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LA SEPSI PROCEDURE DI BASE E SPECIALISTICHE FASE
ANALITICA E POSTANALITICA
Paolina Cavalcanti
La SEPSI egrave una delle piugrave gravi sindromi infettive La SEPSI egrave una malattia progressiva
DIMENSIONE DEL PROBLEMA
MORTALITArsquo
Sepsi 10 ndash 40
Shock settico 40 ndash 70
Lrsquoaumento di incidenza della patologia settica egrave da attribuirsi a vari fattori quali
- aumento aspettativa di vita media della popolazione
- relativa frequenza di sepsi associata ad AIDS
- uso indiscriminato di antibiotici
- terapie cortisoniche prolungate
- migliorate possibilitagrave nellrsquouso della ventilazione artificiale
- terapie antiblastiche e radioterapia
- indagini strumentali invasive
Soggetti a rischio maggiore
immunodepressi ustionati traumatizzati anziani diabetici portatori di
catetere
LO SHOCK SETTICO Egrave LA PIUgrave COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE
UNITAgrave DI TERAPIA INTENSIVA (ICU)
Se la diagnosi egrave rapida la prognosi egrave favorevole nellrsquo80 dei casi altrimenti si
ha una mortalitagrave di circa il 70
Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512
Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock
an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T
The Institute for Systems Biology Seattle WA USA
CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the
causative pathogen is one of the most important predictors of
outcome clinicians must establish a system for rapid administration of
a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic
shock is suspected
Baseline characteristics of 2634 patients with suspected sepsis according to receipt of
adequate or inadequate antibiotic treatment
MacArthur R D et al Clin Infect Dis 200438284-288
copy 2004 by the Infectious Diseases Society of America
ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una
concreta riduzione della mortalitagrave ldquo
(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)
Far primahelliphelliphellip
Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo
lrsquoalta qualitagrave dei risultati
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
La SEPSI egrave una delle piugrave gravi sindromi infettive La SEPSI egrave una malattia progressiva
DIMENSIONE DEL PROBLEMA
MORTALITArsquo
Sepsi 10 ndash 40
Shock settico 40 ndash 70
Lrsquoaumento di incidenza della patologia settica egrave da attribuirsi a vari fattori quali
- aumento aspettativa di vita media della popolazione
- relativa frequenza di sepsi associata ad AIDS
- uso indiscriminato di antibiotici
- terapie cortisoniche prolungate
- migliorate possibilitagrave nellrsquouso della ventilazione artificiale
- terapie antiblastiche e radioterapia
- indagini strumentali invasive
Soggetti a rischio maggiore
immunodepressi ustionati traumatizzati anziani diabetici portatori di
catetere
LO SHOCK SETTICO Egrave LA PIUgrave COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE
UNITAgrave DI TERAPIA INTENSIVA (ICU)
Se la diagnosi egrave rapida la prognosi egrave favorevole nellrsquo80 dei casi altrimenti si
ha una mortalitagrave di circa il 70
Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512
Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock
an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T
The Institute for Systems Biology Seattle WA USA
CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the
causative pathogen is one of the most important predictors of
outcome clinicians must establish a system for rapid administration of
a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic
shock is suspected
Baseline characteristics of 2634 patients with suspected sepsis according to receipt of
adequate or inadequate antibiotic treatment
MacArthur R D et al Clin Infect Dis 200438284-288
copy 2004 by the Infectious Diseases Society of America
ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una
concreta riduzione della mortalitagrave ldquo
(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)
Far primahelliphelliphellip
Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo
lrsquoalta qualitagrave dei risultati
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
DIMENSIONE DEL PROBLEMA
MORTALITArsquo
Sepsi 10 ndash 40
Shock settico 40 ndash 70
Lrsquoaumento di incidenza della patologia settica egrave da attribuirsi a vari fattori quali
- aumento aspettativa di vita media della popolazione
- relativa frequenza di sepsi associata ad AIDS
- uso indiscriminato di antibiotici
- terapie cortisoniche prolungate
- migliorate possibilitagrave nellrsquouso della ventilazione artificiale
- terapie antiblastiche e radioterapia
- indagini strumentali invasive
Soggetti a rischio maggiore
immunodepressi ustionati traumatizzati anziani diabetici portatori di
catetere
LO SHOCK SETTICO Egrave LA PIUgrave COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE
UNITAgrave DI TERAPIA INTENSIVA (ICU)
Se la diagnosi egrave rapida la prognosi egrave favorevole nellrsquo80 dei casi altrimenti si
ha una mortalitagrave di circa il 70
Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512
Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock
an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T
