8/18/2019 Laboratorijsko određivanje bilirubina
1/4
Laboratorijsko određivanje bilirubina
Određivanje bilirubina uveo je Van den Bergh na temelju
Erlichove reakcije bilirubina sdiazobenzolsulfonskom kiselinom. Ova
reakcija je poznata pod imenom Van den Berghovareakcija.
U serumu se određuje koncentracija ukupnog bilirubina i
konjugovanog bilirubina.
Ranije se smatralo da je bilirubin koji cirkulira u krvi vezan
na albumine i oznaavao se kaoindirektni bilirubin. !akođer se
mislilo se i da se u jetri bilirubin oslobađa proteina i da
tajoslobođeni bilirubin predstavlja direktni bilirubin" jer reagira
s diazobeznolsulfonskomkiselinom.
#anas znamo da je direktni bilirubin ustvari bilirubin
konjugiran s glukuronatom da je zatotopiv u vodi" pa daje Van den
Berghovu reakciju.
$%ndirektni& bilirubin je onaj koji jo' nije konjugirao i
vezan je s proteinom. (labo je topiv u
vodi i ne daje direktno reakciju" tj. reagira vrlo sporo.
)ostoji mnogo modifikacija određivanja bilirubina s
diazoreagensom. U dana'njim metodamabez deproteinizacije ili se za
oslabađanje nekonjugirnaog bilirubina od preoteina koristimetanol
ili se bilirubin oslabađa amionima tzv. akceleratorima kao natrijev
acetat" natrijevbenzoat" kofein ili difilin.
*a dijazotiranje bilirubina upotrebljava se smjesa sulfanilne
kiseline i natrija nitrata" a uzadnje vrijeme diazonijeva sol +",
diklorfehila ili +"- dikloranilin. astali spojevi imaju
svojstvoacidobazinog indikatora daju/i kod neutralnog p0 crveno
obojenje" a kod jako kiselog ilialkalnog plavo obojenje. )rije su
se mjerili nastali crveni spojevi dok se danas ve/inom mjerepri
alkalnom p0 plavo obojeni azopigmenti jer im je molarni
apsorpsijski koeficijent duplo ve/ineg vrvenih spojeva u nautralnom
podruju. #odatkom natijeva askorbata ovaj reagira sdilazonijskim
kloridom daju/i 1uto obojenje. !ime se prekid reakcija i nastajanje
boje.
Osim metoda na principu diazotiranja" za određivanje bilirubina
koristi se i njegovo svojstvoapsorpsije pri -,, mm kao i oksidacija
u biliverdin.
Određivanje ukupnog i konjugirnaog bilirubina
Bilirubin stvara s diazotiranom sulfanilnom kiselinom u vodi
topiv spoj. )ri tome" bilirubindiglukuronid reagira direktno s
diazobenzolsulfonskom kiselinom i stvara molekulu pigmentaB"
pigment %%. #rugi izomerni dipirol prelazi u
hidrokipirometenkarbinol i stvara s diazonijevimkloridom izomerni
pigment B.ekonjugirani bilirubin najprije se akceleratorom oslobodi
proteina i onda reagira stvaraju/iazospojeve koji se oznauju kao
pigment 2." dok bilirubin monoglukuronid daje molekulupigmenta B i
molekulu pigmenta 2.#odatkom alkalne otopine kalijeva3natrijeva
tartarata crvena azoboje prelazi u zeleno3plavuboju.
8/18/2019 Laboratorijsko određivanje bilirubina
2/4
Reagensi
4. #ifilin" 456 mmol78" natrijev acetat" 54- mmol78 E#%!2" +"95
mmol78" , g difilina:;4
@. 2skorbinska kiselina" ++6 mmol78" otopi se u 4< ml
destilovane vode. )riprema se svaki dan svje1a.
-. Dehlingov alkalni reagens. alijev3natrijev tartarat" 4"+-
mol78" natrijev hidroksid" +",mol78. @,< g kalijeva3natrijeva
tartarata :;-0-O9a -0+O" =r +A+"+@> i 4
#iazoreag. :reag.+>
(erum#ifilin :reag. 4>Dehling :reag.->
8/18/2019 Laboratorijsko određivanje bilirubina
3/4
Određivanje ukupnog i knjugiranog bilirubina metodom Malloya i
Evelyna
Princip
( diazobenzolsulfonskom kiselinom bilirubin daje crveno obojeni
azobilirubin" ija jeboja proporcinalna koncentraciji bilirubina.
onjugirani bilirubin reagira sdiazoreagensom u vodenoj sredini
unutar 4 minute" a poslije dodatka metilnogalkohola koji oslabađa
nekonjugirani bilirubin" reagira i ovaj tokom 4, do @<
minuta.
Reagensi
4. =etilni alkohol p.a. :;0@O0" h" =r @+"+. #iazo % :sulfanilna
kiselina +5 mmol78>. Otopi se u , g sulfanilne kiseline
:;90,(O@00+" =r 46@"45> u 9< ml 0;l cons. u odmjernoj
tikvici od 4 8 i dopunido marke destilovanom vodom.#iazo %%
:natrijev nitrit +"5 mol78> Otopi se +< g natrijeva nitrita
:ao+" =r 95" udestilovanoj vodi i dopuni destilovanom
vodom do 4
