Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Lại Phƣơng Liên

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7

CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------


NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7

CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Phạm Xuân Hội

PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội – Năm 2013

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Xuân Hội và

PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Nguyễn Duy Phƣơng, CN. Nguyễn

Hoàng Quang cùng các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật,

Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong

thời gian thực tập tại Bộ môn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô giáo trong bộ môn

Di truyền học, khoa Sinh học , trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà

Nội đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong một môi trƣờng học

tập khoa học, giúp cho tôi có những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm học.

Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè,những

ngƣời luôn đứng sau giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013

Học viên thực hiện


ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BVTV Bảo vệ thực vật

bp Base pair (Cặp bazơ)

cDNA complementary (DNA bổ sung)

ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate

DNA Axit deoxy ribonucleic

dNTP Deoxynucleotidetriphosphates

dsRNA Double stranded RNA (ARN sợi đôi)

FDV Fiji disease virus (Virus bệnh Fiji)

EDTA Axit Ethylenediaminetetra acetic

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết

với enzyme)

EtBr Ethidium Bromide

IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế)

Kb Kilobase

LB Môi trƣờng Luria Bertani

LSĐPN Lùn sọc đen phƣơng Nam

MRCV Mal de Río Cuarto virus (Virus Mal de Rio Cuarto)

MRDV Maize rough dwarf virus (Virus lùn ngô)

NLRV Nilaparvata lugens virus (Virus nilaparvata lugens)

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

OD Optical Density (mật độ quang học)

ORF Open reading frame (Khung đọc mở)

OSDV Oat Sterile-Dwarf Virus (Virus lùn yến mạch)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RBSDV Rice black streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen)

RGSV Rice grassy stunt virus (Virus lúa cỏ)

RNA Axit ribonucleic

RRSV Rice ragged stunt virus (Virus lùn xoắn lá)

iii

RSV Rice stripe virus (Virus lúa sọc)

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp

phiên mã ngƣợc)

RTSV Rice tungro spherical virus (Virus Tungro hình cầu)

RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virus Tungro dạng thẳng)

RDV Rice dwarf virus (Virus bệnh lúa lùn)

RGDV Rice gall dwarf virus (Virus vết u lùn lúa)

SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen phƣơng Nam)

TAE Tris base – Acetic - EDTA

https://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&sqi=2&ved=0CC4QFjAA&url=http%3A%2F%2Fen.wikipedia.org%2Fwiki%2FReverse_transcription_polymerase_chain_reaction&ei=OMK1UtnjJOu8iAfwrYDoDA&usg=AFQjCNEbiO8qiID9cg4cqggpNtiCJ3_aQQ&sig2=OfTnnNiYL_VzkQa8y_fKPw&bvm=bv.58187178,d.dGI

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang

Bảng 1 Các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu. 22

Bảng 2 Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa 35

Bảng 3 Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và

RT-PCR một bƣớc

40

Bảng 4 Trình tự các mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế phục vụ cho phản ứng

RT-PCR

42

Bảng 5 So sánh mức đồng nhất trình tự phân đoạn S7 phân lập của các

mẫu Việt Nam và Trung Quốc

54

v

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang

Hình 1 Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 8

Hình 2 Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV 9

Hình 3 Cấu trúc phân tử các Fijivirus 11

Hình 4 Tổ chức bộ gen của các Fijivirus 11

Hình 5 Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 12

Hình 6 Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV

trên gel polyacrylamide 12,5%.

14

Hình 7 Sự xuất hiện của protein P7-1 trong tế bào vector truyền bệnh

(rầy Sogatella furcifera) dƣới kính hiển vi điện tử

16

Hình 8 Xét nghiệm virus SRBSDV bằng phƣơng pháp DOT-ELISA 17

Hình 9 Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các

enzyme cắt giới hạn trên vector pGEM-T

32

Hình 10 Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam 37

Hình 11 Một số kết quả kiểm tra ELISA với các mẫu thu thập ở các tỉnh

Việt Nam

38

Hình 12 Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một

bƣớc của các mẫu lúa

39

Hình 13 Hình ảnh điện di genome của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu

lúa

40

Hình 14 Kết quả điện di phân đoạn S7 phân lập đƣợc của SRBSDV

trên gel agarose 1% (chủng Thái Bình-2)

42

Hình 15 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân

đoạn S7

43

Hình 16 Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch bằng bộ kit

GenJETTM

Gel Extraction trên gel agarose 1%

45

Hình 17 Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T 46

Hình 18 Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng 46

vi

DH5α

Hình 19 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh sạch trên gel

agarose 1%

47

Hình 20 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch Sử dụng

cặp mồi S7-Fw/S7-Rv

48

Hình 21 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch sử dụng

cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv

49

Hình 22 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp

pGEM-T/S7 bằng enzyme EcoRI

50

Hình 23 Một phần kết quả giải trình tự phân đoạn S7 của virus

SRBSDV (mẫu Nghệ An)

50

Hình 24 Trình tự amino acid suy diễn của 2 khung đọc mở nằm trên

phân đoạn S7 (mẫu Nghệ An)

51

Hình 25 Một phần kết quả so sánh trình tự nucleotide phân đoạn S7

của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới

53

Hình 26 Một phần kết quả so sánh trình tự amino acid phân đoạn S7

của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới

53

Hình 27 Hai cây phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự S7 (A) và trình tự

gen P7-1 (B)

55

vii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM............................3

1.1.1. Các virus gây bệnh trên lúa...............................................................................................3

1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam...............................................................3

1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV.......................................5

1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam.........................................................5

1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam....................................................5

1.2.1.2. Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam................................................................6

1.2.2. Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam..................................................7

1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết..........................................................................................................7

1.2.2.2. Vector truyền bệnh ........................................................................................................8

1.2.3. Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV..........................................................................10

1.2.3.1. Phân loại.....................................................................................................................10

1.2.3.2. Đặc điểm hình thái của SRBSDV................................................................................12

1.2.3.3. Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV......................................................................12

1.2.3.4. Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV......................................14

1.2.3.5. Chuẩn đoán virus SRBSDV.........................................................................................16

1.2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam và virus SRBSDV ở Việt

Nam...........................................................................................................................................17

1.2.4.1. Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV ..........................................................17

1.2.4.2. Các nghiên cứu về quy trình chẩn đoán virus SRBSDV.............................................19

CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................21

2.1. VẬT LIỆU.........................................................................................................................21

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.....................................................................................................21

2.1.2. Hóa chất..........................................................................................................................21

2.1.3. Thiết bị............................................................................................................................22

viii

2.2. PHƢƠNG PHÁP..............................................................................................................22

2.2.1. Thu mẫu.........................................................................................................................22

2.2.2. Xét nghiệm mẫu............................................................................................................22

2.2.2.1. Phƣơng thức ELISA gắn đặc hiệu - "Sandwich ELISA".............................................23

2.2.2.2. RT-PCR một bƣớc.......................................................................................................25

2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 1%.............................................................................26

2.2.3. Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11..........................................................26

2.2.4. Tổng hợp cDNA từ dsRNA...........................................................................................28

2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi...........................................................................................................28

2.2.4.2. Tổng hợp cDNA sợi 1..................................................................................................28

2.2.4.3. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR...............................................................29

2.2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas...............................30

2.2.5. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning.................................31

2.2.5.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T.....................................................31

2.2.5.2. Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.colichủng DH5α..............................................32

2.2.6. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM

Plasmid Miniprep...........33

2.2.7. Cắt enzyme giới hạn.......................................................................................................33

2.2.8. Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng.............................................................34

2.2.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7......................................................................35

CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................36

3.1. Thu thập và bảo quản mẫu................................................................................................36

3.2. Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bƣớc......38

3.2.1. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phƣơng pháp Sandwich- ELISA............................38

3.2.2. Sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp RT-PCR 1 bƣớc....................................................39

3.3. Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV............................................................................39

3.4. Phân lập phân đoạn S7 của SRBSDV thu thập từ mẫu lúa bệnh......................................41

3.5. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR.......................................................43

3.5.1. Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân bản phân đoạn S7 ..43

3.5.2. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR....................................................43

ix

3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR phân đoạn S7 của virus SRBSDV............................................44

3.7. Nhân dòng phân đoạn S7 vào vector PGEM-T.................................................................45

3.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp PGEM-T/S7 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α...............45

3.7.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tai tô hơp............................................47

3.7.2.1. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tai tô hơp bằng phản ứng PCR. ..... 47

3.7.2.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tai tô hơp bằng cách xử lí với enzyme

cắt giới hạn EcoRI .................................................................................................................... 49

3.8. Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV.........................................................................50

3.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV...................................52

3.9.1. So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu SRBSDV

trên thế giới...............................................................................................................................52

3.9.2. Phân tích đặc điểm di truyền..........................................................................................55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 57

Kết luận .................................................................................................................................... 57

Kiến nghị..................................................................................................................................57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 57

PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................................. 62

PHỤ LỤC 2 .............................................................................................................................. 68

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học

1

MỞ ĐẦU

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lƣơng thực quan trọng nhất ở Việt Nam, đồng thời

cũng là nguồn lƣơng thực chính cho một nửa dân số thế giới. Là nƣớc xuất khẩu gạo

đứng thứ 2 trên thế giới, lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp

xuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức ăn chính của 90 triệu dân số trong nƣớc.

Tuy nhiên, sản xuất lúa gạo của Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều thách

thức nhƣ (1) điều kiện bất lợi của môi trƣờng do ảnh hƣởng của hiện tƣợng biến đổi

khí hậu toàn câu và (2) dịch bệnh do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học

dẫn đến mất cân bằng sinh thái. Trong điều kiện thích hợp, các tác nhân gây bệnh trên

lúa có thể phát triển rất mạnh, làm giảm năng suất tới trên 85%, thậm chí mất trắng.

Đây là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất, dẫn đến sản lƣợng

nông nghiệp không ổn định và gây tình trạng mất an ninh lƣơng thực.

Trong số các tác nhân gây bệnh trên lúa, virus là mầm bệnh nguy hiểm nhất do

khả năng phát tán rất rộng, đồng thời rất khó kiểm soát. Ở Việt Nam, virus gây ra một

số bệnh rất nguy hiểm, ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sản lƣợng lúa nhƣ bệnh vàng lùn,

bệnh lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen...Trong các năm từ 2009 đến 2010, dịch bệnh lúa

lùn sọc đen lần đầu tiên bùng phát và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng

diện tích nhiễm bệnh lên tới cả trăm ngàn ha, gây thiệt hại lớn cho sản suất Nông

nghiệp. Mặc dù, nguyên nhân gây bệnh bƣớc đầu đã đƣợc xác định là virus gây bệnh

lúa lùn sọc đen (SRBSDV) và dịch bệnh đến nay đã tạm thời lắng xuống nhƣng diễn

biến gây bệnh vẫn tồn tại trong sản suất lúa. Đặc biệt, virus SRBSDV là chủng vius

mới xuất hiện nên tất cả các nghiên cứu nhƣ: (1) nguyên nhân gây bệnh, (2) đặc trƣng

sinh học, (3) dịch tễ bệnh và (4) phòng chống bệnh cần phải đƣợc nghiên cứu. Thực tế

các nghiên cứu hiện tại vẫn đang tập trung vào việc hoàn thiện quy trình chẩn đoán, sau

đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt trung gian truyền bệnh,

trồng giống lúa kháng rầy, luân canh...; chƣa có các nghiên cứu chuyên sâu về bản chất

hệ gene, mức độ đa dạng di truyền, mức độ đột biến, nguy cơ phát sinh chủng mới. Vì

nguy cơ phát dịch trở lại của loại virus này vẫn tiềm ẩn.