The Institute for Systems Biology Seattle WA USA
CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the
causative pathogen is one of the most important predictors of
outcome clinicians must establish a system for rapid administration of
a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic
shock is suspected
Baseline characteristics of 2634 patients with suspected sepsis according to receipt of
adequate or inadequate antibiotic treatment
MacArthur R D et al Clin Infect Dis 200438284-288
copy 2004 by the Infectious Diseases Society of America
ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una
concreta riduzione della mortalitagrave ldquo
(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)
Far primahelliphelliphellip
Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo
lrsquoalta qualitagrave dei risultati
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Soggetti a rischio maggiore
immunodepressi ustionati traumatizzati anziani diabetici portatori di
catetere
LO SHOCK SETTICO Egrave LA PIUgrave COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE
UNITAgrave DI TERAPIA INTENSIVA (ICU)
Se la diagnosi egrave rapida la prognosi egrave favorevole nellrsquo80 dei casi altrimenti si
ha una mortalitagrave di circa il 70
Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512
Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock
an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T
The Institute for Systems Biology Seattle WA USA
CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the
causative pathogen is one of the most important predictors of
outcome clinicians must establish a system for rapid administration of
a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic
shock is suspected
Baseline characteristics of 2634 patients with suspected sepsis according to receipt of
adequate or inadequate antibiotic treatment
MacArthur R D et al Clin Infect Dis 200438284-288
copy 2004 by the Infectious Diseases Society of America
ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una
concreta riduzione della mortalitagrave ldquo
(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)
Far primahelliphelliphellip
Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo
lrsquoalta qualitagrave dei risultati
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Crit Care Med 2004 Nov32(11 Suppl)S495-512
Antimicrobial therapy for patients with severe sepsis and septic shock
an evidence-based review Bochud PY Bonten M Marchetti O Calandra T
The Institute for Systems Biology Seattle WA USA
CONCLUSION Since the prompt institution of therapy that is active against the
causative pathogen is one of the most important predictors of
outcome clinicians must establish a system for rapid administration of
a rationally chosen drug or combination of drugs when sepsis or septic
shock is suspected
Baseline characteristics of 2634 patients with suspected sepsis according to receipt of
adequate or inadequate antibiotic treatment
MacArthur R D et al Clin Infect Dis 200438284-288
copy 2004 by the Infectious Diseases Society of America
ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una
concreta riduzione della mortalitagrave ldquo
(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)
Far primahelliphelliphellip
Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo
lrsquoalta qualitagrave dei risultati
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Baseline characteristics of 2634 patients with suspected sepsis according to receipt of
adequate or inadequate antibiotic treatment
MacArthur R D et al Clin Infect Dis 200438284-288
copy 2004 by the Infectious Diseases Society of America
ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una
concreta riduzione della mortalitagrave ldquo
(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)
Far primahelliphelliphellip
Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo
lrsquoalta qualitagrave dei risultati
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
ldquoLa precocitagrave dellrsquointervento terapeuticocompresa la somministrazione della terapia antimicrobica attiva sullrsquoagente eziologicoegrave decisiva ai fini prognostici ed egrave associata ad una
concreta riduzione della mortalitagrave ldquo
(Camporese A IJLaM 20084 Suppl 45-49)
Far primahelliphelliphellip
Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo
lrsquoalta qualitagrave dei risultati
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Far primahelliphelliphellip
Raggiungere lrsquoobiettivo in tempi rapidi mantenendo
lrsquoalta qualitagrave dei risultati
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
bull Tempo identificazione
bull Tempo prove di sensibilitagrave
bull Terapia empirica
bull Insorgenza resistenze
bull gt mortalitagrave
bull gt costi
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Diagnosis
Obtain appropriate cultures before starting antibiotics provided
this does not significantly delay antimicrobial administration
bullObtain two or more BCs
bullOne or more BCs should be percutaneous
bullOne BC from each vascular access device in place gt 48 hrs
bullCulture other sites as clinically indicated
Perform imaging studies promply in order to confirm and sample
any source of infection if safe to do so
