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bibliográfico a que nos estemos sometien-do. En todo caso, lo más simple es buscarla información en una revista científica.Usualmente aparece una sección conocidacomo "Guía para los autores" en la cualse da información detallada. La RevistaCostarricense de Ciencias Médicas publicóen el año 2000 un folletito con sus indica-ciones, que además incluye los lineamien-tos para la presentación de manuscritos yque está disponible en la bibliotecaBINASSS o bien en la direcciónwwwrccm.sa.cr.

CONCLUSIÓN

Debemos ver en el Protocolo esaespecie de seguro de éxito, que nos

delimita el campo de juego, define 1asreglas y las normas que seguiremos y

además, nos organiza el tiempo, según las

metas que debemos alcanzat en cadaperiodo del estudio. Esto resulta particular-mente importante pues a veces, una vezaprobado el protocolo no se inicia de inme-diato ei trabajo o nos quedamos solo en una

determinada etapa sin avanzal; esto es'nos quedamos en uno de los objetivosespecíficos perdiendo de vista la globalidad

del proyecto. Por estas razones es muyimportante, plantear adecuadamente elprotocolo de lo que pretendemos hacer y no

solo como un requisito.

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LA MICROSCOPIAELECTRÓNICA Y

LAS ENFERMEDADESINFECCIOSAS

Francis c o H erruúnilez- Chavarrla

Facultad de Microbiología YCentro ile Investigación en EsfiucturasMicroscópicas ( CIEMic), Unive rsidadde Costa Rica, San José, Costa Rica,

e-mail: hchavarr@cariari.ucr.ac.cr

El primer microscopio electrónico (ME)

que se construyó podía aumentar la imagenpoco más de l7X. El aumento de los

microscopios actuales sobrepasa el medio

miilón de veces gracias a que su resolución

es de tan solo 1,4 .4.Los albores dé la historia del ME

estuvieron matizados de injusticia. Su

creador, Ernst Ruska, era estudiante en el

laboratorio de investigación en alto voltajey televisión de la Universidad técnica de

Berlín, cuando diseñó 1o que él llamó

un lente elecffomagnético, con el cual se

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Knoll, reconoció el valor de la invenciónde su alumno y lo inscribió en un simposiocientífico que se realizaía el 4 de junio de1931. Pero Knoll cometió un error: contólos detalles de la invención de su alumno aun amigo, quien a su vez se los comentó aotro amigo. Este último era R. Rudemberg,jefe de ingenieros de la compañíaSiemmens, quien con esos datos patentó ellente electromagnético, el microscopioelectrónico y cualquier otro instrumentoque se pudiera construir con esos lentes.Su patente está fechada el 30 de mayo de1931, tan solo 5 días antes de que Ruskay Knoll presentaran oficialmente suinvención en el Simposio.

Una vez que Ruska se graduó y ante lafalta de empleos en la Alemania de entreguerras, no tuvo más recurso que trabajaren la Compañía Siemmens, de donde salióel primer prototipo comercial del ME en1934. Ruska emigró a los EEUU despuésde la Segunda Gue¡ra Mundial y continuótrabajando en el perfeccionamiento del MEen la compañía RCA (1). Esta historia tieneun final feliz pues Ruska recibió el premioNobel en 1986 y el reconocimiento oñcialcomo padre de la microscopia electrónica;aunque eso ocurrió tan solo dos años antesde su muerte.

Actualmente, el ME se ha consolidadocomo un instrumento científico aplicableal estudio biomédico y de otros campostan diversos como la flsica, ingeniefa yarqueologla, entre una gran gama deaplicaciones.

Por ejemplo, en arqueología esimportante señalar que en Costa Rica lalicenciada Patricia Fem¡ández, del Museode Oro del Banco Nacional, ha conducidoestudios ultraestructurales importantesde piezas precolombinas y sus hallazgoshan permitido una mejor interpretaciónde esos obietos v de las técnicas de

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EL MICROSCOPIOELECTRóNICO COMO

HERRAMIENTADIAGNOSTICA

Las primeras observaciones de virus alME fueron realizadas en la década de 1950,mediante sombreado de los viriones. Estoes, que la preparación de virus es sometidaa vapores de un metal como platino ocromo, lo que implica el empleo deevaporadores de metales que debentrabajar a alto vacío, consumiendo untiempo mínimo de 2 a 4 horas porpreparación.

