1

BIOLOKE OSNOVE PLODNOSTI TLA vjebe

1. Navedite osnovne tipove i vrste mikroskopa.

a. Svjetlosni

sa svijetlim vidnim poljem

sa tamnim vidnim poljem

flourescentni

fazno kontrastni

b. Elektronski

transmisijski

pretrani

2. Navedite optike dijelove svjetlosnog mikroskopa.

Okular, objektiv, kondenzor s iris-zaslonom, ogledalo.

3. Objasnite kako se odreuje ukupno poveanje mikroskopa?

Pomnoi se poveanje objektiva s poveanjem okulara.

4. Optiki dijelovi svjetlosnog mikroskopa.

Okular, objektiv, kondenzor s iris-zaslonom, ogledalo.

5. to je okular, emu slui i navedite najea poveanja okulara.

Okular je kratka cijev koja sadri dvije lee, a smjetena je na gornjem dijelu mikroskopa. Slui za ispravljanje nekih iskrivljenja to ih moe proizvesti objektiv. Najea poveanja: 1x, 2x, 5x, 10x i 15x.

6. to je objektiv, emu slui i objasnite pojam moi razdvajanja objektiva.

Objektivi su najvaniji optiki dijelovi mikroskopa, prije svega to utjeu na kvalitetu slike koju promatra vidi. Veina mikroskopa ima po tri objektiva s razliitim poveanjem: malo (10x), srednje (ili veliko poveanje suhim objektivom, 40x) i poveanje s imerzijskom leom (objektivom; najee 100x). Lee objektiva slue za sakupljanje i koncentriranje zraka svjetlosti koje dolaze iz preparata i za poveanje stvorene slike predmeta.

Razdvajanje ili mo razdvajanja je sposobnost lea da istaknu fine detalje i strukturu, odnosno da dvije toke koje su vrlo blizu vidi razdvojene. Ovisi o valnoj duljini upotrebljenog svjetla.

7. Objasnite pojam indeksa refrakcije svjetlosti, te znaaj primjene uljno imerzijske tekuine tijekom mikroskopiranja.

Razlika u brzini koja se pojavljuje u tijeku prolaska zrake svjetlosti kroz tvari razliite gustoe, izraena je kao indeks refrakcije.

Imerzijska tekuina (anisol ili cedrovo ulje) koristi se za zatitu smjera zraka svjetlosti. Ako se radi s obojenim preparatima ili neobojenim (nativnim) preparatima bakterijskih kultura, tada se na obojeni preparat, odnosno na pokrovnicu nativnog preparata bakterijske kulture stavlja kap imerzijske tekuine kako bi se izbjegao lom zraka svjetlosti na granici dvaju sredstava razliite optike gustoe.

8. Objasnite to je kondenzor i iris-zaslon, te emu slue.

Kondenzor je smjeten ispod stolia mikroskopa izmeu izvora svjetlosti i objekta koji se promatra. To je sustav lea koji proputa sjetlo kojim se osvjetljava preparat. Slui za koncentraciju zraka svjetla prije nego to one dosegnu preparat.

Kondenzori mikroskopa openito su opskrbljeni iris-zaslonom radi kontrole intenziteta svjetla. Tim se dijelom regulira koliina svjetlosti to ulazi u kondenzor. Kada se istrauju neobojeni preparati, kao to su npr. ive protozoe ili bakterije u ''viseoj kapi'', otvor je na iris-zaslonu smanjen.

9. Navedite glavne karakteristike neobojenih vlanih preparata i bojenih preparata.

Vlani nebojeni preparati rabe se za izravno istraivanje mikroorganizama, u normalnom ivotnom stanju, ukljuujui oblik i raspored stanica kao i reakcije na razliite kemijske spojeve.

Bojeni preparati omoguuju bolje i detaljnije izuavanje mikroorganizama, a naroito bakterija koje koje su sitne i bezbojne, te ne daju dovoljan kontrast u vodi s kojom su suspendirane. Stoga obojeni mikroorganizmi ine kontrast s okolinom i lake se uoavaju.

10. Opiite postupak pripreme obinih vlanih preparata.

Na dobro oiene i omaene predmetnice steriliziranom mikrobiolokom uicom ili pipetom stavi se kap suspenzije mikroorganizama i oprezno prekrije pokrovnicom da bi se izbjegao ulazak mjehuria zraka u preparat. Promatra li se pripravak pod poveanjem od 1000x ili veim, na pokrovnicu se stavlja kap imerzijske tekuine.

