La biología Molecular en

diagnóstico de

MICOBACTERIAS

Olga lucia ALZATE

bioMérieux Colombia

TUBERCULOSIS

8.6 millones de nuevos casos en 2012

1.3 millones de muertes

320.000 de casos asociados a VIH

500.000 casos MDR

50.000 casos XDR

Global repport WHO 2013

Lawn SD, Zumla AI. Lancet. 2011 Jul 2;378(9785):57-72.

ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015 -OMS

1. Llegar a los casos inadvertidos.

Ampliación de los servicios en los sistemas de salud,

Notificación obligatoria en más países, y mejor recopilación de

datos.

2. Abordar la TB-MR como una crisis de salud pública.

3. Acelerar la respuesta a la TB/VIH. Aumentar la cobertura TAR

en pacientes con TB VIH-positivos

4. Aumentar la financiación para eliminar todo déficit de recursos.

Se estima que en 2014 y 2015 serán necesarios US$ 7000-

8000 millones anuales .

5. Garantizar la adopción rápida de innovaciones. La adopción

rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor

diagnóstico, tratamiento y prevención de todas las formas de TB.

Plan Colombia libre de Tuberculosis

ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015

1. Llegar a los casos inadvertidos.

Ampliación de los servicios en los sistemas de salud,

Notificación obligatoria en más países, y mejor recopilación

de datos.

New Laboratory Diagnostic Tools for Tuberculosis Control. 20009

ACCIONES PRIORITARIAS: AMPLIACIÓN DE SERVICIOS

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Complejo Mycobacterium tuberculosis :

(M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum)

Bacilos Ácido alcohol resistentes (BAAR).

El M. tuberculosis es un bacilo aerobio estricto de 0.2 a 0.6

de ancho por 1 a 10 μ de largo, que se caracteriza por

Tener una pared celular gruesa, de alta complejidad y con

abundante cantidad de lípidos, lo que le da su principal

característica de ácido alcohol resistencia.

El M. tuberculosis es muy resistente al frío, a la congelación

y a la desecación, siendo además muy sensible al calor, la luz

solar y la luz ultravioleta.

Su velocidad de replicación es muy lenta (20 horas en

promedio) por lo que requiere alrededor de 2 a 4

semanas (en medios sólidos, como el de Löwenstein-Jensen)

para ser cultivado.

Pared celular

Velayati AA, y col. Chemotherapy. 2009;55(5):303-7

TUBERCULOSIS

BACILOSCOPIA

VENTAJAS:

Técnica sencilla

Bajo costo

Rápidos resultados

No requiere equipo especial

Amplia cobertura

Variaciones en: La muestra La técnica Al profesional

JAMG-2006-INDRE/SSA5

COLORACION BAAR

(Bacilos ácido alcohol resistentes)

http://www.who.int/tb/publications/2011/led_microscopy_diagnosis_97

89241501613/en/

Sencillo- Confiable - Seguro

TBC RIESGO OCUPACIONAL

TINCIONES DE ALTO RIESGO

“Ser verde”

Manejo de desechos

CULTIVOS

• En caso de que las dos baciloscopias iniciales sean negativas, se deberá cultivar la segunda muestra de esputo.

• Todas las muestras de origen extrapulmonar.

• Para diagnóstico de TB infantil.

• Poblaciones de alto riesgo (personal de salud, población indígena, personas privadas de la libertad, personas que viven en la calle, pacientes inmunosuprimidos, entre otros).

CULTIVO SÓLIDO Y LIQUIDO

El cultivo complementa a la baciloscopia ya que permite poner en evidencia

bacilos viables presentes en escasa cantidad en una muestra de lesión.

METODO GOLD ESTANDAR: primedio 3 a 4 semanas

Cultivo liquido

Cultivo de muestras pulmonares

y extrapulmonares: Promedio de 9 a 14 días

Permitir identificar y realizar perfil de susceptibilidad

BTA Colorimetrico MIGT_ Fluorescencia

Tuberculosis

multirresistente

MDR-TB

•Tuberculosis causada por cepas de Mycobacterium tuberculosis que son resistentes al menos a isoniazida y rifampicina.

Tuberculosis

extensivamenteresistente

XDR-TB

• Tuberculosis multirresistente, con resistencia a fluoroquinolonas y al menos un inyectable de segunda línea (kanamicina, amikacina y/o capreomicina)

Lawn SD, Zumla AI. Lancet. 2011 Jul 2;378(9785):57-72.

ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015

.

2. Abordar la TB-MR como una crisis de salud pública.

TUBERCULOSIS

Lawn SD, Zumla AI. Lancet. 2011 Jul 2;378(9785):57-72.