Las observaciones posteriores se hicie-ron mediante la técnica de tinción negativa,que consiste en colocar una gotita de unos 5pl del material donde se buscan los vi¡usen una rejilla para ME y una vez que lapreparación se ha secado, se contrasta conun compuesto de un metal pesado, como esel ácido fosfotúngstico, lo cual tarda unos10 a 15 minutos. Esta técnica es ani4loga aun frotis teñido sobre un portaobjetos ysu simplicidad abrió una nueva sendadiagnóstica en virología.

El potencial del ME como herramientadiagnóstica en virología comienza aexplotarse en la década de 1960 (2). Paraesa época, la identificación de los virus sercalizaba mediante cultivo, ya fuese enmonocapas celulares, en huevos embriona-dos o mediante inoculación en animales, loque usualmente tardaba más de 48 horas yel resultado a veces no era concluyente,

Las primeras aplicaciones de la MEfueron en el diagnóstico diferencial deviruela, frente a otras virosis comosarampión, varicela y en general concuadros exantemáticos. Obviamente, enuna época donde la viruela era endémicaen algunas regiones de medio oriente y

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occidente para evitar brotes epidémicos (2,3). La ventaja diagnóstica es que el virusde la viruela tiene una morfologíacaracteística.

También, la ME permitió visualizarel Antígeno Australia en la década de 1960,lo que reforzó más la etiología viral dela hepatitis B en esa época, cuando ello erasolo una sospecha (4).

ETIOLOGÍA VIRALDE LAS DIARREASY LA

MICROSCOPIAELECTRONICA

Hacia finales de la década de 1960 seidentificaba el agente causal de las diarreasen aproximadamente an 20Vo de los casos,quedando el resto como casos de etiologíadesconocida, en los cuales se sospechaba lapresencia de algún agente viral, lo cual sehabía planteado desde 1930. Hubo algunasinvestigaciones que evidenciaban la prcsen-cia de virus lo que indirectamente eraconfirmado mediante la dianea que sufríanlos voluntarios que ingerían filtradoslibres de células de las heces dia¡reicasde pacientes (5).

En 1973 se publicaron los dos primerosinformes en los cuales se mostraban lasfotografías tomadas al ME de los rotavirus,lo que desencadenaría una avalancha depublicaciones en todo el mundo, quellevaron a confirmar a este agente como lacausa principal de dianeas infantiles. El .primero de esos Íabajos correspondió a ladoctora aust¡aliana Ruth Bishop, quieninicialmente envió una carta a la revistaThe Lancet informando del primer caso dediarrea en el cual los viriones aparecían enuna biopsia de duodeno. Sin embargo, laspolíticas editoriales de la revista en esa

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solo caso, por lo cual el trabajo fue techaza-do. Semanas más tarde enviaron una nuevanota, esta vez con la recopilación de 9casos, la cual fue publicada (6).

El segundo trabajo correspondió al DrFlewett . quien descubrió los mismosviriones en las heces de niños con diarrea.Este trabajo sería el que motivaría arepetirlo infinidad de veces en todo elmundo pues la metodología empleada erala tinción negativá, lo que permitía eldiagnóstico del virus en minutos (7).

En Costa Rica, la investigación de estosvirus al ME llevó a la descripción delprimer brote anual en 1977 (8), precedidade algunas otras publicaciones como seresumen en el artículo "Una visión de labiología tropical a través del microscopioelectrónico" (9).

La investigación de las heces dia¡reicasal ME condujo al hallazgo de una pléyadede vi¡us involucrados en la etiología de lasdiarreas, entte los que sobresalen como losmás importantes los adenovirus, astrovirus,coronavirus, calicivirus y un grupo hetero-géneo de virus cuyo diiámetro es cercano alos 27 nm, por 1o que fueron denominadoscomo 'Agentes de 27 nm" o bien como"Pequeños virus isomórficos". En estegrupo se identificó al virus Norwalk comouno de los más ptevalentes; actualmenteestá clasificado en la familia Caliciviridaey constituye uno de los principales agentesvirales de dia¡rea en adultos (10).