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Emocoltura
Coltura sito drsquoinfezione
Diagnosi molecolare
Biomarkers (IL-6 PCR PCT LPS)
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
EMOCOLTURA
isolamento colturale
del microrganismo dal sangue
Il laboratorio nella diagnosi delle sepsi
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
14
Emocoltura fase pre-analitica
Emocoltura pre-analitica
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Personale che effettua il prelievo
Sede del prelievo
Sterilizzazione della cute
Momento del prelievo
Numero dei prelievi
Volume del sangue
Mezzo di coltura
EMOCOLTURA
Ottimizzazione della procedura
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Emocoltura team per il prelievo
Riduzione della contaminazione da 48 a 1 (Weinbaum J Clin Microbiol 2001)
da 42 a 22 (Shifman Arch Pathol Lab Med 1996)
Affidare il prelievo a personale competente ed informato
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Lavare le mani prima e dopo il prelievo
Indossare guanti nei passaggi di raccolta e trasporto
Ricerca del sito di prelievo mediante palpazione
Disinfezione della cute
bull sgrassare con Alcool 70 (o Clorexidina)
bull disinfettare con Iodoforo (Iodiopovidone)
bull applicare con movimento circolare verso
lrsquoesterno lazione disinfettante egrave tempo-dipendente
Quando la cute egrave asciutta egrave pronta per il prelievo
Mai pungere prima di 1-3 minuti
Emocoltura il prelievo
Antiseptic skin preparation
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Emocoltura sede del prelievo
Effettuare il prelievo da vena periferica
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Tempo del prelievo
Prima di iniziare la terapia antibiotica
Prima della sommistrazione dellrsquoantibiotico
Nellrsquoarco di 5-10rsquo (eccezione infezioni endovascolari quali
endocardite o sepsi CVC correlate)
As a practical matter blood cultures should be obtained simultaneously (or over a short timeframe) Drawing blood at intervals is only indicated when it is necessary to document continuous bacteremia in patients with suspected infective endocarditis or other endovascular (eg catheter-related) infections
CLSI publication M47-AmdashPrinciples and Procedures for Blood Cultures
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Tempi di incubazione
emocolture
I microorganismi ldquofastidious ldquo richiedono tempi piugrave lunghi di coltura almeno
2 - 3 settimane di incubazione
Washington JA Mayo Clin Proc 1982
Alcuni microorganismi possono generare segnali molto deboli o anche nessun segnale
di crescita
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
SOSPETTO CLINICO
Esami microscopici e subcoltura cieca delle emocolture negative
Aumento dei tempi di incubazione delle emocolture negative
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Prelevare 2 - 3 set (anaerobi + aerobi) per aumentare la possibilitagrave di isolare il
microrganismo in causa
differenzia la vera batteriemia dalle
contaminazioni
At least 15 of positive BC are due to
contaminants the number can be as high as
40
819 of CoNS and 493 of viridans
streptococci were contaminants
Wenstein MP Clin Infect Dis 1997
Numero di emocolture
163 malati (non endocarditi) 20 mL per set (Cockerill FR 2004)
blood cultures
n 1 2 3
diagnostic () 63 80 96
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Optimal volume of blood for culture
ldquoThe volume of blood is the single most
important factor for successful recovery of
microorganisms from the blood stream of patientsrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
What is the optimal volume
of blood for culture
Blood from patients with IE contains 1
to 10 bacteria per mL
There is approximately linear
relationship between the yield of
bacteria from blood and the volume of
blood
ldquoThe volume of blood sample drawn
should be 40-60 mlrdquo
Towns ML Infect Dis Clin N Am 2002
23
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
24
The microbiological diagnosis
TAT
Emocoltura analitica
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
BACTEC 9240
Strumento modulare
Incubatore Agitatore Lettore
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
I flaconi sono prelevati direttamente con modalitagrave tipo Vacutainer
Dopo il prelievo i flaconi non subiscono alcuna manipolazione o intervento invasivo
I flaconi sono inseriti nello strumento
BACTEC 9240
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
FASE PRE-ANALITICA
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Lrsquoefficacia ed il significato clinico dellemocoltura dipendono da
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Emocoltura positiva
Interpretazione del risultato
RUOLO PATOGENO
DEL MICRORGANISMO
ISOLATO
IDENTIFICAZIONE
DEI MICROORGANISMI
CONTAMINANTI
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
29
Batteriemia significativa
Improbabile Incerta Probabile
Corynebacterium spp
Non-anthracis Bacillus spp
Propionibacterium acnes
Stafilococchi Coagulasi Negativi
S aureus
S pneumoniae
Enterobacteriaceae
P aeruginosa
C albicans
probabilitagrave post-test n positivi n colture
confrontare antibiogrammi confrontare genotipi
probabilitagrave pre-test fattori di rischio del paziente
protesi evidenza clinica
