aus M. jannaschii liegen Cys66 und Cys118 3,7 Å auseinander. Es ist
Diskussion 76
vorstellbar, dass beide Cysteine eine Disulfidbrücke unter aeroben Bedingungen
ausbilden, was zu einer Konformationsänderung und Präzipitation des Enzyms führt
(Abb. 14). Nachdem die Sauerstoffempfindlichkeit erkannt worden war, wurde [Fe]-
Hydrogenase-Apoenzym unter anaeroben Bedingungen in Gegenwart von 1 mM
DTT gereinigt und kristallisiert, was letztlich zur Strukturaufklärung führte.
Abb. 14: Konservierte Cysteine in der Struktur von [Fe]-Hydrogenase-Apoenzym aus Methanocaldococcus jannaschii. Die beiden nur innerhalb der Methanococcales konservierten
Cysteine 66 und 118 liegen 3,7 Å voneinander entfernt. Unter aeroben Bedingungen könnten beide
Cysteine eine Disulfidbrücke ausbilden, was die Sauerstoffempfindlichkeit des Apoenzyms erklären
würde.
Mononukleotidbindemotif in [Fe]-Hydrogenase
NAD(P)+-bindende Enzyme wie beispielsweise F420H2:NADP+-Oxidoreduktase
(Fno) besitzen ein spezielles Bindemotif, die sogenannte Rossmannbindetasche, die
aus einem parallelen, sechssträngigen ß-Faltblatt mit α–helikalen Insertionen besteht
(siehe Publikation). Als Sequenzmotif findet sich G(X)XGXXG, wobei das zweite
Glycin Wasserstoffbrücken mit dem Phosphat des Adenosins und das dritte Glycin
Wasserstoffbrücken mit dem Phosphat des Nikotinamids ausbildet. Die
Strukturähnlichkeit von NAD+-bindenden Enzymen ermöglichte die Überlagerung
aller bekannten Strukturen und Aussagen über konservierte Aminosäurereste [75,
76]. Neben dem genannten glycinreichen Motif finden sich immer hydrophobe
Aminosäurereste zu beiden Seiten des Adenins, die das Ringsystem stabilisieren,
Diskussion 77
und ein konserviertes Aspartat, das Wasserstoffbrückenbindungen zu den beiden
Hydroxylgruppen der Ribose ausbildet.
In [Fe]-Hydrogenase ist dieses Aspartat ebenfalls konserviert (Asp64) und zu
beiden Seiten des Guanosins sitzen konservierte Aminosäurereste (siehe
Publikation). Statt des Sequenzmotifs G(X)XGXXG findet sich in [Fe]-Hydrogenase
lediglich GXG, wobei das zweite Glycin Wasserstoffbrückenbindungen mit dem
Phosphat des FeGP-Kofaktors eingeht. Da kein zweites Phosphat vorhanden ist, ist
auch kein drittes Glycin konserviert. Somit handelt es sich in [Fe]-Hydrogenase nicht
um ein Dinukleotid-, sondern ein Mononukleotidbindungsmotif.
[Fe]-Hydrogenase zeigt keine signifikante Sequenzähnlichkeit zu anderen
Enzymen, aber eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu NAD+-bindenden
Oxidoreduktasen wie Hydroxyacyl-Dehydrogenase (siehe Publikation). Auf Basis der
Aminosäuresequenz der N-terminalen Domäne hat [Fe]-Hydrogenase jedoch
weniger als 20 % Ähnlichkeit zu anderen Enzymen. Daher kann nicht von einer
divergenten Entwicklung ausgegangen werden.
Die Struktur von Pyridon im aktiven Zentrum von [Fe]-Hydrogenase
Für Pyridon existieren zwei tautomere Formen (2-Pyridon und 2-Pyridinol,
Abb. 15A). Die Ausbildung einer der beiden tautomeren Formen von Pyridon hängt
von verschiedenen Faktoren ab. Ein polares Lösungsmittel wie Wasser begünstigt 2-
Pyridon. Für monosubstituierte 2-Pyridone ist der Substituent in der Position 6
entscheidend für die Ausbildung einer der beiden tautomeren Formen [77].
Elektronegative Substituenten wie F, Cl oder -OCH3 erniedrigen die Basizität des
Pyridonstickstoffes, sodass 2-Pyridinol begünstigt wird. Im Fall von FeGP-Kofaktor
sitzt jedoch Methylencarboxylat in Position 6, das elektronenschiebend ist. Allerdings
ist das 2-Pyridon des FeGP-Kofaktors nicht mono- sondern tetrasubstituiert
(Methylgruppen in Position 3 und 5 und Phosphat in Position 4), was die Vorhersage
für die Ausbildung einer tautomeren Form erschwert. Eisen liegt in der Struktur
genau auf der Höhe des Pyridons. Daher sollte der Stickstoff sp2-hybridisiert sein wie
im 2-Pyridinol. Wäre er sp3-hybridisiert wie im 2-Pyridon, so läge er außerhalb der
Ringebene. Der Pyridonteil von Guanylylpyridon liegt daher in der Kristallstruktur der
[Fe]-Hydrogenase wahrscheinlich als 2-Pyridinol vor (Abb. 15B).
Diskussion 78
Abb. 15: Strukturen des Tautomeriepaares 2-Pyridon und 2-Pyridinol (A) und Lage von Eisen und Guanylylpyridon in [Fe]-Hydrogenase (B). A: In 2-Pyridon ist der Stickstoff sp3-hybridisiert und
in 2-Pyridinol sp2-hybridisiert. B: In [Fe]-Hydrogenase ist der Pyridonstickstoff vermutlich sp2-
hybridisiert, da Eisen und Pyridon in derselben Ebene liegen.
Pyridone komplexieren Metalle der Übergangsgruppe mit dem Stickstoff der
Ringebene und der Ketogruppe in Position 2. Man unterscheidet je nach Anzahl der
komplexierten Metallatome mono-, di- und trinukleare Pyridonkomplexe. Im Fall von
[Fe]-Hydrogenase liegt ein mononuklearer Komplex vor. In mononuklearen
Komplexen wird das Metall entweder nur durch den Pyridonstickstoff oder nur durch
den Sauerstoff oder durch beide ligiert (Abb. 16).
Abb. 16: Strukturen von mononuklearen Metall-Pyridonkomplexen (M = Metall). Die
Komplexierungsart (mono-, di oder trinuklear) richtet sich nach der Anzahl der beteiligten Metallatome.
Hier sind nur mononukleare Metallpyridonkomplexe gezeigt. An der Komplexierung sind der
Pyridonstickstoff und der Sauerstoff beteiligt oder nur jeweils eines der beiden Atome [77].
