36
LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “KULTUR JARINGAN” Nama : Jamilatuz Zahro NIM : 135040200111027 Kelompok : A1 (Rabu, 06.00) Asisten : Gusti Ngurah K. B. PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014

Kultur Jaringan

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Seiring perkembangan zaman, masalah di dunia semakin kompleks dan beragam. Salah satunya adalah masalah pangan, dimana luas panen semakin menurun dan permintaan akan pangan semakin meningkat. Hal ini menuntut diadakannya berbagai inovasi dalam bidang pangan, salah satunya adalah bioteknologi. Dalam bioteknologi, khususnya bioteknolo tanaman tidak dapat dipisahkan dari kegiatan kultur jaringan. Kultur jaringan adalah perbanyakan dengan menggunakan organ tanaman yang diarahkan untuk tumbuh dan berkembang sebagi tanaman baru yang kengkap.Dalam proses kultur jaringan, dapat menggunakan berbagai organ yang ada pada organisme seperti embrio, biji, kalus, dll. media dan akan menunjukkan. Eksplan yang mampu tumbuh akan menunjukkan tunasnya, sedangkan eksplan yang tidak mampu tumbuh akan mati. Kematian eksplan bisa disebabkan oleh banyak faktor yaitu faktor eksplan maupun media. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan sehingga dapat diketahui bagaimana cara mengkulturkan tanaman secara baik dan benar.

Citation preview

Page 1: Kultur Jaringan

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“KULTUR JARINGAN”

Nama : Jamilatuz Zahro

NIM : 135040200111027

Kelompok : A1 (Rabu, 06.00)

Asisten : Gusti Ngurah K. B.

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2014

Page 2: Kultur Jaringan

BAB 1PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangSeiring perkembangan zaman, masalah di dunia

semakin kompleks dan beragam. Salah satunya adalah masalah pangan, dimana luas panen semakin menurun dan permintaan akan pangan semakin meningkat. Hal ini menuntut diadakannya berbagai inovasi dalam bidang pangan, salah satunya adalah bioteknologi. Dalam bioteknologi, khususnya bioteknolo tanaman tidak dapat dipisahkan dari kegiatan kultur jaringan. Kultur jaringan adalah perbanyakan dengan menggunakan organ tanaman yang diarahkan untuk tumbuh dan berkembang sebagi tanaman baru yang kengkap. Dalam proses kultur jaringan, dapat menggunakan berbagai organ yang ada pada organisme seperti embrio, biji, kalus, dll.

Dalam proses kultur jaringan, eksplan ditanama pada media dan akan menunjukkan. Eksplan yang mampu tumbuh akan menunjukkan tunasnya, sedangkan eksplan yang tidak mampu tumbuh akan mati. Kematian eksplan bisa disebabkan oleh banyak faktor yaitu faktor eksplan maupun media. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan sehingga dapat diketahui bagaimana cara mengkulturkan tanaman secara baik dan benar.

1.2 TujuanDapat mengetahui dan dapat melakukan perbanyakan

tanaman melalui kultur jaringan serta dapat mengetahui proses pertumbuhan eksplan dan mengkategorikannya kedalam eksplan yang berhasil atau gagal.

Page 3: Kultur Jaringan

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kultur Jaringan dan Teknik-tekniknyaMenurut Prayitno, kultur jaringan adalah teknik

menumbuhkan bagian tanaman (jaringan atau organ) secara aseptic di dalam botol (in vitro) yang berisi nutrisi dan/atau hormone pertumbuhan. Kultur jaringan memiliki berbagai kegunaan, yaitu:

