La Real Time PCRLa Real Time PCR

Evoluzione di una tecnica che ha Evoluzione di una tecnica che ha rivoluzionato la biologia rivoluzionato la biologia

molecolaremolecolare

Corso di laurea in Biotecnologie Biotecnoogie Diagnostiche

Francesca Schena

Un po’ di storia...

• 1983 Kary Mullis ideò la PCR

• 1993 premio Nobel

Test ad alta:• SENSIBILITA’• SPECIFICITA’

LA END-POINT PCR

LIMITI:

•Poca precisione

•Bassa risoluzione

•No automazione

•Prodotti a basso p.m.

•Bromuro di etidio non è quantitativo ed è mutageno

•Risultati non numerici

Numero di cicli

[ am

plic

on ]

Vari fattori limitano la crescita esponenziale

0Fase esponenziale

Fasi di PCR in scala logaritmica

QUANTIFICAZIONE NON E’ PRECISA A PLATEAU MA LO E’ NELLA FASE ESPONENZIALE

Numero di cicli

[ am

plic

on ]

0

Numero di cicli

[ am

plic

oni ]

Valore di riferimento K

0

In una PCR con misurazione “end-point” (gel di agarosio) la quantità di ampliconi rilevato

non è proporzionale alla quantità di target iniziale

In una PCR “Real Time” il numero di cicli necessario per raggiungere una certa

quantità di ampliconi è proporzionale alla quantità di

target iniziale

Come funziona la Real Time?Come funziona la Real Time?

Linear scale view Logarithmic scale view

Measure of thereporter signal

UTILIZZA DIVERSE SONDE INTERNE AL TARGET MARCATE A FLUORESCENZA CHE VENGONO RILEVATE DAI TERMOCICLATORI(FLUORIMETRI) DURANTE LA REAZIONE

Vantaggi della PCR Real Time

• Si evitano le contaminazioni date dalla manipolazione del campione

• Si riduce il tempo dell’esperimento

• Si ha una quantificazione del prodotto in tempo reale

La quantificazione del prodotto

•QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA tramite curve standard a concentrazione nota

•QUANTIFICAZIONE RELATIVA tramite curve standard di un gene calibratore

SYBER GREENSYBER GREEN

• * Non sono richieste Non sono richieste sonde specifichesonde specifiche

• * Generale screening * Generale screening di trascritti prima di di trascritti prima di passare alle sondepassare alle sonde

• *Metodiche di pcr già *Metodiche di pcr già collaudate in assenza collaudate in assenza di prodotti aspecifici, di prodotti aspecifici, dimeri di primers ecc.dimeri di primers ecc.

• * GenotipizzazioneGenotipizzazione• * Multiplex* Multiplex• * Amplificazione di * Amplificazione di

trascritti poco trascritti poco espressiespressi

• * Detection di un * Detection di un basso livello di basso livello di patogenipatogeni

Perchè non scegliere Perchè non scegliere SYBER GreenSYBER Green

Perchè scegliere Perchè scegliere SYBER GreenSYBER Green

Extension

NON DETECTEDEMISSION

Annealing

AMPLICON

EXCITATION

NON DETECTEDEMISSION

Extension

AMPLICON

EXCITATION

REPORTER QUENCHER TAQ POLYMERASE PHOSPHATE

Le sonde TaqManLe sonde TaqMan

NON DETECTEDEMISSION

Extension 5’-3’ Exonuclease

AMPLICON

Annealing

AMPLICON

EXCITATION

EXCITATIONDETECTED EMISSION

REPORTER QUENCHER TAQ POLYMERASE PHOSPHATE

Le sonde TaqManLe sonde TaqMan

VantaggiTaqmanVantaggiTaqman

• AFFIDABILITA’• SICUREZZA• SEMPLICITA’• PRODUTTIVITA’

SvantaggiTaqmanSvantaggiTaqman

•COSTO ELEVATO

•PROBLEMI DI ACCUMULO

MULTIPLEXMULTIPLEX

SMART CYCLER

Quattro canali ottici per la rilevazione della fluorescenza

Possibile utilizzo di SYBR® Green, FAM, ROX, Cy3, Cy5, Texas Red, TET, Scorpion

e Amplifluor primer

NON FLUORESCENT QUENCHERREPORTER

A target-specific loop

B stem(5-6 complementary bases)

C fluorophore

EXCITATION

Quenching

EXCITATIONDETECTEDEMISSION

AMPLICON

Annealing

Molecular BeaconMolecular Beacon

SI UTILIZZANO DI PREFERENZA CON SI UTILIZZANO DI PREFERENZA CON L’APPARECCHIATURA NULISENS EASYQL’APPARECCHIATURA NULISENS EASYQ

Vantaggi Vantaggi • INNOVAZIONE: prima utilizzata per il

monitoraggio di paziente HIV positivo approvata dalla FDA

• SEMPLICITA’ per l’interfaccia Windows che consente una facile interpretazione dei dati

SvantaggiSvantaggi

• Massima precisione solo con RNA ottenuti da estrattori automatici

•Complessità della metodica

Fluorescein (donor) LC RED640/705 (acceptor) Phosphate

AMPLICON

EXCITATIONNON DETECTED

EMISSION

EXCITATION FRET

DETECTEDEMISSION

Annealing 1-5nt

AMPLICON

Sonde FretSonde Fret

Genotipizzazione tramite la curva di meltingGenotipizzazione tramite la curva di melting

AMPLICON 136VV

AMPLICON WTA

Sonda = 136 V

VA

Sonde fret e LIGHT Sonde fret e LIGHT CYCLER CYCLER

Ottimo in diagnostica Perchè molto veloce!!

Termociclatore Tipo di sonda + -ABI PRISM 7700•Non versatile

•Set-up Ingombrante

•produttivo

Syber green •Economico•Versatile•Metodica collaudata

•Aspecificità

•Multiplex

•Tipizzazione

Taqman/ •Affidabile

•semplice

•Costoso

Smart Cycler• Set-up piccolo e pratico

Taqman

Syber green

Molecular beacon

•Multiplex

•Veloce (8 min)

•Flessibile

•Diagnostica

•Protocollo rigido

•Ricerca

Nuclisens EasyQ

Molecular beacon

•Tipizzazione

•Diagnostica

•Metodica complessa

Light Cycler

Fret

Syber green

•Tipizzazione

•Veloce

•Diagnostica

•Costoso

•Non per grossi volumi

LightCyclerRoche

7700Applied Biosystems

ApplicazioniApplicazioni

Quantificazione viraleQuantificazione viraleQuantificazione dell’espressione genicaQuantificazione dell’espressione genica

Quantificazione del danno al DNAQuantificazione del danno al DNAControllo di qualita’Controllo di qualita’

Efficacia e monitoraggio di una terapiaEfficacia e monitoraggio di una terapiaDetection di patogeniDetection di patogeni

GenotypingGenotyping