Kim SD et al Infect Control Hosp Epidemiol 2000 21 213-7
Interpretare una emocoltura ldquopositivardquo
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Catetere venoso centrale
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
I CATETERI
sono dispositivi in grado di realizzare una comunicazione tra lrsquoambiente corporeo e quello esterno e consentono
monitoraggio di parametri vitali
somministrazione di nutrienti e di farmaci
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
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Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Siti di inserzione
e tipologie doppio triplo lume
tunnellizzati e non impregnati e non
con diversi gauge
Sono realizzati in materiali polimerici diversi dotati di elevata
biocompatibilitagrave e caratterizzati da proprietagrave meccaniche
morfologiche e chimico-fisiche che ne consentono una agevole
inserzione transcutanea
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
CRBSI
Catheter Related Blood Stream Infection
Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso centrale (CVC) Nella 1 settimana lrsquoinfezione egrave dovuta a contaminazione della superficie esterna del catetere successivamente si ritiene che la colonizzazione microbica sia allrsquointerno del lume del catetere
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Isolamento dello stesso microrganismo da colture ottenute dal catetere e dal sangue periferico in un paziente con segni clinici di infezione sistemica in assenza di altra fonte di infezione
Mermel LA Clin Infect Dis 2001
Sepsi CVC-correlata
- definizione -
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Infezioni nei portatori di CVC
Emocoltura quantitativa
da catetere centrale da vena periferica
bull Prelievo contemporaneo
bull Volume uguale
bull Incubazione contemporanea
DTP gt120 minuti
Sepsi CVC correlata
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Sistema
totalmente
impiantabile
Condizioni
generali
scadute
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
NO
NO
SI
SI
Emocoltura
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Terapia antibiotica
ad ampio spettro
Emocoltura
Germi resistenti
Miceti
Germi sensibili
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
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Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Terapia mirata
Presenza di
trombo distale
Rimozione catetere
(Eventuale sostituzione)
Non
efficace
Trombolisi
Efficace
NO SI
Risposta alla terapia
Negativa Positiva
Permanenza
del catetere
SEPSI DA CATETERE INTRAVASCOLARE
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE
REPARTI chirurgie
neurochirurgia nefrologia+centro trapianti
pediatria rianimazione neonatologia
medicine
geriatria
Anno 2012 Emocolture da sangue periferico n4239 Emocolture da CVC n 259
Anno 2012 Emocolture POSITIVE da sangue periferico n 579 Emocolture POSITIVE da CVC n 93
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
AO Cosenza -UOC Microbiologia e Virologia ATTIVITAgrave SETTORE EMOCOLTURE 2012
2
48 43
2 5
bb+
bb-
cocchi+
anaerobi
lieviti
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Molecular diagnosis
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
LightCycler SeptiFast Test
bull Multiplex Real-time PCR valido per la diagnosi di sepsi su campioni biologici
bull Identifica il materiale genetico di batteri e funghi mediante lrsquoutilizzo di Sonde ad ibridazione FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)rdquo
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
45
Bacterial Lysis amp
DNA Extraction
Gram (-) bull Escherichia coli bull Klebsiella (pneumoniae oxyt) bull Serratia marcescens bull Enterobacter (cloacae aerog) bull Proteus mirabilis bull Pseudomonas aeruginosa bull Acinetobacter baumanii bull Stenotrophomonas maltophilia
Gram (+) bull Staphylococcus aureus
bull CoNS
bull Streptococcus pneumoniae
bull Streptococcus spp
bull Enterococcus faecium
bull Enterococcus faecalis
Fungi bull Candida (albicans
tropicalis
parapsilosis)
bull Candida (krusei glabrata)
bull Aspergillus (fumigatus)
PCR Analysis
MRSA (mecA)
VRE (van A B)
Sample Preparation
Sample whole blood
Septifast Analytical Concept
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
TEST MOLECOLARE vs EMOCOLTURA
Rilevabili mediante PCR
Rilevabili mediante coltura
DNA batterico libero
Batterifunghi vitali Batterifunghi non vitali Batterifunghi fagocitati
Batterifunghi vitali Batterifunghi fagocitati vitali
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
n 46 pazienti con sospetto clinico di sepsi
Reparti di Medicina e di Oncologia Pediatrica
Range etagrave 2-80 anni (etagrave media 40 289)
Per ogni paziente sono stati eseguiti esami
emocoltura
ricerca del DNA dei microrganismi con LightCycler SeptiFast su 1 ml di sangue intero raccolto in EDTA
EMOCOLTURE TEST MOLECOLARI
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Microrganismi non rilevabili mediante Septifast (1) Prelievo eseguito successivamente allrsquoinizio della terapia (2) Emocoltura con flora polimicrobica presenza di DNA di A fumigatus
confermata dalla positivitagrave dellrsquoAg galattomannano
TOT septifast emocoltura
Concordanza Septifast ed emocoltura
K pneumoniae 6 6 (1) 5 833
E aerogenes cloacae 1 1 1 100
