La microbiologia di supporto alla gestione: rapidità Lellis... · Riproduzione: • partenogenetica (condizioni ottimali) • anfigonica o sessuale (condizioni limitanti) ... di

CAP. 1

CAP. 2

CAP. 3

CAP. 4

CAP. 5

La microbiologia di supporto alla gestione: rapidità ed innovazione dott.ssa de Lellis Laura HeraTECH- Sasso Marconi (BOLOGNA)

MICROBIOLOGIA

«INNOVATIVA»

MICROBIOLOGIA

«TRADIZIONALE»…

∆ .

Parametri microbiologici (per requisiti minimi) o Escherichia coli o Enterococchi

Parametri indicatori o Batteri coliformi o Clostridium perfringens o Conte a 37 e 22°C

Parametri supplementari o Alghe o Batteriofagi anti E.coli -Nematodi a vita libera o Salmonella o Funghi e Lieviti o Pseudomonas aeruginosa e Stafilococchi o Protozoi e altri elementi figurati o Attinomiceti o Spore di clostridi solfito-riduttori o Legionella

LA MICROBIOLOGIA DI SUPPORTO ALLA GESTIONE


2002

LABORATORI DISLOCATI IN PIU’ SEDI- UN SETTORE MICROBIOLOGIA per

LABORATORIO

2007-2008

3 LABORATORI PRINCIPALI

UN SETTORE UNICO DI MICROBIOLOGIA

2017

LABORATORI HERATECH

ACQUE POTABILI-NATURALI 60000determinazioniACQUE REFLUE-FANGHI 5500determinazioniARIA-SUPERFICI 2500determinazioni

• SALMONELLE DETERMINAZIONI ANNUE

POTABILI+NATURALI+REFLUE

circa 500

• TOSSICITA’ DETERMINAZIONI ANNUE

POTABILI+NATURALI+REFLUE

circa 2200

ANALISI TOSSICITA’ ACQUE POTABILI E REFLUE CON BATTERI BOLUMINESCENTI- ANALIZZATORE EASYCHEMTOX

AUTOMAZIONE NELLA GESTIONE DEI

CAMPIONI E DEI RISULTATI ANALITICI

1

2


ANALISI SALMONELLA IN PCR

3


METODO TRADIZIONALE

APAT IRSA 7080/

RAPPORTI ISTISAN 07/5 ISSA 011A

FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA

CRESCITA A 37°C (24h)

PASSAGGIO IN RV (24h)

PRIMA SEMINA SU PIASTRA DI HEKTOEN (24h)

SECONDA SEMINA SU PIASTRA DI HEK (24h)

IDENTIFICAZIONE E CONFERMA

COLONIE SOSPETTE

4 giorni per campioni negativi

6-7 giorni per campioni positivi

Test di conferma con terreni selettivi e test biochimici e/o

sierologici con fasi a cadenza giornaliera

METODO ALTERNATIVO

PCR - RT

FILTRAZIONE

IN ACQUA PEPTONATA

CRESCITA A 37°C (24h)

REAZIONE DI PCR

(3h tot)

Conferme non necessarie

Elevata specificità

Maggiore sensibilità

0.1 UFC

Analisi Salmonella nelle acque


La PCR (Polymerase chain reaction) è una metodica

sensibile, veloce e versatile che consente di ottenere

grosse quantità di materiale genetico a partire da

piccole quantità di DNA.

Permette di analizzare specifiche sequenze che altrimenti

costituirebbero bersagli molto rari in un genoma

complesso.

E’ una reazione enzimatica di amplificazione in vitro di un

segmento di DNA ottenuta tramite l’enzima Taq

polimerasi a partire da una coppia di primers

(oligonucleotidi), sequenze di DNA a singolo filamento

necessari per l’innesco della reazione.



Una zona specifica di DNA

viene bersagliata con due

oligonucleotidi che

amplificano, tramite la

reazione polimerasica, la zona stessa copiandola un

enorme numero di volte e

rendendola visibile e manipolabile per l’analisi

REAL-TIME PCR (PCR Quantitativa)


Nel nostro sistema, automatizzato, la rilevazione dei frammenti

amplificati avviene mediante registrazione dell’ emissione di

fluorescenza durante la reazione di amplificazione, per ibridazione di

sonde altamente specifiche- molecular beacons - marcate con

molecole fluorescenti.

Nel momento in cui si appaiano alla sequenza complementare, si

aprono ed emettono il segnale di fluorescenza per allontanamento del

fluoroforo dal suo inibitore (quencher):

SI SEGUE ISTANTE PER ISTANTE L’INDIVIDUAZIONE DEL PATOGENO

Le prove sperimentali per valutare le prestazioni della PCR Real Time

utilizzando il termociclatore Stratagene Mx3005P e il kit Rapid-Pathogen

Detection system evidenziano:

• la maggiore sensibilità della tecnica

• rapidità-esito dell’analisi di campioni di acqua con notevole anticipo

rispetto alla metodica tradizionale.


Accuratezza: elevata specificità e sensibilità con livelli di rilevazione migliori di quelli del metodo di riferimento

Rapidità nell’ottenimento del risultato (una notte di arricchimento e meno di tre ore per la reazione di detection)

Facilità d’uso: kit di analisi e software semplice, utilizzo di strips pratiche, adatte ad un impiego routinario in laboratorio, tutte le fasi visualizzabili a video, risultati che non necessitano di interpretazioni soggettive

Migliore gestione dei campioni vista la possibilità di conservarli in frigo per una settimana

Migliore tracciabilità dei dati grazie all’ archivio informatico di tutte le fasi analitiche.


