La biotecnologia y la diversidad genética de la papa nativa bajo el Tratado

Internacional en el CIPDavid Tay, Ph.D. (d.tay@cgiar.org)

Lider de la División de Conservación y Caracterizac ión de Recursos Genéticos

Centro Internacional de la papa (CIP)

ALAP 2010 – Cusco, PeruALAP 2010 – Cusco, Peru

Banco de Germaplasma en el CIP

CIP La MolinaLima, Peru

Misión

• Asegurar la conservación y distribución a nivel global de las colecciones de papa, camote, raíces y tubérculos andinos en custodia, en forma segura y con alta calidad

• Mejorar la utilización , mediante documentación on line de información pasaporte, caracterización y evaluaciones importantes completa.

• Asegurar la conservación y distribución a nivel global de las colecciones de papa, camote, raíces y tubérculos andinos en custodia, en forma segura y con alta calidad

• Mejorar la utilización , mediante documentación on line de información pasaporte, caracterización y evaluaciones importantes completa.

La conservación Global de papas nativas “en custodia” en el CIP

La conservación Global de papas nativas “en custodia” en el CIP

4,235 accesiones4,235 accesiones

Nueve especies cultivadas (Ochoa, 2003)Nueve especies cultivadas (Ochoa, 2003)

S. ajanhuiri (2x) 14S. goniocalyx (2x) 98S. phureja (2x) 204S. stenotomum (2x) 299S. chaucha (3x) 116S. juzepczukii (3x) 36S. t. tuberosum (4x) 163S. t. andigenum (4x) 3148S. hydrothermicum (4x) 0S. curtilobum (5x) 6

S. ajanhuiri (2x) 14S. goniocalyx (2x) 98S. phureja (2x) 204S. stenotomum (2x) 299S. chaucha (3x) 116S. juzepczukii (3x) 36S. t. tuberosum (4x) 163S. t. andigenum (4x) 3148S. hydrothermicum (4x) 0S. curtilobum (5x) 6

S. stenotomum (1-7); S. goniocalyx (8-12); S. phureja (14-15): S. x ajanhuiri (13); S. x juzepczukii (16-19); S. x chaucha (20-23); S. tuberosum ssp. andigenum (24-42); S. x curtilobum (43-44), S. tuberosum ssp. tuberosum (45)

Países donantes de la colección “en custodia”

5454 3232 3232 11 3737253253 361361

26942694

541541

206206 14314300

500500

10001000

15001500

20002000

25002500

30003000

PaísesPaíses

Acc

sA

ccs

Cv. criollosCv. criollos NativasNativas

Conservación de papa cultivada en el CIP

Bancos de genes* In vitro /Crio * Campo

* Semilla * Tubérculos

Ex situ In situ

* Habitad natural

* Parcelas campesinas

Conservación dinamica

Conservación de Papa In vitro y criopreservación

6-8°C(2 años)

18-22°C(1 año)

Banco – Criogénico(LTS)

Banco In Vitro(MTS)

CIP: El pionero en applicación de la

Biotecnologíaen banco de germaplasma

-196°C(¿100 años o mas?)

Biotecnología- En conservación y distribución de germoplasma

1973–1984: • Cultivo de tejidos para almacenamiento de papa y transferencia Internacional (Roca et al ., 1975, 1978,1979; Wescott et al ., 1977)

• 1975 - Criopreservación de papa (Grout et al.)• Eliminación de patógenos (Schilde & Roca, 1983; Lizarraga, et al., 1983)• Cultivo In vitro de papa por crecimiento lento (Estrada et al., 1983)• Tuberización in vitro de papa (Schilde et al., 1984)• 1977-79 - Eliminación de duplicados con electroforesis de proteínas e isoenzimas

1985–1993: • Multiplicación rápida de papa (Dodds, et al. 1992)• Prueba de virus (Jayashinge & Salazar, 1993)

1994–2000: • Técnicas de eliminación de patógenos mejoradas (Golmirzaie et al., 1997)• Criopreservación de papa (Golmirzaie & Panta, 2000)

Continuación…

2001–2007: • Código de barras para monitoreo de la colección de germoplasma In vitro (Rojas, et al., 2005)

• Método mejorado de criopreservación de papa (Panta, et al. 2006)• Métodos de eliminación de virus mejorados

2007 a la fecha:

• Copias de seguridad (Espinoza, et al., 2008)• Accreditación ISO 17025: Buenas prácticas para conservación y distribución in vitro

• Validación de métodos de conservación y criopreservación (colaboración con los Bancos de CGIAR )

• Estudios de estabilidad genética entre tubérculos, In vitro y accesiones criopreservadas.