Nur wenige mononukleare Eisenpyridonkomplexe sind beschrieben [78-80].
Dabei handelt es sich um mononukleare Eisenkomplexe, bei denen das Eisen durch
die Sauerstoffatome der Hydroxylgruppen von sechs 2-Pyridonen komplexiert wird
(Abb. 17A). Die Stickstoffatome der Ringebenen sind im Gegensatz zu [Fe]-
Diskussion 79
Hydrogenase nicht an der Komplexierung beteiligt. Dies ist allerdings für einen
mononuklearen Pd(II)-Komplex beschrieben worden, bei dem zwei Pyridonliganden
nur mittels ihrer Stickstoffatome PdCl2 komplexieren [81] (Abb. 17B). Am häufigsten
finden sich Pyridonliganden jedoch bei dinuklearen Metallkomplexen. Dabei ligiert
der Pyridonstickstoff eines der beiden Metallatome und die 2-Hydroxylgruppe das
andere. Abb 17C zeigt dies am Beispiel eines Di-Rheniumkomplexes [82]. In [Fe]-
Hydrogenase interagiert die 2-Hydroxylgruppe (die wegen der sp2-Hybridisierung des
Stickstoffs nicht als 2-Ketogruppe vorliegt) mit dem CO-Liganden und nicht mit einem
zweiten Metallatom (Abb 17D). Der Abstand zeischen dem Sauerstoff der 2-
Hydroxylgruppe und dem Sauerstoff des CO beträgt 2,7 Å, was der Distanz einer
Wasserstoffbrückenbindung entspricht. Durch diese Wasserstoffbrücke wird das CO
vom Pyridon weggeschoben, weswegen die quadratisch-pyramidale Koordination
des Eisens nicht perfekt ist (siehe Ergebnisteil). Durch diese Bindung wird die
Eisenkomplexierung durch das Guanylylpyridon stabilisiert.
Abb. 17: Struktur des mononuklearen Eisen-Pyridonkomplexes Fe(pyOH)6(NO3)3 (A), des mononuklearen Palladium-Pyridonkomplexes trans-[PdCl2(HL)2] (B), des dinuklearen Rheniumkomplexes [Re(chp)3Cl3] (C) und Aufsicht auf das aktive Zentrum von [Fe]-Hydrogenase (D). D: Der Pyridonstickstoff ligiert das Eisen, während die Hydroxylgruppe mit dem CO
interagiert, das dadurch in Richtung des Wassermoleküls geschoben wird. Dies hat Ähnlichkeit mit
den dinuklearen Metall-Pyridonkomplexen (C), wobei in [Fe]-Hydrogenase die Hydroxylgruppe mit
einem CO anstatt eines zweiten Metalls wechselwirkt.
Diskussion 80
Die IR-Banden der CO-Moleküle des freien FeGP-Kofaktors sind breiter als die
IR-Banden des rekonstituierten Enzyms, die wiederum breiter sind, als es von den
[FeFe]- und [NiFe]-Hydrogenasen bekannt ist [51] Dies kann daran liegen, dass die
dinuklearen Zentren der [FeFe]- und [NiFe]-Hydrogenasen im Inneren der Enzyme
liegen, wo die CO-Moleküle durch vielseitige hydrophobe Wechselwirkungen
stabilisiert sind. In [Fe]-Hydrogenase liegen die CO-Moleküle ebenfalls in einer
hydrophoben Tasche, sind aber vom Protein nicht eingeschlossen. Im freien FeGP-
Kofaktor hingegen sind sie von Wassermolekülen umgeben und beweglicher.
Eine weitere Besonderheit des Pyridons in der Kristallstruktur von [Fe]-
Hydrogenase ist das Fehlen der Carboxymethylgruppe. Die Elektronendichte an
dieser Stelle ist von den Dichten der beiden Methylgruppen des Pyridons nicht zu
unterscheiden (Abb. 17D). Ist die Carboxymethylgruppe tatsächlich vorhanden, so
muss sie eine hohe Flexibilität aufweisen und rotiert möglicherweise frei. Die
Ausbildung zweier alternativer Konformationen und zwar einmal vom Eisen entfernt
nach hinten zeigend, wie im Modell zu sehen, und zum anderen in der Form eines
Eisenliganden, würde auch die unbekannte Elektronendichte am Eisen erklären. In
einem solchen Fall müsste aber auch Elektronendichte zwischen der
Methylengruppe und der Carboxylatgruppe vorhanden sein. Diese fehlt aber.
Außerdem hat die Carboxymethylgruppe keine Wasserstoffbrücke zu Thr13
ausgebildet, obwohl die Hydroxylgruppe von Thr13 nur 2,4 Å vom Carboxylat entfernt
liegt. Daher ist es möglich, dass die Carboxylatgruppe in der Kristallstruktur gar nicht
vorhanden ist. Decarboxylierungen von Aminosäureresten durch die bei der
Röntgenstrukturanalyse eingesetzte Strahlung sind beschrieben worden [83].
NMR- und Massen-spektroskopische Experimente zur Ermittlung der Struktur
von Guanylylpyridon zeigten das Vorhandensein der Carboxymethylgruppe. Im
Verlauf der massenspektroskopischen Experimente trat meist auch der Verlust des
Carboxylats auf, allerdings immer zusammen mit dem Verlust des Eisencarbonyls
des FeGP-Kofaktors. Bei der Massenspektroskopie von Eisen-freiem Kofaktor, also
von Guanylylpyridon, hingegen war das Carboxylat meistens nachweisbar [50].
Daher wäre es möglich dass die Carboxymethylgruppe das Eisen in freiem FeGP-
Kofaktor komplexiert, in diesem Fall aber die C-C-Bindung zwischen Methylen und
Carboxylat schwach ist.
Diskussion 81
Wassermoleküle im aktiven Zentrum von [Fe]-Hydrogenase
In der Kristallstruktur von [Fe]-Hydrogenase wurde ein konserviertes
Wassermolekül 2,8 Å vom Eisen entfernt und auf Höhe des Pyridons liegend
entdeckt. Der Abstand ist zu groß für einen Liganden, aber ausreichend um eine
Wasserstoffbrückenbindung zum Eisen einzugehen. Die unbekannte Ligandendichte
gegenüber von CO in der Ebene des Pyridons ist möglicherweise auch Wasser oder
stammt von einem partiell besetzten CO (siehe Ergebnisteil). Die XAS-Messungen
lieferten keinen Hinweis auf ein drittes CO-Molekül, sondern sprechen auch eher für
ein Wasser oder ein Hydroxid als fünften Liganden (Wolfram Meyer-Klauke,
unveröffentlicht).
