Kultivisanje bakterija

Za uspešno gajenje mikroorganizama u laboratoriji neophodno je da budu ispunjeni

sledeći uslovi:

1. Odgovarajući sastav podloge2. Odgovarajuća pH vrednost podloge3. Odgovarajući sastav atmosfere u kojoj se mo

gaje (npr. anaerobni mo zahtevaju atmosferu bez O2)

4. Odgovarajuća temperatura inkubacije (termostata)

5. Odsustvo konkurentskih organizama tj. organizama kontaminanata (ulaze u kompetitivne odnose sa gajenim mo i cesto prevladaju i potisnu gajeni mo)

pH-metar Termostat

Hranljive podloge

• služe za kultivisanje mo u laboratorijskim uslovima i izvori su materija za njihov rast i razmnožavanje

• nikad ne obezbedjuju uslove identične sredini iz koje su mo izolovani

• ne postoji univerzalna podloga• mogu sadržati neorganske i organske materije, ili

samo jedne od njih, uzavisnosti od potreba mo koji se kultivišu

• mineralne soli -višestruka uloga (utiču na pH, imaju puferske karakteristike, obezbedjuju adekvatan osmotski pritisak, aktiviraju enzime…)

• destilovana voda-u slobodnom (tečne podloge) ili vezanom stanju (čvrste podloge)

Hranljive podloge

• mesna voda-dobija se prelivanjem 1kg govedjeg mesa sa 2l hladne destilovane vode i kuvanjem smeše 30min (voda koja ispari dopuni se novom), a potom filtriranjem tečnosti kroz gazu i filter hartiju; dehidrirana mesna voda naziva se mesni ekstrakt

• peptoni-kompleksne smeše polipeptida, peptida i aminokiselina, dobijaju se enzimskom razgradnjom proteina (tripsinom, pepsinom) i rastvorljivi su u vodi

• ugljeni hidrati-najdostupniji izvor energije, dodaju se u obliku mono-, di- ili polisaharida

• ekstrakt kvasca -kompleksni izvor vitamina, posebno B grupe

Hranljive podloge

• agar-sastojak skoro svih čvrstih hranljivih podloga, dobija se od alge Gellidium corneum, ne rastvara se u hladnoj vodi, rastvaranjem u ključaloj vodi gradi koloidni rastvor, koji hladjenjem ispod 45°C prelazi u gel, daje hranljivim podlogama čvrstinu, a samo neke marinske bakterijske vrste imaju sposobnost razlaganja agra

• mogu da sadrže i:– telesne tečnosti (žuč, serum, krv i dr.)– indikatore– antibiotike– boje i dr.

• standardna podloga za gajenje bakterija je hranljivi agar ili MPA (meso-peptonski agar)

Podela hranljivih podloga

• Prema poreklu:1. Prirodne hranljive podloge -biljnog (krompir,

šargarepa…) ili životinjskog porekla (krv, jaje, žuč…)2. Sintetičke (vestacke) hranljive podloge –sadrže

samo sintetske materije čiji je hemijski sastav jasno definisan

3. Polusintetičke –hemijski sastav nije jasno definisan, pored materija sa jasno definisanim hemijskim sastavom sadrže i prirodne sastojke (pepton, serum, kvaščev ekstrakt…)

Podela hranljivih podloga

• Prema konzistenciji (agregatnom stanju):1.Tečne podloge -ne sadrže agar, u svom nazivu obično

nose naziv voda ili bujon (mesna voda, mesnopeptonski bujon…), primenjuju se najčešće za dobijanje biomase za biohemijska, fiziološka ili genetska ispitivanja

2.Čvrste podloge -sadrže 2% agar, u svom nazivu nose naziv agar (mesnopeptonski agar), primenjuju se najčešće za čuvanje stok kultura (kulture iz kolekcije), za izolaciju čiste kulture ili za ispitivanje kulturelnih osobina

3.Polučvrste (polutečne) podloge –sadrže 0,5-0,15% agara, koriste se za ispitivanje pokretljivosti mo

Kultivacija mikroorganizama

Podela hranljivih podloga

• Prema nameni:1. Neselektivne podloge –sadrže veću količinu

hranljivih materija i obezbedjuju rast velikom br. mo, koriste se za odredjivanje brojnosti bakterija koje se razvijaju pri odredjenim uslovima sredine (npr. ukupnog broja aerobnih mezofilnih bakterija), najčešće korišćena podloga ove vrste je mesnopeptonski agar (MPA) koji se često koristi i kao osnovni sastojak složenih podloga, mesnopeptonski bujon (MPB) je istog sastava samo ne sadrži agar