Estudios nacionales de vigilancia de la

resistencia de

M. tuberculosis a fármacos antituberculosos

Casos nuevos n Resistencia total MDR-TB

Primer estudio 1992 829 14,1% 1,8%

Segundo estudio 1999 - 2000 1087 15,6% 1,5%

Tercer estudio 2004 – 2005 926 11,8% 2,4

Casos previamente tratados n Resistencia total MDR-TB

Tercer estudio 2004 - 2005 264 44,3% 31,4%

Fracaso 60 50%

Abandono 110 25%

Recaída 72 19%

Archivo: LNR - INS

Georeferenciación de casos de tuberculosis

Multirresistente y Extensivamente resistente

según frecuencia. Colombia, 2001 – 2010

Fuente: Consolidado de casos MDR 2001 – 2010 LNR – INS

RESISTENCIA FENOTÍPICA VS

RESISTENCIA GENOTÍPICA

Campbell PJ, y col. Antimicrob Agents Chemother. 2011 May;55(5):2032-41.

Fármaco Gen Sensibilidad Especificidad

RIF rpoB 97,1 93,6

INH

katG

inhA

katG e inhA

85,4

16,5

90,6

100

100

100

EMB embB 78,6 93,1

MDR (RIF+INH) rpoB y katG o

inhA 90,8 94,7

Barroso, E. C., y col J Pneumol 2003 29: 350-357. Barroso, E. C., y col J Pneumol 2003 89-97.

MDR

B

E

C

D

A Alcoholismo

Pobreza

Tabaquismo

Tratamientos inadecuados

Cavidades pulmonares

Smith PA, Romesberg FE. Nat Chem Biol. 2007 Sep;3(9):549-56.

Resistencia

Smith PA, Romesberg FE. Nat Chem Biol. 2007 Sep;3(9):549-56.

Resistencia

Smith PA, Romesberg FE. Nat Chem Biol. 2007 Sep;3(9):549-56.

Sociomicrobiología

Parsek MR, Greenberg EP. Trends Microbiol. 2005 Jan;13(1):27-33.

Mutaciones

Zhang Y, Yew WW. Int J Tuberc Lung Dis. 2009 Nov;13(11):1320-

30.

Fármaco Actividad Genes involucrados

en la resistencia

Isoniazida Bactericida frente a los bacilos metabólicamente activos.

Bacteriostática en las demás poblaciones katG (42–58%). Promotor

mabA-inhA (21–34%)

Rifampicina Bactericida; bacilos metabólicamente activos. Actividad

en los latentes y con crecimiento intermitente rpoB (96–98%)

Pirazinamida Bactericida, bacilos en estado de latencia en el interior

de los macrófagos pncA (72–97%)

Estreptomicina Bactericida, bacilos metabólicamente activos rpsL (52–89%);

rrs (8–21%)

Etambutol Bacteriostático, bacilos metabólicamente activos embCAB

(47–65%)

Hormesis

Davies J, Spiegelman GB, Yim G. Curr Opin Microbiol. 2006 Oct;9(5):445-

53

Drlica K, Zhao X. Clin Infect Dis.2007 Mar

1;44(5):681-8

Definiciones

•La farmacocinética estudia el curso temporal de las

concentraciones de los fármacos en el organismo y

construye modelos para interpretar estos datos y por

tanto para valorar o predecir la acción terapéutica o

tóxica de un fármaco.

•La farmacodinamia estudia los mecanismos de acción

de los fármacos y los efectos bioquímicos/fisiológicos

que estos producen en el organismo.

Dosis- Concentración

Concentración-Efecto

PK/PD

ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015 -OMS

. Aumentar la financiación para eliminar todo déficit de recursos. Se

estima que en 2014 y 2015 serán necesarios US$ 7000-8000

millones anuales .

5. Garantizar la adopción rápida de innovaciones. La adopción

rápida de nuevas herramientas y estrategias para un mejor

diagnóstico, tratamiento y prevención de todas las formas de TB.

PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

Moore DA, Shah NS. J Infect Dis. 2011 Nov;204 Suppl 4:S1110-9.

ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015

5. Garantizar la adopción rápida de

innovaciones.

La adopción rápida de nuevas herramientas y

estrategias para un mejor diagnóstico,

tratamiento y prevención de todas las formas

de TB.

RED NACIONAL DE LABORATORIOS

LNR

PSF -EED

Laboratorios Nivel III

-IV

L S P

D x – PSF - EED

Laboratorios Nivel

Il

Laboratorios Nivel l

BK – ZN O – K ADA Proporciones L J Bactec MGIT 960 ® MGIT TBc Nitrato Reductasa GeneXpert ® Genotype ®

BK – ZN O – K

BK – ZN O – K ADA Proporciones L J MGIT TBc Nitrato Reductasa GeneXpert ® Genotype ®

BK – ZN O – K ADA Bactec MGIT 960 ® MGIT TBc Nitrato Reductasa GeneXpert ® Genotype ®

Avances en el diagnóstico rápido de tuberculosis y de la resistencia a los fármacos antituberculosos

ACCIONES PRIORITARIAS PARA 2015

5. Garantizar la adopción rápida de innovaciones.

La adopción rápida de nuevas herramientas y

estrategias para un mejor diagnóstico,

tratamiento y prevención de todas las formas de

TB.

