La tecnica HPTLC per un rapido screening

qualitativo di prodotti cosmetici a base

vegetale

Francesca Romana Gallo

Giuseppina Multari

Dipartimento del Farmaco

Istituto Superiore di Sanità Roma

Giornata informativa sui prodotti cosmetici: aspetti regolatori e

problematiche emergenti

Roma ISS, 20 giugno 2013

Gmp: determinano la qualità, la sicurezza e l’efficacia,

direttiva 2001/83/EC;

Glp: si riferiscono a procedure secondo cui le prove non cliniche di

laboratorio sono programmate, condotte e controllate. Le procedure di

certificazione di conformità dei centri di saggio alle GLP sono regolate

dal Decreto 4 luglio 1997;

Gcp: sono le norme di buona pratica clinica che devono essere seguite nelle

sperimentazioni cliniche. Attuazione alle direttive europee con i decreti

legislativi: D.Lvo 211/2003 e D.Lvo 200/2007.

Cosmetico La norma UNI EN ISO 22716 linee guida di riferimento per dimostrare

la conformità alle Gmp richieste dal Reg. 1223/2009, in vigore dall’11

luglio 2013.

Integratore

Alimentare

Regolamento 178/2002/CE (GFLR) relativo alla legislazione sugli

alimenti di carattere generale che specifica le responsabilità del

produttore e impone un obbligo di notifica in caso di problemi di

sicurezza con il prodotto. I singoli produttori sono legalmente

responsabili degli adempimenti previsti dal GFLR e dai molti altri

regolamenti in materia di igiene, qualità, requisiti di fabbricazione e

lavorazione, ecc.

Le normative richiedono al produttore una serie di informazioni circa la

qualità della produzione o della manifattura ma non una garanzia di

efficacia e nel caso della classe I è sufficiente un’autocertificazione,mentre

per le altre classi è previsto un controllo sulla fabbricazione e sulla

sicurezza ma non sull’efficacia da parte di un ente preposto.

Dispositivo

Medico

REQUISITI DI QUALITA’ E SICUREZZA

Farmaco

General Guidelines for Methodologies on

Research and Evaluation of Traditional

Medicines

L’OMS, nel “General Guidelines for Methodologies on Research

and Evaluation of Traditional Medicines” per definire la qualità di

una pianta o di un prodotto a base di piante,

(WHO/EDM/TRM/2000.1), ove altre tecniche da sole non sono

sufficienti, prende in considerazione la possibilità di identificare

una sostanza caratteristica o una miscela di sostanze tramite il

“fingerprint”, definito come impronta digitale specifica della

pianta.

Fingerprint

L’analisi tramite “fingerprint” è un valido metodo

d’identificazione per le piante soprattutto quando non sia

possibile effettuare l’isolamento e il riconoscimento dei vari

principi attivi.

Il gran numero di molecole diverse presenti negli estratti

vegetali rende la separazione cromatografica complessa sia

come tempi di analisi che come rese dei vari costituenti.

Piante utilizzate nei Cosmetici

La Lawsonia inermis L. (Lythraceae), comunemente conosciuta

come Hennè, è una pianta originaria delle regioni dell’Africa

centro-orientale, coltivata in diversi paesi.

Da millenni viene usata per tingere capelli, unghie e per fare

tatuaggi in varie parti del corpo, contiene resine, tannini, glucosidi

quali hennoside A, B e C il cui prodotto di idrolisi e di

autossidazione è il lawsone.

Azione colorante delle foglie di Lawsonia inermis L.

L’azione colorante è dovuta al lawsone (2-idrossi-1,4-

naftochinone), uno dei costituenti della Lawsonia

inermis L., potenzialmente tossico (anemia emolitica,

antifertilità, dermatiti allergiche, genotossicità

dimostrata in vitro).

Alcuni preparati, erroneamente etichettati Hennè,

vengono utilizzati per tingere i capelli. Tali prodotti

contengono piante diverse dalla Lawsonia inermis

come Cassia obovata Collad., Indigofera tinctoria L.,

Isatis tinctoria L.

O

O

OH

lawsone

Lawsone nei cosmetici

La Commissione Scientifica Europea sui Prodotti Cosmetici ed

i Prodotti non alimentari destinati ai consumatori, con il

documento SCCNFP/0798/04 fornisce una valutazione e

caratterizzazione tossicologica del lawsone definendolo, come

sostanza che può costituire un pericolo per la salute da non

utilizzare nei cosmetici come sostanza chimica aggiunta

proponendo di inserirlo nella classe 2A.

