Patoloji Patoloji laboratuvarlaboratuvarıınnııkurduk: (Daha) kurduk: (Daha) ĐĐyi bir kesit yi bir kesit ve yayma ive yayma iççin ne yapmalin ne yapmalııyyıız?z?

88--9 May9 Mayııs 2010, s 2010, ĐĐZMZMĐĐRR

Bu sunumda yer alan resimler yazarBu sunumda yer alan resimler yazarıın izni n izni olmadan kullanolmadan kullanıılamaz. lamaz.

Mikroskop AnsiklopedisiPatoloji Laboratuvarını kurduk

(Daha) Đyi bir kesit ve yayma için ne yapmalıyız?

Sait Şen

9/5/2010

Patoloji Laboratuvarını kurduk: (Daha) Đyi bir kesit ve yayma için ne yapmalıyız?

• Fiksasyon, takip, gömme• Kesit, yayma, boyama

– Teknisyenlerimiz– Uzmanlık öğrencilerimiz– Patologlar

• Tanı koyma, araştırma, eğitim• Mikroskop ve ataşmanlar

Mikroskop

• Gözle görünemeyecek kadar küçük objelerin optik lensler ve yansıtıcılar aracılığı ile istenen seviyelerde büyütülmesinde kullanılan sistemlerin geneline verilen isimdir.

• Đlk mikroskop Hollandalı Zacharias Janssen, – 1590 dolaylarında bir teleskobu tadili ile

• Bugünkü mikroskobun ana prensiplerini ise 17. asırda Hollandalı Anton van Leeuwenhoek ve Đngiliz Robert Hooke bulmuşlardır.

Büyüteç

Antonie van Leeuwenhoek

6

Oküler

Objektif

Işık Kaynağı

Numune

BÜYÜTME: Oküler X Objektif

Kondanser

MĐKROSKOP YAPISI

8

MMĐĐKROSKOP TKROSKOP TĐĐPLERPLERĐĐ

• KULLANIM ALANLARINA GÖRE : – Bioloji ve medikal bilimler

– Endrüstri ve materyal bilimler

• STEREO MĐKROSKOP

• BĐYOLOJĐK MĐKROSKOP

• INVERTED MĐKROSKOP

• ENDÜSTRĐYEL MĐKROSKOP

• POLARĐZE MĐKROSKOP

9

MONOKÜLER MĐKROSKOP

BĐNOKÜLER MĐKROSKOP

TRĐNOKÜLER MĐKROSKOP BĐNOKÜLER MĐKROSKOP

Sadece tek gözle bakılır.Her iki gözle bakılabilir.Her iki gözle bakılabilir.+Görüntü aktarımı için gerekliçıkış mevcuttur.

GÖZLEM TÜPLERĐNE GÖRE

10

ÇOKLU EĞĐTĐM ATAÇMANLARI• Birden fazla kişi aynı anda gözlem yapabilir• Gereğinde diğer yardımcı ataçmanlar, mikrofoto, video vb eklenebilir.• Mikroskop tipine göre 2 , 3 , 5 veya 21 kişi aynı anda gözlem yapabilir. • Gözlem esnasında istenen nokta hareketli ışıklı ok sistemi ile gösterilebilir.

11

MMĐĐKROSKOP TKROSKOP TĐĐPLERPLERĐĐ

• AYDINLATMA KAYNAĞINA GÖRE :

• Görünen ışık kaynağı kullananlar – Halojen ışık, Led lamba, ayna

– Optik mikroskop, polarizasyon, faz kontrast, karanlık saha, interferans mikroskobu, inverted

• Diğer ışın ve ışıkları kullananlar – Flöresan ışık

• Colibri

– Elektron mikroskobi

– X ray

Işık kaynakları

Işık kaynağına göregeçirgen-yansıtmalı

14

Işık kaynağı

Kondanser

Objektifler

Okülerler

Fokus ayarları

Işık ayarı

INVERTED MĐKROSKOP• Doku–Hücre kültürleri, IVF (Mikroenjeksiyon) ünitelerinde kullanılır.• Petri kapları, Flaskler, Kültür şişelerinin kullanılabilmesine uygun• Numune mesafesine sahiptir.• Toplam büyütme Max. 400x civarındadır.• Genelde faz kontrast tiptedir.