1. Kultur jaringan digunakan untuk perbanyakan tanaman secara cepat, dalam jumlah banyak, dan seragam.

2. Kultur jaringan merupakan alternatif perbanyakan tanaman secara konvensional (stek, biji).

3. Kultur jaringan juga sebagai upaya penyelamatan terhadap tanaman langka.

4. Kultur jaringan dapat digunakan untuk menciptakan tanaman yang bebas penyakit.

5. Kultur jaringan dapat digunakan untuk menumbuhkan embrio tanaman yang tidak memiliki endosperma. Misalnya: anggrek.

6. Kultur jaringan dapat digunakan untuk regenerasi tanaman hasil rekayasa genetik.

Sedangkan menurut Soegianto (2014) Tissue culture is the culture and maintenance of plant cells or organs in sterile, nutritionally and environmentally supportive conditions (in vitro). Tissue culture produces clones, in which all product cells have the same genotype (unless affected by mutation during culture). It has applications in research and commerce. In commercial settings, tissue culture is primarily used for plant propagation and is often referred to as micropropagation.

Page 4: Kultur Jaringan

Kultur jaringan tanaman bermula dari pembuktian teori totipotensi sel yang dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden

(1838). Menurut teori ini, setiap sel tanaman hidup mempunyai

informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk

dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai. (Yusnita, 2003).1.Memahami Konsep Skoog and Miller. Skoog dan Miller mengemukakan bahwa regenerasi tunas dan akar in vitro dikontrol secara hormonal oleh ZPT sitokinin dan auksin. Organogenesis adalah proses terbentuknya organ seperti tunas atau akar, baik secara langsung dari permukaan eksplan atau secara tidak langsung melalui pembentukann kalus terlebih dahulu. Dengan menggunakan eksplan empulur tembakau Skoog dan Miller mendemonstrasikan bahwa nisbah sitokinin dan auksin yang tinggi mendorong pembentukann tunas, sedangkan nisbah sitokinin dan auksin yang rendah mendorong pembentukann akar. Jika diberikan dalam jumlah yang seimbang sitokinin dan auksin akan mendorong pembentukann kalus. Disamping merangsang pembentukann tunas adventif, sitokinin juga merangsang multiplikasi tunas aksilar dan melawan dominasi apikal. Sedangkan auksin merangsang pembentukann akar adventif. Semua perbanyakan tunas tersebut dirangsang oleh sitokinin benziladenin (BA) dalam media kultur (1957).2. Macam-macam Teknik Kultur Jaringan. Berbagai macam teknik kultur jaringan yang telah dikenal antara lain:a. Meristem kultur, yaitu teknik kultur jaringan dengan menggunakan eksplan (bagian tanaman) dari jaringan muda atau maristem.b. Pollen atau anther kultur, yaitu teknik kultur jaringan dengan menggunakan eksplan dari serbuk sari atau benang sari.

Page 5: Kultur Jaringan

c. Protoplast kultur, yaitu teknik kultur jaringan dengan menggunakan eksplan protoplast (sel hidup yang telah dihilangkan dinding selnya).d. Cloroplast kultur, yaitu teknik kultur jaringan dengan menggunakan eksplan cloroplast untuk keperluan memperbaiki sifat tanaman dengan membuat varietas baru.e. Somatic cross atau silangan protoplasma, yaitu penyilangan dua macam protoplasma menjadi satu, kemudian dibudidayakan sehingga menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat baru. (Gunawan Winata Livi, 1992).

Kultur jaringan tanaman adalah suatu metode atau teknik mengisolasi bagian tanaman (protoplasma, sel, jaringan, dan organ) dan menumbuhkannya pada media buatan dalam kondisi aseptik di dalam ruang yang terkontrol sehingga bagian-bagian tanaman tersebut dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman lengkap. Penggunaan teknik kultur jaringan pada awalnya hanya untuk membuktikan teori “totipotensi” (“total genetic potential”) yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann (1838) yang menyatakan bahwa sel tanaman sebagai unit terkecil dapat tumbuh dan berkembang apabila dipelihara dalam kondisi yang sesuai.