Los primeros hallazgos de Adenovirus enheces estuvieron matizados de incefidum-bre ante el dilema dé si realmente se tratabade vitus respiratorios o de un agente causalde diarrea; esto, por cuanto la mayoría de losestudios se realizaban en hospitales y setomaba como controles a pacientes sindianea internados por otras causas, entre lasque sobresalían las infecciones respiratorias.Sin crnharon ecnc q¡{pnm¡i¡'¡ nn oo nnz{í.-

r04

respiratorios por lo que en un principio seles calificó de 'Adenovirus no cultivables".Posteriormente se perfeccionaron lastécnicas pam su cultivo y se demostró que

se trataba de Adenovirus entéricos, iamayoría de los cuales corresponde a dosserotipos denominados 40 y 41 (11).

También, con los coronavirus huboincertidumbre, pues incluso se ptopusoque podrían ser detritus celulares más queviriones. Hoy, es considerado uno de losagentes causales de diarrea que afectan aniños. aunque su mayor importancia es entemeros y cerdos. En Costa Rica fueronrelacionados como el segundo agente másimpofante, luego de los rotavirus, en lasdiarreas de terneros (12) y también, se hanidentifrcado como el segundo agente viralinvolucrado con el brote de diarrea infantil,que se presenta entre noviembre y enero decada año (13).

Otro agente viral relacionado condiarrea en humanos son los Torovirus,perteneciente a la familia Coronaviridae. Elsegundo lugar en frecuencia, luego de losfot¿virus, lo disputan en este momento losastrovirus y los calicivirus, que al ME sondemostrados esporádicamente debido a quese excretan en baja cantidad y a su pequeñotarÍaño (2'1 nm); sin embargo, las técnicasde inmunoensayos con antlcuerPosmonoclonales y las pruebas de diagnósticomolecular han mostrado que estos virusson más frecuente que los adenovirus,desplazandolos a un cuarto lugar en cuantoa prevalencia en diarreas infantiles (10).

Como se mencionó previamente, losroiavirus ocupan el primer lugar en cuantoa frecuencia, y presentan un rncrementoen la incidencia durante los meses másflos del año, tanto en países desarrollados -

donde se cuenta con medidas higiénicasadecuadas-. como en países en desarrollo,

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No obstante, se han encontrado en aguasy vegetales. En Costa Rica fueron detecta-dos en lechugas compradas en las Ferias delAgricultor (14).

Actualmente, se han descrito 7 gruposde ¡otavirus denominados con las letras deA a G, de los cuales solo los A, B y Cafecta¡ a humanos; el primero es el demayor prevalencia mundial, en tanto losotros dos se han relacionado con brotesesporádicos; de esos, el grupo B fueresponsable de una gran epidemia enChina en 1982 en Ia cual al principio sedesconocía el agente, pues las muestrasanalizadas por rotavirus mediante la técnicade ELISA daban resultados negativos; pero,fueron detectados al ME, por lo que se lescalificó como "Pa¡arotavirus" dado a queno compartían los antígenos que permitíanel diagnóstico serológico de los rotavirusdescritos hasta esa época (10).

En general el descubrimiento de losvirus de las diarreas se ha realizado alME, con excepción de los Picobirnavirus,último agente de esta serie desc¡ito en ladécada de 1990. Su descubrimiento ocuniópor serendipia: Se investigaba la presenciade rotavirus mediante electroforesis cuandose descubrieron unas bandas dobles deARN que no correspondían a totavirus yque se asocr¿fon a un nuevo vrrus, cuyogenoma está integrado por unos 2 o 3segmentos de ARN de doble banda, por 1oque se denominó Picobirnavirus (15)'

Actualmente se han descrito estos virusen u¡a serie amplia de ve¡tebrados, inclu-yenco peces. i

SIDAY LAAPARICIÓNDE NUEVOSAGENTES

INFECCIOSOS

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muchas entidades infecciosas, algunascausadas por agentes otrora consideradosno virulentos.

Nuevamente la microscopia electrónicafue la henamienta que permitió esclarecermuchas relaciones ultraest¡ucturales entreesos agentes. Por ejemplo, se redescubrióel género Cryptosporidium, que emergiócomo un agente importante en la causalidadde las diarreas. En un principio se conside-ró a Cryptosporidium como el únicococcidio extracelular; pero el análisisultraestructural demostró que se trataba deun parásito intraceiular, solo que se localizainmediatamente bajo la membranacitoplasmática. Aunque los primerosdiagnósticos asociaban a este parásitocon pacientes inmunosupresos, luego sedemostró que también afectaba a personassin problemas inmunológicos de fondo;solo que en éstos el cuadro era más leve yautolimitado.