DETECCION Y VIGILANCIA DE LA RESISTENCIA

DNA•STRIP® TECHNOLOGY POLIMORFISMOS GENÉTICOS

GenoType” polimorfismo de la estructura genética de la micobacteria.

Un factor importante es el uso de PCR para alcanzar el máximo de sensibilidad.

DNA•Strip® technology

Principio Punto de inicio:

Aislamiento del ácido Nucleico

El método DNA•STRIP® requiere

amplificación selectiva del

acido nucleico aislado

DNA•Strip® technology

Principio Hibridación:

El DNA/RNA es amplificado en la

matriz DNA•STRIP® donde se

localizan sondas específicas de DNA

La reacción de Hibridación permite

el desarrollo de bandas visibles sobre

la tira (DNA•STRIP® matrix)

DNA•Strip® technology

Interpetación de resultados

Se realiza

comparando el

perfil de bandas

desarrolladas en

la tira DNA•Strip®

con una

evaluación del

amplificado.

DNA•Strip® technology

Interpretación de resultados

Los resultados son validados por 3

controles:

Control del conjugado: para

asegurar la eficiencia en la reacción de

color

Control amplificación: para asegurar la

implementación del método

Control de sensibilidad: Verificar una

sensibilidad optima en la reacción de

hibiridación

RIFAMPICINA REGIÓN DE RESISTENCIA RPOB GENE

rpoB-Wildtype-probes: WT 1 to WT 8

rpoB-Mutation-probes: MUT D516V, H526Y, H526D, S531L

Detección demutaciones por la perdida de la señal del wildtype

Detección demutaciones porla presencia de laseñal de la mutación

511 513 516 518 522 526 531 533

rpoB WT2 rpoB WT4 rpoB WT6rpoB WT8rpoB WT7

rpoB MUT1 (D516V)

rpoB MUT3 (S531L)rpoB MUT2B (H526D)

514 515

rpoB WT1 rpoB WT3 rpoB WT5

509508505

Gen que codifica sub unidad B de la RNA polimerasa

Cada tira tiene 27 sitios de reacción

Conjugate Control (CC)Amplification Control (AC)

complex (TUB)M. tuberculosis

rpoBrpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB

rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB

Locus ControlWT1)WT2)WT3)WT4)WT5)WT6)WT7)WT8)

mutation probe 1 ( MUT1)MUT2A)MUT2B)

MUT3)

rpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoBrpoB

rpoB rpoB

rpoB

wild type probe 1 ( wild type probe 2 ( wild type probe 3 ( wild type probe 4 ( wild type probe 5 ( wild type probe 6 ( wild type probe 7 ( wild type probe 8 (

mutation probe 2A ( mutation probe 2B ( mutation probe 3 (

katGkatGkatG katG katG

WT) mutation probe 1 ( MUT1)

MUT2)

Locus Controlwild type probe (

mutation probe 2 (

katG

katG

inhAinhA inhA inhA inhA inhA inhA

WT1)WT2)MUT1)MUT2)

MUT3A)MUT3B)

colored marker

Locus Controlwild type probe 1 (wild type probe 2 (mutation probe 1 (mutation probe 2 (mutation probe 3A (mutation probe 3B (

inhA inhA inhA inhA

inhA inhA

Controles Identificaciónn

banda para

M.tb complex

Resistencia a

Rifampicina

Resistenica a

isoniazida

GenoType MTBDRplus

MTBC y su resistencia a Rifampicina y/o Isoniazida

GENOTYPE®MTBDR PLUS

PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

Hillemann D, Rusch-Gerdes S, Richter E. J Clin Microbiol. 2009 Jun;47(6):1767-72.

FLQ: 90.6%

AMK: 84.8%

CAM: 86.7%

EMB: 69.2%

PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

Falkinham JO, 3rd. Clin Chest Med. 2002 Sep;23(3):529-51.

PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

Pitombo MB, Lupi O, Duarte RS. Rev Bras Ginecol Obstet. 2009 Nov;31(11):529-33.

PERSPECTIVAS DE LOS MÉTODOS MOLECULARES

Lee AS, Jelfs P, Sintchenko V, Gilbert GL. J Med Microbiol. 2009 Jul;58(Pt 7):900-4.

GenoType Mycobacterium CM

Differentiation between 14 common atypical mycobacterial species and MTBC

AB

GenoType Mycobacterium AS

Differentiation between 16 additional atypical mycobacterial species

Gracias

Olga-lucia.alzate@biomerieux.com