Menurut Kusuma (2012) saat ini teknik kultur jaringan digunakan bukan hanya sebagai sarana untuk mempelajari aspek-aspek fisiologi dan biokimia tanaman saja, tetapi sudah berkembang menjadi metoda untuk berbagai tujuan seperti:

a. Mikropropagasi (perbanyakan tanaman secara mikro) Teknik kultur jaringan telah digunakan dalam membantu produksi tanaman dalam skala besar melalui mikropropagasi atau perbanyakan klonal dari berbagai jenis tanaman. Jaringan tanaman dalam jumlah yang sedikit dapat menghasilkan ratusan atau ribuan tanaman secara terus menerus. Teknik ini telah digunakan dalam skala stablis di berbagai negara untuk memproduksi

Page 6: Kultur Jaringan

secara komersial berbagai jenis tanaman seperti tanaman hias (anggrek, bunga potong, dll.), tanaman buah-buahan (seperti pisang), tanaman stablis dankehutanan (kopi, jati, dll). Dengan menggunakan metoda kultur jaringan, jutaan tanaman dengan sifat genetis yang sama dapat diperoleh hanya dengan berasal dari satu mata tunas. Oleh karena itu metoda ini menjadi salah satu stablishme dalam perbanyakan tanaman secara stablishm.

b. Perbaikan tanaman. Dalam usaha perbaikan tanaman melalui metoda pemuliaan secara konvensional, untuk mendapatkan galur murni diperlukan waktu enam sampai tujuh generasi hasil penyerbukan sendiri maupun persilangan. Melalui teknik kultur jaringan, dapat diperoleh tanaman homosigot dalam waktu singkat dengan cara memproduksi tanaman haploid melalui kultur polen, antera atau stab yang diikuti dengan penggandaan kromosom. Tanaman homosigot ini dapat digunakan sebagai bahan pemuliaan tanaman dalam rangka perbaikan sifat tanaman.

c. Produksi tanaman yang bebas penyakit (virus). Teknologi kultur jaringan telah memberikan kontribusinya dalam mendapatkan tanaman yang bebas dari virus. Pada tanaman yang telah terinfeksi virus, sel-sel pada tunas ujung (meristem) merupakan daerah yang tidak terinfeksi virus. Dengan cara mengkulturkan bagian meristem akan diperoleh tanaman yang bebas virus.

d. Transformasi genetic. Teknik kultur jaringan telah menjadi bagian penting dalam membantu keberhasilan rekayasa genetika tanaman (transfer gen). Sebagai contoh transfer gen bakteri (seperti gen cry dari Bacillus thuringiensis) ke dalam sel tanaman akan

Page 7: Kultur Jaringan

terekspresi setelah regenerasi tanaman transgeniknya tercapai.

e. Produksi senyawa metabolit sekunder. Kultur sel tanaman juga dapat digunakan untuk memproduksi senyawa biokimia (metabolit sekunder) seperti alkaloid, terpenoid, phenyl propanoid dll. Teknologi ini sekarang sudah tersedia dalam skala stablis. Sebagai contoh produksi secara komersial senyawa “shikonin” dari kultur sel Lithospermum erythrorhizon.

3. Memahami Tata Cara Perbanyakan Tanaman. Tata cara pembiakan tanaman secara kultur jaringan dapat dibagi menjadi beberapa tahap yang berurutan yaitu:a. Tahap 0, memilih dan menyiapkan tanaman induk untu eksplan.b. Tahap 1, inisiasi Kultur/ culture stablishmentc. Tahap 2, multiplikasi atau perbanyakan propagul (bahan tanaman yang diperbanyak seperti tunas atau embrio)d. Tahap 3, menyiapkan untuk transfer propagul kelingkungan eksternal yaitu pemanjangan tunas, induksi dan perkembangan akar.e. Tahap 4, aklimatisasi plantlet kelingkungan eksternal.

2.2 Eksplan dan Syarat Eksplan yang BaikEksplan yaitu bagian tanaman yang dijadikan bahan

inokulum awal yang ditanam dalam media, akan menunjukkan pertumbuhan dan perkembangan tertentu. Arah pertumbuhan dan perkembangan ditentukan oleh komposisi media dan zat pengatur tumbuh yang digunakan (dalam hal jenis zat pengatur tumbuh dan konsentrasinya), bagian tanaman yang dijadikan eksplan, lingkungan tumbuhnya (Gunawan, 1995).