Konservierte Wassermoleküle und Cysteinreste stellen in den [FeFe]-
Hyrogenasen von Clostridium pasteurianum und Desulfovibrio desulfuricans einen
Protonentransportweg dar [13, 84]. [FeFe]-Hydrogenase aus C. pasteurianum trägt
einen putativen Wasserliganden am distalen Eisen (2,5 Å zwischen Sauerstoff und
Eisen) [13, 15], der bei CO-Inhibition durch CO verdrängt wird [85, 86] und am Ende
eines Gaskanales liegt, der von der Enzymoberfläche bis zum aktiven Zentrum reicht
[13]. Im Fall von [Fe]-Hydrogenase liegt im Abstand von 3 Å zum Wasser gegenüber
dem Pyridonstickstoff ein zweites konserviertes Wasser, das wiederum 3 Å vom
Peptidsauerstoff von Cys250 entfernt ist. Dies könnte eine Protonentransportkette
darstellen. Möglich ist aber auch, dass es lediglich mit dem elektronenreichen Eisen
über Wasserstoffbrückenbindungen interagiert. Sollte es gelingen Kokristalle mit
Methenyl-H4MPT+ zu erhalten, wäre es interessant zu sehen, ob das konservierte
Wassermolekül verdrängt wurde oder immer noch in der Struktur vorhanden ist.
Katalysemechanismus von [Fe]-Hydrogenase
Durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist es erstmal möglich, einen
Katalysemechanismus von [Fe]-Hydrogenase auf Grundlage der Kristallstruktur des
Holoenzyms vorzuschlagen. Dieser unterscheidet sich schon wegen der Tatsache,
dass [Fe]-Hydrogenase nur die heterolytische Spaltung von H2 in ein Hydrid und ein
Proton katalysiert, grundlegend vom Ping-Pong-Reaktionsmechanismus der [NiFe]-
und [FeFe]-Hydrogenasen [19]. Diese beiden Hydrogenasetypen spalten H2
vollständig in Protonen und Elektronen und benötigen für diese Spaltung auch
Diskussion 82
lediglich ihr binukleares Metallzentrum. Für die H2-Spaltung benötigt [Fe]-
Hydrogenase neben dem aktiven Zentrum noch die Bindung des Substrates
Methenyl-H4MPT+. Aufgrund dieser Tatsachen wurde schon früh ein ternärer
Komplexmechanismus für [Fe]-Hydrogenase vorgeschlagen [40, 41, 47].
Die Ligandenzahl von fünf und die quadratisch-pyramidale Koordinierung von
Eisen in [Fe]-Hydrogenase, sowie die Tatsache, dass ein Wassermolekül mit dem
Eisen interagiert, sind Argumente für Fe(0) im aktiven Zentrum, auch wenn Fe(0)
unter aeroben Bedingungen in wässriger Lösung normalerweise nicht stabil ist. Bei
Fe(0) im aktiven Zentrum von [Fe]-Hydrogenase würde nach der heterolytischen
Spaltung das Proton an die Lewis-Base Fe(0) binden (Abb. 18), was einem
mononuklearen Fe(II)-Hydrid entsprechen würde. Mononukleare Fe(II)-Hydrid-
Komplexe sind beschrieben worden [87, 88].
Mössbauer-Untersuchungen an [Fe]-Hydrogenase zeigten, dass das Eisen
entweder als Fe(0) oder Fe(II) vorliegt [52]. Molekularer Wasserstoff ist eine sehr
schwache Säure (pK = 35). Bei Bindung an elektronenarme Kationen wie Fe(II) wird
H2 polarisiert und der pK-Wert erniedrigt. Der pK-Wert kann dabei bis auf -6 sinken.
In solchen Fällen bindet H2 seitlich an das Kation und das H-H-σ-Orbital gibt
Elektronendichte auf das freie d-Orbital des Kations ab [2, 89]. CO-Liganden sind
starke π-Elektronenakzeptoren und ziehen Elektronendichte vom Eisen ab. Damit
fördern sie zusätzlich den elektrophilen Charakter des Eisens. Für die Erhöhung der
Azidität von H2 kann CO in trans oder cis zu H2 stehen [90]. Bei den meisten
Modellverbindungen bindet das Hydrid nach der heterolytischen Spaltung an Fe(II)
und das entstehende Proton wird auf eine Base übertragen.
In [Fe]-Hydrogenase bindet nach heterolytischer Spaltung von H2 nicht das
Hydrid an das Eisen, sondern das Proton, da das Hydrid auf das Carbokation
Methenyl-H4MPT+ übertragen wird (Abb. 18). Im Fall von Fe(II) würde das Eisen bei
der Protonierung formal zu einem Fe(IV)-Hydrid oxidiert. Mononukleare Fe(IV)-
Hydrid-Komplexe sind bekannt [74]. Die Bindung von einem Proton an ein Fe(II), also
die Protonierung eines 16-Elektronen-Zentrums ist jedoch selten, da es die
Verbindung zweier Lewissäuren (Fe(II) und H+) bedeutet [90]. Ein Beispiel hierfür ist
die Protonierung des 16-Elektronen-Zentrums in W(CO)3(PR3)2 durch starke Säuren
[91]. Daher erscheint es unwahrscheinlich, dass das Eisen in [Fe]-Hydrogenase als
Fe(II) vorliegt und dabei als Base fungiert. In [FeFe]-Hydrogenasen würde bei der
Rückreaktion, der Bildung von Wasserstoffgas aus Protonen und Elektronen, ein
Diskussion 83
Proton an das Fe(II) binden müssen. Hier könnten allerdings die Elektronen der
Metall-Metall-Bindung ein Proton akzeptieren [92].
Abb. 18: Reaktionsmechanismus von [Fe]-Hydrogenase aufgrund der Kristallstruktur. [Fe]-
Hydrogenase katalysiert den stereoselektiven Hydridtransfer von H2 auf das C14a-Carbokation von
Methenyl-H4MPT+, das dabei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Das Substrat Methenyl-H4MPT+
bindet wahrscheinlich in der Lücke zwischen der C- und N-terminalen Domäne des [Fe]-Hydrogenase-
Dimers (siehe Ergebnisteil). Das C14a von Methenyl-H4MPT+ läge in diesem Modell etwa 6 Å vom
Eisen entfernt, wobei die unbekannte Ligandendichte oder Cyanidligandendichte (nichtinhibierte bzw.
cyanidinhibierte [Fe]-Hydrogenase) genau zwischen Eisen und C14a läge, was einen weiteren Hinweis
darstellt, dass dies auch die H2-Bindestelle ist. In diesem Modell fungiert das Eisen als Lewisbase und
ist im Oxidationszustand 0. Das Carbokation agiert als Lewissäure. H2 bindet zwischen beiden
Reaktionspartnern und wird heterolytisch gespalten [2, 89]. Falls Fe(II) vorliegt, sollte das Proton an
eine Base im aktiven Zentrum übertragen. Mutationsanalysen lassen darauf schließen, dass es sich
um His14 handeln könnte.
