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L3BO Nancy Microbio 2009 n3

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Présentation du cours n3 de microbiologie L3BO Nancy, 2009 - Cyril Bontemps

Text of L3BO Nancy Microbio 2009 n3

Lespce procaryotique

Lespce est lunit taxonomique de baseEucaryotes reproduction sexue : Ensemble des individus dune population capables de sereproduire entre eux et dengendrer une descendance fertileAne Jument Mulet (non fertile)

+

=

Eucaryotes reproduction sexue non tudie : ensemble dindividus prsentant un haut degr deressemblance entre eux. Lespce dfinie doit tre nettement spare des autres espces.

Chez les procaryotes : Pas de reproduction sexue.Lespce procaryotique est dfinie par comparaison avec une souche type cense possder les caractristiques typiques de lespce. Toutes les souches prsentant un certain degr de ressemblance avec la souche type appartiendront la mme espce.

Descendance non sexue de type verticale

Souche type

Lespce procaryotiqueLa dmarcation entre espces bactriennes est difficile dfinir et peut parfois tre arbitraire, anthropocentrique, voire fausse ! Historiquement, la plupart des espces ont t dfinies en fonction de leur intrt pour ltre humainExemple: Espces pathognes dfinies en fonction de la maladie quelles confrent (Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis)

Pb : Cette approche ne permet pas de dfinir un concept de classification applicable lnorme majorit des bactries qui nont pas dintrt pour lhomme ou qui nont pas des caractristiques marques

Lapproche polyphasique de caractrisation des espces bactriennes(milieux annes 1980)

But: Dlimiter, grce des conditions standardises, un ensemble de souches/isolats (prfrentiellement) cohrent au niveau gnomique et qui partagent un fort degr de similarits sur (beaucoup) dautres caractres.

Dfinition actuelle dune espce procaryotique

Lespce polyphasiqueLa taxonomie polyphasique est une approche consensus pour classifier les procaryotes en intgrant diverses informations qui possdent le moins de contradictions possibles: Intgration de donnes gnomiques:Ex: Hybridation ADN-ADN, DNA fingerprint

Intgration de donnes phnotypiques:Ex: composition en acides gras, tests biochimiques, rsistances antibiotiques, utilisation de diffrents composs carbons ou azots

Intgration de donnes phylogntiques:Ex: Construction darbres phylogntiques avec un ou plusieurs gnes de mnage

Pratiquement: Une espce polyphasique est considre comme un groupe de souches (incluant la souche type) qui possdent entre elles un certain degr de cohrence phnotypique, 97% didentit en 16S rRNA et 70% dhybridation ADN-ADN

Lespce polyphasiqueLapproche polyphasique a lavantage dtre applicable tous les procaryotes, sans a priori Elle a permis de corriger quelques erreurs de classification(fragmentation dune espce en plusieurs ou regroupement)

Ex: Escherichia coli et ShigellaE. coli est une bactrie commensale du tube digestif, mais certaines souches peuvent devenir pathognes, provoquant par exemple des gastro-entrites Les Shigella sont des pathognes intestinaux Les tudes polyphasiques ont rvl que E.coli et 4 espces de Shigella appartiennent en fait la mme espce gnomique La diffrence du caractre pathogne sexpliquerait par lacquisition ou la perte de plasmides portant des gnes de virulence

Rq: la reclassification na pas t faite, car cette erreur de classification reste pratique dun point de vue clinique et vite des confusions en microbiologie mdicale

Lhybridation ADN-ADNTechnique qui reste considre comme la pierre angulaire de la caractrisation des espces procaryotes Repose sur la rassociation de lADN de 2 souches, qui est fonction de leur nombre de bases complmentairesSouche typeSouche tester

ContrleSouche type

Souche type

Extraction ADN Fragmentation (mcanique) et marquage radioactif uniquement de lADN de la souche type Dnaturation la chaleur (ADN simple brin)

Mlange (1500X plus dADN de la souche tester) Diminution de la T pour permettre la rassociation de lADN (ADN double brin)Statistiquement ngligeable

Elimination des ADN sb (ex: nuclease S1)