Bahan tanaman yang dikulturkan lazim disebut eksplan. Dalam hal perbanyakan tanaman secara kultur jaringan, eksplan merupakan faktor penting penentu keberhasilan. Umur

Page 8: Kultur Jaringan

fisiologis, umur otogenetik, ukuran eksplan, serta bagian tanaman yang diambil merupakan hal-hal yang harus dipertimbangkan dalam memilih eksplan yang akan digunakan sebagai bahan awal kultur (Yusnita, 2003).

Sumber asal eksplan dapat mempengaruhi pertumbuhan dan potensial morfogenetiknya. Eksplan yang berasal dari satu jenis organ misalnya, juga diketemukan adanya keragaman dalam regenerasinya. Ukuran eksplan untuk dikulturkan juga mempengaruhi keberhasilannya. Ukuran yang terlampau kecil akan kurang daya tahannya bila dikulturkan, sementara bila terlampau besar akan sulit mendapatkan eksplan yang steril. Setiap jenis tanaman maupun organ memiliki ukuran eksplan yang optimum untuk dikulturkan (Armini,dkk, 1992).

Eksplan yang digunakan didalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatip besar, penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitip yang berupa selulosa microfibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan meristem yang terdapat pada kuncup diketiak daun disebut meristem aksiler (Elisa, 2005).

2.3 Macam-macam Sterilisasi Alat, Bahan, dan EksplanSterilisasi ruang kerjaRuang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis

adalah ruang steril, ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai bersihkan setiap pagi dengan zat anti kuman / desinfektan. Udara didalam ruangan disterilisasi dengan lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya ruangan yang dipakai, lampu

Page 9: Kultur Jaringan

ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan harus dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Sinar UV dapat menghasilkan ozon sehingga peneliti yang akan bekerja harus menunggu 15-30 menit setelah UV dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup. Peneliti yang akan bekerja didalam ruangan ini haras memakai jas laboratorium, masker, dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik, kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Didalam ruangan ini terdapat alat-alat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain Laminar Air Flow dan stenl box (entkas).

a. Laminar air flow (laf).Alat ini sangat baik dan efisien, namun harganya relatif mahal untuk menciptakan atmosfer yang steril dimana pekerjaan-pekerjaan aseptis harus dilakukan. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan hembusan udara yang sudah disaring Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 μm, spora-spora jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar sudah suci hama, laf kadang-kadang dilengkapi dengan UV. Sebelum mulai bekerja, permukaan meja kerja laf disemprot dan dilap dengan kain yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat dimasukkan ruangkerja. Alat-alat dan medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya, untuk botol kultur yang berisi media, permukaannya disemprot atau dilap dengan alkohol 70%. Untuk laf yang dilengkapi dengan UV, sebelum bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan kontaminan pada permukaan ruang kerja. Didalam laf juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukanuntuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti dengan lampu spiritus atau baktisinerator.

Page 10: Kultur Jaringan

b. Steril box (entkas)Alat lain untuk dapat menciptakan ruang kerja yang steril dengan harga yang relatip murah adalah steril box (entkas). Alat ini berwujud seperti kotak yang terbuat dari bahan kaca plywood, papan kayu atau yang lebih sederhana misalnya dari kardus yang didalamnya dilapisi aluminum foil. Steril box atau entkas dapat dibuat dengan ukuran sesuai dengan yang dikehendaki, yang penting untuk diperhatikan adalah tangan kita dapat menjangkau setiap dinding entkas karena akan memudahkan untuk membersihkannya. Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan lebih dahulu dengan melap kain yang sudah dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja didalam entkas disterilisasi dengan formalin tablet yang ditaruh didalam cawan porselin kecil dan diletakkan disudut-sudut ruangan, setiap cawan berisi satu tablet. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat didalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi media disemprot permukaannya satu persatu dengan alkohol 70% kemudian dimasukan kedalam entkas, dibiarkan 30 menit baru mulai bekerja. Pada entkas juga dapat ditambahkan lampu UV, entkas ini seluruh dinding luarnya harus ditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata dan kulit dari bahaya radiasi UV.

