Laboratoire de Dynamique, Évolution et Expression des génomes de micro-organismes

FRE2326

Daniel Muller

Stéphanie Weiss

Sandrine Koechler

Michael Heymann

Didier Lièvremont

Marie-Claire Lett

Philippe Bertin

Cycle biogéochimique

agriculture

puitsAs[III]

Nappes phréatiques

Micro-organismes

industries

As[III]

Sources naturelles Sources anthropogéniques

Micro-organismes

As[V]Formes immobilisées

volcanisme

fond géochimique

Méthyl-As

As

Sol A Sol B

Souche modèle ULPAs1Cenibacterium arsenoxydans

• Oxyde As[III] en As[V] (100 mg.L-1 en 2 heures)

• Résiste à 500 mg.L-1 en As[III]

• Multirésistante : Ni, Sb,Cd, Cr[III], Pb, Mn, Se, As[V]

• Mécanisme d’oxydation induit en présence d'As[III]

(Weeger et al, 1999)

Les gènes de l’arsénite oxydase

Test au nitrate d’argent :

- dosage qualitatif et rapide

- As[III] couleur jaune; pas d’oxydation

-As[V] couleur brune; oxydation

Simeonova et al. 2004

Mutants

As[III] As[V]

3 min 6 min

ULPAs1

aoxD

aoxCaoxBaoxA

mini Tn5 insertion M1

mini Tn5 insertion M2

0,5kb

AoxA: sous-unité de type Rieske

AoxB: sous-unité catalytique

AoxC: protéine à domaine nitroréductase

AoxD: protéine cytochrome c-551Muller et al., 2003

Arsénite oxydase2H3AsO3+O2

HAsO42—+H2AsO4

—+3H+

AoxD

Mo

CuBaa3

3Fe4S

2Fe2S

2e—

CuA

1e—

4e—

1e—

1e—

AoxB

AoxA

Périplasme

Cytoplasme

4H+

4H+

Caractérisation des gènes de l’arsénite oxydase

Aox : une paléo-enzyme

Lebrun et al., 2003

AoxB AoxA

aoxBaoxA aoxCaoxDaoxBaoxA

aoxBaoxA

aoxBaoxA

1 kb

Cenbacterium arsenoxidansAlcaligenes faecalis

aoxAB Sarg1aoxAB Sarg2

aoxBaoxA

aoxBaoxAChloroflexus aurantiacusSouche NT—26

Synténie des gènes codant l’arsénite oxydase

aoxDOrf moaA

orfaorfborfaorfborfaorfb

moaC

phnDmoaAorfcorfcorfc

orfc

aoxBaoxAaoxBaoxA

Aeropyrum pernixSulfolobus tokodai

Bactéries

Archéesorf

Réponse à l’arsenicchez C. arsenoxidans

Mr

(kD

a)

IEF IEFpI = 4 pI = 4pI = 7 pI = 7

2121

9 9

10 10

22 22

1111

1212

11

2 2

13 131414

15 15

1818

3 3

1919

16161717

44

5 5

66

77

20

8 8

20

Sans As[III] 2 mM As[III]

Stress Arsenic

Réponse au stress arsenic

Spot identification des protéinesA. Voie informative et de régulations

1 Probable protein-L-isoaspartate O-methyltransferase2 Putative PMBA protein3 Probable methionine aminopeptidase protein4 Histidyl-tRNA synthetase5 Elongation factor Tu6 Aspartyl/glutamyl-tRNA (Asn/Gln) amidotransferase B7 Probable tyrosyl-tRNA synthetase protein8 Hypothetical protein PhoU

B. métabolisme intermédiaire

9 Adenosylhomocysteinase10 Phosphoribosylformylglycinamidine cyclo-ligase11 Adenosylhomocysteinase12 3-isopropylmalate dehydrogenase13 Adenylate kinase14 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase15 Imidazole glycerol phosphate synthase16 Dihydroorotase17 Succinyl-CoA synthetase, beta chain

C. Processus cellulaire et enveloppe 18 3-demethylubiquinone-9 3-methyltransferase 19 (nucleoside diphosphate sugar epimerase)20 D-alanine--D-alanine ligase

D. Autres fonctions21 Hypothetical arsenate reductase22 Hypothetical arsenate reductase

nomgè

induction %identité

M11 rnr

2 63%

M13 3 40%

M16 3 51%

M3 3 68%

M9 fu 2

58%

M33fd

2 64%

M39nir

2,576%

M173,5

62%

C. Processus cellulaire et enveloppe M30a

cr

4 58%

M36fli

3,5 50%

M31 2,5 48%M20 3,5 33%M28 2,5 66%

D. Autres fonctionsM1 a

oPublié

M2 ao

Publié

E. Protéines inconnuesM18 3 22%

carboxynorspermidine décarboxylase [Bordetella pertussis]

Identification de gènes

régulateur de transcription [R solanacerum]

B. métabolisme intermédiaire

A. Voie informative et de régulations

Exoribonuclease R [Burkholderia cepacia R18194]probable régulateur de transcription [Ralstonia solanacerum]

UDP-3-O-[3-hydroxymyristoyl] glucosamine N-acyltransférase [R. metallidurans]

NAD(P)H-nitrite réductase [Rubrivivax gelatinosus PM1]

FDHD homologue [R. solanacearum]

fumarate hydratase class II (Fumarase) [Ralstonia solanacearum]

Lipoprotéine [R. metallidurans]ATPases [Methylobacillus flagellatus KT]

Probable FLIL protéine flagellaire [R. solanacearum]

Protéine membranaire putative [Erwinia carotovora] perméase type Acr3

protéine hypothétique conservée [Pseudomonas syringae]

arsénite oxydase sous-unité catalytique

arsénite oxydase sous-unité Rieske

GTPases [Methylobacillus flagellatus KT]

GlpF

ArsB

Bactéries

As[III]

As[III]

ADPATP

As[III]

Pit

ArsC

As[V]

ArsA

As[V]Opérons de résistance

Nébulisation Clonage Transformation0,5kb

Operon arsB1

61% 71%

59%

14%

74%57%

44% 54%

63%

regulation Arsenatereductase

Arsenatereductase

Arsenitepump

Flavoprotein

arsR

arsR

arsCa

arsCa

arsB

arsB MSF transporter

arsH

arsHarsCb

arsR arsCa arsB arsHarsCb permease

236 aa

251 aa

117 aa 185 aa 426 aa

111 aa 171 aa 303 aa 142 aa 236 aa

107 aa 164 aa 356 aa 384 aa 140 aa 245 aaOperon arsA1

Operon arsB3

Membrane protein

Induction des opérons ars

Système de résistance à l’arsenic

0 As 50 ppm 50 ppm

1/4 h 1/2 h

rrn

arsBA1

arsBB1

arsBB3

015

30

arsBB1

arsBB3

arsBA1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

temps induction (min)

gènes

arsBB1

arsBB3

arsBA1

Rapport

d’intensité

Rapport d'expression des gènes arsB