La Lawsonia inermis L., come pianta contenente lawsone, è

presente nelle tinture per capelli. La Commissione Scientifica

Europea con il documento SCCP/0943/05 mette in evidenza

che non è presente nell’allegato IV (coloranti ammessi) e che

dovrà essere sottoposta ad ulteriori indagini volte ad ottenere

un giudizio finale sulla sua presunta tossicità.

Lawsonia inermis nei cosmetici

Analisi tramite Fingerprint

di tinture per capelli

Grazie alla tecnica del “fingerprint” è stato possibile delineare il

profilo chimico caratteristico della Lawsonia inermis L. e

distinguerlo da quello della Cassia obovata Collad. e della

Indigofera tinctoria L., spesso chiamate Hennè, alle quali per

conferire il potere colorante rosso caratteristico, possono essere

aggiunti coloranti di sintesi o lo stesso Lawsone.

HPTLC “Fingerprint” di 9 campioni di Lawsonia inermis L. provenienti da differenti Paesi del Medio Oriente Rivelati con il reattivo per le sostanze naturali.

HPTLC “Fingerprint” tridimensionale dei 9 campioni di Lawsonia inermis L.

Densitogramma di un singolo

campione di Lawsonia inermis

L. = 337 nm

Fingerprint in HPTLC Materie prime “herbal drugs” di Lawsonia inermis L.

B

C

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Phytochemical analysis 2008 19: 550-559 (Gallo FR, Multari G, Giambenedetti M, Federici E)

Tacce 1-6 Cassia obovata Collad.

Traccia 7 Lawsonia inermis L.

Tracce 8-12 Indigofera tinctoria

B) Densitogramma della

Cassia obovata Collad.

C) Densitogramma della

Indigofera tinctoria L.

B C

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Fingerprint in HPTLC Materie prime “herbal drugs” di Cassia obovata Collad e

Indigofera tinctoria L.

Lawsonia inermis L.

Cassia obovata Collad.

Indigofera tinctoria L.

Analisi di prodotti commerciali Tramite HPTLC fingerprint

A

Lawsonia inermis

Indigofera tinctoria

c

b

a

Cassia obovata

B

B) Analisi tridimensionale di prodotti commerciali

etichettati come “Hennè” a) neutro, b) rosso,

c) nero. In realtà contengono Cassia obovata,

Lawsonia inermis, Indigofera tinctoria.

A) HPTLC

•Tr. 1-3 prodotti commerciali dichiarati L. inermis

•(Ref1) Lawsonia inermis L. di riferimento

•Tr. 5 prodotto commerciale dichiarato C. obovata

•(Ref2) Cassia obovata Collad. di riferimento

•Tr. 7 prodotto commerciale dichiarato I. tinctoria

•(Ref 3) Indigofera tinctoria L. di riferimento

Tr. 1 Lawsone

Rif Lawsonia inermis

Campioni vecchi

Tr. 2-3 L. inermis

Tr. 4 Cassia obovata

Tr. 5 Indigofera tinctoria

Campioni nuovi

Tr. 6, 8 L. inermis

Tr. 9, 10 Isatis tinctoria

Tr. 11 Mix L. inermis 91%

Tr. 12 Mix L. inermis 38%

1 2 3 4 5 6 Rif 8 9 10 11 12

Metodo per il fingerprint Materie prime a confronto con prodotti commerciali

Fase mobile: Etile acetato, acido formico, acqua (82:9:9)

Lastre HPTLC di gel di silice 60 senza fluorescenza

Foto al visualizer a 366 nm

Nuovi campioni Vecchi campioni

Lawsone Prodotti

Fase mobile: Etile acetato,

metanolo, ammoniaca 5 N

(60:15:5)

1 2 3 4 5 6 Rif

Foto della lastra visualizzata all’UV 366 nm

Lawsone

Lawsone

Colorante

colorante

Tr. 2 Lawsone

Spettro UV effettuato in situ

sulle bande del lawsone e dei

coloranti

METODO PER IL LAWSONE Applicato a prodotti commerciali

Tr. 3

• Arctostaphylos uva-ursi L. foglie

• Famiglia: Ericaceae

• Habitat: Terreni sabbiosi, sassosi, umidi

• Provenienza: Europa e Nord America

• Usi: Diuretico ed antisettico delle vie urinarie

• Foglie: Ovato-oblunghe o spatolate, lunghe 7–30 mm e larghe 5–13

mm, apice ottuso o arrotondato, margine intero o leggermente

revoluto

• L’impiego tradizionale dell’uva ursina è largamente documentato sia

nel Nord America che in Europa. E’ considerato un rimedio per le

patologie del tratto urinario.

• La droga è riportata in diverse farmacopee: British Herbal

Pharmacopoeia, The Japanese Pharmacopoeia, European

Pharmacopoeia.