Ecoli 7 5 7 7140
Saureus 2 2 2 100
L monocytogenes 1 0 1 0
P mirabilis 1 1 1 100
P aeruginosa 1 1 1 100
E faecalis 1 1 0 0
A fumigatus 1 1 (2) 0 0
M morganii 1 0 1 0
P stuartii 1 0 1 0
Negativi 31 30 28 93
Risultati LightCycler SeptiFast
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
bull IL-6 citochina infiammatoria che puograve indurre una risposta infiammatoria sistemica Sembra correlare in maniera significativa rispetto alla gravitagrave del quadro clinico Marker non specifico
bull PCR proteina della fase acuta rilasciata su stimolo di IL-6 Valori elevati di PCR sono predittivi di sepsi Marker non specifico
bull PCT la procalcitonina egrave prodotta in risposta ad infezioni batteriche (stimolo piugrave potente egrave lrsquoendotossina batterica) puograve essere utilizzata nella valutazione del rischo Marker non specifico
bull TREM-1 aumento dei recettori appartenenti alla superfamiglia delle Ig in risposta ad infezioni batteriche o fungine Piugrave sensibile di PCR e PCT
Biomarkers non molecolari di sepsi
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Conclusion
ldquoOur data show that the combined use of the PCT and SF tests does not prove
sufficiently useful results in the laboratory diagnosis of sepsisrdquo
ldquoBC SF and PCT values were negative and in agreement in 32 cases
with a correlation of 68
In 18 cases the results were positive and in agreement with a correlation of 60
in bacterial sepsisrdquo
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Biomarkers non molecolari di sepsi
rilevamento di antigeni fungini
bull Rilevamento del galattomannano (GM) di Aspergillus sp test positivo su due campioni egrave considerato un valido indice per la diagnosi di aspergillosi invasiva
Svantaggi falsi positivi e cross-reattivitagrave con altre specie (Blastomyces dermatitidis Penicillium sp Fusarium sp)
bull Rilevamento di β-glucano (BG) la maggior parte dei pazienti con infezione fungina disseminata hanno alti livelli di BG giorni prima della diagnosi clinica
Studi multicentrici hanno riportato una sensibilitagrave variabile
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
MACROARRAY
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
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207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
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207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
IBRIDAZIONE TRAMITE TECNOLOGIA MICROARRAY
Substrato del Test
TECNOLOGIA
NANOPARTICELLE DlsquoORO PER LlsquoAMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE RILEVAMENTO MEDIANTE IBRIDAZIONE
Empio di lettura
del Microarray
Il test viene ripetuto diverse volte sul Microarray se tutti i risultati
sono concordi viene prodotto il referto
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
eptide ucleic cid luorescent n itu ybridization
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
MALDI-TOF-MS
Sample plate
Analyte molecules in matrix substance
Acceleration
grids
Drift tube Ion detector
Mass spectrum
Vacuum system
Vacuum
lock
Mass spectrum essentially reflects analyte molecules
Principle
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
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fever endocarditis
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207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Tecnologia FilmArray DID
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
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Abiotrophia spp
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Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
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fever endocarditis
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207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
102 pozzetti
In ogni pozzetto primer specie specifici
Tutti I target sono testati in 3 pozzetti
diversi
Per ogni pozzetto vengono generate curve
di Melting
Ecoli
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
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207
Abiotrophia spp
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207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
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Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
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207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Quando un campione egrave positivo
3 criteri
1) Almeno 2 su 3 devono
avere Curve Melting
specifiche
2) Curve Melting devono
cadere nella finestra
specifica
3) Curve Melting devono
essere significativamente
simili
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
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207
Abiotrophia spp
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207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
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207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
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Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
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207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Pannello per emocoltura Gram +
bull S aureus