Im Fall von Fe(0) bindet das bei der H2-Spaltung entstehende Proton an Eisen,
im Fall von Fe(II) nicht an das Eisen sondern an eine Base im aktiven Zentrum. Fe(II)
dient dann lediglich der Polarisierung des Wasserstoffs. Mehrere konservierte
Aminosäuren wurden gegen Alanin ausgetauscht. Die Mutanten zeigten noch
signifikante Restaktivität (siehe Publikationsentwurf), mit Ausnahme der Mutante
His14Ala, deren sehr geringe Restaktivität (0,3 % der Wildtyp-Aktivität) ein Hinweis
ist, dass diese Aminosäure als Base im aktiven Zentrum fungieren könnte. Ihr
Abstand zum Eisen beträgt 6 Å. Neben der Funktion als Base könnte His14 auch zur
Stabilisierung des Pterinringes des Substrates dienen, wie es bei einem Histidin im
aktiven Zentrum von Formaldehyd-aktivierendem Enzym (Fae) der Fall ist [93].
Diskussion 84
Die Gene in den flankierenden Regionen von hmd
Abb. 19: hmd-Gene und Gene der flankierenden Regionen aus verschiedenen Organismen. Blau: hmd; rot: bioB?, Gen mit 25 – 30 % Identität zum Gen der Biotinsynthase aus E. coli; gelb:
unbekanntes, konserviertes Gen; braun: Gen für die δ-Untereinheit der methylviologenreduzierenden
Hydrogenase; andere Farben: Gene, die sich in den flankierenden Regionen in mindestens zwei der
genannten Organismen finden; dunkelgrau: Gene, die sich außer in einer flankierenden Region eines
der genannten Organismen noch im Genom von mindestens einem der anderen Organismen finden;
hellgrau: Gene, die sich nur im jeweils dargestellten Organismus finden.
Abb. 19 vergleicht die offenen Leserahmen in den flankierenden Regionen um
die [Fe]-Hydrogenase-Gene verschiedener Organismen einschließlich derjenigen von
M. fervidus und M. arboriphilus. Die meisten offenen Leserahmen stellen unbekannte
Gene da. Nur wenige dieser Gene (farbig) finden sich wenigstens ein weiteres Mal in
einer anderen flankierenden Region. Vielfach finden sich die Gene noch im Genom
eines anderen der genannten Organismen, soweit die Genomsequenz vorhanden ist,
allerdings weit vom hmd-Gen entfernt (dunkelgrau eingefärbt). Einige unbekannte
Gene finden sich sogar nur in einem der genannten Organismen (hellgrau
eingefärbt). Eine Funktion neben dem hmd-Gen lässt sich nur wenigen weiteren
Genen sicher zuordnen: δ-Untereinheit der methylviologenreduzierenden
Hydrogenase (braun eingefärbt), α-Untereinheit der Formiatdehydrogenase
Diskussion 85
(MTH1140), DNA-Helikase (MK0007), Aminosäure-Aminotransferase (MMP0132)
und Phosphoribosylglycinamidformyltransferase 2 (MMP0123).
Bis auf M. fervidus findet sich überall ein als bioB? bezeichnetes Gen, das 20 -
30 % Sequenzidentität zur Biotinsynthase aus E. coli hat. Biotin-Synthase ist ein
sogenanntes Radikal-S-Adenosylmethionin-Enzym (Radikal-SAM-Enzym) und baut
Schwefel in Dethiobiotin ein [94]. Radikal-SAM-Enzyme erzeugen mittels eines
[4Fe4S]-Clusters und S-Adenosylmethionin ein 5’-Desoxyadenosylradikal, das dann
für eine Vielzahl von Reaktionen genutzt wird, neben Biotinsynthese beispielsweise
auch bei der Lipoat- und Porphyrinogenbiosynthese [95]. Es wurde auch
vorgeschlagen, dass SAM-Radikal-Enzyme an der Biosynthese des dinuklearen
[FeFe]-Zentrums in [FeFe]-Hydrogenase beteiligt sind [96]. Die Gene hydE und hydG
von Chlamydomonas rheinhardtii sind essentiell für die Maturation von [FeFe]-
Hydrogenase in diesem Organismus, was anhand von Deletionsmutanten entdeckt
wurde, und ihre Expression in E. coli ist bei der heterologen Produktion von [FeFe]-
Hydrogenase notwendig [97]. HydE und HydG aus C. rheinhardtii sind
höchstwahrscheinlich SAM-Radikalenzyme, da homologe Proteine aus Thermotoga
maritima SAM reduktiv spalten können [98]. Die genaue Rolle von HydE und HydG
im Maturationsprozess von [FeFe]-Hydrogenase aus C. rheinhardtii ist nicht bekannt.
Wegen dieser Untersuchungen wäre es denkbar, dass das als bioB? bezeichnete
Gen ein Radikal-SAM-Enzym kodiert, das an der Biosynthese des FeGP-Kofaktors
mitwirkt. Wegen der fehlenden Verwandtschaft von FeGP-Kofaktor zu irgendeinem
anderen bekannten biologischen Kofaktor und der Einzigartigkeit von
Guanylylpyridon als Teil einer biologischen Verbindung ist kein analoger
Biosyntheseweg bekannt. Nur ein weiteres Gen neben bioB? wurde in allen
bekannten flankierenden Regionen gefunden (gelb eingefärbt in Abb. 19), das keine
signifikante Sequenzähnlichkeit mit bekannten Proteinen hat.
Ausblick
In nächster Zeit sollten verschiedene Kokristallisationsexperimente
weiterverfolgt werden, d. h. Kristallisation von [Fe]-Hydrogenase in Gegenwart des
Substrates Methenyl-H4MPT+ und der Inhibitoren CO, Cu2+ und Imidazol. Im Fall von
Cu2+ wurden bereits einige Kokristallisationsexperimente ohne Erfolg durchgeführt
(3.6.2). Diese Experimente sollten weiterverfolgt werden.
Diskussion 86
Imidazol stellt in hohen Konzentrationen (Ki = etwa 50 – 100 mM) einen
kompetitiven Inhibitor von [Fe]-Hydrogenase dar (Sonja Vogt, unveröffentlicht).