2

Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi,

có kích thƣớc từ 1 đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào

kích thƣớc phân đoạn RNA sợi đôi. Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF

có chiều dài 1073 và 930 nucleotide. Trong đó, ORF 7-1 chứa gen 7-1 quy định protein

P7-1 liên quan đến tính tƣơng tác đặc hiệu với vector trung gian truyền bệnh là rầy

lƣng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan trọng trong nghiên cứu tính đa

dạng di truyền và sự tiến hóa của virus.

Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đa

dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen” với

những mục tiêu chính nhƣ sau:

- Phân lập và giải trình tự phân đoạn S7 của vius SRBSDV trên các mẫu lúa

nhiễm bệnh thu thập tại 5 vùng sinh thái trồng lúa của Việt Nam.

- Phân tích tính đa dạng di truyền và so sánh mức độ tiến hóa của các chủng

SRBSDV ở Việt Nam với các chủng SRBSDV khác trên thế giới.


3

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM

1.1.1. Các virus gây bệnh trên lúa

Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân

chính làm sản lƣợng nông nghiệp không ổn định, gây ra tình trạng mất an ninh lƣơng

thực. Đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu, cân bằng sinh thái bị phá vỡ do

việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học đã làm cho diễn biến phát sinh dịch và

mức độ gây hại của các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào

hết. Trong sản xuất nông nghiệp tổng cộng có 16 loại virus gây hại cho lúa (phụ lục 1)

và khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp nhƣ

cây ngô, đậu tƣơng…Trong số các virus hại lúa ngoài Rice hoja blanca virus (một

Ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một Luteovirus, phân bố tại

châu Âu), Rice stripe necrosis virus (một Furovirus, phân bố tại châu Phi) thì 13 virus

còn lại đều phát hiện thấy tại các nƣớc trồng lúa châu Á. Tuy nhiên có 5 bệnh virus gây

hại nghiệm trọng và phổ biến nhất là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn

lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời.[17,24,26,23,34]

1.1.2. Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam

Việt Nam hiện có 12/16 loại vius gây hại trên lúa, các bệnh do vius gây ra thành

các đợt dịch thƣờng nối tiếp nhau ở các vùng trồng lúa khác nhau trên cả nƣớc. Tuy

nhiên, cho đến nay mới ghi nhận 5 loại bệnh virus gây thành dịch, bao gồm bệnh vàng lá di

động, bệnh tungro, bệnh lúa cỏ, bệnh lúa lùn xoắn, bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam [15]. Hiện

nay, virus gây bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus – RYSV) đang gây hại tại Bắc giang

và đang có nguy cơ thành dịch [14].

Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó

áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, diệt môi giới truyền bệnh, trồng

giống kháng rầy, luân canh… Một số cơ quan nghiên cứu nhƣ Viện Bảo vệ Thực vật và

Trƣờng đại học Nông nghiệp Hà Nội đã hoàn thiện quy trình chẩn đoán dựa trên kháng


4

huyết thanh, RT-PCR và đã sản xuất đƣợc kháng huyết thanh cho virus vàng lùn và lùn

xoăn lá, đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát hiện RGSV, RRSV,

RBSDV, RSV, RTSV, SRBSDV [8, 13]. Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng

lùn và lùn xoăn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và

biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên

cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật [7]. Các nghiên cứu về virus hại lúa

tại Viện Di truyền Nông Nghiệp và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các

nghiên cứu phân tử nhƣ giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng Công nghệ

gen. Hiện Viện Di truyền Nông Nghiệp đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn

và lùn xoăn lá lúa ở ngân hàng gen NCBI, đã xác định đƣợc các gen quan trọng và các

đoạn trình tự bảo thủ của các gen virus (không trùng lặp với trình tự gen của cây chủ),

đã thiết kế các vector RNAi mang gen có khả năng làm bất hoạt virus và đã nhận đƣợc

một số cây chuyển gen [5, 11]. Gần đây, trong một hợp tác nghiên cứu với Trung tâm

nghiên cứu Nông nghiệp quốc gia Nhật Bản, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã sản suất

đƣợc 7 bộ kit chẩn đoán 7 virus lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: RGSV,

RRSV, RBSDV, RSV, RTSV, RTBV, RDV và RGDV với số lƣợng đủ cho nghiên

cứu, hợp tác và chẩn đoán [5].

Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong thời gian qua là

đáng ghi nhận nhƣng vẫn chƣa thể đáp ứng đƣợc với diễn biến phức tạp của dịch virus

hiện nay. Vì vậy, chiến lƣợc nghiên cứu bệnh virus hại lúa trong giai đoạn hiện nay cần

phải có sự kết hợp hài hòa giữa nghiên cứu đối ứng và nghiên cứu dài hạn. Nghiên cứu

đối ứng tập trung vào khâu chỉ đạo sản suất và phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh từ đó

xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả, trong khi nghiên cứu dài hạn tập trung vào

khâu xác định bản chất hệ gen, mức độ đa dạng di truyền, tính độc và mức độ đột biến

để xác định danh tính tác nhân gây bệnh, hoàn thiện các quy trình chẩn đoán chính xác,

nguy cơ phát sinh chủng mới và tiến tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả tác nhân gây

bệnh dựa trên công nghệ gen.


5

1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV

1.2.1. Giới thiệu chung về bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam

1.2.1.1. Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam.

Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (Oryza sativa) tại

một số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc. Cây lúa

nhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sần

nhỏ. Ban đầu, virus gây bệnh chỉ đƣợc coi nhƣ là một biến chủng của virus lùn sọc đen.

Mãi tới gần đây, dựa vào các kết quả nghiên cứu về môi giới truyền bệnh, cấu trúc và

bản chất hệ gen virus, các nhà khoa học Trung Quốc đã kết luận nguyên nhân gây bệnh

là do 1 chủng virus mới với tên gọi virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam. Nhóm virus

mới có môi giới truyền bệnh riêng biệt là rầy lƣng trắng – một đặc điểm quan trọng và

khá đặc trƣng cho các thành viên trong nhóm Fijivirus. Hình dạng, kích thƣớc và cấu

trúc đặc trƣng của các tiểu thể virus dƣới kính hiển vi điện tử có những đặc điểm rất

đặc trƣng. Toàn bộ trình tự gen của 2 biến chủng (Quảng Đông và Hải Nam) đã đƣợc

xác định. Các tính chất đặc trƣng ở mức phân tử cho thấy trình tự gen cũng nhƣ trình tự

axit amin của 2 biến chủng này có độ tƣơng đồng cao hơn hẳn so với sự sai khác giữa

các biến chủng của các thành viên khác trong nhóm Fijivirus và nằm trong khoảng sai

khác khi so sánh giữa các chủng với nhau. Mặt khác, những khác biệt này lại gần gũi

hơn với Rice black streaked dwarf virus (RBSDV), Maize rough dwarf virus (MRDV)

và Mal de Rio Cuarto virus (MRCV) – các thành viên trong phân nhóm Fijivirus-2 của

nhóm Fijivirus, so với các thành viên thuộc các phân nhóm khác. Do đó, có thể nói

chính xác hơn rằng SRBSDV là 1 thành viên mới thuộc nhân nhóm 2 – cùng với

RBSDV, MRCV, MRDV, trong nhóm Fijivius, họ Reoviridae. Việc đặt tên là lùn sọc

đen phƣơng Nam là do nhóm virus này có sự tƣơng đồng về triệu chứng bệnh trên cây

nhiễm, song virus lùn sọc đen tập trung chủ yếu ở phía Bắc Bán cầu trong khi virus

SRBSDV mới chỉ ghi nhận ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc [25,24,18]. Ngoài lúa và

ngô, virus SRBSDV cũng đƣợc xác định co thê nhiêm tƣ nhiên trên 3 loài cỏ dại là cỏ


6

lông vƣc (Echinochloa crusgalli), cỏ đuôi voi (Pennisetum flaccidum) và Juncellus

serotinus có mặt trong hoặc xung quanh ruộng lúa nhiễm bệnh [7,42,22].

1.2.1.2. Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen tại Việt Nam

Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, môt bênh la (bênh lun lui ) đa xuât hiên

trên diên rông trên lu a mua vơi tông diên tich nhiêm bênh lên tơi 5.506 ha, trong đo

gần 3.510 ha bị mất trắng. Cây bênh bi lun manh , lá xanh đậm , nhiêu la bi xoăn văn ,

sau biên vàng, trô không thoat . Triêu chƣng cây bênh kha giông vơi bênh lun xoăn la

tại miền Nam . Tât ca cac giông gieo trông tai Nghê An (TH3-3, Nhị ƣu 838, Bio404,

Bắc thơm số 7, Khang dân 18 và Hƣơng thơm ) đều bị nhiễm bệnh [9]. Cho tơi giƣa

tháng 9, môt sô đia phƣơng tai miên Băc nhƣ Nam Đinh , Thái Bình cung thông bao

dịch bệnh tƣơng tự [2].

Báo cáo tại cuộc họp do bô Nông Nghi ệp và Phát Triển Nông Thôn

(NN&PTNT) chủ trì ngày 23/9 cho biết từ ngày 16-19/9, Cục Bảo Vệ Thực Vật

(BVTV) đã kiểm tra và lấy mẫu tại một số tỉnh ở miền Bắc. Cục đã phát hiện 5 tỉnh có

diện tích lúa nhiễm bệnh gôm Ngh ệ An, Thanh Hóa, Nam Định, Thái Bình và Ninh

Bình với trên 13 nghìn ha lúa nhiễm bệnh, trong đo hơn 8 nghìn ha bị bệnh rất nặng, có

khả năng mất trắng [3].

Để làm rõ nguyên nhân gây bênh t ại Nghệ An, đặc biệt khi bệnh đang đƣợc

liên tuc bao cao xuât hiên tai nhiêu tinh miên Băc , ngày 4/9/2009, Bộ NN &PTNT đa

tô chƣc hôi thao khân câp vê nguyên nhân gây bênh tai Nghê An do đich thân Bô

trƣơng Cao Đƣc Phat chu tri vơi sƣ tham gia cua cac chuyên gia đâu nganh ca nƣơc va

Tiến sĩ Rogelio , chuyên gia vê bênh virus lua cua Viên nghiên c ứu lua quôc tê (IRRI).

Dƣa chu yêu vao triêu chƣng quan sat bênh trên thƣc đia va y kiên chuyên gia , hôi nghi

kêt luân bênh lua lun lui tai Nghê An la do 2 virus gây bênh vàng lùn / lùn xoắn lá

giông nhƣ ơ miên Nam vơi vector truyên bênh la rây nâu . Các kêt quaxét nghi ệm

ELISA trên cac mâu rây nâu thu thâp đƣơc thƣ nghiêm tai IRRI va Trung tâm BVTV

phía Nam, Bô NN &PTNT và Cục BVTV v ẫn kêt luân nguyên nhân gây bênh lua lun

lụi ở miền Bắc la do 2 virus vàng lùn và lùn xoắn lá và do rây nâu lan truyên [4].


