Click here to load reader

kultur jaringan hewan

  • View
    236

  • Download
    3

Embed Size (px)

Text of kultur jaringan hewan

  • BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM

    KULTUR JARINGAN HEWAN

    Penyusun: KholifahHolil, M.Si.

    JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN)

    MAULANA MALIK IBRAHIMMALANG 2012

  • KATA PENGANTAR

    Segala puji syukur kehadirat Allah SWT atas kesempatan yang diberikan untuk selesainya penyusunan buku petunjuk praktikum kultur jaringan hewan ini. Buku petunjuk ini disusun berdasarkan kebutuhan mahasiswa biologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang khususnya untuk para mahasiswa yang menempuh matakuliah kultur jaringan hewan.

    Buku petunjuk ini terdiri dari beberapa bagian tetapi secara garisbesar buku petunjuk praktikum ini berisi dasar-dasar praktikum yang dilakukan dalam kultur jaringan hewan. Sebagai dasar praktikum maka diharapkan buku petunjuk ini memberikan ketrampilan dasar bagi para mahasiswa khususnya mahasiswa yang menempuh matakuliah kultur jaringan hewan dan umumnya bagi mahasiswa biologi atau mahasiswa yang serumpun.

    Pada akhirnya tak ada gading yang retak. Saran dan kritik untuk pengembangan lebih lanjut guna penyempurnaan buku petunjuk ini benar-benar sangat diharapkan dan semoga bermanfaat.

    Malang, Februari 2012

    Penyusun

  • DAFTAR ISI

    Kata Pengantar.....i

    Daftar Isi.........................ii

    I. PreparasidanSterilisasiAlatdanBahan....................................1 II. SterilisasiRuang.....................................4 III. UjiSterilitas..6 IV. Pembuatan Media Stock.....8 V. KulturSel Baby Hamster kidney (BHK).....10 VI. PengamatanSelHasilKultur BHK..12 VII. In Vitro Maturation (IVM)................15

  • PREPARASI DAN STERILISASI ALAT DAN BAHAN

    A. Pendahuluan Teknik kultur jaringan merupakan teknik untuk mengembangbiakkan sel,

    jaringan maupun organ di dalam media yang sesuai yang dilakukan di luar tubuh organisme. Keberhasilan teknik ini salah satunya ditentukan oleh teknik sterilisasi yang tepat untuk menghasilkan alat-alat maupun bahan yang steril yang akan digunakan dalam kultur jaringan. Jenis alat dan bahan yang akan disterilisasi didasarkan pada beberapa pertimbangan diantaranya adalah pada ketahanan alat maupun bahan tersebut terhadap perlakuan suhu yang diberikan pada saat sterilisasi, komponen penyusun, dan lain-lain.

    Alat-alat dari jenis glassware menunjukkan ketahanan yang lebih terhadap panas daripada alat-alat selain itu. Untuk beberapa bahan tertentu didasarkan pada komponen penyusunnya (ada yang dengan menggunakan filter dan ada juga yang menggunakan autoclave). Berikut ini adalah beberapa metode untuk sterilisasi (table 1) yang dapat dijadikan bahan pertimbangan untuk proses sterilisasi. Tabel 1. Metode sterilisasi menurut Freshney (2005) Method Conditions Materials Limitations Dry heat 160C, 1 h Heat stable: metals, glass,

    PTFE. Some charring may occur, e.g., of indicating tape and cotton plugs.

    Moist heat 121C, 1520 min Heat-stable liquids: water, salt

    solutions, autoclavable media. Moderately heat-stable plastics: silicones, polycarbonate, nylon, polypropylene

    Steam penetration requires steam-permeable packaging. Large fluid loads need time to heat up.

    Irradiation: Irradiation

    25 kGy

    Plastics, organic scaffolds, heat-sensitive reagents and pharmaceuticals.

    Chemical alteration of plastics can occur. Macromolecular degradation.

    Electron beam

    25 kGy

    Plastics, organic scaffolds, heat-sensitive reagents and pharmaceuticals.

    Needs high-energy source. Not suitable for average laboratory installation.

    Microwave

    5 min full power

    Aqueous solutions and gels such as agar.

    Only useful for small volumes; usually just for melting agar

    Short-wave UV 254 nM, 50100 W, 30 min

    Flat surfaces, circulating air. Will not reach shadow areas. Spores resistant.

    Chemical: Ethylene oxide

    1 h

    Heat-labile plastics. Items must be ventilated for 2448 h; leaves toxic residue.

    Hypochlorite

    3002500 ppm 30 min

    Contaminated solutions. Plastics.

    Needs extensive washing. May leave residue.

    70% Alcohol Soak for 1 h Dissecting instruments (combined with

    Does not kill spores. Fire risk with

  • flaming). Some plastics. flaming. Precast Perspex or Lucite may shatter if immersed in alcohol.

    Filtration 0.1- to 0.2-m

    porosity All aqueous solutions; particularly suitable for heat-labile reagents and media. Specify low protein binding for growth factors, etc.

    Not suitable for some solvents, e.g., DMSO. Slow with viscous solutions

    B. Tujuan 1. Untuk menyiapkan alat-alat yang akan digunakan dalam kultur jaringan

    hewan 2. Untuk mengetahui teknik sterilisasi pada berbagai alat dan bahan yang

    akan digunakan dalam kultur jaringan hewan.