bull S pyogenes
bull S agalactiae
bull S pneumoniae
bull Coagulase Neg Staph
bull Enterococcus spp
bull Streptococcus spp
bull L monocytogenes
Funghi
bull C albicansdubliniensis
bull C parapsiolosistropicalis
bull C glabrata
bull C krusei
Gram -
bull H influenzae
bull N meningitidis
bull P aeruginosa
bull E coli
bull A Spp
bull A baumannii
bull E Cloacae
bull Enteric spp Pan
bull K pneumoniae
bull K oxytoca
bull S marcescens
Resistenze
bull mecA
bull Van AB
bull KPC
Tempo necessario 1h
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
refertazione
Risultati definitivi
ID + ATB
72-96 h
Colonie
24 h
ID + ATB
24 ore
Colorazione
di Gram =gt 2 h
Test diretti
Spettrometria di massa PNA FISH test molecolari
ID =gt 6-8 h
grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
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207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
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ID + ATB
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di Gram =gt 2 h
Test diretti
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Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
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207
Abiotrophia spp
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207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
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Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
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fever endocarditis
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HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
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grazie
Probable bacterial etiology of endocarditis depending on the patient history and
epidemiologic situation
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207
Abiotrophia spp
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207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
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Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
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Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
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HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
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bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
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Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
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ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
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Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
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bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
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Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
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ndash Also includes H paraphrophilus
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bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
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bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
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bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
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bull Colonies firm star shaped rough and pitting
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bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Abiotrophia spp
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
fever endocarditis
Brouqui P and Raoult D Clin Microbiol Rev 200114177-
207
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
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Whipples disease endocarditis showing foamy PAS-positive macrophages (arrow)
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bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
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Warthin-Starry silver stain of a Bartonella quintana-infected valve
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bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
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Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Immunohistochemical demonstration of Coxiella burnetii in a heart valve of a patient with Q
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bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
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Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
HACEK Organisms
bull Haemophilus species
bull Actinobacillus actinomycetemcomitas
bull Cardiobacterium hominis
bull Eikenella corrodens
bull Kingella species
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
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ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
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bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
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ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
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bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Clinical