Piante utilizzate nei Cosmetici

La droga contiene una grande quantità di composti fenolici di

diverso tipo, tra cui spiccano l’acido gallico, i tannini idrolizzabili e

non idrolizzabili, flavonoidi e i chinoni, tra cui l’arbutina (8-16 %),

anche nota come arbutoside, o come vacciniina (C25H34O14) noto

agente sbiancante naturale della pelle che per tale proprietà viene

utilizzata in cosmesi. A differenza dell’arbutina il suo prodotto di

idrolisi l’idrochinone è inserito nell’anneso II delle sostanze non

ammesse nei prodotti cosmetici.

Specie correlate

Vaccinium vitis-idaea foglie = Mirtillo rosso

Famiglia: Ericaceae

Habitat: Foreste circumboreali,

Provenienza: Eurasia settentrionale e Nord

America

Usi: Diuretico ed antisettico delle vie urinarie

Foglie: Ovato-oblunghe, persistenti con margine

intero o appena crenato, con presenza di

ghiandole resinifere nella pagina inferiore,

dall’aspetto molto simile a quelle dell’uva ursina.

da cui si distingue per l’ assenza della

reticolazione delle due facce delle foglie.

Campione 1 non identificato

1 2 3 4 5 6 Rif 8 9 10

? ? ? ?

Campione 5 tipologia 1

(2, 5, 6, 8)

provenienza Messico

Campione Rif tipologia 2

(3, 4, 9, 10)

provenienza Balcani

Materie prime Arctostaphylos uva-ursi foglie

idrochinone

flavonoidi

arbutina

idrochinone

flavonoidi

arbutina

arbutina

???

idrochinone

Lastra trattata con NP reagent e letta al

visualizer a 366 nm

Campioni: [6 mg/ml]

Depositati: 6 μl

Eluente: etile acetato,

ac. formico, acqua

Rif Arctostaphylos uva-ursi L.

standard

Lettura densitometrica a 275 nm

1 Rif. 2 5 Arb 3 4

I Campioni della tipologia 1 sono Mirtillo

rosso?

1 Campione sconosciuto

Rif. Mirtillo rosso di riferimento

2 e 5 Campioni etichettati genericamente come

Uva ursina

Arbutina standard [2 mg/ml]

3 e 4 Campioni etichettati come A. uva-ursi

Campioni: [5 mg/ml]

Depositati: 6 μl

Eluente: etile acetato, ac. formico, acqua Mirtillo rosso di

Rif

A. uva-ursi

(tipologia 2)

Uva ursina (tipologia 1)

? ?

Specie correlate e sofisticazioni

Arctostaphylos pungens (= glauca) Lindley,

foglie

Famiglia: Ericaceae

Habitat: Boschi mediterranei, e sulle creste del

deserto

Provenienza: Parte meridionale del Nord

America, dalla California al Messico, nota

volgarmente come manzanita.

E’ riportato un elevato contenuto di tannini (10%)

e una certa presenza di arbutina (0,3-1,8 %),

negata da altre fonti.

6 11 8 15 Arb Rif 13 14 16 12

? ?

Campioni: 6 e 8 vecchi, 11-16 nuovi

Rif A. uva-ursi L.

Conc:[ 5 mg/ml]

Depositati: 6 μl= 30 µg

Eluente: etile acetato, ac. formico, acqua

Lastra letta al visualizer a

366 nm

Rf dell’arbutina 0.37

A. pungens

?

A. uva-ursi

arbutina nei campioni di A.uva

ursi

Spettro relativo alle bande con Rf

0.37 nei campioni di A. pungens

Analisi di nuovi campioni con

l’indicazione dell’esatta denominazione

di A. pungens foglie (11, 15) e A. uva-

ursi foglie (6, 8,11-16).

In HPTLC le macchie corrispondenti

all’Rf dell’arbutina (0.37) nei campioni

di A. pungens hanno un UV e intensità

minore rispetto all’A. uva-ursi.

2 5 6 8 Arb 11 15 Rif

2,5,6,8,11,15: A. pungens di diversi

grossisti e provenienze [10 mg/ml](4- 5 μl =

40-50 μg)

Rif: A. uva ursi [5 mg/ml] (3 μl = 15 μg)

Arbutina: 0.3 mg/ml (6 μl = 1,8 μg)

Rf arbutina 0.37

Eluente: etile acetato, ac. formico, acqua,

(82:9:9)

Lastra letta al densitometro a 275 nm trattata

con NP reagent e vista al visualizer a 366 nm

arbutina arbutina

Vecchi campioni

A. pungens

Nuovi campioni

A. pungens

arbutina

standard

arbutina nei campioni 2

A. pungens

arbutina nel campione 7

A. uva-ursi

Non in tutti campioni di A.

pungens è stato possibile

identificare inequivocabilmente

il picco dell’ARBUTINA tramite il

suo Rf e di conseguenza il suo

spettro

Visione 3D della lastra

contenente i campioni di A.

pungens

arbutina

? arbutina

•La banda a Rf 0.37 ben separata nel campione 2 ha permesso di

identificare l’arbutina presente nei campioni di A. pungens e lo spettro

UV effettuato su questa l’ha confermato ulteriormente.