15

MMĐĐKROSKOP TKROSKOP TĐĐPLERPLERĐĐ

• Patolojide mikroskoplar :– Stereo mikroskop

• Diseksiyon mikroskobu

– Düz mikroskop• Polarize mikroskop

– Flöresan mikroskop

STEREO MĐKROSKOP

Mikroskop

• Işık kaynağı– Halojen, led, ksenon, civa, kömür

• Kondansör– Abbe

• Objektif – 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 100

• Oküler– 5, 10, 15, 20, 30

• Maksimum büyütme – Ojektif X oküler

Oküler

20

Büyütmeler : 5X-10X-15X-20X-30X

Görüş alanları : 18-20-22-26.5

Görüş alanları

182022

OKÜLER

Objektif - ler

• A-Plan: – giriş seviyesi - rutin uygulamalara uygun

• Achroplan – mikrofotografiye uygun

• Plan-Apochromat– Kaliteli - pahalı

• Flörid

22

Akromat Plan Akromat Plan Apokromat

Plan40X / 0.65

0.17

Ach40X / 0.65

0.17

UPLAPO100X / 1.35 Oil

0.17

%70-80 net bölge %96-99 net bölge %100 net bölge

OBJEKTĐF TĐPLERĐ

Objektifler

Objektifler

Objektifler

Büyütme renk bandıKırmızı:4XSarı :10XYeşil :20XMavi :40XBeyaz :100X

Max. lamel kalınlığı

Numerik aralık:Kondanser ayarıbu seviyede yapılmalıdır.

Objektif tipi

Objektif

• Işık mikroskobi

• Flöresan mikroskobi

• Yakın

• Uzak

Objektif

28

X ve Y eksenkoordinatları

ŞARYO• Numunenin sağa-sola ve ileri-geri hareketi için

kullanılır.• X ve Y ekseninde koordinatlar bulunur.

29

Plan40X / 0.50

0.17

Numerik açıklık değeri

KONDANSÖR• Kondansör ; ışık kaynağından gelen dağınık haldeki ışığı bir

mercek vasıtası ile toplayarak objektife gönderir.• Đyi bir görüntü için kondanser ayarı objektifin numerik açıklık

seviyesiyle aynı değerde ayarlanmalıdır. • Numerik açıklık (NA) her objektif üzerinde belirtilmektedir.

Kondansör

34

KABA ve ĐNCE FOKUS• Objektifler numuneye belirli bir mesafede iken net görüntü alabilir.

– Bu mesafe fokus mesafesidir ve her büyütmede farkeder.

• Fokuslama ile bazı mikroskoplarda şaryo , bazılarında ise objektifler hareket ettirilir.• Hassas fokuslama knobunun üzerindeki her birim 1µm – 3µm lik hareket sağlar.• Hassas fokuslama ile numunede derinlik hesabı yapılabilir.

Şaryo – makro - mikro ayar motorize

36

MĐKROSKOP AKSESUARLARI

• ATAÇMANLAR : Mikroskopta farklı görüntüleme teknikleri için

kullanılan parçaların geneline verilen isimdir.-Çoklu eğitim ataçmanları-Flöresan ataçman-Polarize ataçman-Mikrofotografi ataçmanı

-Faz Kontrast ataçman-Karanlık saha (Darkfield) ataçman-DIC Ataçman (Differantial Interference Contrast) 3D-Çizim ataçmanı-Mikrometre ataçmanı

-Görüntü analiz programları

Flöresan mikroskobu

38

FLORESAN ATAÇMAN• Normal ışık mikroskobu teknikleri ile görüntülenemeyen bazı objelerin, özel boyama

maddeleri ile boyanarak (DAPI , FITC , Rhodamine , Texas red v.b. ) boyayı absorbe etmesi sağlanır.

• Boyalı preparat üzerine boyandığı maddenin yansıma yapabileceği uygun dalga boyunda ışık gönderilir.

• Yansıtmalı ışık (Reflected ligh)t prensibine göre çalışır.

39

Oküler Barrier filtre

Objektif

Numune

Lamba

Dichroic

Exciter filtre

FLORESAN ATAÇMAN

Đmmunflöresan mikroskobi

Direkt flöresan işaretli antikor– Đmmun globülinler (IgA, IgG, IgM)– Hafif zincir (kappa, lambda)– Kompleman (C3, C1q)– Fibrinojen– Albumin?