Tipo de Material:

Germoplasma (G)

Investigación (R)Estado Sanitario:

HS0, HS1, HS2

Período de Almacenamiento:

Permanente, Transitorio

Papa: 9,643 acc.

Evaluación de sobrevivencia y recuperación (30 y 60

después de descongelamiento)

- 75% de acc. con ≥ de 20% de recuperación;

- 5% no sobreviven

Criocolección de papa (CIP)

* S. Dussert et al., 2003.

Cultivo in vitro (6°C) (3 semanas)

Aislamiento de ápices meristemáticos

Método de vitrificación de la “pequeña gota” de PVS2

Almacenamiento de 100 muestras por entrada (acc.

con 95% de probabilidad de recuperación)*

Monitoreo de viabilidad

Cultivares Nativas:800 acc criopreservadas

Protocolo de eliminación de virus en papa

Introducción de explantes

in vitro

(1 mes)

(1 mes)

Termoterapia 32-34°C5

(2-3 meses)

Cultivo

de meristemos

6

Evaluación y diagnóstico

(3 meses)

8

Plantas libres de patógenos

Siembra en macetas y

pruebas iniciales de

sanidad

(2 meses)

12

Multiplicación para

termoterapia

(1 mes)

4

Multiplicación para

pruebas virológicas

(1 mes)

7

Multiplicación inicial y

pruebas fitosanitarias3

(4 meses)

NASH: PSTVd y PVT

ELISA: 8 viruses

Plantas indicadoras (11sp.)

Inspección visual

NASH: PSTVd and PVT

ELISA (8 virus): PVS, PVY, PVX, APLV, PLRV, APMV, PYV, y AVB-OPlantas indicadoras (11 sp.):Inspección visual

B. Zea, G. Muller, C. Chuquillanqui, A. Panta, May 2010

In vitro Facilities Virology

OfficeSerology

LaboratoryThermotherapy

ADU

Virus testing greenhouse

Outside CIP& CIP

Medium Preparation

Area

GreenhouseQuarantine Active Collection

OfficeGADC In vitro Potato

Long term Collection Cleaning Transfer roomInternal QuarantineOffice

NashDas-Elisa

1 month (4 tubes)

Meristem excision and culture 6 meristemsCulture

2-3 months

Select the best 3 clones Multiplication

3 tubes

Select the 1 clone

Move to In vitro Bank as HS0 or HS1

If PSTVdPositive

Incinerate

If all clones are positive

NashDas-Elisa

Store Pathogen tested

clone HS2Host Range

Introduce in vivo material into in vitro according to the protocol for introduction to in vitro culture.

Host Range

Send request Evaluate request

Quarantine process according to the protocol for in vitro quarantine

Receive result

Send material

Introduction to In vitro

Receive notificationSend list material

Multiplication of mother plant

In vitro plantlets from outside CIP

In vitro plantlets from CIP genebank

Get samples HS0 – HS1

Culture

Select 1 clone

Bacteria TestingBacteriaelimination

HS0 (unknow HS) or HS1

Multiplication

Positive virus - select next clone

Bacteria TestingBacteriaelimination

Multiplication

Multiplication

Move to In vitro Bank as

HS2

Legend

TubersIn vitro plantlets from outside CIP In vitro plantlets from CIP genebank PositiveNegativeAll clones are positive

Identity verificationTrue type clone

Distribution

Review by A.panta and L.Rojas, Octubre 2009

Tubers

Bacteria TestingBacteriaelimination

Multiplication into 2 tubes

HS0 (virus positive)

If PSTVdPositive

Incinerate

HQU

Quarantine

Culture

Quarantine process according to SENASA

Proceso de eliminación de virus en papa

Estado Actual

• Protocolos y procedimientos estándarizados

- Desde 2008

- Auditorías internas y externas

• Acreditación ISO 17025

- Código de barra (100%)

- Base de Datos (Conección

inalámbrica) para el manejo de la

colección in vitro

• Flujos de Trabajo en gráficos (muchos)

• Documentación

Eliminación de Duplicados(1970s – 1990s)