•l’HPLC-MS ha avvalorato la tesi della presenza di arbutina nella A.

pungens ed ha permesso di dare una valutazione quantitativa che unita

ai dati ottenuti dall’ HPTLC, NMR e HPLC ha consentito di affermare che

l’arbutina è presente nell’Uva ursina in percentuali che variano dall’ 8 al

16 % e nella A. pungens dallo 0,3 all’1,8 %. Affinchè non si verifichi una

diminuizione dell’effetto voluto è di fondamentale importanza che non

avvenga la sostituzione di una pianta con l’altra.

16.93 ± 0.07 Bearberry leaf (tea) Serbia 16

0.34 ± 0.01 Bearberry leaf (tea) Mexico 15

10.48 ± 0.04 Bearberry leaf (tea) Macedonia 14

7.65 ± 0.07 Bearberry officinal (tea) Macedonia 13

12.45 ± 0.04 Bearberry officinal (tea) Albania 12

0.61 ± 0.01 Bearberry leaf (tea) Mexico 11

15.29 ± 0.06 Bearberry leaf Siberia 10

11.59 ± 0.02 Bearberry leaf Albania 9

0.64 ± 0.03 Bearberry glauca leaf (tea) Mexico 8

9.55 ± 0.01 Bearberry leaf Balkans 7

0.43 ± 0.03 Bearberry leaf (tea) Latin America 6

0.80 ± 0.10 Bearberry Uva-ursi Mexico 5

8.09 ± 0.33 Bearberry leaf (tea) Not declared 4

11.38 ± 0.06 Bearberry leaf Not declared 3

2.00 ± 0.10 Bearberry Not declared 2

Below LOD Bearberry Macedonia 1

ARBUTIN (%, w/w) LABEL NAME ORIGIN SAMPLE

Arbutin content (%, w/w) in 16 sample analysed

Provenienza dei campioni e loro contenuto in arbutina

Natural product research 2013 27(8): 735-742 (Gallo FR, Multari G, Pagliuca G et al)

CONCLUSIONI

Le tecniche quali-quantitative ufficialmente

riconosciute, come quelle di Farmacopea, unite a

tecniche identificative quali il fingerprint in HPTLC e

HPLC, forniscono un valido aiuto per uno screening di

qualità veloce di piante e loro prodotti.

Con la metodica del fingerprint è possibile individuare

eventuali adulterazioni di prodotti a base di piante,

mediante il semplice confronto del loro tracciato

cromatografico con quello standardizzato della pianta

di riferimento.

Cosmoprof 2011: la crescita della cosmesi naturale. E’ emerso:

•un incremento della domanda di prodotti naturali e della filiera certificata;

• il 45% della clientela consuma cosmetici naturali

(Secondo una ricerca di Organic monitor, istituto di ricerca londinese specializzato in prodotti

biologici); • un giro d’affari che in Europa supera i due miliardi di euro;

• ricerca di bellezza coniugata a etica nei comportamenti;

• prodotti naturali, ovvero di origine vegetale preferibili per la maggiore tollerabilità per la pelle – e biologici piante coltivate biologicamente,

senza pesticidi sintetici o fertilizzanti;

• prodotti non testati su animali, e eco-friendly

per il processo produttivo che per il confezionamento;

• Il tutto garantito da appositi enti certificatori.

La tendenza consolidata negli ultimi anni dell’uso di prodotti di origine vegetale

anche nella cosmesi fa capire la necessità di un controllo mirato in questo campo

e la tecnica HPTLC unita ad altre tecniche più sofisticate contribuisce alla

realizzazione di questo obiettivo.

Si ringrazia:

• le ditte di materie prime per averci fornito il materiale su cui lavorare,

• il Reparto “Farmacopea, qualità dei farmaci chimici, sicurezza dei

prodotti cosmetici. Unità difetti e corpi estranei” per averci fornito i dati

HPLC-MS,

• il Dipartimento di Biologia Ambientale dell’Università “Sapienza” di

Roma per il valido e scrupoloso supporto scientifico nel riconoscimento e

catalogazione delle piante, per l’esame al microscopio, e per i dati NMR,

• gli organizzatori per averci invitato a partecipare a questa giornata

informativa.