Wegen der geringen Größe von Imidazol im Vergleich zu Methenyl-H4MPT+ ist es
denkbar, dass Imidazol die Kristallisation weniger stark stört als es eventuell bei
Methenyl-H4MPT+ der Fall ist, das wegen seiner Größe bei Bindung an das Enzym
teilweise aus der Struktur herausragen würde. Es gelang im Verlauf dieser Arbeit
Datensätze von Imidazol-inhibierte [Fe]-Hydrogenase-Kristalle zu sammeln (siehe
auch 3.6.3 und 3.7.1). Die Strukturdaten zeigten keine Dichte für Imidazol an. Es
sollte allerdings versucht werden, die Imidazolkonzentration (gegenwärtig 50 –
200 mM) bei der Kokristallisation auf ein Vielfaches des Ki zu erhöhen. Fände sich
Imidazol in der Struktur in der Nähe des Eisens wieder, so könnte daraus auf die
Bindestelle von Methenyl-H4MPT+ geschlossen werden (Abb. 20).
Abb. 20: Strukturen vom Carbokationenteil von Methenyl-H4MPT+ (A) und von Imidazol (B). Wegen der Ähnlichkeit der Strukturen und der Tatsache, dass Imidazol ein kompetitiver Inhibitor von
[Fe]-Hydrogenase ist, ist eine Besetzung der Methenyl-H4MPT+-Bindestelle durch Imidazol vorstellbar.
Die unbekannte Ligandendichte in [Fe]-Hydrogenase stammt eventuell von CO,
das an einen Teil der Enzymmoleküle gebunden hat. Die Bindung dieses
zusätzlichen CO könnte abhängig von der Temperatur sein, da die Bindung von CO
an freien FeGP-Kofaktor bei den Mössbauer-Messungen (Probe bei -80 °C)
nachweisbar war, bei den IR-spektroskopischen Messungen (Probe bei +20 °C)
allerdings nicht. Daher sollte versucht werden, rekonstituierte [Fe]-Hydrogenase vor
der Kristallisation unter Stickstoffbegasung kurzzeitig zu erwärmen und danach zu
kristallisieren. Entsprechend könnte [Fe]-Hydrogenase vor der Kristallisation auch
unter einer CO-Atmosphäre inkubiert werden. Im ersten Fall sollten die Kristalle an
der putativen CO-Bindestelle keine Elektronendichte mehr aufweisen oder zumindest
Diskussion 87
eine geringere als bisher und im zweiten Fall eventuell Elektronendichte
entsprechend einer voll besetzten CO-Bindestelle.
Neben der Koordination von Eisen im aktiven Zentrum ist dessen
Oxidationszustand von großem Interesse, worüber die Kristallstruktur durch die
Ligandenzahl nur einen Hinweis geben kann. Daher wird demnächst versucht, den
Oxidationszustand durch redoxchemische Analysen, Kernresonanz-
vibrationsspektroskopische (NRVS)-Untersuchungen [99] und soft-EXAFS-
Messungen [100] zu bestimmen.
Literatur 88
6. Literatur
1. Winter, C.-J., Electricity, hydrogen - competitors, partners? International Journal of Hydrogen Energy, 2005. 30: p. 1371-1374.
2. Kubas, G.J., Catalytic processes involving dihydrogen complexes and other sigma-bond complexes. Catalysis Letters, 2005. 104(1-2): p. 79-101.
3. Karyakin, A.A., et al., Hydrogenase electrodes for fuel cells. Biochem Soc Trans, 2005. 33(Pt 1): p. 73-5.
4. Darensbourg, M.Y., et al., The organometallic active site of [Fe]hydrogenase: models and entatic states. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(7): p. 3683-8.
5. Vincent, K.A., et al., Electrocatalytic hydrogen oxidation by an enzyme at high carbon monoxide or oxygen levels. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(47): p. 16951-4.
6. Tard, C., et al., Synthesis of the H-cluster framework of iron-only hydrogenase. Nature, 2005. 433(7026): p. 610-3.
7. Boyke, C.A., et al., Diferrous cyanides as models for the Fe-only hydrogenases. J Am Chem Soc, 2005. 127(31): p. 11010-8.
8. Conrad, R., Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4, OCS, N2O, and NO). Microbiol Rev, 1996. 60(4): p. 609-40.
9. Green, D.E. and L.H. Stickland, Studies on reversible dehydrogenase systems: The reversibility of the hydrogenase system of Bact. coli. Biochem J, 1934. 28(3): p. 898-900.
10. Hartmann, G.C., et al., Studies on the catalytic mechanism of H2-forming methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase: para-ortho H2 conversion rates in H2O and D2O. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 1996b. 1: p. 446-450.
11. Zirngibl, C., et al., H2-forming methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase, a novel type of hydrogenase without iron-sulfur clusters in methanogenic archaea. Eur J Biochem, 1992. 208(2): p. 511-20.
12. Zirngibl, C., R. Hedderich, and R.K. Thauer, N5,N10-Methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase from Methanobacterium thermoautotrophicum has hydrogenase activity. FEBS Lett, 1990. 261(1): p. 112-116.
13. Peters, J.W., et al., X-ray crystal structure of the Fe-only hydrogenase (CpI) from Clostridium pasteurianum to 1.8 angstrom resolution. Science, 1998. 282(5395): p. 1853-8.
14. Nicolet, Y., et al., Crystallographic and FTIR spectroscopic evidence of changes in Fe coordination upon reduction of the active site of the Fe-only hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans. J Am Chem Soc, 2001. 123(8): p. 1596-601.
15. Nicolet, Y., et al., Crystallographic and FTIR spectroscopic evidence of changes in Fe coordination upon reduction of the active site of the Fe-only hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans. J Am Chem Soc, 2001. 123(8): p. 1596-601.
16. Nicolet, Y., C. Cavazza, and J.C. Fontecilla-Camps, Fe-only hydrogenases: structure, function and evolution. Journal of Inorganic Biochemistry, 2002. 91: p. 1-8.
Literatur 89
17. Winkler, M., et al., Isolation and molecular characterization of the [Fe]-hydrogenase from the unicellular green alga Chlorella fusca. Biochim Biophys Acta, 2002. 1576(3): p. 330-4.
18. Cohen, J., et al., Finding gas diffusion pathways in proteins: application to O2 and H2 transport in CpI [FeFe]-hydrogenase and the role of packing defects. Structure, 2005. 13(9): p. 1321-9.
19. Vignais, P.M., B. Billoud, and J. Meyer, Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol Rev, 2001. 25(4): p. 455-501.
20. Albracht, S.P., E.G. Graf, and R. Thauer, The EPR properties of nickel in hydrogenase from Methanobacterium. FEBS Lett, 1982. 140(2): p. 311-3.