7

Trong thang 9, 10 năm 2009, các hoạt động nghiên cứu nhằm xác đin h tac nhân

gây bênh đa đƣơc thƣc hiên tich cƣc tai cac cơ quan nhƣ Viên BVTV , Cục BVTV ,

Trƣơng ĐHNN Ha Nôi va Viên Nghiên c ứu lua quôc tê (IRRI). Kết quả nghiên cứu đã

xác định tac nhân gây bênh lùn l ụi lúa tại Nghệ An và các tỉnh phía bắc trong vụ mùa

2009 là do SRBSDV [9]. Ngay sau khi tác nhân gây bệnh đƣợc xác định, Bộ

NN&PTNT đã thành lập ban chỉ đạo phòng chống dịch lùn sọc đen do thứ trƣởng Bùi

Bá Bổng làm trƣởng ban chỉ đạo.

Trong vụ mùa 2010, cũng theo thông báo của Cục BVTV, tính đến tháng 10,

bệnh lùn sọc đen cũng vẫn phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành tổng diện tích bị nhiễm

tính từ đầu vụ là 24.000 ha, trong đó diện tích phải nhổ tỉa là 9.000 ha và phải tiêu hủy

là 1.700 ha. Các tỉnh có xuất hiện bệnh lùn sọc đen bao gồm:

+ Bắc Bộ (19 tỉnh): Bắc Kạn, Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Lạng Sơn, Sơn La,

Bắc Giang, Hải Dƣơng, Điện Biên, Thái Bình, Ninh Bình, Bắc Ninh; Hải Phòng, Hòa

Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Hƣng Yên, Cao Bằng và Hà Nam.

+ Bắc Trung Bộ (6 tỉnh): Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình, Quảng Trị,

Hà Tĩnh và Thanh Hóa.

+ Duyên Hải Nam Trung Bộ (3 tỉnh): Quảng Nam, Quảng Ngãi và Đà Nẵng.

Đến năm 2013, bệnh lùn sọc đen đã tạm thời lắng xuống, chỉ còn rải rác ở một

vài tỉnh thành. Tuy nhiên, bệnh vẫn chƣa đƣợc phòng trị hoàn toàn, có nhiều khả năng

tái bùng phát thành dịch.

1.2.2. Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam

1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết

Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm virus SRBSDV rất giống với biểu hiện của

bệnh lùn sọc đen do virus RBSDV gây ra. Triệu chứng chung của lúa nhiễm bệnh bao

gồm: cây lúa tƣơng đối thấp lùn, lá xanh đậm, lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách

mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt

sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân. Các u sáp này đƣợc hình thành do sự phát triển vƣợt trội


8

cả về số lƣợng và kích thƣớc của mô mạch dẫn nhựa. Khi cây còn non gân chính trên

bẹ lá cũng bị sƣng phồng. Từ giai đoạn làm đòng và khi có lóng, cây bị bệnh thƣờng

nảy chồi trên đốt thân và mọc nhiều rễ bất định. Trên bẹ và lóng thân xuất hiện nhiều u

sáp và sọc đen (rất dễ nhận thấy u sáp khi dùng tay vuốt nhẹ thân). Cây lúa bị bệnh

nặng không trổ bông đƣợc hoặc trổ bông không thoát, hạt thƣờng bị đen [11] (Hình 1).

Hình 1: Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam[11]

1.2.2.2. Vector truyền bệnh

Vector chính truyền bệnh lùn sọc đen phƣơng nam là rầy lƣng trắng (Sogatella

furcifera). Cả rầy non và rầy trƣởng thành đều có khả năng truyền bệnh. Rầy lƣng

trắng sau khi đã chích hút nhựa cây bị bệnh mang virus có thể truyền virus gây bệnh

đến khi chết. Một nghiên cứu về phƣơng thức lan truyền bệnh lùn sọc đen phƣơng nam

ở lúa đã đƣợc tiến hành nhằm đanh gia kha năng lan truyên virus SRBSDV qua vector

đã đƣợc thực hiện trên 3 loài rầy là rầy lƣng trắ ng (Sogatella furcifera), rây nâu

(Nilaparavata lugenes) và rầy nâu nhỏ (Laodelphax striatellus). Kêt qua cho thây ca

rây lƣng trăng va rây nâu nho đêu co kha năng truyên SRBSDV tƣ lua sang lua vơi

hiêu qua truyên rât cao (100 % cây nhiêm bênh vơi chi 3 – 4 rây/cây). Tuy nhiên, chỉ


9

có rầy lƣng trắng (Hình 2) mơi co kha năng truyên SRBSDV tƣ lua sang ngô . Nghiên

cƣu nay cung cho thây rây nâu không thê truyên đƣơc SRBSDV [36,38,39].

Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV[11]

Rầy lƣng trắng gây hại cùng với rầy nâu nhỏ, nhƣng trong cùng một lứa thì rầy

lƣng trắng phát sinh rộ sớm hơn. Rầy lƣng trắng thƣờng có mật độ cao, gây hại nặng

vào giai đoạn lúa làm đòng. Cũng nhƣ rầy nâu, rầy lƣng trắng thích hợp với điều kiện

khí hậu ấm nóng, ẩm độ cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở vùng Đồng bằng sông Hồng, một

năm có 6-7 lứa rầy, quan trọng nhất là lứa rầy vào tháng 4 (vụ xuân) và cuối tháng 8

đầu tháng 9 (vụ mùa). Vụ xuân thƣờng gây hại nặng hơn vụ mùa. Rầy lƣng trắng hại

nặng trên các giống lúa nhiễm rầy, lúa lai; nếu thâm canh cao, bón nhiều đạm, ruộng

lúa cấy dày, rậm rạp là điều kiện cho rầy lƣng trắng phát sinh, phát triển. Rầy lƣng

trắng phân bố rộng rãi trên khắp các vùng trồng lúa của Việt Nam và trên thế giới, có

khả năng du nhập và di chuyển rất cao [7].

Một nghiên cứu về đặc tính lây truyền SRBSDV của rầy lƣng trắng Sogatella

furcifera đã đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc thực hiện nhằm xác định các giai đoạn

phát triển của bệnh cũng nhƣ tìm phƣơng pháp kiểm soát bệnh hiệu quả nhất. Bằng

phƣơng pháp RT-PCR, các nhà khoa học đã xác định đƣợc sự có mặt của virus

SRBSDV trong tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của S. furcifera, bao gồm cả

giai đoạn ấu trùng, rầy cánh dài và rầy cánh ngắn S. furcifera khi đã nhiễm virus

SRBSDV sẽ có khả năng truyền virus cho cây lúa trong suốt vòng đời còn lại. Tuy

nhiên, virus SRBSDV không truyền qua giai đoạn trứng. Mỗi cá thể rầy S. furcifera

mang virus SRBSDV trung bình có thể lây nhiễm cho 48-50 cây lúa, tối đa là 87-90

cây lúa. Thời gian tối thiểu và tối đa để rầy nâu lƣng trắng truyền virus cho cây lúa non

Rầy cánh dài Rầy cánh ngắn


10

tƣơng ứng là 5-7 phút và 10-12 phút, tùy theo từng giai đoạn phát triển của rầy. Kết

quả nghiên cứu cũng chứng tỏ giai đoạn lúa non là giai đoạn dễ bị nhiễm virus

SRBSDV từ rầy nâu lƣng trắng nhất[29].

Ngoài cây lúa, virus SRBSDV còn gây hại trên ngô, cỏ lồng vực, cỏ chát, cỏ

đuôi phụng, vì các cây này là vật chủ của rầy lƣng trắng và cũng là nguồn chứa virus

để rầy lƣng trắng truyền sang cây lúa. Bệnh cũng có thể lƣu tồn trên lúa chét của cây

lúa bị bệnh trƣớc đó. Virus gây bệnh tồn tại trong cơ thể rầy lƣng trắng sống qua mùa

đông hoặc di chuyển rất xa theo gió và bão để gây bệnh cho lúa và một số loài cây

khác ở các vùng khác hoặc vụ tiếp theo [29].

1.2.3. Đặc điểm sinh học của virus SRBSDV

1.2.3.1. Phân loại

Dựa trên các phân tích phân tử, virus SRBSDV đƣợc xếp là một thành viên

mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho Reoviridae.

Họ Reoviridae: Các virus thuộc họ Reoviridae (đƣợc gọi chung là các Reovirus)

đƣợc đặc trƣng bởi có bộ gene RNA sơi kep (dsRNA), phân đoạn bao gồm 10 đến 12

phân tử RNA sợi kép mạch thẳng. Tất cả các phân tử RNA đều đƣợc lắp ráp trong cùng

một phân tử virus hình cầu. Họ Reoviridae là một họ đa dạng về ký chủ. Trong số 12

chi của họ, có tới 8 chi hại ngƣời và động vật, một chi hại nấm và 3 chi gây hại thực

vật là (1) Phytoreovirus (ví dụ virus lúa lùn RDV (Rice dwarf virus)), (2) Oryzavirus

(ví dụ virus lúa lùn xoắn lá RRSV (Rice ragged stunt virus), (3) Fijivirus (ví dụ virus

lúa lùn sọc đen RBSDV (Rice black streaked dwarf virus))[30].

Chi Fijivirus: Các virus thuộc chi Fijivirus đƣợc đặc trƣng bởi có phân tử virus

hình khối đa diện đối xứng 20 mặt (icosahedral) và nhìn dƣới kính hiển vi điện tử có

dạng hình cầu, kích thƣớc 65-70 nm. Phân tử virus có cấu trúc phức tạp, gồm 2 lớp vỏ

(với lớp vỏ ngoài có số tam giác T = 13 còn lớp vỏ trong có T = 2). Trên bề mặt phân

tử, ở mỗi lớp vỏ đều có 12 gai vỏ (Hình 3)

Tât ca cac Fijivirus đa biêt đêu co b ộ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA sợi


11

kép, mạch thẳng. Các phân tử RNA này có kích thƣớc dao đông tƣ 1,4 kb đên 4,5 kb va

đƣơc đăt tên lân lƣơt tƣ S 1 đến S 10 theo tôc đô di chuyên khi đi ện di PAGE

(Polyacrylamide). Các phân tử RNA genome đều mã hóa cho 1 gen, ngoại trừ phân

đoạn 7 và 9 mã hóa 2 gen (Hình 4) [30].

Hình 3.Cấu trúc phân tử các Fijivirus [30]

Đối với các Fijivirus, phần lớn chức năng của các gen chƣa đƣợc nghiên cứu

ngoại trừ gen VP10 (trên phân đoạn S10) mã hóa protein tạo gai vỏ của virus và VP1

(trên phân đoạn S1) mã hóa cho protein tái bản của virus là RdRp (RNA dependent

RNA polymerase) [30].

Hình 4.Tổ chức bộ gen của các Fijivirus [30]


12

Chi Fijivirus là 1 trong 3 chi gây hại thực vật thuộc họ Reoviridae. Hiện nay, chi

Fijivirus đƣợc ghi nhận gồm 9 loài trong đó Fiji disease virus (FDV) là loài điển hình.

Ngoài ra, căn cứ vào mức đồng nhất của bộ gen, các Fijivirrus lại đƣợc chia thành 5

nhóm (phụ lục 2) [10].

Nhóm Fijjivirus-2 là nhóm lớn nhất trong chi Fijjivirus, gồm MRCV, PaSV,

RBSDV và SRBSDV (phụ lục 2), các thành viên của nhóm Fijjivirus-2 có nhiều đặc

điểm di truyền và sinh học tƣơng đồng hơn hẳn so với 5 nhóm còn lại trong chi

Fijjivirus.