Mesnopeptonski agar (MPA)

Podela hranljivih podloga

2. Selektivne podloge –sadrže odredjene materije koje omogućavaju rast i razmnožavanje jednoj grupi mo, a onemogućavaju razvoj drugih grupa; primer selektivne podloge je podloga sa 6,5% NaCl-a (omogućava rast halofilnih bakterija); selektivne podloge na kojima rastu Gr-, a ne rastu Gr+ (ili bar većina), sadrže žučne soli, bazični fuksin, eozin, metilen plavo…; podloge koje inhibiraju rast Gr-, a omogućavaju rast Gr+ bakterijama sadrže antibiotike; tečne podloge ovog tipa nazivaju se podloge za obogaćenje, primer ovakve podloge je Selenit F bujon (sadrži Na selenit koji onemogućava rast velikom br. bakterija, a omogućava rast bakterijama roda Salmonella i Shigella)

Podela hranljivih podloga

3. Diferencijalne podloge –omogućavaju rast više grupa mo, koje je zbog prisustva odredjenih supstanci ili indikatora mouće razlikovati; primer ovakve podloge je krvni agar; krvni agar dobija se dodavanjem 5-10% defibrinisane krvi, najčešće ovčije ili govedje u sterilni, još uvek tečni hranljivi agar ili bazu za krvni agar; krvni agar ne sadrži indikatore, ali se na njemu mogu razlikovati tipovi hemolize (razlaganje eritrocita i hemoglobina od strane bakterije)

Podela hranljivih podloga

4. Kombinovane podloge -istovremeno su i selektivne i diferencijalne; endo agar sadrži bazični fuksin i laktozu i na njemu se diferenciraju bakterije koje fermentišu laktozu (njihove kolonije su obojene crveno) od onih koje je ne fermentišu (kolonije su obojene bledo roze ili su bezbojne), a selektivna je jer sprečava rast Gr+ bakterija; MSA (Manitol Salt Agar) sadrži 7,5% NaCl, omogućavajući rast malom br. mo, pre svega predstavnicima roda Staphylococcus, sadrži i manitol, pa se stafilokoke mogu razlikovati po tome da li fermentišu manitol (podloga menja boju iz crvene u žutu) ili ne fermentisu (podloga ne menja boju); Mc Conkey agar sadrži žučne solii kristal violet koji inhibiraju rast Gr+ bakterija, a laktoza pozitivne bakterije obojene su crveno ili intenzivno roze

Endo agar

Podela hranljivih podloga

• Prema nameni podloge se mogu još podeliti na:1. Podloge za čuvanje2. Podloge za izolaciju3. Podloge za subkultivisanje4. Podloge za kultivisanje posebne vrste

mikroorganizama5. Biohemijske podloge i dr.

Hranljive podloge

• Bez obzira na vrstu svaka podloga mora da zadovolji sledeće kriterijume:– Da sadrži sve potrebne materije za razvoj mo koji

se kultiviše– Da bude sterilna– Da ima odredjenu pH vrednost– Da bude prozirna i bistra kako bi mogli da se prate

rast i razmnožavanje bakterija (pojava kolonija) i uoče promene podloge kao posledica njihove metaboličke aktivnosti

Pravljenje hranljive podloge

• Koriste se dehidratizovane podloge, koje se pripremaju prema preskripciji proizvodjača

• Većina komercijalnih podloga je u praškastom obliku, pa ih je potrebno rastvoriti u vodi pre sterilizacije (sterilizacija se vrši u autoklavu)

Pravljenje hranljive podloge

• u slucaju čvrstih podloga neophodno je otopiti agar (agar je otopljen kada je rastvor potpuno bistar)

• podesiti pH vrednost dodavanjem NaOH ili NaCl, pH vrednost treba da bude za 0,1-0,2 visa od predvidjene, jer prilikom sterilizacije dolazi do pada pH vrednosti

• sterilizacija podloga u autoklavu • podloga namenjena za razlivanje u petri ploče, steriliše se u

erlenmajeru u količini do 2/3 njegove zapremine• podloga za kosi agar se razliva u epruvete u količini od 5ml• podloga se prohladi na oko 50°C i pristupa njenom razlivanju• za gajenje mo u tečnoj podlozi najčešće se koriste

erlenmajeri ili epruvete, dok se za gajenje mo na čvrstoj podlozi koriste petri ploče ili epruvete sa “kosim agarom”

