La Citogenetica nella Diagnosi Prenatale

Per diagnosi prenatale si intende l’insieme delle indaginistrumentali e di laboratorio finalizzate ad individuare determinate patologie su

base :

geneticainfettivaiatrogena

Attualmente l’indagine citogenetica per lo studio del cariotipo fetale

interessa circa l’80% delle diagnosi prenatali eseguite per evidenziare

patologie genetiche.

Indicazioni alla diagnosi prenataleIndicazioni alla diagnosi prenataleEta’ materna > 35 anni

(l'aumento del rischio di aneuploidie cromosomiche correla con l'etàmaterna)

Genitori con precedente figlio affetto da aneuploidia(rischio di ricorrenza circa 1%)

Genitori eterozigoti per anomalie cromosomiche bilanciate(aumento del rischio di concepimenti sbilanciati)

Anamnesi familiare positiva per patologia cromosomica(analisi del cariotipo su sangue del genitore a rischio) Anamnesi familiare positiva per malformazioni congenite

Evidenza ecografica di malformazioni fetali (circa il 20% di questi feti è sbilanciato)

Alterazioni biochimiche nella madre(aumento dei valori di gonadotropina corionica, riduzione dell'alfa-

fetoproteina e dell'estriolo non coniugato predicono nel Triplo-test il 70% delle gravidanze con feto

affetto da trisomia 21; >NT+free-beta hCG+PAPP-A predicono nel Bi-test l’80-85% delle gravidanze con feto affetto da trisomia 18 o 21 )

Malattie mendeliane(analisi del DNA su villi coriali)

•AMNIOCENTESI (16-18 sett.gestazione)

•VILLOCENTESI (11-12 sett.gestazione)

•FUNICOLOCENTESI (18 sett.- termine gravidanza)

Tecniche di diagnosi prenatale

FunicolocentesiFunicolocentesi

Approccio tardivo alla diagnosi prenatale(18 sett.->termine gravidanza)

•Fallimento della coltura dopo amniocentesi

•Mosaicismi presenti nelle cellule del LA

•Mosaicismi confinati alla placenta

•Riscontro ecografico di malformazione fetale

Cariotipo fetale da celluledi liquido amniotico

Materiale esaminato: cellule di liquido amniotico (cellule di desquamazione provenienti da: sacco amniotico, epidermide, mucosa del tubo digerente, del tratto respiratorio e di quello urogenitale).

Metodica d’indagine:•in situ: l’analisi avviene per colonie. Migliore valutazione diagnostica in caso di mosaicismo cromosomico o di contaminazione materna.Tempi di coltura più brevi.•in fiasca: si perde l’individualità dei cloni.Maggiore crescita cellulare.

CariotipoCariotipo fetale da villifetale da villi corialicoriali

Materiale esaminato: cellule del trofoblasto

Metodica d’indagine:•coltura diretta: si analizzano le mitosi spontaneepresenti nel citotrofoblasto, dopo 48-72 ore dal prelievo.Rapidità.Minore rischio di inquinamento da cellule materne.Attività mitotica e qualità delle metafasi inferiori rispetto alla tecnica della coltura.•coltura a lungo termine: le colture vengono allestite previo trattamento dei villi con enzimi proteolitici per disgregare le cellule del cito e del sinciziotrofoblasto.Contaminazione con cellule di origine materna.

CVSCVS

Frequenza anomalieFrequenza anomalie cromosomichecromosomiche in in rapporto all’età maternarapporto all’età materna

1/301/2045 anni1/1101/6040 anni1/1461/8139 anni1/3501/17035 anni1/4741/24434 anni1/9001/39030 anni1/1.3501/48025 anni1/1.5301/53020 anni

Trisomia 21Anomalie numeriche

Età materna

Problemi tecnici ed interpretativi Problemi tecnici ed interpretativi collegati alla diagnosi citogenetica collegati alla diagnosi citogenetica

fetalefetale• Fallimento dello sviluppo della coltura cellulare in vitro (<1%)• Crescita in coltura di cellule di origine materna (CCM)

• Mosaicismo cromosomico, pseudomosaicismo (anomalie in vitro oppure derivate da tessuti extraembrionali)

• Riarrangiamenti strutturali

• ESACs (Extra Structurally Abnormal Chromosome) insorti de novo

MosaicismoMosaicismo

Presenza in uno stesso individuo di due o più linee cellulari a cariotipo diverso

•Livello III (mosaicismo vero)•Livello II (pseudomosaicismo a cellule multiple)•Livello I (pseudomosaicismo a singola cellula)

Caratteristiche dei Caratteristiche dei mosaicismimosaicismicromosomicicromosomici

Errori postzigotici

Variabili nel tipoVariabili nei diversi tessuti

Variabili nel tempo

Mosaicismo Mosaicismo XX/XYXX/XY

•Di solito è uno pseudomosaicismo (CCM in gravidanza 46,XY)

•Non documentabile in una gravidanza 46,XX

•Il mosaicismo XX/XY, di III livello si associa di solito ad una femmina 46,XX (linea XY vanishing twin)

•Importante e dirimente l’analisi ecografica dei genitali esterni

Mosaicismo Mosaicismo X/XYX/XY

•In postnatale fenotipo variabile : femmina con fenotipoTurneriano, neonato con genitali ambigui, maschio sterile