    C. Alat dan Bahan Disinfectan (300ppm hypoclorit yang diencerkan dengan menggunakan detergen seperti Clorox atau detegen lain yang biasa digunakan) Detergen (7X atau Decon, teepol) Ember Kuas penggosok botol/Busa pencuci Keranjang stainless Aluminum Foil Oven Autoclave

    D. Cara Kerja 1. Rendam alat-alat yang akan digunakan dengan menggunakan air yang

    ditambah dengan detergen yang mengandung disinfectan (contoh larutan teepol). Biarkan selama 24 jam.

    2. Sikat dan bilas alat-alat tersebut di bawah air mengalir lakukan sebanyak 20x.

    3. Bilas dengan aquades dan Deionized Water (DI), lakukan sampai tidak ada busa yang menempel pada glassware.

    4. Keringkan alat-alat tersebut dalam oven suhu 50C -60C. Jika sudah kering bungkus dengan aluminium foil.

    5. Sterilisasi kering untuk glassware dan alat-alat stainless lainnya dalam oven pada suhu 125oC selama 3 jam atau pada suhu 160C selama 1 jam.

    6. Sterilisasi basah untuk alat-alat yang bukan tergolong glassware dan alat-alat stainless dalam autoclave pada suhu 121C selama 15 menit dan selanjutnya keringkan dalam oven suhu 50C -60C.

    7. Simpan alat-alat yang sudah disterilisasi dalam oven dengan suhu 50C -60C tersebut atau simpan dalam lemari penyimpanan yang disinari dengan bolam dalam ruang steril.

    8. Alat-alat siap untuk digunakan (maksimal penyimpanan 48 jam).

  • E. Data Pengamatan

    No Nama Alat Fungsi Jenis Sterilisasi

    F. Tugas/Pertanyaan 1. Jelaskan fungsi alat-alat dibilas dengan menggunakan DI? 2. Apa tujuan sterilisasi kering dan sterilisasi basah 3. Sebutkan alat-alat apa saja yang tergolong disterilisasi dengan sterilisasi

    kering dan yang tergolong disterilisasi dengan sterilisasi basah pada praktikum yang sudah saudara lakukan.

  • STERILISASI RUANG

    A. Pendahuluan Ruang menjadi salah satu pendukung dalam menunjang keberhasilan

    dalam kultur jaringan hewan. Ruang yang terbebas dari kontaminan akan menjadi lingkungan yang tepat untuk tumbuhnya sel/jaringan yang dikultur. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mempersiapkan ruangan yang tepat untuk keberhasilan kultur jaringan. Beberapa diantaranya adalah pada prilaku dan penanganan yang dilakukan oleh peneliti. pemilihan teknik sterilisasi, dan intensitas sterilisasi.

    Ada beberapa teknik sterilisasi ruang yang bisa digunakan mulai dari cara fisik/mekanik, kimiawi dan radiasi. Teknik sterilisasi ruang dengan cara fisik/mekanik yaitu sterilisasi dengan cara membersihkan ruangan dengan melakukan pengepelan atau penyapuan dengan dikombinasi dengan pemakaian disinfektan. Sedangkan teknik sterilisasi cara kimiawi misalnya dengan membersihkan ruangan menggunakan alcohol 70% atau melalui proses fumigasi. Sementara itu teknik sterilisasi dengan cara radiasi adalah dengan cara penyinaran menggunakan sinar UV.

    Selain teknik sterilisasi di atas maka intensitas sterilisasi juga perlu diperhatikan. Sterilisasi ruang yang dilakukan secara berkala akan meminimalisir kontaminan.

    B. Tujuan 1. Untuk menyiapkan ruangan yang steril yang akan digunakan dalam kultur

    jaringan hewan. 2. Untuk mengetahui teknik sterilisasi ruang yang akan digunakan dalam

    kultur jaringan hewan.

    C. Alat dan Bahan Sapu Lap

  • Kain Pel Disinfektan Alkohol 70%

    D. Cara Kerja 1. Laminar Air Flow (LAF)

    Bersihkan permukaan LAF dengan menggunakan lap bersih atau tissue. Semprotkan area kerja dengan menggunakan alkohol 70% dan lap

    dengan menggunakan tissue. Semprotkan kembali area kerja dengan menggunakan alkohol 70% dan

    biarkan kering sendiri. Lakukan penyinaran dengan menggunakan UV minimal 1 jam.

    Lakukan langkah ini sebelum maupun sesudah digunakan. Jika LAF tidak sedang digunakan hindari meninggalkan alat maupun bahan di atas area kerja yang ada di dalam LAF.

    2. Inkubator

    Nonaktifkan incubator, keluarkan rak incubator. Bersihkan rak incubator dari lemak, kotoron media yang tumpah, debu,

    dan lain-lain yang bisa menjadi sumber kontaminan. Lakukan dengan menggunakan tissue yang ditetesi alcohol 70%. Jika perlu rendam dengan air hangat terlebih dahulu.

    Rendam dengan menggunakan detergen yang telah ditambah disinfektan (minimal 1 jam), gosok dengan menggunakan busa pembersih, bilas di bawah air mengalir dan bilas kembali dengan menggunakan deionized water (DI). Keringkan.

    Masukkan rak ke dalam incubator dan semprot dengan menggunakan alcohol 70%.

    Inkubator siap untuk digunakan.

    3. Ruang Kultur Bersihkan lantai dari debu dan kotoran lain dengan menggunakan sapu. Lakukan pengepelan dengan detergen yang ditambah dengan

    disinfektan (misal wipol). Lakukan penyinaran dengan sinar UV (minimal seminggu sekali

    dengan durasi minimal 1 jam).

    E. Data Pengamatan Alat/Ruang yang disterilisasi

    Metode sterilisasi (cara fisik, kimia, radiasi)

    Hasil Uji Sterilitas

    LAF Inkubator Ruan