17,300 accesiones

4,235 accesiones

Fuente: www.msu.edu/~douchesd/fingerprint.html

Nueva Generación de Marcadores Genéticos en

los Bancos de Germoplasma

1990

1991

1992

1993

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2010

Microsatélites(SSR)

SCAR

Isoenzimas

RAPD

RFLP

DArT

Año

AFLP

Evolución de los marcadores genéticos

SNP

Jonathan FengShuBaiXushu18

Jewel

Wagabolige

Yanshu1

Beauregard

I. trifidaparent 1

I. trifidaparent 2

Jonathan FengShuBaiXushu18

Jewel

Wagabolige

Yanshu1

Beauregard

Jonathan FengShuBaiXushu18

Jewel

Wagabolige

Yanshu1

Beauregard

I. trifida

I. trifida

Marcadores moleculares para la Caracterización de Bancos de germoplasma

Marcadores diseñados para:-Huella genética – “Carnet de identidad”

para accesiones del Banco-Análisis de Diversidad/ Colección ‘Core’-Estudios Taxonómicos-Selección de progenitores con alta

diversidad-Desarrollo de poblaciones

Asociación de marcadores a Caracteres(A través de QTLs o Análisis de segregantes en Bulk):

-Selección asistida por Marcadores -introducción de genes dentro de un pool genético deseable

-Piramidación de QTLs-Predicción de Fenotipos

(Fuente : Roland Schafleitner)

Kit de Identidad Genética de Papa (PGI): ESTANDARIZACION DEL PESO DE LOS

FRAGMENTOS PARA LA GEMOTIFIPICACION DE PAPA

•Ghislain et. al. (2009). Robust and highly informative microsatellite-based genetic identity kit for potato. Mol Breeding (2009) 23:377–388.

•Ghislain et. al. (2004). Selection of highly informative and user-friendly microsatellites (SSRs) for genotyping of cultivated potato. Theor Appl Genet (2004) 108:881–890

Kit de identificación para papa basado en 24 marcadores SSR

Iniciadores AFLP seleccionados para la genotipificación de papa

Sistema LI-CORSTM1104

STI0014

E42_M49

•CIP (1997). Molecular Biology Laboratory Protocols: Plant Genotyping. Ghislain M, Zhang D, Herrera R (Eds.). Genetic Resources Department, training manual, CIP, Lima, Peru.

•Vos et. al. (1995) . AFLP A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research 23: 4407-4414

Evaluación Morfológica: Evaluación Molecular• 32 descriptores • SSR 24 primers

Verificación de integridad genética de colección tubérculos, in vitro y criopreservación

Microsatélites

Dodds (1962) Hawkes (1990)* Ochoa (1990, Huaman & Spo oner et al. 1999) Spooner (2002) (2007)

2x -------- S. ajanhuiri S. X ajanhuiri S. tuberosum S. ajanhuiriAjanhuiri Group

S. tuberosumGroup Stenotomum S. stenotomum S. stenotomum Stenotomum Gp S. tuberosumSubgroup Goniocalyx ssp. goniocalyx S. goniocalyx Andigenum Gp (2x)Subgroup Stenotomum ssp. stenotomum

Group Phureja S. phureja S. phureja Phureja Gp Subgroup AmarillaSubgroup Phureja

3x S. tuberosum S. chaucha S. X chaucha S. tuberosumGroup Chaucha Chaucha Gp Andigenum Gp (3x)

S. X juzepczukii S. juzepczukii S. X juzepczukii Juzepczukii Gp S. juzepczukii

4x S. tuberosum S. tuberosum S. tuberosum S. tuberosumGroup Andigena ssp. andigenum ssp. andigenum Andigenum Gp Andigenum Gp (4x)Group Tuberosum ssp. tuberosum ssp. tuberosum Chilotanum Gp Chilotanum Gp

S. hygrothermicum

5x S. X curtilobum S. curtilobum S. X curtilobum Curtilobum Gp S. curtilobum

La taxonomía de papas nativas

4,235 accesiones

S. ajanhuiri (2x) 14 14 S. goniocalyx (2x) 98S. phureja (2x) 204S. stenotomum (2x) 299S. chaucha (3x) 116S. juzepczukii (3x) 36 36S. t. ssp. tuberosum (4x) 163S. t. Chilotanum Group 163S. t. Andigenum Group 3865S. t. spp. andigenum (4x) 3148S. hydrothermicum (4x) 0S. curtilobum (5x) 6 6