21. Graf, E.G. and R. Thauer, Hydrogenase from Methanobacterium thermoautotrophicum, a nickel-containing enzyme. FEBS Lett, 1981. 136(1): p. 165-9.
22. Frey, M., Hydrogenases: Hydrogen-Activating Enzymes. ChemBioChem, 2002. 3: p. 153-160.
23. Volbeda, A., et al., Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature, 1995. 373(6515): p. 580-7.
24. Ogata, H., et al., Structural studies of the carbon monoxide complex of [NiFe] hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F: suggestion for the initial activation site for dihydrogen. J Am Chem Soc, 2002. 124(39): p. 11628-35.
25. Higuchi, Y., T. Yagi, and N. Yasuoka, Unusual ligand structure in Ni-Fe active center and additional Mg site in hydrogenase revealed by high resolution X-ray structure analysis. Structure, 1997. 5: p. 1671-1680.
26. Garcin, E., et al., The crystal structure of a reduced [NiFeSe] hydrogenase provides an image of the activated catalytic center. Structure, 1999. 7(5): p. 557-66.
27. Matias, P.M., et al., [NiFe] hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: gene sequencing, three-dimensional structure determination and refinement at 1.8 A and modelling studies of its interaction with the tetrahaem cytochom c3. J Biol Inorg Chem, 2001. 6(1): p. 63-81.
28. Higuchi, Y., et al., Removal of the bridging ligand atom at the Ni-Fe active site of [NiFe] hydrogenase upon reduction with H2, as revealed by X-ray structure analysis at 1.4 A resolution. Structure, 1999. 7: p. 549-556.
29. Happe, R., et al., Biological activation of hydrogen. Nature, 1997. 385: p. 126. 30. Montet, Y., et al., Gas access to the active site of Ni-Fe hydrogenases probed
by X-ray crystallography and molecular dynamics. Nat Struct Biol, 1997. 4(7): p. 523-6.
31. Teixeira, V.H., A.M. Baptista, and C.M. Soares, Pathways of H2 toward the active site of [NiFe]-hydrogenase. Biophys J, 2006. 91(6): p. 2035-45.
32. Burgdorf, T., et al., [NiFe]-hydrogenases of Ralstonia eutropha H16: modular enzymes for oxygen-tolerant biological hydrogen oxidation. J Mol Microbiol Biotechnol, 2005. 10(2-4): p. 181-96.
33. Lenz, O., et al., The hydrogen-sensing apparatus in Ralstonia eutropha. J Mol Microbiol Biotechnol, 2002. 4(3): p. 255-262.
34. Sawers, G., Formate and its role in hydrogen production in Escherichia coli. Biochem Soc Trans, 2005. 33(Pt 1): p. 42-6.
35. Thauer, R.K., Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. 1998 Marjory Stephenson Prize Lecture. Microbiology, 1998. 144 (Pt 9): p. 2377-406.
36. Afting, C., A. Hochheimer, and R.K. Thauer, Function of H2-forming methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase from methanobacterium
Literatur 90
thermoautotrophicum in coenzyme F420 reduction with H2. Arch Microbiol, 1998. 169(3): p. 206-10.
37. von Bunau, R., et al., Hydrogen-forming and coenzyme-F420-reducing methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase are genetically distinct enzymes in Methanobacterium thermoautotrophicum (Marburg). Eur J Biochem, 1991. 202(3): p. 1205-8.
38. Livingston, D.J., et al., 8-Hydroxy-5-Deazaflavin-Reducing Hydrogenase from Methanobacterium thermoautotrophicum. Kinetic and Hydrogen-Transfer Studies. Biochemistry, 1987. 26: p. 4228-4237.
39. Pilak, O., Synthese von Hydrogenase Hmd und von zwei vermuteten Isoenzymen in Methanothermobacter marburgensis bei Wachstum unter Fe-, NH3- und Ni-Limitierung. Diplomarbeit, 2004.
40. Klein, A.R., V.M. Fernandez, and R.K. Thauer, H2-forming N5,N10-methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase: mechanism of H2 formation analyzed using hydrogen isotopes. FEBS Lett, 1995b. 368(2): p. 203-6.
41. Klein, A.R., G.C. Hartmann, and R.K. Thauer, Hydrogen isotope effects in the reactions catalyzed by H2-forming N5,N10-methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase from methanogenic Archaea. Eur J Biochem, 1995a. 233(1): p. 372-6.
42. Thauer, R.K., A.R. Klein, and G.C. Hartmann, Reactions with Molecular Hydrogen in Microorganisms: Evidence for a Purely Organic Hydrogenation Catalyst. Chem Rev, 1996. 96(7): p. 3031-3042.
43. Schleucher, J., et al., H2-forming N5, N10-methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase from Methanobacterium thermoautotrophicum catalyzes a stereoselective hydride transfer as determined by two-dimensional NMR spectroscopy. Biochemistry, 1994. 33(13): p. 3986-93.
44. Schworer, B., et al., H2-forming N5,N10-methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase from Methanobacterium thermoautotrophicum. Studies of the catalytic mechanism of H2 formation using hydrogen isotopes. Eur J Biochem, 1993. 212(1): p. 255-61.
45. Bartoschek, S., et al., Re-Face Stereospecificity of Methylenetetrahydromethanopterin and Methylenetetrahydrofolate Dehydrogenases is Predetermined by Intrinsic Properties of the Substrate. ChemBioChem, 2001. 2: p. 530-541.
46. Olah, G.A. and R.H. Schlosberg, Chemistry in Super Acids. I. Hydrogen Exchange and Polycondensation of Methane and Alkanes in FSO3H-SbF5 ("Magic Acid") Solution. Journal of the American Chemical Society, 1968. 90: p. 2726-2727.
47. Berkessel, A., Activation of dihydrogen without transition metals. Curr Opin Chem Biol, 2001. 5(5): p. 486-90.
48. Buurman, G., S. Shima, and R.K. Thauer, The metal-free hydrogenase from methanogenic archaea: evidence for a bound cofactor. FEBS Lett, 2000. 485(2-3): p. 200-4.
49. Lyon, E.J., et al., UV-A/blue-light inactivation of the 'metal-free' hydrogenase (Hmd) from methanogenic archaea. Eur J Biochem, 2004a. 271(1): p. 195-204.
50. Shima, S., et al., The cofactor of the iron-sulfur cluster free hydrogenase hmd: structure of the light-inactivation product. Angew Chem Int Ed Engl, 2004. 43(19): p. 2547-51.