Have an enhanced capacity to produce endocardial infections (IE) Approximately 3 of native valve endocarditis
Most common cause of gram negative endocarditis in non drug users
Also associated with Periodontal infections Bacteremia Abcesses
Peritonitis Otitis media Conjunctivitis Septic arthritis Osteomyeitis UTI Brain abcess
Infections frequently associated with dental procedure
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
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bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Haemophilus IE
bull Cause up to 1 of IE
bull Of these
ndash 40 due to H aphrophilus followed by H parainfluenzae
ndash H influenzae rarely causes IE despite the frequency of it being associated with bacterimia
bull Up to 10 of cases of IE include a second pathogen
ndash Either a Streptococcus viridans or Staphylococcus aureus
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Actinobacillus Clinical
bull Frequently associated with localized juvenile periodontitis
ndash Manifestation of early-onset periodontitis (EOP)
bull Also associated with gingivitis
ndash Can mimic clinical picture of Actinomycetes
bull IE infections
ndash 86 have underlying heart disease
ndash 25 have infection of prosthetic valve (aortic)
ndash Arterial embolism occurs in 43 of cases
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Eikenella Clinical
bull Usually associated with mixed bacterial infections
bull Cellulitis from human bites or clenched-fist injuries
bull Also associated with osteomylitis and various pulmonary infections (empyema pneumonia)
bull Soft tissue infections and endocarditis in drug abusers
ndash Most patients have underlying valve lesions
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Kingella Clinical
bull Frequently associated with diseases in children
ndash Osteomylitis amp septic arthritis in young children
ndash Bacteremia in infants
ndash IE in school aged children and adults
bull Vary rapid progress is characteristic
ndash Rarest of the HACEK organisms causing infection
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Haemophilus Hints
bull New Name Haemophilus aphrophilus is Aggregatibacter aphrophilus
ndash Also includes H paraphrophilus
bull Short Gram ndash bacillus that may for filaments
bull Require 5-10 CO2
bull Growth maybe enhanced by heamin but X factor not absolute requirement V variable
bull Colonies opaque granular amp yellow
bull Catalase amp UreasemdashNeg Oxidase --variable
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Actinobacillus Hints bull New name Aggregatibacter actinomycetamcomitans
bull Short gram negative coccobacillus may stain irregularly cells arranged singly amp in pairs
bull Does not require X or V factors
bull Microaerophilic optimal temp 370 C
bull Colonies firm star shaped rough and pitting
bull Slime maybe produced colonies sticky
bull Catalase amp OxidasemdashPos UreasemdashNeg
bull Floating colonies in TSB
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Cardiobacterium Hints bull Two species hominis amp valvarum
bull Pleomorphic or straight rods with round ends may give rosette clusters
bull May find some of these cells are gram +
bull Growth on BA poor does not require X or V factors May require X initially
ndash Very small colonies need humidity amp 5 CO2
ndash Optimal temp-----30 to 370 C
bull Colonies smooth opaque butyrous
bull Oxidase---Pos Catalase amp Urease---Neg
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Eikenella Hints
bull Monospecies corrodens
bull Straight unbranched non-spore forming
bull May take several days to grow bleach odor
bull Flat colonies maybe surrounded by spreading
ndash Pitting common yellow color in older cultures
ndash Non hemolytic but slight greening maybe seen
ndash Optimal temperature 35-370 C
ndash Twitching ldquomotilityrdquo maybe seen
bull Oxidase---Pos Catalase amp urease--- Neg
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
Kingella Hints
bull Three species--- kingae denitrificans oralis
bull Straight rods with rounded or square end
ndash Tendency to decolorize poorly
bull Two colony types Neither requiring X or V
ndash Spreading corroding
ndash Smooth convex
ndash Zone of beta hemolysis
bull Optimal temperature---33-370 C
bull Oxidase --Pos Catalase amp Urease-- Neg
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University
HACEK Organisms
H A1 C2 E3 K4 Mac +ndash5 +ndash ndash ndash ndash Oxidase +ndash ndash + + + Catalase ndash + ndash ndash ndash Indole ndash ndash + ndash ndash Nitrate + + ndash + ndash Glucose + + + ndash + Mannitol ndash +ndash + ndash ndash Sucrose + ndash + ndash ndash 1Colonies show central opaque dot that with incubation forms a star-like configuration like
ldquocrossed cigarsrdquo visible on clear agar medium such as brain heart infusion (supplemented with serum) at 100X magnification may show light growth on MacConkey agar
2Irregularly-staining gram-negative rods with bulbous (swollen) ends indole detected by xylene extraction
3Cultures smell of hypochlorite (bleach) 4Colonies show small but distinct zones of β-hemolysis 5X-factor requirement lost with passage in culture
Slide taken from Dr J Warren lecture Northwestern University