S. ajanhuiri (2x) 14 14 S. goniocalyx (2x) 98S. phureja (2x) 204S. stenotomum (2x) 299S. chaucha (3x) 116S. juzepczukii (3x) 36 36S. t. ssp. tuberosum (4x) 163S. t. Chilotanum Group 163S. t. Andigenum Group 3865S. t. spp. andigenum (4x) 3148S. hydrothermicum (4x) 0S. curtilobum (5x) 6 6

Ochoa, 2003 Spooner et al, 2007

Implicación:

• S. phureja � Anexo 1 (IT)

adg

tbr

cha

Biotecnologia –Marcadores SSR (Spooner et al., 2007)

cha

cha

stnstn

stnstn

phu

cha

cha

¿Confirman la clasificación de Hawkes y

Ochoa?

Una necesidad de seguir estudiando…• Hawkes (1956) – 8 especies y 22 especies sinónimos• Bukasov (1971) – 21 especies• Ochoa (1990,1999) – 9 especies y 141 taxa infraespecíficos

Sistema taxonómico indígena +

Concepto de Grupo Cultivar (ICNCP)

(Incorporando datos morfológicos, geográficos, citológicos, FISH, mayor numero de

marcadores. Ej. DArt, SNP, cloroplastos, mitocondrial, secuencias, etc.)

Marcador DArTMuestras de clones diversos

Reducción de complejidad(Digestión con enzimas de restricción,

Selección de tamaños

Chip

Selección de

fragmentos

polimórficos

Representación de genoma

ADN

DArT

microarreglos

•Secuencias independientes

•Método de alto rendimiento y bajo costo

•Descubre ~1000 marcadores en un solo ensayo

Jonathan FengShuBaiXushu18

Jewel

Wagabolige

Yanshu1

Beauregard

I. trifidaparent 1

I. trifidaparent 2

Jonathan FengShuBaiXushu18

Jewel

Wagabolige

Yanshu1

Beauregard

Jonathan FengShuBaiXushu18

Jewel

Wagabolige

Yanshu1

Beauregard

I. trifida

I. trifida

(Fuente: A. Kilian)

4x trifida

6x batatas

4x tabascana

Localización de genes en el cromosoma

Estudiar las relaciones entre especies

Estudiar los cambios cromosomales durante la especiación

Estudiar la estructura del cromosoma

FISH nos permite:

Grupos genéticos del 18S (verde) y 5S (rojo) en camote y 2 posibles progenitores (Fuente: Jan Kreuze)

Uso y Beneficiosde la

Colección de papa nativa bajo el Tratado Internacional

• 17,617 muestras distribuídas a 143 países

• 3,600 muestras de más de 1,250 (30%)accesiones de papa nativa de alta calidad fueron repatriadas a 41 comunidades en los últimos 10 años

Distribución de papa cultivada:

Cultivares mejorados

Finalmente –Deseamos que la diversidad sea utilizada

Papas nativas

Beneficios: Programa de Mejoramiento del CIP

• 9,062 muestras distribuídas dentro del CIP

• 5.6% utilizado - 246 accesiones (de 4,354 nativas & cultivares criollos) usados en cruzamientos

•

• 30% de representación - 6,324 cruzes (de 20,922) con al menos una de 246 accesiones en el pedigree

Impacto en Peru

Canchan (22.4%), Perricholi (7.6%), Amarilis (7.1%), Unica (0.3%), Atahualpa (0.1%), Chata roja (0.1%)

Santa Ana, Maria Huanca, Wankita (INIA 308), Tahuaqueña, INIA 301, Kori-INIA, Haille, Costanera, Muru, Yana, UNALM GUISI, Chagllina-INIA, Puneñita (INIA 307), INIA 305, Colparina (INIA 308), Maria Tambeña, Reiche, Maria Bonita-INIA, Tacna, Desertica, Serranita INIA 309 , Primavera, Chucmarina, Puca Lliclla INIA 312, Pallay Poncho INIA 311, Chacasina, Molinera, Caxamarca, Molinera II, Amapola, San Juan

37 variedades liberadasCanchan

Impacto en América Latina

Bolivia: Chaposa, Jaspe, Runa Toralapa (Iscayachi), Potosina, PampeñaColombia: Zipa, NovaCosta Rica: Birris, Floresta, IDIAFRITEcuador: Fripapa 99, Margarita, Rosita, Santa Rita, BastidasGuatemala: Paquix, Xalapan, MercedesPanama: IDIAFRIT, IDIAP 92, PRECODEPAParaguay: Villa SerranaVenezuela: Andinita, Tibisay