1.2.3.2. Đặc điểm hình thái của SRBSDV

Virus SRBSDV có hình thái điển hình của chi Fijivirus là dạng hình cầu đa diện đối

xứng icosahedral [38] Đƣờng kính lớp vỏ ngoài là ~ 70 nm, trên bề mặt vỏ ngoài có 12

gai ngắn gắn trên 12 đỉnh của hình đa diện icosahedra kiểu T=13. Hình đa diện

icosahedra T=13 cấu tạo từ 60 mặt tam giác, mỗi mặt tam giác là 13 phân tử protein,

tạo thành 12 pentamer tƣơng đƣơng với 120 capsomer lục giác (Hình 5) [15].

Hình 5:Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 [41]

1.2.3.3. Đặc điểm di truyền của virus SRBSDV

Theo một nghiên cứu về SRBSDV gây bệnh ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc, virus

SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho Reoviridae. Hệ

http://www.expasy.org/all_by_protein/260.html


13

gen có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến

4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn RNA

sợi đôi (Hình 6). Phân đoạn S1 có chiều dài 4500 bp, mã hóa một polypeptide (chứa

các vùng chức năng của enzym RNA polymerase) có trọng lƣợng phân tử 169 kDa.

Phân doạn S2 có chiều dài 3815 bp, chứa một ORF mã hóa một protein vỏ virus có

trọng lƣợng phân tử 141 kDa (chƣa xác định rõ chức năng). Phân đoạn S3 có chiều dài

3618 bp, chứa một ORF mã hóa một protein có trọng lƣợng phân tử 141 kDa (chƣa xác

định rõ chức năng) và có điểm đẳng điện Pi là 5,96. Phân đoạn S4 có chiều dài 3618

bp, chứa một ORF mã hóa một protein có vùng trình tự từ acid amin 608 – 786 tƣơng

đồng 22 – 25% với các thành viên khác của reovirus. Phân đoạn S5 có chiều dài 3167

bp, chứa một ORF chính và một ORF mã hóa một protein (chƣa xác định rõ chức

năng) trọng lƣợng phân tử 24 kDa chồng lên ORF chính. Phân đoạn S6 có chiều dài

2651 bp, mã hóa một protein có trọng lƣợng phân tử 90 kDa và có điểm đẳng điện

4,89. Đây là phân đoạn có sự khác biệt lớn nhất về trình tự nucleotide so với các thành

viên trong phân nhóm Fijivirus-2 (70,6% tƣơng đồng so với RBSDV và 62,4% tƣơng

đồng so với MRCV). Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF có chiều dài

1073 và 930 nucleotide mã hóa hai protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 40,5

kDa và 36,4 kDa. Phân đoạn S8 có chiều dài 1928 bp, chứa một ORF có chiều dài

1776 nucleotide mã hóa protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 67.9 kDa. Phân

đoạn S9 có chiều dài 1899 bp, chứa hai ORF có chiều dài 1044 và 630 bp, mã hóa hai

protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 39,9 kDa và 24,2 kDa. Phân đoạn S10 có

chiều dài 1797 bp, chứa một ORF có chiều dài 1674 nucleotide mã hóa protein hinh

thành lớp vỏ ngoài của phân tử virus có tr ọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 62,6 kDa và

36,4 kDa. [37,22]. Trong một nghiên cứu khác, hệ gen virus SRBSDV gây bệnh trên

lúa ở tỉnh Hải Nam Trung Quốc đã đƣợc phân lập và giải trình tự. Kết quả là trình tự

nucleotide của hai phân đoạn S9 và S10 có độ tƣơng đồng 98-99% so với chủng Quảng

Đông [22]. Nếu so sánh toàn bộ hệ gen thì hai chủng virus SRBSDV ở Quảng Đông và

Hải Nam có độ tƣơng đồng >97%. Nếu so sánh với các thành viên của phân nhóm


14

Fijivirus-2, hai chủng virus này chỉ có độ tƣơng đồng ở mức độ amino acid là 77-78%

so với RBSDV, 65% so với MRCV và 44% so với Fiji disease virus (FDV) [23]. Nhƣ

vậy sau 25 năm kể từ khi dịch virus lùn sọc đen bùng phát lần cuối cùng tại Trung

Quốc vào năm 1975, trình tự nucleotid của hệ gen virus lùn sọc đen đã thay đổi hơn

20%.

Hình 6: Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi của virus SRBSDV trên gel

polyacrylamide 12,5%[37].

1.2.3.4. Đặc điểm phân đoạn S7 và khả năng tiến hóa của SRBSDV

SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho Reoviridae.

Hệ gen có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8

đến 4,5 kb và đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn

RNA sợi đôi [17]. Phân đoạn S7 có chiều dài 2176 bp, chứa hai ORF không chồng gối

lên nhau: ORF 7-1 có chiều dài 1073 và ORF 7-2 có chiều dài 930 nucleotide lần lƣợt

mã hóa hai protein có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 40,5 kDa và 36,4 kDa [33].

Phân đoạn S7 có phần không dịch mã ở đầu 5„ dài 40bp, phần không dịch mã ở

đầu 3„ dài 81bp và vùng intron dài 51bp, trình tự bảo thủ ở hai đầu S7 là 5‟-

AAGTTTTT và CAGCTGATGTC-3„. Ngoài ra, SRBSDV tồn tại đặc điểm đặc trƣng


15

cho chi Fijivirus, sát những vùng bảo thủ này tồn tại những đoạn lặp lại liền kề, ở phân

đoạn S7 chúng tồn tại ở những trình tự 5′-TTTCGACCT……AGGTCGA AA-3′

[36,38,39].

Một nghiên cứu về các chủng SRBSDV đƣợc phát hiện trên các mẫu bệnh ở

Sơn Đông, Quảng Đông và Hải Nam, Trung Quốc cho thấy có sự tƣơng đồng lớn giữa

hai ORF của phân đoạn S7 ở SRBSDV với phân đoạn tƣơng ứng của FDV, OSDV,

NLRV, MRCV, MRDV và RBSDV. Đặc biệt, ORF 7-1 của phân đoạn S7 ở SRBSDV

có mức độ tƣơng đồng trung bình với các virus trên lớn hơn hẳn so với bất kì phân

đoạn nào còn lại, lớn nhất là 81% amino acid tƣơng đồng với RBSDV [34,36,37]. Điều

này cho thấy có sự liên hệ giữa phân đoạn S7, đặc biệt là ORF 7-1 với khả năng tiến

hóa của SRBSDV [33].

Trong hai gen của phân đoạn S7, một nghiên cứu gần đây cho thấy, gen 7-1 mã

hóa cho protein P7-1 chịu trách nhiệm tạo thành các cấu trúc ống (tubular) cho phép

virus di chuyển qua tế bào biểu mô ruột của vector truyền bệnh (rầy Sogatella

furcifera) [25,28]. Các protein P7-1 đƣợc tìm thấy dày đặc trong các cấu trúc ống ở bề

mặt tế bào Sogatella furcifera mang virus và gen 7-1 cũng có chức năng giúp các

protein này tự lắp ráp tạo thành các cấu trúc ống (tubular) [34] (Hình 7). Điều này cho

thấy gen 7-1 mã hóa cho protein P7-1 liên quan đến tính tƣơng tác đặc hiệu với vector

trung gian truyền bệnh là rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan

trọng trong sự tiến hóa của virus.

Hiện nay, chức năng của gen 7-2 ở SRBSDV chƣa đƣợc công bố. Tuy nhiên, một

nghiên cứu về RBSDV, họ hàng gần với SRBSDV, trên vật chủ là cây ngô (Zea mays)

cho thấy gen 7-2 quy định protein P7-2 có khả năng tƣơng tác với một tiểu đơn vị lõi

của SCF ubiquitin ligase trong phức hợp SCF [32], có chức năng quan trọng trong chu

trình tế bào và chịu trách nhiệm chỉ định tiêu hủy nhiều loại protein [31]. Chức năng

này ở SRBSDV cần đƣợc nghiên cứu xa hơn để làm rõ vai trò của gen trong sự tiến

hóa của virus.


16

Hình 7: Sự xuất hiện của protein P7-1 trong tế bào vector truyền bệnh

(rầy Sogatella furcifera) dưới kính hiển vi điện tử [34]

1.2.3.4. Chuẩn đoán virus SRBSDV.

Việc phát hiện bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam khi gieo trồng lúa không quá khó

khăn do cây lúa bệnh có biểu hiện khá rõ. Tuy nhiên, việc phân biệt bệnh do virus

SRBSDV và bệnh do RBSDV rất khó thực hiện bằng cách quan sát hình thái bên

ngoài, do cả 2 bệnh đều có chung những đặc điểm về triệu chứng bệnh. Cho đến nay,

công tác chân đoan bênh virus trên lua nhin chung v ẫn kha phƣc tap . Hiên nay , kỹ


17

thuât chân đoan bênh virus phô biên nhât vân la phƣơng pháp ELISA va phan ƣ ng

trùng hợp chuỗi (RT-PCR va PCR).

Theo công bố mới nhất năm 2012, Zhenchao Wang và cộng sự đã phát triển một

phƣơng pháp phát hiện nhanh virus SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh, sử sụng kĩ

thuật DOT-ELISA. Phƣơng pháp của Z.Wang sử dụng loại kháng thể đa dòng đặc hiệu

cho protein vỏ của viurs SRBSDV (mã hóa bởi phân đoạn S10) để phát hiện sự có mặt

của SRBSDV trong mẫu lúa bệnh. Kết quả xét nghiệm trên 100 mẫu lúa bằng phƣơng

pháp này cho kết quả tƣơng đồng với kết quả xét nghiệm bằng phƣơng pháp RT-PCR

(Hình 8). Phƣơng pháp DOT-ELISA này khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm của

phƣơng pháp xét nghiệm truyền thống bằng RT-PCR, đồng thời vẫn có độ chính xác

cao, cho phép phát hiện sớm virus SRBSDV [11].

Hình 8: Xét nghiệm virus SRBSDV bằng phương pháp DOT-ELISA[11]

1.2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam và virus SRBSDV ở

Việt Nam

1.2.4.1. Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV

Ngày 27/9/2009, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (ĐH Nông Nghiệp Hà Nội) đa

nhân đƣơc yêu câu cua Trung tâm Kiêm dịch sau nhập khẩu 2 (thuôc Cuc BVTV ) yêu

câu thƣ cac mẫu lua thu thâp tai Nghê An (60 mâu). Các thử nghiệm ELISA với kháng


18

huyêt thanh do Trung tâm san xuât cung nhƣ RT -PCR vơi môi đăc hiêu do Trung tâm

thiêt kê đa cho thây các mẫu lúa bệnh thu tại Nghệ An không bị nhiễm 2 virus gây bênh

VL/LXL nhƣ ơ miên Nam.

Tuy nhiên khi chuân bi mâu bênh cho kiêm tra ELISA , nhóm nghiên cứu đã

quan sat thây 2 đăc điêm không binh thƣơng (ngoài các đặc điểm giống nhƣ cây bi

bênh lun xoăn la la bi nhiêm bơi virus Rice ragged stunt virus (RRSV) ở miền Nam

nhƣ cây lun, lá xanh đậm, ngọn lá xoắn vặn):

(1) Cây bênh không biêu hiên triêu chƣng tap va biên vang tai môt bên cua mep la

ở các la bi xoăn văn . Đây la môt triêu chƣng luôn đƣơc quan sat thây trên cây bi bênh

lùn xoắn lá bị nhiễm bởi virus RRSV.

(2) Có nhiều nốt phồng nhỏ màu trắng tới nâu chạy dọc gân của thân cây lúa sau khi

bóc lớp bẹ bên ngoài. Các nốt phồng này đặc biệt nhiều ở phần lóng sát gốc .