Flöresan Boyalar– Kongo red– Tioflavin T

Led Flöresan gelişmiş

43Polarize kayaç görüntüsü

POLARĐZE ATAÇMAN• Kristal yapıların incelenmesinde kullanılır• Amiloid birikimleri

– Kayaç, mineral yapılar, Cam, seramik, Đlaç kristalleri, Gıda ( Nişasta, Vitaminler)– Likit kristal yapılar, Polimerler. – Jeoloji ve Maden mühendisliği dallarının en önemli aracıdır.

• F:\2005\2005 olympus mikrofoto\WCN amyloid\P6090202.JPG

47

Oküler

Faz kontrast Objektif

Işık kaynağı

Numune

Kondanser

Faz kontrast ring

FAZ KONTRAST ATAÇMAN

• Kullanım alanları :• -Hücre, doku kültürleri• -Bakteri, Plankton v.b

Faz kontrast

49

DIC ATAÇMAN(Differantial Interference Contrast)

• Yüzeydeki girinti ve çıkıntıları görünür hale getirmek için kullanılan ataçmandır. • Işığın numuneye açılı gelmesi ve gölgelenme sayesinde yüzey şekillerinin belirmesi

mantığı ile çalışır. • Yüksek kalitede objektifler kullanılır.

50

Plan40X/0.65

Oküler

Objektif

Işık kaynağı

Numune

Kondanser

Darkfield atç.

KARANLIK SAHA ATAÇMANI (DARKFĐELD)

• Direkt ışık altında çok parlayan ve ışığı ayna gibi yansıtan özellikteki numuneler için kullanılır.

• Numuneye gelen ışığın merkezi kapatılır, Işığın dolaylı yoldan numuneye gelmesi ile parlamayan görüntü elde edilir.

Karanlık saha

Karanlık saha

Mikroskopların özellikleri

• Geçirgen-yansıtmalı

• Aydınlık-karanlık saha

55Mikrofotografi Dijital mikrofotografi

MĐKROFOTOGRAFĐ• Mikroskoptan elde edilen görüntülerin belgelenmesi, saklanması , için gerekli olan ekipmanlarının tümüne verilen

isimdir. • Yakın zamana kadar film şeritleri ile çalışılmaktaydı.

– Film banyo, baskı ve kalite sorunları içeriyordu.

• Bu gün dijital fotografi. • Dijital sistemlerde mikroskoptan elde edilen görüntüler bilgisayara aktarılabilmekte ve farklı uygulamalarda

kullanılabilmektedir.

Digital kamera adaptasyonu

59

okülermikrometre

10X objektif görüntüsü 40X objektif görüntüsü

•

MĐKROMETRELER• OKÜLER MĐKROMETRELERĐ : Numune

üzerinde mikron olarak boyut ölçümleri için kullanılan ve okülere takılan parçalardır.

• Görüntü üzerine düşen mesafe çizgileri farklıbüyütmelerde farklı mesafelere karşılık gelmektedir.

• Örneğin 10X objektifte her bir çizgi aralığı 10 mikron iken, 40X objektifte 2.5 mikrona karşılık gelmektedir.

60

45.6

33.5ul

24.5ul

22

GÖRÜNTÜ ANALĐZ PROGRAMLARI

• SĐSTEM: Mikroskop, kamera, bilgisayar, görüntü analiz programı.

• ĐŞLEV: Kamera yardımı ile mikroskoptan alınan görüntüler bilgisayara aktarılır.

• Görüntüler üzerinde mesafe , alan , çevre , açı ölçümü hücre sayımı yüzde oranları gibi uygulamalar hızlı bir şekilde yapılabilir.

Dijital Slide - Sanal mikroskobi

Mirax – Pannoramic

• Rutin

• Araştırma

• Seri kesitler

• Telekonsultasyon

• Đn situ hibridizasyon (FISH)

• Đmmunhistokimya (ĐHK)

Elektron mikroskop

• Örneği görüntülemek için elektron partiküllerini kullanır.

• Optik ışık mikroskobuna göre görülebilir (foton) dalga boyu 100,000 kez küçük, 1000000 kat büyük görüntü oluşturabilir,

• optik mikroskobun büyütmesi ise 2,000 kat ile sınırlıdır.

Geçirgen elektron mikroskobu

• Büyütme

• 1000000

Taramalı elektron mikroskobu