11. Opiite postupak pripreme preparata visea kap.

Kap suspenzije mikroorganizama stavlja se na pokrovnicu. Oko rubova pokrovnice nanese se tanak sloj vazelina ili laboratorijske masti, potom se predmetnica (deblja od obine, sa poluokruglastim udubljenjem na sredini) okrene za 180o i lagano pritisne na pokrovnicu. itav se preparat ponovno okrene za 180o, te se tako dobiva pokrovnica na kojoj kap visi povrh udubljene predmetnice. Na pokrovnicu se potom nanese kap imerzijske tekuine i pripravak se mikroskopira pod poveanjem od 1000x ili vie. Ali prije samog mikroskopiranja potrebno je kratko ostaviti preparat da bi se tekuina umirila, da ne bi dolo do pogrenog dojma.

12. Navedite vrste postupka bojenja.

a. Jednostavno

b. Diferencijalno izdvajanje u skupine

i. po Gramu

ii. acidorezistentno

c. Strukturalno vizualizacija skupina

i. bojanje bieva

ii. bojanje ahura

iii. bojanje spora

iv. bojanje jezgre

13. Opiite postupak diferencijalnog bojenja. Kada se taj postupak bojenja upotrebljava?

Diferencijalno bojenje zahtijeva upotrebu najmanje triju kemijskih reagenasa koji se dodaju uzastopno na razmak mikrobne kulture fiksirane toplinom. Prvi reagens oznaava se kao primarno bojilo, drugi je odbojavajui, a trei je konani reagens (kontrasno bojilo; posjeduje boju kontrastnu primarnom bojilu). Diferencijalno bojenje dijeli bakterijske stanice u dvije glavne skupine, gram+ i gram-, to je bitna znaajka tijekom klasifikacije i diferencijacije.

14. Koja je funkcija razliitih reagenasa to se upotrebljavaju tijekom bojanja po Gramu?

Gentiana violet (kristal violet) primarno bojilo koje oboji sve stanice u preparatu plavo-ljubiasto.

Otopina joda u kalij-jodidu (lugol) lugol je kemijski spoj koji s primarnim bojilom tvori teko topivi kompleks (KV-J), kod gram+ stanica taj kompleks je sloenije strukture i spaja se s odreenim komponentama stanine stjenke.

Alkohol (96% etilni alkohol) slui kao sredstvo za odbojavanje, a zbog razlika u grai stanine stjenke razliitih bakterija, dolazi i do razliitog djelovanja etanola:

neke stanice se ne oboje djelovanjem etanola zbog postojanja vrste veze s primarnim bojilom to su gram+ stanice

neke stanice nakon djelovanja etanola oboje se zbog oslobaanja KV-J kompleksa

Karbol fuksin (safranin; crveno, kontrasno bojilo) upotrebljava se za bojanje stanica koje su prethodno odbojene, to znai da e gram- stanice apsorbirati karbol fuksin i postati crvene, dok gram+ zadravaju ljubiastu boju primarnog bojila.

15. Koji se tipovi staninih struktura boje bazinim bojilima i navedite neka bazina bojila.

Bazina se bojila koriste za bojanje bakterijskih stanica: bojanje bieva, ahura, spora, jezgre. Neka bazina bojila: metilensko bojilo, bazini karbol fuksin, gentiana violet.

16. Koje su prednosti diferencijalnog bojenja u odnosu na jednostavno bojenje?

Jednostavno bojenje se izvodi radi usporedbe morfolokih oblika i rasporeda bakterijskih stanica.

Svrha diferencijalnog bojenja je dijeljenje bakterijskih stanica na gram+ i gram-, to je vano za klasifikaciju i diferencijaciju. Prednosti su to to niz znaajki gram+ i gram- mikroorganizama (kemijski sastav, osjetljivost na penicilin i relativna debljina stanine stjenke) s povezane s njihovim reakcijama na bojenje.

17. Podjela hranjivih podloga prema nainu upotrebe (prema namjeni).

a. Obini hranjivi supstrati slue za izolaciju i uzgoj veine mikroorganizama (osobito za uzgoj bakterija)

b. Specijalni hranjivi supstrati upotrebljavaju se za utvrivanje pisustva specifinih mikroorganizama; s obzirom na to razlikujemo selektivne i diferencijalne podloge.

18. emu slue selektivne i diferencijalne hranjive podloge?

Selektivne podloge imaju sastav koji potie rast eljenih, a onemoguava rast neeljenih mikroorganizama. Omoguuju brzu izolaciju i identifikaciju poeljnih mikroorganizama.

Diferencijalne podloge omoguavaju lake razlikovanje kolonija eljenog mikroorganizma od drugih kojonija koje rastu na istoj podlozi. Sadravaju indikatore koji razlikuju mikroorganizme na osnovu njihovih posebnih karakteristika tijekom rasta na podlozi (karakteristine kolonije ili karakteristine zone oko kolonija tako da se razlikuju od ostalih u uzorku).