Mesure de radioactivit

Rapport de ces mesures donne le % de rassociation

Mesure de radioactivit

Lhybridation ADN-ADNAutre mesure complmentaire:Au cours de la phase de rassociation, les Tm de lhomoduplexe et de lhtroduplexe sont mesurs, cest--dire la T o la moiti de lADN est dnatur

Tmhtroduplexe homoduplexe

Deux souches seront considres comme appartenant la mme espce, si :- leur % de rassociation ADN-ADN est suprieur 70% - Les Tm de lhomoduplexe et de lhtroduplexe ne diffrent pas de plus de 5C

Une souche caractrise sous ces seuls critres de rassociation de gnome est appele espce gnomique (ou genospecies). Des donnes phnotypiques et phylogntiques supplmentaires sont ncessaires pour caractriser une espce.

Les mthodes phnotypiquesPris individuellement, ces caractres ne sont pas pertinents pour estimer les relations taxonomiques. Toutefois, pris dans leur ensemble, ils procurent une certaine information. Forme, flagelles, coloration Gram etc Composition en acides gras, analyse des protines totales (par SDS-page), spectre de rsistances antibiotiques Analyse du mtabolisme de diffrents substrats (carbons, azots).Exemple de rsultats mtaboliques utiliss pour la caractrisation dune nouvelle espce de bactrie

Les mthodes phylogntiquesLa phylognie du gne codant l'ARN ribosomique 16S (ARNr 16S)La comparaison phylogntique de lARNr 16S a t une vritable rvolution pour la taxonomie des bactries !

Le 16S volue lentement, prsent chez toutes les bactries, gnralement en copie unique et trs peu de recombinaison Son squenage est facile et rapide (primers PCR universels) et permet davoir une ide rapide sur un isolat Blast et/ou comparaison inconnuIsolat inconnu Extraction ADN PCR 16S Squenage du produit PCR

phylogntique avec souches de rfrence

On considre gnralement que 2 isolats appartiennent la mme espce sils ont au moins 97% didentit en 16S Linformation fournie par le 16S nest nanmoins pas suffisante elle seule pour caractriser un isolat au niveau de lespce !

Le gne de lARNr 16S est un excellent marqueur et est le plus utilis (de loin). Toutefois, il existe galement de nombreux autres gnes de mnage rpondant aux mmes caractristiques et qui possdent selon les cas un meilleur pouvoir rsolutif (recA, dnaK, atpD, gyrB, etc).

Les mthodes phylogntiquesLa MLST (Multi Locus Sequence Typing)Mthode qui repose sur lutilisation de la squence de plusieurs gnes pour obtenir une meilleure information phylogntiquePCR 16S

Isolat inconnu

Extraction ADNConcatnation des squencesPCR recA

comparaison phylogntique avec souches de rfrence

PCR atpD

Jusqu 7 marqueurs diffrents

Exemple: Avec 7 marqueurs (3399bp concatnes) regroupement de B. mallei et B. pseudomallei et dfinition de B. thailendensis comme une espce partB. mallei

76% hyb ADN-ADN

44% hyb ADN-ADN

B. mallei(pathogne)

B. pseudomallei(saprophyte)

B. thailendensis(saprophyte)

MLST

B. pseudomallei

B. thailendensis outgroup

99% identit 16S

Rq: Marqueurs doivent tre choisis sur le core gnome

Les limitations de lespce polyphasiqueLong ! Techniquement difficile (hybridation ADN-ADN) Les regroupements restent largesEn 16S: 1-2% de divergence, reprsentent grossirement 50 Ma40 Ma

Le polymorphisme gntique de lespce polyphasiqueGnomique comparative de gnomes entirement squencs de souches dune mme espce montrent que le contenu en gnes peut tre trs diffrent et que certains gnes sont prsents ou absents chez les diffrentes souches Concerne quelques gnes jusqu des fractions importantes du gnome (15, voire 50%)

Comparaison du gnome complet de 3 souches dune mme espce

Les notions de core gnome et de gnome accessoireCore gnome (gnes dossature) :Ces gnes peuvent varier en terme de squence (allles) mais sont prsents chez toutes les souches de lespce. Ils correspondent souvent aux gnes de mnage et sont gnralement indispensables ou utiles lespce bactrienne quelque soit ses conditions de vie Leur transmission est majoritairement verticale