Literatur 91
51. Lyon, E.J., et al., Carbon monoxide as an intrinsic ligand to iron in the active site of the iron-sulfur-cluster-free hydrogenase H2-forming methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase as revealed by infrared spectroscopy. J Am Chem Soc, 2004b. 126(43): p. 14239-48.
52. Shima, S., et al., Mossbauer studies of the iron-sulfur cluster-free hydrogenase: the electronic state of the mononuclear Fe active site. J Am Chem Soc, 2005. 127(29): p. 10430-5.
53. Korbas, M., et al., The iron-sulfur cluster-free hydrogenase (Hmd) is a metalloenzyme with a novel iron binding motif. J Biol Chem, 2006. 281(41): p. 30804-13.
54. Vogt, S., Die Rolle von Cystein 176 im aktiven Zentrum der Eisen-Schwefel-Cluster-freien Hydrogenase Hmd. Diplomarbeit, 2004.
55. Vaupel, M., Untersuchungen mit Methanobacterium thermoformicicum und Methanobacterium formicicum zur Rolle der H2-bildenden N5,N10-Methylentetrahydromethanopterindehydrogenase in methanogenen Archaea. Diplomarbeit, 1993.
56. Ma, K., et al., N5, N10-methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase (H2-forming) from the extreme thermophile Methanopyrus kandleri. Arch Microbiol, 1991. 156(1): p. 43-8.
57. Hartmann, G.C., et al., Purification, properties and primary structure of H2-forming N5,N10 -methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase from Methanococcus thermolithotrophicus. Arch Microbiol, 1996a. 165(3): p. 187-93.
58. Hendrickson, E.L., et al., Complete genome sequence of the genetically tractable hydrogenotrophic methanogen Methanococcus maripaludis. J Bacteriol, 2004. 186(20): p. 6956-6969.
59. Zirngibl, C., Eine neuartige Hydrogenase ohne Eisen-Schwefel-Zentren in methanogenen Bakterien. Dissertation, 1991.
60. Mamat, B., Strukturaufklärung der metallfreien Hydrogenase aus methanogenen Archaea. Dissertation, 2002.
61. Escalante-Semerena, J.C., K.L. Rinehart, Jr., and R.S. Wolfe, Tetrahydromethanopterin, a carbon carrier in methanogenesis. J Biol Chem, 1984. 259(15): p. 9447-55.
62. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.
63. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54.
64. Fish, W.W., Rapid colorimetric mircomethod for the quantification of complexed iron in biological samples. Methods Enzymol, 1988. 158: p. 357-364.
65. Otwinowski, Z. and W. Minor, Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol, 1996. 276: p. 307-326.
66. Kabsch, H., Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown summertry and cell constants. J Appl Crystallog, 1993. 26(795-800).
67. Kissinger, C.R., D.K. Gehlhaar, and D.B. Fogel, Rapid automated molecular replacement by evolutionary search. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1999. 55(Pt 2): p. 484-91.
Literatur 92
68. Jones, T.A., et al., Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Crystallogr A, 1991. 47 (Pt 2): p. 110-9.
69. Brunger, A.T., et al., Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1998. 54(Pt 5): p. 905-21.
70. Murshudov, G.N., A.A. Vagin, and E.J. Dodson, Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1997. 53(Pt 3): p. 240-55.
71. Laskowski, R.A., D.S. Moss, and J.M. Thornton, Main-chain bond lengths and bond angles in protein structures. J Mol Biol, 1993. 231(4): p. 1049-67.
72. Douglas, B.E., D.H. McDaniel, and J.J. Alexander, Concepts and Models of Inorganic Chemistry. 1994.
73. Kayal, A. and T.B. Rauchfuss, Protonation studies of the new iron carbonyl cyanide trans-[Fe(CO)3(CN)2]2-: implications with respect to hydrogenases. Inorg Chem, 2003. 42(17): p. 5046-8.
74. Yao, Z., K.J. Klabunde, and A.C. Hupton, Metal atom syntheses and studies of π-arene Fe(IV) complexes: (η6-arene)Fe(H)2(SiRCl2)2 (arene = toluene, benzene; R=H, Me). Inorganica Chimica Acta, 1997. 259: p. 119-124.
75. Carugo, O. and P. Argos, NADP-Dependent Enzymes. I: Conserved Stereochemistry of Cofactor Binding. Proteins: Structure, Function and Genetics, 1997. 28: p. 10-28.
76. Carugo, O. and P. Argos, NADP-Dependent Enzymes. II: Evolution of the Mono- and Dinucleotide Binding Domains. Proteins: Structure, Function and Genetics, 1997. 28: p. 29-40.
77. Rawson, J.M. and R.E.P. Winpenny, The coordination chemistry of 2-pyridone and its derivatives. Coordination Chemistry Reviews, 1995. 139: p. 313-374.
78. Goodgame, D.M.L., D.J. Williams, and R.E.P. Winpenny, Formation of some 2-Pyridone Hg/M [M=Mn(II), Fe(III) and Cu(II)] Heterometallic Complexes and Cystal Structure of Hexakis(2-pyridone)iron(III) Nitrate. Inorganica Chimica Acta, 1989. 166: p. 159-162.
79. Griffith, W.P. and S.I. Mostafa, Complexes of 3-hydroxypyridin-2-one and 1,2-dimethyl-3-hydroxypyridin-4-one with second and third row elements of groups 6,7 and 8. Polyhedron, 1992. 11(23): p. 2997-3005.
80. Blake, A.J., et al., Use of a hexanuclear copper complex as a ligand transfer agent: crystal structures of hexakis(6-methyl-2-pyridone)iron(III) nitrate and tetrakis(6-methyl-2-pyridone)bis(nitrato)cobalt(II). Polyhedron, 1994. 13(2): p. 187-191.
81. Ueda, M., et al., Metal complexes with pyridone-based radicals: Preparation and properties of a dinuclear paddle-wheel copper(II) complex and a mononuclear palladium(II) complex. Polyhedron, 2005. 24: p. 2189-2193.
82. Cotton, F.A. and T. Ren, Synthesis and structural characterization of Re2(µ-chp)2(η2-chp)Cl3: A new coordination mode of hydroxypyridinate around demetallic centres. Polyhedron, 2002. 11(7): p. 811-815.
83. Fioravanti, E., et al., Specific radiation damage to acidic residues and its relation to their chemical and structural environment. J Synchrotron Radiat, 2007. 14(Pt 1): p. 84-91.
84. Nicolet, Y., et al., Desulfovibrio desulfuricans iron hydrogenase: the structure shows unusual coordination to an active site Fe binuclear center. Structure, 1999. 7(1): p. 13-23.