Sterilisasi media dan alat-alat media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas sterilisasinya dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya autoclave, bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk Sterilisasi ini adalah pada temperatur 121°C, tekanan antara 15 - 17 psi dengan waktu antara 15-40 menit tergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, Sterilisasi dilakukan dengan tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan tekanan yang lebih tinggi dengan waktu

Page 11: Kultur Jaringan

yang lebih lama. Autoclave yang digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang paling sederhana sampai yang dapat diprogram (programmable). Autoclave sederhana pemanasan airnya menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu tekanan dan waktunya dilakukan secara manual. Pada waktu mengoperasikan autoclave ini, jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum udara yang ada didalam autoclave diganti seluruhnya oleh uap air yang mendidih sehingga akan tercapai temperature 121°C ( langkah ini tidak dikerjakan untuk autoclave yang programmable). Setelah waktu Sterilisasi selesai (15-20 menit) klep-klep pembuang dibuka pelan-pelan, tekanan uap didalam autoclave pelan-pelan akan sama dengan tekanan atmosfer, pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa akan mengakibatkan medium yang ada didalam botol kultur mendidih dan meluap. Alat lain yang mempunyai prinsip kerja mirip dengan autoclave adalah pressure cooker, alat yang biasa digunakan untuk memasak didapur ini kapasitasnya sangat terbatas, sehingga tidak dianjurkan untuk pekerjaan pada skala laboratorium karena tidak efisien. Autoclave yang paling modern adalah yang programmable, dapat diatur waktu, suhu dan tekanannya secara automatis sehingga dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan yang lain. Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas yang tinggi, misalnya GAs, Ca-panthothenate dan Thiamin-HCl harus disterilisasi dengan ultra filtrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25°C). Dengan memakai ultrafiltrasi larutan yang berisi bahan-bahan yang termolabil dimasukkan kedalam medium kultur yang telah steril, langkah ini dikerjakan didalam ruang steril (laf) ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat. Ada beberapa macam Millipore filter, yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai terus dibuang (disposable), ada Millipore filter yang dilengkapi dengan holder, filter holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave

Page 12: Kultur Jaringan

(autoclavable). Porositas dari filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22 - 0,45 μm. Untuk larutan termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam jumlah besar (50 - 5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu dengan pompa vakum. Alat-alat yang digunakan didalam ruang steril antara lain : scalpel, pinset bermacam-macam ukuran, petridish, cork borrer, pipet, alat-alat gelas (botol kultur dsb), gunting, kertas saring dsb. Alat-alat tersebut, sebelum disterilisasi, dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus rapi dengan kertas coklat. Alat-alat yang akan disterilisasi dengan autoclave tidak boleh dibungkus dengan aluminum foil sebab uap air tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Untuk botol kultur, sebelumnya harus dicuci kemudian ditutup dengan aluminum foil atau bahan lain yang terbuat dari karet, kain atau plastik yang tahan panas. Botol kultur dengan penutup yang berulir, tidak boleh ditutup terlalu rapat ketika disterilisasi, ini diperlukan agar tidak terjadi perbedaan tekanan dengan ruangan didalam autoclave, perbedaan tekanan akan mengakibatkan pecahnya botol kultur.Sterilisasi eksplanEksplan yang digunakan didalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatip besar, penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitip yang berupa selulosa microfibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan meristem yang terdapat pada kuncup diketiak daun disebut meristem aksiler. Bagian tanaman yang bersifat meristematik seringkali terdapat dalam keadaan

Page 13: Kultur Jaringan

terbuka sehingga kotoran dan berbagai kontaminan seringkali menempel pada bagian permukaannya. Kontaminan ini dapat berupa bakteri, jamur dan spora-sporanya, serangga dan telur-telurnya, protozoa dsb. Keadaan ini terutama dijumpai pada tanaman donor yang tumbuh dilapangan. Kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptis yang terkendali, jika kontaminan ini tidak dihilangkan maka medium yang mengandung banyak nutrisi akan dengan cepat dipenuhi oleh mikrobia kontaminan tersebut. Untuk mengurangi adanya kontaminan pada permukaan eksplan, tanaman donor sebaiknya ditanam didalam rumah kaca.