Izolacija mikroorganizama

• Od kada je Koch zapazio da se na povrsini krompira, koji je koristio kao podlogu za gajenje mo, razvijaju pojedinacne i razlicite bakterijske kolonije, koriste se metode izolacije mo pomocu cvrste podloge

• Mikroorganizmi mogu da se izoluju iz razlicitih uzoraka (vode, zemljista, hrane, urina…)

• Kada se radi o uzorku vode, on se u laboratoriju donosi u sterilnoj boci, a zatim uzorak zasejava na podlogu metodom razmazivanja

Osnovne tehnike zasejavanja mikroorganizama

• Zasejavanje-postupak kojim se mo dovodi u kontakt sa hranljivom podlogom

• Metode zasejavanja mikroorganizama:

1. Metoda prelivanja (pour plate)2. Metoda razmazivanja (spread plate)3. Zasejavanje ubodom4. Zasejavanje potezom

Metoda prelivanja (pour plate)

• u petrijevu posudu aseptično se sipa odredjeno razblaženje uzorka (najčešće 1ml), a potom se prelije sterilnom podlogom otopljenom i ohladjenom na 45°C

• kružnim pokretanjem petrijeve posude uzorak i podloga se dobro izmešaju

• kada se podloga stegne, petrijeve posude se okrenu i inkubiraju

Metoda prelivanja (pour plate)

sipanje uzorka

prelivanje sterilnom podlogom

kružno pokretanje petrijeve posude (mešanje uzoraka i podloge)

inkubacija

Metoda razmazivanja (spread plate)

• Na površini razlivenog i ohladjenog agara stavi se 0,5ml uzorka ili manje, a potom se pomoću sterilne staklene špatule razmaže po površini podloge

Zasejavanje ubodom

• Koristi se pri zasejavanju čvrste hranljive podloge razlivene u epruvetama

• Sterilnom igličastom ezom uzme se kolonija mikroorganizama i zatim ubode u hranljivu podlogu

Zasejavanje potezom

• Koristi se prilikom subkultivisanja, odnosno presejavanja mikroorganizama na petrijevu ploču

• Sterilnom ezom sa omčom uzme se malo materijala i cik-cak potezom zaseje po površini agara

Zasejavanje potezom

Zasejavanje potezom

Zasejavanje potezom

• Zasejane petri ploce se obelezavaju na poklopcu (vrsta podloge, uzorak, datum zasejavanja)

• Inkubacija se vrsi u termostatu, pri cemu se petri ploce odlazu u obrnutom polozaju (tako da je poklopac sa donje strane)

• Nakon inkubacije iz kulture se pravi mikroskopski preparat bojen po Gramm-u, da bi se uverilo da se u kulturi nalazi samo 1 morfološki oblik bakterija, koje se boje jedinstveno po Gramm-u

• u slučaju da kultura nije čista pristupa se postupku iščišćavanja

Dobijanje čiste kulture

• čista kultura-bakterijska kultura koja je nastala iz 1 ćelije

• za identifikaciju jedne vrste bakterija neophodan je rad sa čistim kulturama, kako se ne bi dobili pogrešni rezultati

• u slučaju da kultura nije čista pristupa se postupku iščišćavanja

• Najčešće primenjivana metoda je metoda iscrpljivanja

Metoda iscrpljivanja• Deo kolonije se uzima ezom i prenosi u drugu

petri ploču i raznosi cik-cak pokretima tako da pokriva celu površinu, a zatim se ploča okreće za 90° i ista površina agara prelazi cik-cak potezima

• Postupak se ponavlja na još 2-3 petri ploče

Dobijanje čiste kulture

• Drugi način podrazumeva da se na jedan deo ploče zaseje inokulum sa ishodisne kolonije se (kultura koja se iščišćava), spali se eza, a potom se deo zasejane kulture razmazuje na nezasejani deo podloge, eza se ponovo spali, a postupak ponavlja 3-4x na istoj ploči, nakon inkubacije u slučaju da je kultura bila čista, u delovima podloge koji su poslednji zasejani javlja se 1 tip pojedinačnih kolonija, u slučaju da kolonija nije bila čista javiće se 2 ili više različitih tipova kolonija