Các mẫu đƣợc thu thập tiếp theo tại Nam Định , Thanh Hoa, Sơn La cung đêu co

triêu chƣng tƣơng tƣ mâu Nghê An.

Dƣa trên 2 triêu chƣng trên , đăc biêt la triêu chƣng thƣ 2, tác nhân gây bệnh đã

đƣơc dƣ đoan la do môt reovirus (họ Reoviridae) gây ra . Các triệu chứng này khá

giông vơi 2 reovirus la Rice black streaked dwarf virus (RBSDV) và Southern rice

black streaked dwarf virus (SRBSDV) = Rice black streaked dwarf virus 2 (RBSDV2).

Đê kiêm tra liêu mâu lua bênh miên Băc co bi nhiêm RBSDV va SRBSDV hay không ,

môt căp môi cho phép phát hi ện đông thơi ca 2 virus nay đa đƣơc thiêt kê dƣa trên

vùng bảo thủ gene S10 của tất cả các chủng săn co của 2 virus trên Ngân hang gen.

Kêt qua kiêm tra RT -PCR cho thây cac mâu bênh thu thâp tai Nghê An va môt sô

đia phƣơng miên Băc nhƣ Thanh Hoa , Nam Đinh , Sơn La đêu cho phan ƣng RT -PCR

dƣơng đôi vơi môi đăc hiêu RBSDV va SRBSDV nhƣng không phan ƣng vơi môi đăc

hiêu virus lun xoăn la (RRSV).

Bôn san phâm RT -PCR đai diên cho Nghê An , Nam Đinh , Thanh Hoa va Sơn

La đa đƣơc giai trinh tƣ trƣc tiêp . Kêt qua phân tich trinh tƣ và ph ả hệ cho thây ca 4

mâu nay đêu la virus lùn s ọc đen phƣơng Nam (SRBSDV). Ngoài ra, nghiên cứu hiển


19

vi điện tử cũng phát hiện thấy phân tử virus và thể vùi của virus trong mô cây lúa bị

bệnh.Dƣa trên kêt qua nghiên cứu nay, Trung tâm đa bƣơc đâu kêt luân bênh lua lun lui

tại miền Bắc là do virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV) gây ra [18,25,19,17].

Trong cùng thời gian, các nghiên cứu tƣơng tự cũng đƣợc tích cực thực hiện tại

Viện Bảo Vệ thực vật (BVTV). Nhóm nghiên cứu Viện Bảo Vệ thực vật cũng hợp tác

chặt chẽ với chuyên gia Trung Quốc và Pháp để xác định tác nhân gây bệnh dựa trên

RT-PCR, giải trình tự sản phẩm PCR và hiển vi điện tử .

Căn cứ vào đặc điểm triệu chứng bệnh trên cây, đặc điểm hình thái, kích thƣớc

tiểu thể virus trên kính hiển vi điện tử và kết quả lây bệnh nhân tạo nhằm khẳng định

nguyên tắc Koch, cũng nhƣ giải trình tự sản phẩm PCR trên phân đoạn S10 và S3 của

hệ gene virus, nhóm nghiên cứu Viện BVTV cũng xác định tác nhân gây bệnh là virus

lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV)[10].

Ngoài ra, các nghiên cứu lan truyền thực hiện tại Viện Bảo vệ Thực vật cũng

xác định đƣợc môi giới truyền bệnh là rầy lƣng trắng giống nhƣ nghiên cứu của các tác

giả Trung Quốc.

Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tại

Việt Nam là bệnh lùn sọc đen (LSĐ) và virus gây bệnh là virus lùn sọc đen phƣơng

Nam (SRBSDV).

1.2.4.2. Các nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán virus SRBSDV

Năm 2010, Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu phát triển quy trình chẩn đoán

SRBSDV bằng phƣơng pháp PCR/RT-PCR. Quy trình bao gồm các bƣớc: Giải trình tự

sản phẩm PCR vùng gen bảo thủ có chiều dài 600 bp và phân tích trình tự gen sử dụng

chức năng BLAST trong ngân hàng gen để xác định độ tƣơng đồng với tất cả các trình

tự nucleic acid hiện có trong ngân hàng gen. Sau đó, gia phả trình tự gene thu đƣợc

đƣợc phân tích bằng phần mềm MEGA-4.1 với trình tự gen tƣơng ứng của các virus có

độ tƣơng đồng cao nhất cũng nhƣ các virus có cùng nhóm hoặc cùng phân nhóm và các

virus thuộc nhóm hay phân nhóm khác cùng họ[6].


20

Từ năm 2012 đến nay, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật - Viện Di truyền

Nông nghiệp và Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã phân

lập và giải trình tự toàn bộ phân đoạn S7, S9 và S10 của 13 chủng SRBSDV đại diện

cho các vùng sinh thái trồng lúa từ miền Trung trở ra. Trên cơ sở phân tích trình tự hệ

gene phân đoạn S10 của các chủng vius đã thiến kế cặp mồi đặc hiệu cho chủng

SRBSDV ở Việt nam và phát triển quy trình chẩn đoán dựa trên kỹ thuật RT-PCR.

Nghiên cứu đã tối ƣu hóa đƣợc phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số, thiết kế đƣợc cặp

mồi đặc hiệu dùng trong chẩn đoán SRBSDV, tối ƣu đƣợc loại mẫu và vị trí xét

nghiệm, tối ƣu loại phản ứng RT-PCR dùng trong xét nghiệm SRBSDV và thời gian

RT-PCR tƣơng ứng [5,12]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã nghiên cứu cơ sở khoa

học của việc chẩn đoán SRBSDV bằng kỹ thuật kháng nghuyên kháng thể và đã (1) tạo

mẫu nhiễm bệnh, tinh sạch phân tử virus từ mẫu nhiễm bệnh và tạo thành công kháng

thể đa dòng SRBSDV và (2) tinh sạch và biểu hiện thành công protein vỏ P10, 2

polypeptide P1 và P2 trên protein P10 phục vụ cho việc tạo kháng thể đặc hiệu [5].


21

CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Mẫu lúa

Tổng số 51 mẫu lúa bệnh có những đặc điểm nhiễm bệnh điển hình của bệnh lúa

lùn sọc đen nhƣ cây lúa lùn, lá vặn xoắn, gốc thân có nốt, vết sần mầu trắng đến đen...

đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa khác nhau của Việt Nam nhƣ: (1) đồng bằng

Bắc bộ, (2) Hà Nội và các tỉnh vùng ven, (3) Trung du và miền núi phía Bắc, (4) các

tỉnh Bắc Trung bộ và (5) các tỉnh Duyên hải Miền Trung đƣợc thu thậpphục vun cho

nghiên cứu.

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm có:

- Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng PCR nhân bản trình

tự S7 của SRBSDV do Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông

nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) thiết kế dựa trên trình tự S7 đã đƣợc

công bố trên Ngân hàng gen Thế giới (mã số EU 784841).

- Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng RT-PCR một bƣớc

nhằm xét nghiệm sự có mặt của SRBSDV đƣợc thiết kế theo nghiên cứu của Zhou và

cs (2008) là SRBSDVS10F3/R3 (525bp) [39].

- Các bộ kít dùng trong nghiên cứu gồm: pGEM®-T Easy Vector (Promega);

GenJETTM

Gel Extraction (Thermo Scientific); RevertAidTM

First Strand cDNA

Synthessis (Thermo Scientific); kít ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV,

RGSV, RTBV, RTSV, RGDV và RBSDV do TS. Omura, Trung tâm Khoa học Nông

nghiệp Nhật Bản chuyển giao; kit Read-to-go của GE healthcare cho phản ứng RT-PCR

1 bƣớc; pJet1.2 cloning kit và first strand cDNA kit của Fermentas...

- Các enzyme dùng trong nghiên cứu gồm: Dream Taq DNA polymerase, T4

DNA ligase (Thermo Scientific)…


22

Bảng 1:Trình tự các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu.

Tên mồi Trình tự mồi

T7-Fw 5‟-AATACGACTCACTATAG-3‟

SP6-Rv 5‟-TATTTAGGTGACACTATAG-3‟

SRBSDVS10F3 5-TATTCAAAGTTATTTCCGT-3‟

SRBSDVS10R3 5-ACATGAATAGTTTCAAGT-3′

- Các hóa chất và d ụng cụ tiêu hao khác dùng trong nghiên cứu: bột cellulose

CF11, SDS , Phenol, ống PCR 0,2 ml, đầu tip 2, 20, 200 và 1000 µl, chày cối sứ ... đạt

tiêu chuẩn cho Sinh học Phân tử.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu gồm: Máy PCR 9700 của hãng Applied

Biosystem, hệ thống điện di DNA của hãng Biorad, máy ly tâm Universal 30RF của

hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus, máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader

của hãng UVItec, máy giải trình tự ABI 3100, .

2.2. PHƢƠNG PHÁP

2.2.1. Thu mẫu

Những mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh đặc trƣng (nhƣ cây lùn, lá xanh đậm,

xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các

đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân) đƣợc thu thập trên đồng ruộng tại các

tỉnh thành miền Bắc và miền Trung.

2.2.2. Xét nghiệm mẫu

2.2.2.1. Phương pháp Sandwich ELISA

Nguyên tắc:

Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp

thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa


23

trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn

với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate)

vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu

chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua

cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.

Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế cho việc phát hiện và định lƣợng vật chất nhƣ

peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đƣợc gọi bởi một tên gọi

khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay). Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta

xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So

với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và

an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. ELISA đƣợc dùng để xác định

nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh...

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng

thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng

oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của

hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.

Tiến hành:

- Mẫu khi lấy về trữ ở -20oC, chọn những lá vừa không non cũng không già,

phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn chỉ

thấy dạng dung dịch. Sau đó đổ vào eppendoff gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận.

- Mẫu sau đó đƣợc đem ly tâm tốc độ 5000vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt

độ 4oC, dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới và

cũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng) và giữ ở 4oC.

Sử dụng bộ kit ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV, RGSV, RBTV,

RBSDV do TS. Omura, Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản chuyển giao, quy trình

ELISA đƣợc tiến hành nhƣ sau:


24

- Đĩa và sơ đồ bố trí đƣợc chuẩn bị. Mỗi đĩa đƣợc bố trí 2 đối chứng âm và 2 đối

chứng dƣơng. Pha loãng kháng thể 1/250 trong dung dịch đệm (coating buffer). Trên

mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100µl, chạy trên 5 đĩa, nhƣ vậy tổng cộng

là 30ml, do đó phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha loãng 140µl kháng thể

vào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trƣớc khi dùng. Hút 100µl

dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC

trong 2 giờ.

- Hỗn hợp đƣợc rửa với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗi

lần 3 phút. Sau đó, mỗi đối chứng âm và dƣơng đƣợc hoà tan với 1ml nƣớc cất, hút

100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào các

giếng đã đƣợc bố trí. Đem ủ ở 4oC qua đêm.

- Hỗn hợp đƣợc rửa lại với PBS – T 3 lần mỗi lần 3 phút. Sau đó, pha kháng thể

có gắn enzyme vào dung dịch đệm (tƣơng tự nhƣ pha kháng thể ở bƣớc 2). Hút 100µl

dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau

đó đem ủ ở 37oC trong 2 giờ.