24 variedades liberadas

Runa Toralapa (Iscayachi),

Estratégias para crea mas impacto

• Tratado Internacional• Cuarentena Internacional eficiente –

diagnóstico de enfermedades• Buena información de evaluación• Base de Datos en web• Colección núcleo (Core) / set de

referencia (GCP)

4,235 acc. – Tratado Internacional

• http://www.planttreaty.org/• Acuerdo de Transferencia de Material

Estándarizados (SMTA)• Firmado por: Argentina, Brazil (r), Chile, Colombia,

Costa Rica (r), Cuba (r), República Dominicana, Ecuador (a), El Salvador (r), Guatemala (r), Haiti, Honduras (a), Nicaragua (a), Panamá (a), Paraguay (ac), Perú (r), Uruguay (r), Venezuela (r)

Nueva Tecnología: Secuenciamiento detallado en la identificación y caracterización de virus

1 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000

MOVEMENT PROTEIN

COAT PROTEIN

REPLICASE

6222 nt

Fragmentos

del ARN viral

Genoma del virus ensamblado a partir de los fragmentos

Fuente: Wilmer Cuellar (Ver su poster para mas detalles)

Protocolos actuales – ~18 mesesNuevas tecnologías – ~3 meses

Evaluación después de 3 semanas de cultivo in vitro siguiendo tratamientos con Poli-etilene glicol (PEG)

Evaluación de respuesta de papas nativas a estrés hídrico*

•Altura de planta

•Longitud de raíz principal

•Número de raíces

0 10 20 40 80 100

PEG (g/L)

* Tesis de MSc, Elise Vendeuvre

Respuesta de papa al efecto de 8 niveles de NaCl en términos de altura relativa

0

10

20

30

40

50

60

70

0.04 0.06 0.08 0.12 0.16 0.20 0.28 0.40

Niveles de NaCl (mM)

Altu

ra r

elat

iva

(%) Desiree

Piñaza

Sierra Volcan

Tacna

Waca Corota

Wila Yari

(M)

* Tesis de MSc, Carmen Maza (Ver su presentación para mas detalles)

Análisis de asociación genética

Germoplasma panel

Genotipos con fenotipos tolerantes

a stress contrastables

Genotipificación Fenotipificación

QTLs para tolerancia a stress relacionado a

caracteres

Alelos para tolerancia a stress

Marcadores para alelos con tolerancia

a stress

Análisis de asociación genética

(Fuente : Roland Schafleitner)

Formación de Colección Núcleo – Un ejemplo

Huaman et al., 2000

Spooner et al., 2007Accesiones

Núcleo 306 251 (4x)

Común 136 136

Diferente 172 115

S. tuberosum ssp. andigenum10% de 3,148 accesiones = 315 accesiones

CIP Online Database

1

2

3

�Botany, Taxonomy, Geography, Population Genetics, Ecology, Seed Science & Technology, Logistics, etc.

Acquisition

Regeneration

Conservation

Characterization

Evaluation

Distribution

Utilization

Documentation

Genebanking StepsGenebanking Steps Scientific DisciplinesScientific Disciplines

�General Horticulture, Seed Production & Technology, Plant Pathology, Entomology, etc.

�Seed Science and Technology, Refrigeration Design & Engineering, Tissue Culture, Cryopreservation, etc.

�Morphology, Anatomy, Taxonomy, Genetics, Molecular Biology, Statistics, Physiology, etc.

�Statistics, Genetics, Physiology, Pathology, Entomology, Biochemistry, Pharmacology, etc.

�Pathology, Entomology, Seed Technology, Tissue Culture, Quarantine, etc.

�Germplasm Enhancement, Plant Breeding, Biotechnology, Nutra- & Pharmaceutical Uses, etc.

�Computer Science, GIS, Taxonomy, Statistics, etc.

Flow of germplasm materialsFlow of germplasm information

La Ruta Condor: Una red de conservación in situ de la agrobiodiversidad a lo largo de los Andes

Fuente mapa: Ricardo Espinosa, 2002. La Gran Ruta Inca.

Parque de la papaCusco Per

Oruro Bol

Potosi Bol

Chimborazo Ecu

Carchi Ecu

Huancavelica Per

Huanuco Per

Cajamarca Per

Jujuy Arg

Merida Ven

Gracias!