•In prenatale, maschi normale

•Monitoraggio ecografico

•Origine placentare della linea 45,X

Trisomia Trisomia 2020

•Di solito è contributo dagli amniociti, ed il feto ha un cariotipo normale

•Raramente il mosaicismo causa difetti

•Rischio di patologia legato alla presenza della linea aneuploide in >60% delle cellule

Mosaicismo Mosaicismo per per isocromosoma autosomicoisocromosoma autosomico

•Raro

•i(12p) associata alla Sindrome di Pallister Killiannon presente nel sangueprognosi grave

•forme molto rare, a prognosi infausta

Riarrangiamenti strutturaliBilanciati: spostamento di parti di un cromosoma

su di un altro o all’interno dello stesso, senza modificare il contenuto genomico dell’individuo (es.:traslocazioni, inversioni).

Frequenza nella popolazione 1:200• familiari ( 1% rischio aggiuntivo di patologia)

• de novo ( 3-5% rischio aggiuntivo di patologia)

Sbilanciati: aumento o perdita di materiale genetico (es.: duplicazioni, delezioni).

Frequenza 1:1000 diagnosi prenatali

46,XY,t(3;4)(q24;q34)46,XY,t(3;4)(q24;q34)

Traslocazioni Traslocazioni de novode novo

Difficoltà a definire se il riarrangiamento sia realmente bilanciato

In postnatale la presenza di un fenotipo normale suggericse un’anomalia bilanciata

Frequenza: 1/2.000 amniocentesi; 1/9.000 quelle robertsoniane; 1/10.000 le inversioni

Meccanismi alla base di un effetto fenotipico:• delezione• duplicazione• rottura di un gene• effetto di posizione

Screening rapido delle aneuploidie dei cromosomi

•FISH (Fluorescence in situ Hybridization)Materiale esaminato: amniociti non coltivatiTempi di risposta: 48-72 ore dall’arrivo del campione in laboratorioLimiti diagnostici: valutazione parziale e limitata solo ai cromosomi specificatamente ricercati (cromosomi 21,13,18,X,Y).Limiti di affidabilità:materiale da esaminare scarsomosaicismi molto diluiti

•QF-PCR (Quantitative Fluorescence-PolymeraseChain Reaction)

QFQF--PCRPCREstrazione del DNA da amniociti non coltivati

Analisi dei microsatelliti (cromosomi 13,18,21,X) ed analisi del gene amelogenina in Xp ed Yp mediante PCR

Analisi dei prodotti di PCR per elettroforesi capillare, analisi dei frammenti e calcolo delle aree sottostanti gli amplificati (picchi)

Vantaggi: rapidità, meno laboriosa, automatizzabile, meno costosa

QFQF--PCRPCR

Trisomia 21

Trisomia 18

FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)

FISHFISH((FluorescenceFluorescence inin situsitu HybridizationHybridization))

• Studio delle traslocazionigenoteche cromosoma specifiche(painting)• Definizione più precisa dei punti di rottura• Individuazione di riarrangiamenti criptici(microdelezioni e/o microduplicazioni, riarrangiamenti subtelomerici)• Precisa definizione sullo status mono o dicentricodelle traslocazioni robertsoniane.• Caratterizzazione di marker sovrannumerari(ESAC)• Identificazione di delezioni causa di sindromi da geni contigui• Origine e struttura dei cromosomi ad anello

ESAC in diagnosi prenataleESAC in diagnosi prenataleFrequenza 1:2500

Importante l’analisi dei genitori(familiare vs de novo)

Mosaicismo vs aneuploidia omogenea

Con satelliti vs senza satelliti

1/3 presentano reperti ecografici patologici(Warburton, Am J Hum Genet 49,995-1013,1991)

Morfologia: ad anello (ring), metacentrico

ESAC FamiliariESAC Familiari

In genere non comportano rischi per il feto

ESAC de novo•I dati sui rischi empirici riflettono difetti di campionamento

•Non sono disponibili follow-up adeguati dei neonati

•Le anomalie diagnosticate sulle gravidanze interrotte riguardano solo idifetti principali

•15% per ESAC non satellitati•11% per ESAC satellitati•Sottoclassificazione con bande C, Ag-NOR, Distamicina A/DAPI, FISH

ESACsESACs in diagnosi prenatale:in diagnosi prenatale:approccio diagnosticoapproccio diagnostico

Caratterizzazione del marcatore contecniche di citogenetica molecolare (FISH)

Prelievo ematico ai genitori per controllo cariotipo

der 14/22 Ish.alfasat.14/22 +

ESACESAC(Extra (Extra Structurally Abnormal ChromosomeStructurally Abnormal Chromosome))

IDENTIFICAZIONE DI RIARRANGIAMENTI DELLE REGIONI SUBTELOMERICHE

LSI 1pter; LSI Xpter/YpterLSI 1qter; LSI Xpter/Ypter CEP X

Dalla citogenetica tradizionale alla CGH-Array

1970 Bandeggio standard

1980 Bandeggio ad alta risoluzione

1990 Citogenetica molecolare (FISH)

2002 Array-CGH (aCGH)

A-CGH: principi ed applicazioni in ambito diagnostico

Agli studenti è stato fornito materiale didattico cartaceo e sono stati consigliati testi specifici dove poter approfondire gli argomenti trattati a lezione.