2.4 Kontaminasi pada Kultur JaringanAdapun menurut Indrianto (2002) macam-macam dari

kontaminasi yaitu sebagai berikut :1. Eksplan

Eksplan awal merupakan sumber utama kontaminasi, tapi kontaminasi kembali dapat terjadi selama proses kultur. Pertama tama, media dan semua wadah dan alat harus disterilisasi. Semua kegiatan harus dilakukan pada kondisi higienis, meskipun tidak selalu perlu pada laboratorium yang steril. Udara merupakan sumber utama spora dan agen kontaminasi lainnya, termasuk badan dan pakaian si pelaksana. Pertumbuhan dan morfogenesis dalam mikropropagasi sangat dipengaruhi oleh keadaan jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan. Selain faktor genetis eksplan pada kultur in vitro yang telah disebutkan di atas, kondisi eksplan yang mempengaruhi keberhasilan teknik mikropropagasi adalah jenis eksplan, ukuran, umur dan fase fisiologis jaringan yang digunakan sebagai eksplan.

Page 14: Kultur Jaringan

Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Organisme – organisme tersebut secara universal terdapat pada jaringan tanaman. Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kondisi kering dan adanya organisme kompetitor menyebabkan mereka dalam kondisi terkontrol. Tapi, kondisi in vitro yang disukai eksplan, yaitu mengandung sukrosa dan hara dalam konsentrasi tinggi, kelembaban tinggi dan suhu yang hangat, juga disukai mikroorganisme yang seringkali tumbuh dan berkembang sangat cepat, mengalahkan eksplan.2. Kontaminasi permukaan

Kontaminasi mungkin terjadi pada permuakan tanaman, antar sel atau dalam sel tanaman. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia. Keterbatasan utama adalah untuk memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk mengeliminasi kontaminasi tanpa merusak jaringan tanaman. Jika permukaan tanaman ditutupi oleh rambut atau sisik, perhatian mesti diberikan untuk memastikan penetrasi bahan kimia, karena kontak dengan organisme sangat penting untuk sterilisasi. Ini biasanya dicapai dengan menambahkan detergen, agitasi (digoyang –goyang), atau membenamkan eksplan dengan sedikit tekanan untuk mengilangkan gelembung - gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme.3.     Kontaminasi endogenus

Organisme yang hidup pada jaringan tanaman lebih susah ditangani. Hal ini mungkin dapat dikontrol dengan pemberian pestisida atau fungisida sistemik yang diberikan

Page 15: Kultur Jaringan

pada tanaman stok sebelum dijadikan eksplan atau dapat juga diberikan di kultur itu sendiri.4. Eksudat

Tipe lain kontaminasi adalah eksudasi dari eksplan, bukan dari organisme lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara pemotongan atau perlakuan bahan kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi pada sel sekitar luka. Salah satu prosesnya adalah produksi bahan biokimia apakah sebagai produk pecahan atau sintesa sebagai mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi dari jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini mungkin atau mungkin tidak memberi pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur.5. Kondisi eksplan

Pertumbuhan dan morfogenesis dalam mikropropagasi sangat dipengaruhi oleh keadaan jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan. Selain faktor genetis eksplan pada kultur in vitro yang telah disebutkan di atas, kondisi eksplan yang mempengaruhi keberhasilan teknik mikropropagasi adalah jenis eksplan, ukuran, umur dan fase fisiologis jaringan yang digunakan sebagai eksplan.6.  Media awal