Literatur 93
85. Bennett, B., B.J. Lemon, and J.W. Peters, Reversible Carbon Monoxide Binding and Inhibition at the Active Site of the Fe-Only Hydrogenase. Biochemistry, 2000. 39: p. 7455-7460.
86. Lemon, B.J. and J.W. Peters, Photochemistry at the Active Site of the Carbon Monoxide Inhibited Form of the Iron-Only Hydrogenase (CpI). Journal of the American Chemical Society, 2000. 122: p. 3793-3794.
87. Albertin, G., S. Antoniutti, and M. Bortoluzzi, Preparation and Reactivity of Mixed-Ligand Iron(II) Hydride Complexes with Phophites and Polypyridyls. Inorg Chem, 2004. 43: p. 1328-1335.
88. Van der Sluys, L.S., et al., An Attractive "Cis-Effect" of Hydride on Neighbor Ligands: Experimental and Theoretical Studies on the Structure and Intramolecular Rearrangements of Fe(H)2(η2-H2)(PEtPh2)3. J Am Chem Soc, 1990. 112: p. 4831-4841.
89. Heinekey, D.M. and W.J. Oldham, Coordination Chemistry of Dihydrogen. Chem Rev, 1993. 93: p. 913-926.
90. Huhmann-Vincent, J., B.L. Scott, and G.J. Kubas, Reactions of H2, silanes and olefins with superelectrophilic cationic rhenium complexes: heterolytic cleavage of H2 and relation to the structure and function of hydrogenases. Inorganica Chimica Acta, 1999. 294: p. 240-254.
91. Van der Sluys, L.S., et al., Protonation of W(CO)3(PCy3)2. Inorg Chem, 1991. 30: p. 306-310.
92. Nataro, C. and R.J. Angelici, Protonation of Metal-Metal Bonds in Cp2Ru2(CO)3(PR3) and Cp2Mo2(CO)4(PR3)2. Inorg Chem, 1998. 37: p. 2975-2983.
93. Acharya, P., et al., How an enzyme binds the C1 carrier tetrahydromethanopterin. Structure of the tetrahydromethanopterin-dependent formaldehyde-activating enzyme (Fae) from Methylobacterium extorquens AM1. J Biol Chem, 2005. 280(14): p. 13712-9.
94. Berkovitch, F., et al., Crystal structure of biotin synthase, an S-adenosylmethionine-dependent radical enzyme. Science, 2004. 303(5654): p. 76-9.
95. Layer, G., et al., Structure and function of radical SAM enzymes. Curr Opin Chem Biol, 2004. 8(5): p. 468-76.
96. Peters, J.W., et al., A radical solution for the biosynthesis of the H-cluster of hydrogenase. FEBS Lett, 2006. 580(2): p. 363-7.
97. Posewitz, M.C., et al., Discovery of two novel radical S-adenosylmethionine proteins required for the assembly of an active [Fe] hydrogenase. J Biol Chem, 2004. 279: p. 25711-25720.
98. Rubach, J.K., et al., Biochemical characterization of the HydE and HydG iron-only hydrogenase maturation enzymes from Thermotoga maritima. FEBS Lett, 2005. 579: p. 5055-5060.
99. Xiao, Y., et al., Now nitrogenase shakes - initial information of nitrogen-fixing (nifH) genes in alp prairie soil of Sanjiangyuan natural reserve. J Am Chem Soc, 2006. 128(23): p. 7608-12.
100. Drury, O.B., et al., The advantages of soft X-rays and cryogenic spectrometers for measuring chemical speciation by X-ray spectroscopy. Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section A, 2006. 559(2): p. 728-730.
Lebenslauf 94
Lebenslauf
Persönliche Daten Name Oliver Pilak
Geburtsdatum 05. Juni 1979
Geburtsort Lebach
Ausbildung Aug. 1989 - Juni 1998 Cusanus-Gymnasium des Landkreises St. Wendel
Juni 1998 Abitur
Wehrdienst Juli 1998 - April 1999 Fallschirmjägerbataillon 365, Lebach
Studium & Praktika Okt. 1999 - März 2004 Studium der Biologie and der Philipps-Universität,
Marburg
Okt. 2001 Vordiplom
Juli 2002 - Sep. 2002 Praktikum bei BASF AG, Ludwigshafen
April 2003 Diplomprüfungen in Mikrobiologie, Genetik,
Biochemie, Virologie
Mai 2003 - März. 2004 Diplomarbeit am Max-Planck-Institut für Terrestri-
sche Mikrobiologie, Marburg; Arbeitsgruppe von
Professor Dr. R. Thauer; Titel: Synthese von Hydro-
genase Hmd aus Methanothermobacter marbur-
gensis bei Wachstum unter Nickel-, Eisen- oder
Ammonium-Limitierung
Seit April 2004 Doktorarbeit am Max-Planck-Institut für Terres-
trische Mikrobiologie, Marburg; Arbeitsgruppe von
Professor Dr. R. Thauer, Titel: Kristallstruktur von
[Fe]-Hydrogenase Hmd
Danksagung 95
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Dr. Seigo Shima und Professor Dr. Rudolf K. Thauer
für die Überlassung des Themas und die Betreuung während der ganzen Zeit meiner
Doktorarbeit und für ihre Hilfe bei der Planung meiner weiteren beruflichen Laufbahn.
Professor Dr. W. Buckel danke ich herzlich für seine Bereitschaft, als
Zweitgutachter meiner Dissertation zur Verfügung zu stehen.
Mein Dank gilt allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppen Thauer und Shima für die
ständige Diskussions- und Hilfsbereitschaft und die angenehme Arbeitsatmosphäre.
Sonja Vogt danke ich neben der Herstellung der [Fe]-Hydrogenase-Mutanten für das
tägliche Umschiffen vielfältiger Hindernisse im Labor, die Inkenntnissetzung über
aktuelle Entwicklungen im sozialen Berufsumfeld und die Planung meines Lebens im
Allgemeinen. Meinem designierten Nachfolger Michael Schick danke ich für die nette
Zusammenarbeit und wünsche ihm viel Erfolg mit der [Fe]-Hydrogenase.
Ich danke herzlich Dr. Ulrich Ermler und Dr. Eberhard Warkentin für die
Datenauswertung und Strukturaufklärung von [Fe]-Hydrogenase und den
Mitarbeitern des Paul-Scherrer-Institutes in Brugg (Schweiz) für die Hilfe bei der
Datenaufnahme.
Erklärung 96
Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich meine Dissertation mit dem Titel
„Kristallstruktur von [Fe]-Hydrogenase Hmd“
selbständig, ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als der
von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient habe.
Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner
anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken
gedient.
__________________ ___________________
Ort, Datum Oliver Pilak