En esa misma década se descubrióotro coccidio relacionado con las diarreas.Tempranamente se asoció con la diarreadel viajero ya que aparecía en individuos depaíses desarrollados que recientementehabían viajado a iáreas tropicales, aunqueexiste un informe previo de su hallazgo enhumanos, que data de 1979. Inicialmenteese agente fue considerado una alga y pos-te¡iormente se clasificó como Ciclosporacayetanensis, En este caso, se trata de uncoccidio que al microscopio de luz separece a Cryptosporidíum, solo que mideprácticamente el doble que éste (16).

Adicionalmente, en la década de 1990 .se redescubrió otro grupo impoÍante decoccidios involucrados con las diarreas,Esta vez, se trata de agentes cuyos esporas-única forma capaz de sobrevivir fuera delhospedero- tienen un tamaño que osciladesde 1 pm (Enterocytozoon bieneusi)h¡ctq 4O ur¡ (Rn¡illi¡lhtm ñlif¿ntm\ w ct¡

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causales de diasrea E. bieneusi, E. cuniculiy Encephalitozoon intestínalís. Además,otras especies se han asociado conpatologías como keratoconujuntivis,cuadros respiratorios, miositis, nefritis,hepatitis, encefalitis e incluso cuadrosgeneralizados desgastantes.

Entre las nuevas especies estánBrachiola (Nosema) algerae, Nosemaoculatum, Microsporidium ceylonensis,Pleistophora sp., Trachipleistophorahominis, T. Anthropophtera y Vttformacomeae. Actualmente se han descrito 143géneros con 1200 especies 13 de las cualesafectan a humanos (17). No obstante,aparentemente este agente evolucionó apartir de los hongos zygomicetales (18).

Independientemente de su posiciónfilogenética, la microscopia electrónica seconvirtió en la herramienta diagnósticainicial para clasificar las especies demicrosporidios, pues el número de espirasdel filamento polar, una estructura caracte-rística de estos parásitos es impofantetaxonómicamente (19).

El estudio etiológico de las diarreas delos pacientes inmunosupresos condujo aldescubrimiento de otras especies deCampylobacter relacionadas con diarreaaparte de C. jejuni, como son C. larus, C.

fenneliae y C. cinaedi. Las dos últimasfueron reclasificadas posteriormente en elgércro H elic obacte r (20).

SIGLO XXI.LA MICA.OSCOPIA

ELECTRONICAYLASENFERMEDADES INFECCIOSAS

El campo de la bacteriología muestrados descubrimientos interesantes en loscuales la microscooia electrónica es una

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bacterias cuyo pequeño tamaño (50 y200 nm) les permite atravesar los filtrosotrora considerados "esterilizantes". Por lotanto, se trata de bacterias visibles soloal microscopio electrónico y queaparentemente están relacionadas con laetiología de las litiasis renales. Aunquealgunos científicos dudan de su existencia,asociando los hallazgos más a precipitacio-nes químicas de sales de calcio que aagentes biológicos, la evidencia microscó-pica sugiere que se trata de bacteriasbacilares recubiertas de un glicocalix queincorpora sales de calcio (21).

El otro hallazgo trascendental es eldescubrimiento de citoesqueleto bacteria-no, constituido por un forro proteico localizado bajo la membrana citoplasmática, conproyecciones que atraviesan el cuerpo dela bacteria, en las cuales se adosan lospolisomas bacterianos.

Aunque, esos hallazgos parecen solo deciencia básica, sus aplicaciones prácticasson muy esperanzadoras pues las eviden-cias ultraestructurales muestran como laincorporación de fragmentos de esecitoesqueleto provoca su destabilización ydestrucción de la bacteria. Por lo tanto, suaplicación será una nueva generación dedrogas antibacteri anas (22).

CONCLUSION

Han transcurrido unos 70 años desdeque salió al mercado el primer ME y eneste peíodo se ha consolidado como uninstrumento importante en la investigaciónbiomédica, especialmente en el campo dela virología, en el que sigue siendo uninstrumento impofante en los laboratoriosde referencia. No obstante, su aplicación enbiomedicina es parte de una rutina en mu-chos laboratorios de países desar¡ollados.

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Centro de Investigación en EstructurasMicroscópicas y continúa con su política deprestar servicio a la comunidad científicanacional e incluso extranjera, vendiendoservicios de análisis ultraestructural encampos tan diversos como biología, medi-cina, agronomía y ciencia de materiales.

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