Biasanya digunakan media dasar dengan sukrosa tanpa penambahan hormon untuk penanaman eksplan awal. Ini menghindari pemborosan media dimana sebagian kultur biasanya akan terkena kontaminasi ataumati akibat perlakuan awal. Kebanyakan kontaminasi jamur atau bakteri akan terjadi pada 2 minggu pertama.Pada beberapa contoh, pestisida mungkin dimasukkan pada media awal atau sukrosa mungkin dihilangkan agar eksplan dapat tumbuh tanpa terkontaminasi. Tanaman yang baru tumbuh ini lalu dapat dipindah dengan hati - hati dengan cara

Page 16: Kultur Jaringan

mensubkultur. Perhatian juga mesti diberikan pada ruang persiapan kultur, untuk menghindari kontaminasi.7. Kondisi kultur

Tipe substrat hampir semua kultur dilakukan pada media semi-solid (semi-padat) dengan menggunakan agar atau Gelrite. Gel ini menjadi pendukung fisik untuk eksplan dan meningkatkan aerasi pada media. Gelrite adalah produk sintetik yang memiliki keuntungan gel yang lebih jernih dibandingkan agar yang agak keruh (dari ekstrak rumput laut). Gelrite membuat pengamatan kontaminan atau perkembangan akar lebih mudah. Gelrite memiliki kondisi fisik dan kimia yang sedikit berbeda sehingga memerlukan sedikit modifikasi pada persiapan media.

Page 17: Kultur Jaringan

BAB IIIMETODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan a. Alat:- Gunting : untuk memotong nodus tanaman- Botol kaca : sebagai wadah eksplan saat sterilisasi- LAFC : tempat sterilisasi dan penanaman- Bunsen : untuk membakar alat tanam- Cawan Petri : untuk meletakkan alat tanam- Tisu : untuk mengusap alat tanam- Pisau scalpel : untuk memotong eksplan- Pinset : untuk menanam eksplan- Plastik dan karet : untuk menutup botol kulturb. Bahan:- detergen : untuk sterilisasi eksplan- kloroks : untuk sterilisasi eksplan- fungisida : untuk sterilisasi eksplan- aquades : untuk membilas eksplan- Alkohol : untuk sterilisasi alat

3.2 Metode Kultur Jaringan

Menyiapkan alat dan bahan mensterilkan semua peralatan

STERILISASI EKSPLAN

Memotong nodus batang/pucuk tanaman krisan sesuai kebutuhan (ukuran di lebihkan)

Page 18: Kultur Jaringan

Memasukkan kedalam botol yang telah berisi 10% detergen, goyang-goyangkan selama 10 menit, lalu

membilas dengan air mengalir

Memasukkan kedalam botol yang telah berisi cloroks (bahan aktif NaOCl) 30%, goyang-

goyangkan selama 10 menit, lalu membilas dengan aquades

Memasukkan kedalam botol yang telah berisi aquades steril dan memasukkan ke LAFC

Memasukkan kedalam botol yang telah berisi fungisida, merendam selam 5 menit, membilas

dengan aquades

PENANAMAN EKSPLAN

Menyiapkan alat dan bahan serta planlet yang telah disterilkan

Membersihkan LAFC dan mensterilkan dengan UV selama 20 menit

Menyemprotkan alkohol 70% pada tangan dan semua alat yang akan digunakan

Page 19: Kultur Jaringan

Alat-alat ditata rapi di LAFC (bunsen, pinset, pisau scalpel, alkohol, cawan petri)

Memasukkan planlet kedalam LAFC

Mengambil planlet dan mengeringkan dengan tisu

Memotong planlet menggunakan pisau scalpel

Membersihkan pisau scalpel (mencelupkan kedalam alkohol 90%, lalu di bakar diatas api

bunsen) sebelum dan sesudah pemakaian

Menanam eksplan pada media tanam, sebelumnya membersihkan bibir botol dengan cara dibakar di

api bunsen

Menutup botol menggunakan plastik atau alumunium foil dan karet

Menyimpan botol kultur yang telah ditanam di ruangan khusus

Melakukan pengamatan dan mendokumentasikan secara berkala

Page 20: Kultur Jaringan

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

No.