19. Podjela hranjivih podloga prema kemijskom sastavu.

a. Prirodni hranjivi supstrati

b. Sintetiki hranjivi supstrati (umjetne)

c. Kompleksne podloge (polusintetike)

20. Podjela hranjivih podloga prema konzistenciji.

a. Tekui hranjivi supstrati

b. Kruti (vrsti) hranjivi supstrati

c. Polutekui hranjivi supstarti

21. to su kompleksne podloge?

Koriste se za rast heterotrofnih bakterija i gljiva. Tono su poznatog kemijskog sastava, ali se ne zna njihov koliinski sastav. Te podloge imaju izvor energije i ugljika, kadkad u obliku glukoze, kvasni ili mesni ekstrakt (kao nadomjestak u vodi topljivih vitamina i soli). Neke podloge sadravaju peptone, hidrolizate proteina bogate aminokiselinama koje osiguravaju izvor ugljika i duika.

22. to treba imati svaki hranjivi supstrat (glavne karakteristike)?

a. sve hranjive sasojke koji su potrebni za rast i razmnoavanje

b. dovoljnu koliinu vode

c. povoljnu pH vrijednost (optimalni pH za bakterije je 7, a gljive 4)

d. supstrat mora biti sterilan

e. supstrat mora biti pozraan

23. to je agar i emu slui?

Heteropolisaharid koji se dobiva ekstrakcijom i suenjem sluzaste tvari iz crvenih morskih algi roda Gelidium. Kupuje se u obliku suhog prakastog proizvoda. Zagrijavanjem agara na temperaturu 95-98oC on se otopi u tekuoj podlozi, a prilikom hlaenja kod temperature 40-45oC uzrokuje skruivanje hranjive podloge. Koncentracija agara u vrsim hranjivim podlogama je 1-2%, a u polutekuim 0.1-0.5%.

24. Opiite postupak izolacije primjenom metode iscrpljenja.

Postupak ponekad zahtijeva prethodnu pripravu razrjeenja suspenzije mikroorganizama iz koje elimo izolirati kulturu. Na prethodno izliveni i ohlaeni hranjivi supstrat u Petrijevoj zdjelici stavimo kap mikrobiolokog materijala. Materijal razvlaimo po povrini vrste podloge pomou Pasteurove viljuke ili eze, te bez ponovnog uzimanja materijala razmaemo po rugoj i treoj Petrijevoj zdjelici. Na taj se nain smanjuje brojnost mikroorganizama i na treoj Petrijevoj zdjelici nalazi se najmanji broj.

25. Opiite postupak izolacije primjenom metode razrjeenja.

U seriju od est epruveta odpipetira se 9mL vode. U prvu epruvetu se odvae 1g tla ili 1mL nekog drugog materijala koje se istrauje. Sterilnom pipetom se odpipetira 1mL iz prve epruvete i prenese u slijedeu. Isti postupak ponovimo do kraja, mijenjajui pipete pri promjeni razrjeenja. Na taj nain dobivamo eljenu seriju razrjeenja (od 10-1 do 10-6). Kad elimo odrediti broj mikroorganizama uzimamo po 1ml suspenzije iz posljednja tri razrjeenja (10-6,10-5,10-4), te stavljamo u Petrijeve zdjelice na ohlaenu, vrstu hranjivu podlogu. Potupak se vri u tri repeticije. Petrijevke se stavljaju u termostat na inkubaciju, na kojima izraste odreen broj kolonija. Nakon inkubacije odreuje se prosjean broj mikroorganizama ispitivanog uzorka.

26. emu slui metoda iscrpljenja, a emu metoda razrjeenja?

Metoda razrjeenja slui za izolaciju i odreivanje broja mikroorganizama.

Metoda iscrpljenja je brz i kvalitetan postupak koji slui samo za izolaciju.

27. Objasnite kako se odreuje broj mikroorganizama u uzorku tla?

Pomou metode razrjeenja, iz posljednje tri repeticije (10-6,10-5,10-4) prebroje se kolonije i izrauna se njihova srednja vrijednost.

CFU = (broj izraslih kolonija / volumen uzorka) * reciprona vrijednost razrjeenja

Broj CFU (colony forming units) jednak je broju ivih stanica samo kada jedna kolonija nastane od jedne stanice.

28. Navedite koja se svojstva ispituju kod identifikacije bakterija.

a. Morfoloke karakteristike kolonija

b. Morfoloke karakteristike bakterija

c. Fizioloke i biokemijske karakteristike

d. Ekoloke karaktristike

e. Seroloke karakteristike

f. Genetike i molekularne karakteristike

29. Morfoloke karakteristike kolonija.

a. Oblik: okrigli, nepravilni, ameboidni, rizoidni, konasti, miceloidni

b. Veliina: sitne(1-3mm), srednje (