- Hỗn hợp đƣợc rửa lại với PBS – T 3 lần, mỗi lần 3 phút. Sau đó, hoà tan pNPP

trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của pNPP, chờ 5 phút

để pNPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Hút 100µl hỗn hợp cho vào mỗi giếng,

dán băng keo lại. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 30 phút.

- Kết quả đƣợc đọc bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ

+ Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu dƣơng tính với

kháng nguyên.

+ Những giếng không màu: giếng chứa mẫu âm tính với kháng nguyên.

Các mẫu cho kết quả âm tính với kháng nguyên của RRSV, RGSV, RBTV,

RBSDV sẽ đƣợc phân loại riêng để tiếp tục phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo.


25

2.2.2.2. RT-PCR một bước

Nguyên tắc

cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA dƣới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngƣợc

(reverse transcriptase). Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuôn

mRNA. Sợi kép RNA/DNA sẽ tách nhau ra dƣới tác động của nhiệt độ cao, giải phóng

sợi đơn cDNA. Tiếp sau đó, enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi đơn cDNA thứ hai

để có đƣợc sợi đôi cDNA hoàn chỉnh.

Tiến hành:

Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 đƣợc sử dụng để tiến hành

tổng hợp cDNA sợi đôi từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm

bệnh lùn sọc đen. Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau:

Thành phần phản ứng:

Mồi xuôi 10 pmol : 1 µl

Mồi ngƣợc 10 pmol : 1 µl

RNA sợi đôi : 0.3 µl

Đệm 10X : 1.5 µl

dNTP 10 mM : 1.5 µl

Reverse transcriptase (200u/µl) : 0.5 µl

Taq DNA polymerase (5u/ µl) : 0.2 µl

RiboLockTM

RNase Inhibitor (20u/µl) : 0.3 µl

ddH2O : 8.7 µl

Tổng thể tích : 15µl

Phản ứng RT-PCR một bƣớc đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau:


26

Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC

cho đến phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên gel

agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide.

2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 1%

Nguyên tắc:

Điện di là một quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch

dƣới tác dụng của điện trƣờng. DNA là phân tử tích điện âm nên trong môi trƣờng

trung tính hoặc kiềm, dƣới tác dụng của điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển theo chiều từ

cực âm sang cực dƣơng. Các phân tử DNA sẽ chuyển động với vận tốc khác nhau phụ

thuộc vào điện tích, hình dạng, kích thƣớc của chúng. Do vậy phƣơng pháp điện di

đƣợc sử dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc, hình dạng khác nhau.

Tiến hành:

Sau khi gel agarose 1% đƣợc chuẩn bị, tiến hành tra mẫu gồm 5 l mẫu DNA

đƣợc trộn với 1 l loading dye 6X có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu

bromophenol xanh, xylene cyanol và ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 g/ml và

tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến

khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau đó, gel

đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel (Firereader-UVITEC),

các đoạn DNA gắn với EtBr đƣợc biểu hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel

màu đen.

Các mẫu điện di lên băng dƣơng tính với SRBSDV đƣợc giữ lại để tiếp tục tiến

hành các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.3. Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11

Nguyên lý:

Các phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) có đặc tính bám vào cột CF-11 trong điều

kiện môi trƣờng đệm STE có chứa 16.5% EtOH và mất khả năng bám cột trong môi


27

trƣờng đệm STE không chứa EtOH. Vì vậy hệ gen virus đƣợc tách ra khỏi hệ gen và

RNA của lúa bằng phƣơng pháp chạy qua cột CF-11.

Tiến hành:

Quy trình phân lập hệ gen của SRBSDV đƣợc thực hiện theo những bƣớc sau:

- Nghiền nhỏ khoảng 1g mẫu lúa, chuyển mẫu đã đƣợc nghiền sang ống falcol

sạch, bổ sung 10-20ml STE 2X vào mẫu để làm đệm cho phản ứng. Tiếp tục bổ sung

vào hỗn hợp 2ml SDS 10% và lắc đều. Sau đó, bổ sung vào hỗn hợp 10ml phenol đã

bão hòa, lắc nhẹ trong khoảng 45 phút.

- Ly tâm hỗn hợp trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, chuyển dịch nổi sang ống

mới, thêm vào H2O đến thể tích 20ml. Sau đó, bổ sung 4ml EtOH tuyệt đối vào dung

dịch, tạo điều kiện để phân tử dsRNA bám vào cột (~16.5%EtOH)

- Cân 2g bột CF-11 vào cốc đong, bổ sung 10ml dung dịch STE 1X chứa 16.5%

EtOH. Sau đó, đƣa hỗn hợp lên cột và tiếp tục bão hòa cột bằng 10x10ml STE1X chứa

16.5% EtOH. Quá trình gắn cột xảy ra khi hỗn hợp mẫu (đã chuẩn bị) chảy từ từ qua

cột đã đƣợc bão hòa.

- Sau khi gắn cột, rửa cột bằng cách cho chảy từ từ qua cột 10x10ml STE 1X

chứa 16.5% EtOH

- Cột sau khi rửa, đẩy cột bằng cách cho chảy từ từ 10ml STE 1X không chứa

EtOH qua cột, làm mất khả năng bám cột của các phân tử dsRNA, thu dịch đẩy vào

ống Falcol sạch. Sau đó, tách hoàn toàn dsRNA bằng cách thêm 0,6V Isopropanol vào

dịch đẩy cột, lắc đều hỗn hợp, ủ ở -20oC ít nhất 4h.

- Ly tâm dịch trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Rửa

cặn 2 lần bằng EtOh 70% để làm tan các muối. Sau đó, cặn đƣợc phơi trong không khí

đến khi khô và tiếp tục đƣợc hòa tan bằng 50µl H2O (cất 2 lần). Sản phẩm thu đƣợc

đƣợc giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo.


28

2.2.4. Tổng hợp cDNA từ dsRNA

2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi

Các phân đoạn S7 của các chủng SRBSDV trên thế giới có trên GeneBank đƣợc

tổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tƣơng đồng bằng phần mềm MEGA5. Vùng bảo

thủ của các phân đoạn này sẽ đƣợc lựa chọn và sử dụng để thiết kế các cặp mồi đặc

hiệu cho phép nhân bản phân đoạn S7. Các cặp mồi có sẵn trình tự sẽ đƣợc chúng tôi

đặt sinh tổng hợp tại công ty Sigma.

2.2.4.2. Tổng hợp cDNA sợi 1

Nguyên tắc:

cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA dƣới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngƣợc

(reverse transcriptase). Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuôn

mRNA. Sợi kép RNA/DNA đƣợc xử lý với kiềm hoặc ribonuclease (phân hủy sợi

khuôn RNA) để tạo thành sợi đơn cDNA. Tiếp sau đó, DNA polymerase I tổng hợp sợi

đơn cDNA thứ hai để có đƣợc sợi đôi cDNA hoàn chỉnh.

Tiến hành:

Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 đƣợc sử dụng để tiến hành

tổng hợp cDNA sợi 1 từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm bệnh

lùn sọc đen. Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau:

Thành phần phản ứng:

Mồi xuôi 10 pmol : 1 µl

Mồi ngƣợc 10 pmol: 1 µl

RNA sợi đôi : 1 µl

Đệm 5X : 4 µl

dNTP 10 mM : 2 µl

Reverse transcriptase (200u/µl): 1 µl

H2O : 10 µl

Tổng thể tích : 20µl


29

Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 42oC trong 60 phút. Sản phẩm phản ứng sau đó

đƣợc sử dụng trực tiếp để làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại các đoạn trình tự

đặc hiệu.

2.2.4.3. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đƣợc Karl Mullis cùng cộng sự

phát minh năm 1985 và đƣợc tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất

enzyme DNA polymerase bền nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus và một số loài

vi khuẩn khác.

Nguyên tắc của kỹ thuật này là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả

năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase trong môi trƣờng thích hợp có dƣ

các dNTPs và cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng nhiều

triệu lần so với ban đầu.

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ đều có ba giai đoạn cơ bản:

Giai đoạn biến tính (Denaturing): Tách DNA mạch kép thành dạng mạch

đơn ở nhiệt độ cao (94-95°C) trong thời gian ngắn.

Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Các đoạn mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp với mạch

khuôn theo nguyên tắc bổ sung bằng cách hạ nhiệt độ xuống khoảng 30-65°C.

Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extending): Nhờ hoạt tính của enzyme DNA

polymerase các dNTP đƣợc lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với mạch

DNA khuôn bắt đầu từ đoạn mồi. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ 68-72°C. Thời

gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào kích thƣớc đoạn gen cần nhân bản.

Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC

cho đến khi phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên

gel agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide.


30

Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi nhân trình tự phân đoạn S7 nhƣ sau:

Thành phần Thể tích

dd H2O 9,8 l

Đệm Taq DNA polymerase 10X 1,5 l

Taq DNA polymerase (5u/ µl) 0,5 l

dNTPs 2mM 1,5 l

Mồi xuôi 10 pmol 0,6 l

Mồi ngƣợc 10 pmol 0,6l

cDNA khuôn 0,5 l

Tổng thể tích 15 l

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau:

2.2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas

Bộ kit GenJETTM

Gel Extraction đƣợc thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA

từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn.

Bộ kít sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thƣớc từ 25 bp đến 20 kb, hiệu

suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ 100 bp đến 10 kb. Quy trình đƣợc

thực hiện ở nhiệt độ phòng nhƣ sau:

Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác bằng lƣỡi dao sạch từ gel agaros và

đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (binding buffer) đƣợc bổ sung vào với 1 thể

tích bằng khối lƣợng miếng gel (1 µl:1 mg) và ủ ở 0° trong 60°C trong khoảng 10

phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột

tinh sạch và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng đƣợc


31

gạn bỏ. 500 µ đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung vào cột và ly tâm 1 phút với vận

tốc 10.000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng đƣợc gạn bỏ. Lặp lại bƣớc này một lần

nữa. Cột tinh sạch có chứa DNA đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới và bổ

sung 100 µl Elution buffer vào chính giữa lớp màng silica của cột. Ly tâm 1 phút với

tốc độ 10.000 vòng phút để thu DNA. Mẫu DNA tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20° để sử

dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

2.2.5. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning

2.2.5.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T

Phân đoạn S7 đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq polymerase,

do đó sản phẩm tạo ra là các đoạn DNA có sẵn đầu A. Các đoạn DNA này dễ dàng

ghép nối vào vector pGEMT có đầu T nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase. Phản ứng

gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT đầu T đƣợc thực hiện theo quy trình kèm theo

của bộ kit, với các thành phần nhƣ sau:

Thành phần Thể tích (µl)

Đệm phản ứng 2X 10 µl

Sản phẩm PCR 3 µl

Vector đầu T pGEMT-T 1 µl

T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl

H2O cất khử ion vô trùng 5 µl

Tổng thể tích 20 µl

Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó đƣợc ủ trong bể ổn nhiệt 16°C qua đêm.

Plasmid pGEM-T có kích thƣớc khoảng 3kb có chứa trình tự mã hóa của

gen kháng chất kháng sinh ampicillin (Hình 9), nhờ đó các tế bào mang vector có

thể sinh trƣởng bình thƣờng ở môi trƣờng có chứa ampicillin với nồng độ ức chế

tối thiểu.


32

Hình 9: Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các enzyme cắt

giới hạn trên vector pGEM-T

Ngoài ra, vector này đƣợc thiết kế có gắn operon Lac chuyển hóa đƣờng lactose.