Hari, Tanggal

Pengamatan

DokumentasiKeterangan

Pertumbuhan

1.Selasa, 2 Desember 2014

Tanaman mulai mengalami kematian, ditandai dengan warnanya yang kecoklatan.

2.Kamis, 4 Desember 2014

Tanaman mengalami kematian lebih parah. Selain itu, mulai muncul hifa jamur seperti kapas, berwarna putih di medianya.

3.Selasa, 8 Desember 2014

Tanaman mulai mati secara keseluruhan. Hifa jamur pada media berubah menjadi agak kecoklatan.

Page 21: Kultur Jaringan

4.2 Kondisi Pertumbuhan EkplanPada pengamatan pertama, yaitu saat tanaman berusia

lima hari, tanaman mulai menunjukkan kematian selnya. Warna batang menjadi kecoklatan. Sedangkan pada pengamatan kedua, kematian sel semakin meluas dan terdapat kontaminasi pada media. Kontaminasi terjadi dalam bentuk jamur dengan hifa berwarna putih yang terdapat di sekitar tanaman. Pada pengamatan ketiga, tanaman mati 80%. Selain itu, kontaminasi juga semakin parah. Hal ini ditunjukkan dengan kondisi media yang berwarna kecoklatan. Hifa jamur pun juga berwarna oranye kecoklatan.

4.3 Faktor Penyebab Keberhasilan dan Kegagalan KulturMenurut Soegianto (2014), kultur jaringan harus

memenuhi syarat-syarat berikut: 1) jaringan atau eksplan yang tepat; 2) media pertumbuhan yang sesuai, yang mengandung sumber energy, bahan anorganik; 3) kondisi aseptik (steril); 4) ZPT; 5) subkultur yang berkala. Berdasarkan hal tersebut, dapat diketahui bahwa keberhasilan kultur jaringan sangat bergantung pada pemenuhan syarat-syarat tersebut. Pada kultur yang dilakukan pada praktikum ini terjadi kegagalan. Hal ini diduga diakibatkan oleh eksplan dan kesterilan media. Pada praktikum ini, eksplan yang dipakai berkualitas kurang baik dan sedikit tua. Sedangkan pada penanamannya terjadi beberapa kali kejadian tidak membersihkan alat yang dipakai sehingga terjadi kontaminasi pada media.

Page 22: Kultur Jaringan

BAB VPENUTUP

5.1 KesimpulanTerdapat banyak faktor yang mempengaruhi

keberhasilan kultur jaringan. Pada kultur jaringan yang saya lakukan pada praktikum ini tidak berhasil. Hal ini diduga karena faktor kondisi eksplan yang sudah tidak baik dan kondisi media serta alat yang digunakan yang tidak steril.

5.2 SaranSemoga di praktikum selanjutnya leboh baik lagi dan

praktikum bisa dilakukan dengan sebenar-benarnya yaitu melaksanakan semua kegiatanpraktikum secara mandiri dan bertahap.

Page 23: Kultur Jaringan

DAFTAR PUSTAKA

Elisa. 2005. Medium Kultur Jaringan. Yogyakarta: UGM Gunawan LW. 1987. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor. Hal. 252.

Prayitno, Joko._______. Kultur Jaringan Gaharu. Balai Teknologi Lingkungan Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi

Rahardja, P. C., dan Wahyu, W. 2003. Aneka Cara Memperbanyak Tanaman. Agromedia Pustaka. Jakarta.

Soegianto, Andi. 2014. Teknik Kultur Jaringan. Disampaikan dalam Kuliah Bioteknologi Pertanian Kelas A Agroekoteknologi 2013. Malang

Widyastuti, N. 2002. Inovasi Memperbanyak Bibit Tanaman. Diakses dari www.sinarharapan.co.id/berita/0202/13/ipt02.html Tanggal 14 Desember 2014 .

Yusnita, 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien. Agromedia Pustaka, Jakarta.