Gnome accessoire (gnes dadaptation):Ces gnes sont prsents chez certaines souches, mais pas toutes ! Ils sont utiles, voire indispensables, mais uniquement sous certaines conditions environnementales. Ils permettent une adaptation diffrentes niches cologiques. Ils sont transmis de manire verticale, mais peuvent tre facilement perdus ou acquis de manire horizontale. Ils sont souvent ports par des lments particuliers (mobilome), permettant leur transfert de manire horizontale entre diffrentes souches, espces, genres. La perte ou acquisition de gnes accessoires participe essentiellement au polymorphisme intraspcifique. Exemple: gnes dinteractions (pathognicit, de symbiose), de rsistance (antibiotique, bactriophage, polluants), de synthse (antibiotique, bactriocine)

environnement non slectif (en terme de rat)

Perte de gnes accessoires

Acquisition de nouveaux gnes accessoires

Core gnome Gnome accessoire

Les changes gntiquesLes procaryotes nont pas de reproduction sexue, mais changent des gnes de manire unidirectionnelleChez les eucaryotes, contrairement aux procaryotes, la quasi totalit des gnes prsents dans une espce se retrouve dans les autres espces du mme genre, famille, ordre (98.8% de gnes en commun entre lhomme et lechimpanz.

Les changes de gnes chez les procaryotes apportent donc un brassage et une dynamique gntiques importants. Cest une force volutive trs forte! Un transfert horizontal de gne (HGT pour Horizontal Gne Transfer) implique trois tapes successives: 1) Le transfert

2) Le maintien

3) Le succs volutif de la bactrie ayant acquis de nouvelles squences

Les changes gntiquesLe transfertLa transformation naturelle(acquisition dADN libre)

La conjugaison(Transfert dADN entre 2 cellules par contact physique)

La transduction(transfert dADN par lintermdiaire dune particule virale)

Les changes gntiquesLe maintienCas de squences chromosomiques (transduction, transformation) : intgration se fait par recombinaison homologue, cest--dire entre squences trs proches. Aboutit gnralement au remplacement dun allle par un autre

Fragment dADN transfr A B C D E A B C D E

Chromosome

A

B

C

D

E

Chromosome recombin

Un plasmide, un lment intgratif ou un lment transposable devront se rpliquer, sintgrer ou se transposer pour se maintenir.

Les changes gntiquesLe succs volutif des squences transfresSi les gnes nouvellement transfrs apportent un avantage slectif important, les organismes rcepteurs vont se multiplier de faon plus efficace que les souches concurrentes.HGT expliquent lmergence de bactries multirsistantes aux antibiotiques (super bug)

antibiotique1

antibiotique2

Dispersion de la rsistance un antibiotique diffrentes espcesGnes transfrs

taxonomie

Phylognie gne transfr

Ex: Les gnes strAB quasiment identiques en squence sont retrouvs chez E. coli, Salmonella, Vibrio cholerae, Corynobacterium striatum

ConclusionLe concept despce tel quon lentend pour les eucaryotes reproduction sexue, ne sapplique pas aux procaryotes asexus. De plus, les transferts de gnes et la plasticit gnomique importante quils gnrent brouillent encore plus limage que lon a de lespce procaryote. Si la notion despce procaryote est sujette dbat, elle reste nanmoins primordiale pour pouvoir comprendre la biologie des procaryotes et apprhender leur volution et leur cologie . Lapparition de la taxonomie polyphasique, malgr des limitations, a permis de fournir un cadre pour tudier la diversit procaryotique de faon standardise. La diffrenciation actuelle du gnome des bactries en core gnome et gnome accessoire permet de pondrer les effets des transferts de gnes lors de la dfinition de lespce.

Le core gnome permet dobtenir information taxonomique plus fiable. Ltude du gnome accessoire est intressante pour comprendre lcologie et ladaptation des procaryotes

Le concept de core gnome et de gnome accessoire appliqu lespce 2 chevaux

Core gnome

Gnome accessoire