Tại vùng ranh giới giữa promoter của operon này và gen cấu trúc lacZ mã hóa cho

enzyme -galactosidase có vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (Hình 9).

Thiết kế này cho phép phân biệt đƣợc tế bào nào mang plasmid nguyên bản

(không gắn thêm sản phẩm PCR) và tế bào nào mang plasmid tái tổ hợp có gắn thêm

sản phẩm PCR. Đối với tế bào mang plasmid nguyên bản, gen lacZ hoạt động bình

thƣờng để tổng hợp enzyme -galactosidase nên khi bổ sung cơ chất X-gal và chất

cảm ứng IPTG vào môi trƣờng, enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm màu

xanh trong môi trƣờng có oxy. Đối với tế bào mang plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA lạ

xen vào giữa Lac-promoter và gen lacZ làm cho enzyme -galactosidase không đƣợc

tổng hợp nên khi có mặt X-gal và IPTG, quá trình chuyển hóa cơ chất không xảy ra và

không tạo ra sản phẩm màu xanh.

2.2.5.2. Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.coli chủng DH5α

Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) đƣợc làm tan

trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, 10 µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector

pGEM-T đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để tạo

điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển

sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó đƣợc chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút.

Tiếp theo, 450µl LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ 37°C


33

trong vòng 20 phút trƣớc khi đƣợc nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong thời gian 30

phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB đặc có bổ sung

ampicillin 100 µg/ml và ủ ở 37°C qua đêm.

2.2.6. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM

Plasmid

Miniprep

DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM

Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi lắc trong 5ml môi trƣờng LB lỏng có bổ

sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế

bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Tế bào

đƣợc hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme

RNase . Sau đó, 250 µl đệm P2 (lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào và đảo

nhẹ 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Tiếp theo,

hỗn hợp đƣợc trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4-6 lần.

Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc

13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh

sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp

màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. Tiếp theo, 500 µl đệm rửa (Wash buffer)

đƣợc bổ sung và ly tâm 30- 60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại

một lần nữa. Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

50 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và ủ ở

nhiệt độ phòng 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000

vòng/phút trong 1 phút.

Lƣợng plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.

2.2.7. Cắt enzyme giới hạn

Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính sẽ đƣợc nuôi cấy để tách

chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.


34

Enzym cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử là những

enzyme endonuclease có khả năng nhận biết vị trí đặc hiệu trên DNA và phân hủy

liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi tại đó mà không gây tổn hại đến

bazơ nucleotide. Trình tự nhận biết của enzyme giới hạn đƣợc cấu tạo từ 4 đến 6 đôi

bazơ và có cấu trúc đối xứng nghịch đảo. Enzym cắt giới hạn có thể cắt ngay chính

giữa trình tự nhận biết để tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng hoặc có thể cắt lệch tâm để

tạo ra hai đoạn DNA có kiểu đầu dính.

Phản ứng cắt giới hạn với EcoRI để kiểm tra sự có mặt của phân đoạn S7 trong

plasmid tái tổ hợp có thành phần nhƣ sau:

Thành phần Thể tích

pGEM-T/S7 3,0 µl

Đệm Fast Digest 10X 0,5 µl

Enzyme EcoRI (10u/µl) 0,5 µl

H2O khử ion vô trùng 1,0 µl

Tổng thể tích 5,0 µl

2.2.8. Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng

Nguyên tắc:Đoạn trình tự gen đặc hiệu sau khi đƣợc nhân dòng vào vector

pGEM-T sẽ đƣợc đọc trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3100. Cụ thể, phản ứng PCR

đƣợc tiến hành qua 2 bƣớc: bƣớc PCR thông thƣờng để khuếch đại đoạn trình tự cần

đọc và bƣớc PCR cho xác định trình tự. Trong đó, phản ứng PCR thông thƣờng sử

dụng khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T mang đoạn gene đặc hiệu với cặp mồi T7-

Fw/SP6-Rv của vector. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch, pha loãng ở nồng độ

thích hợp và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR xác định trình tự. Về cơ bản, phản

ứng PCR này có các thành phần giống nhƣ PCR thông thƣờng nhƣng có một số khác

biệt là sự có mặt của ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc).

Các ddNTP khác với các dNTP là thiếu một nhóm 3‟-OH nên khi đƣợc enzyme DNA

polymerase gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể hình thành liên

kết phosphodiester với nucleotide đƣợc đƣa vào kế tiếp và khiến cho quá trình kéo dài


35

chuỗi bị ngừng lại. Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới đƣợc đánh

dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ đƣợc tổng hợp và các sợi này có độ dài khác

biệt nhau một nucleotide. Các sợi đơn mới tổng hợp đƣợc phân tách trên gel điện di

acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đƣa ra

trình tự đoạn DNA gốc.Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống máy giải

trình tự ABI 3100. Kết quả đọc trình tự đƣợc so sánh với các đoạn gene tƣơng ứng đã

đƣợc đăng ký trong ngân hàng gen để biết đƣợc mức độ tƣơng đồng giữa chúng.

2.2.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7

Từ các trình tự thu đƣợc của các phân đoạn S7 của các mẫu bệnh thu đƣợc tại

Việt Nam, chúng tôi tiến hành tổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tƣơng đồng với

các trình tự tƣơng ứng của các chủng SRBSDV khác trên GeneBank. Từ đó, chúng tôi

xây dựng cây phân loại và phân tích các đặc điểm di truyền học cũng nhƣ mối quan hệ

của chủng virus thu đƣợc tại mẫu bệnh ở Việt Nam với các chủng gây bệnh lúa lùn sọc

đen trên thế giới (hiện nay bệnh mới chỉ đƣợc phát hiện tại Trung Quốc và Việt Nam).

Qua đó, mức độ tiến hóa của phân đoạn S7 của các chủng thu đƣợc và mức độ ảnh

hƣởng của protein mã hóa bởi phân đoạn này đến khả năng lây lan của bệnh đƣợc đánh

giá. Từ đó, chúng tôi có thể đƣa ra phƣơng án phòng bệnh hoặc dập dịch thích hợp.


36

CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thu thập và bảo quản mẫu

Các mẫu lúa bệnh đƣợc thu trực tiếp tại đồng ruộng, với những cây lúa có triệu

chứng điển hình: thân cây thấp, lá xanh đậm, xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có

những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các

đốt thân... (Bảng 2 và Hình 10). Trong đó, triệu chứng lớp u sáp trên thân hay sọc

phồng ở gân thân cây lúa (bên trong bẹ) là triệu chứng đặc trƣng duy nhất của bệnh

lùn sọc đen. Các mẫu sau khi thu thập sẽ đƣợc rửa sạch, loại bỏ phần héo úa, cắt nhỏ

và sử dụng ngay hoặc bảo quản khô trong các bình kín nhờ hạt hút ẩm silicagel.

Kết quả chúng tôi đã thu đƣợc 51 mẫu bệnh thuộc các tỉnh Ninh Bình, Sơn La, Hải

Phòng, Thái Bình, Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà

Tĩnh, Quảng Trị, Huế. Các mẫu đều đƣợc đánh số thứ tự theo từng tỉnh.

Bảng 2: Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa

STT Triệu chứng

1 Cây thấp lùn

2 Xoắn chót lá

3 Có nhiều vết nhăn ngang trên lá

4 Lá bị xoắn

5 Xoắn lá nõn

6 Sọc phồng ở gân phiến lá

7 Sọc phồng ở gân bẹ lá

8 Sọc phồng ở gân thân cây (bên trong bẹ) hay lớp u sáp trên thân

9 Bộ lá xanh đậm

10 Cây cứng

11 Trắng mép lá

12 Rách mép lá

13 Nhánh phụ

14 Đen hạt


37

ĐH (Đen hạt) GL (Gấp lá) L (lùn) NG (nhăn giữa lá) N (nghẹn lá) NP (Nhánh phụ)

NC (Nhăn chót lá) RN (rễ ngƣợc) RM (rách mép lá) SP (Sọc phiến) SB (Sọc bẹ) ST (Sọc thân)

PTH (Phồng tràng hạt) TM (trắng mép lá) VLX (Vàng lá xoắn) X (xoắn lá) XLN (Xoắn lá nõn) XC (Xoắn chót lá)

Hình 10. Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam


38

3.2. Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một

bƣớc

3.2.1. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phương pháp Sandwich- ELISA

Sử dụng phƣơng pháp Sandwich-ELISA với quy trình và kit (IgG và conjugate) do

Tiến sỹ Omura tại Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản cung cấp chúng tôi đã tiến

hành kiểm tra mẫu bệnh với lần lƣợt từng loại virus RRSV, RGSV, RTBV, RTSV, RGDV,

RRBV và RBSDV. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Kết quả bƣớc đầu cho thấy số lƣợng mẫu nhiễm RTSV là 11/51 mẫu, số lƣợng mẫu

nhiễm RGSV là 6/51 mẫu, nhiễm RGDV là 4/ 51 mẫu, nhiễm RRSV là 4/51 mẫu, lƣợng

mẫu nhiễm RTBV là 3/51 mẫu, nhiễm RRBV rất ít, chiếm 1/51 mẫu, 5/51 mẫu nhiễm

RBSDV, ngoài ra còn có 5/51 mẫu nghi nhiễm RBSDV với phản ứng dƣơng tính không rõ

ràng (Hình 11). Sau kiểm nghiệm chỉ có 12 mẫu không có bất kỳ phản ứng dƣơng tính nào

với kiểm nghiệm ELISA, các mẫu này sau đó đƣợc chúng tôi kiểm nghiệm tiếp bằng

phƣơng pháp RT-PCR một bƣớc cùng với các mẫu có phản ứng dƣơng tính không rõ ràng

để khẳng định sự có mặt của SRBSDV với cặp mồi đặc hiệu cho virus này.

Hình 11. Một số kết quả kiểm tra ELISA với các mẫu thu thập ở các tỉnh Việt Nam


39

3.2.2. Sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp RT-PCR 1 bước

Tất cả 17 mẫu sau khi đã đƣợc kiểm tra bằng kit ELISA không có phản ứng

dƣơng tính hoặc dƣơng tính không rõ ràng với bất kỳ kit phát hiện virus nào đã đƣợc

chúng tôi đi kiểm nghiệm bằng phƣơng pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu virus lùn

sọc đen phƣơng Nam là SRBSDVS10F3/R3 (725bp). Kết quả điện di kiểm tra cho thấy

phản ứng RT-PCR 1 bƣớc với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 có 12 mẫu có phản ứng

dƣơng tính với cặp mồi này (Hình 12A,B) . Sơ bộ chúng tôi cho rằng 12 mẫu bệnh này

có thể đƣợc sử dụng làm nguồn vật liệu phân lập hệ gen virus lùn sọc đen phƣơng nam

SRBSDV ở Việt Nam (Hình 12A&B).

Kết quả toàn bộ quy trình xét nghiệm đƣợc thể hiện trong bảng 3.

Hình 12. Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một bƣớc của các mẫu lúa

A, B. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một bước với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3

Giếng M: Marker; giếng 1: Mẫu Hải Phòng-3; giếng 2: Mẫu Huế-1; giếng 3: Mẫu Huế-2; giếng 4:

Mẫu Hòa Bình-2; giếng 5: Mẫu Nam Định-2; giếng 6: Mẫu Nam Định-1; giếng 8: Mẫu Nghệ An-1;

giếng 9: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 10: Mẫu Ninh Bình-3; giếng 11: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 12: Mẫu

Thái Bình-4; giếng 13: Mẫu Thái Bình-1; giếng 14: Mẫu Thái Bình-2

3.3. Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV

12 mẫu lúa bệnh thu đƣợc từ các vùng dịch, sau khi sàng lọc để chọn ra các mẫu

dƣơng tính với SRBSDV, đƣợc chúng tôi sử dụng để phân lập hệ gen của SRBSDV, sử

dụng phƣơng pháp tách bằng cột CF11.