PCR Real time per analisi Salmonella

COLLABORAZIONE UNIBO

Per verificare i margini di ottimizzazione del funzionamento/gestione di bacini depurativi al

fine della rimozione dei macronutrienti e dei patogeni

ANALISI di parametri di processo (macronutrienti: azoto e fosforo - microbiologici: E.coli

e Salmonella) nei bacini di finissaggio nello stato di fatto e nell’impianto pilota

appositamente costruito per simulare variazioni di battente idraulico e di tempi di

ritenzione idraulici.

SALMONELLA - ANALISI IN PCR

possibilità di aumentare l’efficienza e la garanzia di rimozione di questo patogeno

Il piano di monitoraggio proposto rappresenta un primo screening e il primo

step dell’indagine per definire una base dati solida rappresentativa delle condizione di

diffusione della Salmonella nel periodo primaverile-estivo.


PCR Real time per analisi Salmonella


Daphnia magna-crostaceo cladocero

Riproduzione: • partenogenetica (condizioni ottimali) • anfigonica o sessuale (condizioni limitanti) Buon indicatore: breve ciclo vitale e buona capacità riproduttiva Esposizione degli organismi a diverse concentrazioni del campione in esame per una durata di 24/48 ore • Viene utilizzato per diverse tipologie di matrici, sostanze

chimiche note (mg/L), acque di scarico e superficiali (%), rifiuti (% o mg/L) e fanghi (mg/L)

• Endpoint: morte /immobilizzazione del crostaceo

Per stabilire la tossicità di prodotti e sottoprodotti delle attività umane - sostanza note, miscele (rifiuti- fanghi) o acque di scarico - per un determinato ECOSISTEMA si utilizzano

Test su bioindicatori allevati in laboratorio

Analisi tossicità Nessuna metodologia chimica è in grado di stabilire quale sia la frazione realmente biodisponibile e quindi in grado di interagire con il biota


Analisi tossicità

ANALISI TOSSICITA’

CON DAFNIA MAGNA

ALLEVAMENTO


CON VIBRIO FISCHERI-METODO

AUTOMATICO


CON DAFNIA MAGNA

EFIPPI COMMERCIALI


CON VIBRIO FISCHERI-METODO MANUALE


Analisi tossicità con Vibrio fischeri

• La bioluminescenza emessa dai batteri marini gram negativi della specie Vibrio fischeri (ceppo

NRRL-B-11177) viene utilizzata per un saggio a 5-15 e 30 minuti

• Secondo la UNI EN ISO 11348-3:2009 il risultato dell’analisi con Vibrio fischeri è una concentrazione di effetto (EC50-EC20)

• La diminuzione di luminescenza viene ritenuta proporzionale alla tossicità del campione

Gli effetti ottenuti possono essere:

NON TOSSICO -bioluminescenza invariata o diminuzione minore del 10% nel campione tal quale

TOSSICO misurabile - diminuzione di bioluminescenza contenuta tra 10 e 90 % nelle diverse diluizioni del campione estremamente TOSSICO -bioluminescenza assente nel campione

• Se il campione tal quale dà un'inibizione <10 % allora l’EC50 non è calcolabile, il campione è non tossico, e il risultato analitico è

“EC 50 > 100% o non calcolabile”. • Se l’inibizione è compresa tra 10 e 90% è invece possibile calcolare un valore finito

di EC 50, che sarà il risultato da fornire al gestore.








La procedura ha permesso di velocizzare e rendere più sicura la gestione dei campioni e più rapida la fase di inserimento dei risultati analitici

• Fase di preparazione: In questa fase è prevista la stampa delle etichette, da apporre sulle relative piastre. Sono riportate tutte le informazioni delle analisi del Piani di lavoro di MICROBIOLOGIA.

• Fase di inserimento risultati: E’ prevista una maschera, a più schede, per la gestione dei risultati, con acquisizione tramite lettura dei barcode

Automazione nella gestione campioni e risultati

• Il laboratorio HERAtech ha individuato l’impianto pilota

Algae Online Analyser, in grado di monitorare e

quantificare in continuo la biomassa algale e cianobatterica

tramite la fluorimetria in vivo in acque grezze, di processo

e potabili. Il principio si basa sull’analisi dello spettro di

fluorescenza emesso dai pigmenti dopo averli sottoposti

ad eccitazione per mezzo di una luce di lunghezza d’onda

compresa tra 400 e 650 nm

• Viene determinata la clorofilla e l’attività fotosintetica; è in

grado di discriminare simultaneamente fino a 5 classi algali

(Clorofite, Cianobatteri, Crisofite e Criptofite) utilizzando

sei LED a diverse frequenza.


Algae Online Analyser

• Limitata manutenzione (pistone interno per pulizia della camera) • Semplice operatività • Possibilità analisi campioni in sequenza • Possibilità uso off line • Nessuna preparazione del campione o di reattivi • Supporto al metodo tradizionale che comporta tempo ed elevata

specializzazione per il riconoscimento al microscopio


Algae Online Analyser

Grazie per l’attenzione

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