40

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA sợi đôi tinh sạch trên gel agrose 1%

(chạy 100V trong 1 giờ) trong hình 13 cho thấy, hệ gen của các mẫu virus thu đƣợc

gồm 7 băng, trong đó băng thứ 3 (tính theo kích thƣớc giảm dần) bao gồm ba phân

đoạn S3, S4, S5 có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau ( lần lƣợt là 3618bp, 3571bp và

3167bp) và băng thứ 6 bao gồm hai phân đoạn S8 và S9 (1928bp và 1900bp) (Hình

13). So sánh với hình ảnh điện di hệ gen SRBSDV trên agarose của Zhou et al. (2008)

[23] có thể thấy chúng tôi đã phân lập thành công hệ gen của SRBSDV. Đây chính là

nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu RNA đƣợc bảo quản ở

-20oC để sử dụng cho các mục đích tiếp theo.

Hình 13: Hình ảnh điện di hệ gen của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu lúa

Giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Ninh Bình-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4: Mẫu Thái Bình-1;

giếng 5: Mẫu Thái Bình-2; giếng 6: Mẫu Nghệ An; giếng 7: Mẫu Nam Định; giếng 8: Mẫu Lào Cai; giếng 9:

Mẫu Quảng Trị-1; giếng 10: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 11: Mẫu Huế-1; giếng 12: Mẫu Huế-2


41

STT

Mẫu

Địa điểm

lấy mẫu

Kết

quả

ELISA

Kết quả RT-PCR

với cặp mồi

SRBSDVS10F3/R3

Kết luận

1 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV




5 Hải Phòng Nhiễm RGDV

6 Hải Phòng Nhiễm RGDV

7 Hải Phòng Nhiễm RBSDV Ghi chú

8 Hải Phòng (*) (-) Nhiễm RBSDV

9 Hòa Bình Nhiễm RGSV Dƣơng tính với kháng

nguyên RTSV 10 Hòa Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV

11 Hòa Bình Nhiễm RRSV Dƣơng tính với kháng

nguyên RGSV 12 Hòa Bình Nhiễm RRSV

13 Huế (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng

nguyên RGDV 14 Huế (+) Nhiễm SRBSDV

15 Huế Nhiễm RBSDV Dƣơng tính với kháng

nguyên RRSV 16 Huế Nhiễm RTSV

17 Lào Cai (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng

nguyên RBSDV 18 Lào Cai Nhiễm RTBV

19 Lào Cai Nhiễm RTBV Dƣơng tính với kháng

nguyên RTBV 20 Lào Cai Nhiễm RBSDV

21 Nam Định (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng

nguyên RRBV 22 Nam Định (*) (-) Nhiễm RBSDV

23 Nam Định Nhiễm RGSV (*) Dƣơng tính không rõ ràng

với kháng nguyên RBSDV 24 Nam Định Nhiễm RRBV

25 Nghệ An (+) Nhiễm SRBSDV Âm tính

26 Nghệ An Nhiễm RTSV

27 Nghệ An Nhiễm RTSV (+) Dƣơng tính với cặp mồi

tƣơng ứng 28 Nghệ An Nhiễm RBSDV

29 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV (-) Âm tính với cặp mồi tƣơng

ứng 30 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV

31 Ninh Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV

32 Ninh Bình Nhiễm RRSV

33 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV

34 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV

35 Quảng Trị Nhiễm RGSV

36 Quảng Trị Nhiễm RGSV

37 Sơn La (+) Nhiễm SRBSDV

38 Sơn La Nhiễm RGDV

39 Sơn La Nhiễm RTBV

40 Sơn La Nhiễm RGSV

41 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV

42 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV

43 Thái Bình Nhiễm RGDV

44 Thái Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV

45 Thanh Hóa Nhiễm RTSV

Bảng 3: Kết quả sàng lọc mẫu

bệnh bằng phương pháp

Sandwich-ELISA và RT-PCR

một bước




49 Vĩnh Phúc Nhiễm RBSDV

50 Vĩnh Phúc Nhiễm RGSV

51 Vĩnh Phúc Nhiễm RRSV


42

3.4. Phân lập phân đoạn S7 của SRBSDV từ các mẫu lúa bệnh

Sau khi thu đƣợc RNA hệ gen SRBSDV tinh sạch, chúng tôi điện di các mẫu

RNA sợi đôi trên gel agarose 1% để các băng RNA phân tách hoàn toàn. Chúng tôi cắt

chính xác băng RNA có kích thƣớc 2176 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc lí thuyết của

phân đoạn S7. Các phân mảnh này sau đó đƣợc chúng tôi tinh sạch bằng bộ kit

GenJETTM

Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình của nhà sản xuất để loại hoàn

toàn agarose. Sản phẩm RNA tinh sạch đƣợc chúng tôi tiếp tục điện di kiểm tra trên gel

agarose 1% .

Kết quả thu đƣợc cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc băng RNA có kích thƣớc

khoảng 2176 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc lí thuyết của phân đoạn S7 (Hình 14). Kết

quả này chứng tỏ chúng tôi đã phân lập thành công phân đoạn S7 của SRBSDV từ các

mẫu lúa dƣơng tính với bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam thu thập từ các vùng dịch.

Hình 14: Kết quả điện di phân đoạn S7 phân lập được của SRBSDV trên gel agarose 1%

Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; ; Giếng 1: Đối chứng âm; Giếng 2-13: Phân đoạn S7 của SRBSDV

của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam

Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2


43

3.5. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR

3.5.1. Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân bản phân

đoạn S7

Dựa trên các trình tự của phân đoạn S7 của SRBSDV đã công bố trên

Genebank, chúng tôi đã phân tích mức độ tƣơng đồng, so sánh và chọn lựa vùng bảo

thủ trong hệ gen của virus này, từ đó thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phép nhân bản

phân đoạn S7 (bao gồm cả khung đọc mở và vùng không dịch mã). Các cặp oligo

nucleotide có kích thƣớc 25 nucleotit, nằm trên vùng bảo thủ của phân đoạn S7, có

hàm lƣợng GC cao đƣợc chúng tôi đặt sinh tổng hợp tại công ty Sigma. Trình tự của

các cặp oligo nucleotide đƣợc trình bày trong bảng 4.

Bảng 4: Trình tự các mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế phục vụ cho phản ứng RT-PCR

Tên mồi Trình tự

S7-Fw 5‟-AAGTTTTTTTCGACCTGTCTGGACC-3‟

S7-Rv 5‟-GTCAAGGTCGAAATGCAGCTGATGTC-3‟

3.5.2. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phương pháp RT-PCR

Sử dụng các cặp oligo nucleotide đã thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7, chúng

tôi đã tiến hành sinh tổng hợp cDNA sợi 1 từ RNA hệ gen của 12 mẫu virus LSĐPN

thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam bằng bộ kit Revert Aid First strand cDNA

Synthesis của hãng Fermentas. Phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc chúng tôi thực hiện

theo quy trình hƣớng dẫn kèm theo của bộ kit nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.4.2.

Do sản phẩm của phản ứng tổng hợp cDNA có nồng độ rất thấp, nên không thể

kiểm tra kết quả bằng phƣơng pháp điện di sản phẩm trên gel agarose đƣợc. Chính vì

vậy chúng tôi đã sử dụng trực tiếp sản phẩm này làm khuôn cho phản ứng nhân bản

phân đoạn S7 bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế (Bảng 3). Phản ứng

PCR đƣợc thực hiện với các thành phần và chu trình nhiệt nhƣ đã trình bày ở mục

2.2.4.3.


44

Sản phẩm PCR sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả cho

thấy với phản ứng PCR sử dụng 1µl sản phẩm phản ứng tổng hợp cDNA làm khuôn,

chúng tôi đã thu đƣợc một băng DNA đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình 15).

Kích thƣớc này hoàn toàn tƣơng tự với kích thƣớc tính toán lí thuyết đã công bố trên

Ngân hàng Gen Thế giới của phân đoạn S7. Ngƣợc lại, đối với phản ứng đối chứng âm

sử dụng H2O làm khuôn thay cho DNA, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA có kích

thƣớc 2,1 kb này.

Hình 15: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn S7 của 12 chủng vius với

cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7

Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1: Đối chứng dương; giếng 2-13: Sản phẩm PCR phân đoạn

S7 của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam

Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng 14: đối chứng âm (không có khuôn

DNA)

Kết quả thu đƣợc chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công phân đoạn S7 của

12 mẫu virus SRBSDV tách chiết từ các mẫu lúa nhiễm bệnh thu đƣợc tại miền Bắc và

miền Trung Việt Nam bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế dựa

trên trình tự đã công bố của phân đoạn S7. Sản phẩm nhân bản này sẽ đƣợc chúng tôi

sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR phân đoạn S7 của virus SRBSDV.

Sản phẩm PCR nhân bản phân đoạn S7 sau khi điện di trên gel agarose 1% đƣợc

chúng tôi nhuộm bằng Ethidium bromide và kiểm tra sự có mặt của băng DNA kích

thƣớc 2,1 kb dƣới tia UV. Băng DNA này đƣợc chúng tôi cắt chính xác khỏi bản gel

agarose và tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM

Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình


45

của nhà sản xuất (mục 2.2.4.4) nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dƣ thừa của phản

ứng PCR. Sản phẩm DNA tinh sạch tiếp tục đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%,

kết quả thu đƣợc cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm DNA hoàn toàn tinh sạch,

có kích thƣớc đúng với kích thƣớc tính toán lí thuyết của phân đoạn S7 (Hình 16).

Sản phẩm PCR tinh sạch nhân bản phân đoạn S7 đƣợc bảo quản ở -20oC để sử

dụng cho thí nghiệm nhân dòng tiếp theo.

Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM

Gel

Extraction trên gel agarose 1%

Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: Sản phẩm DNA tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh

Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1,

Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; Giếng 13: Đối chứng âm

3.7. Nhân dòng phân đoạn S7 vào vector PGEM-T

3.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp PGEM-T/S7 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α.

Phân đoạn S7 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq DNA

polymerase, ngoài hoạt tính tổng hợp ADN còn có hoạt tính terminal transferase do đó

có thể gắn thêm một Adenosine 5‟ monophosphate vào đầu 3‟ của sản phẩm PCR. Chính

vì vậy chúng tôi đã tiến hành gắn sản phẩm PCR nhân bản phân đoạn S7 bằng enzyme

Taq ADN polymerase vào vector pGEM-T mang Thymidine 5‟ monophosphate đầu 3‟.

Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector pGEM-T gắn với phân đoạn S7.

Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector đầu T pGEM-T đƣợc thực hiện theo

quy trình kèm theo của bộ kit pGEM®-T Easy Cloning (mục 2.2.5.1) với nguyên tắc


46

đƣợc mô tả nhƣ hình 17. Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó đƣợc chúng tôi biến nạp vào tế

bào khả biến E. coli chủng DH5α. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn đầu T vào tế bào E.

coli cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc nhiều khuẩn lạc (có khả năng mang vector tái tổ

hợp) trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung ampiciline 100 µg/ml, cơ chất X-gal và

IPTG là chất cảm ứng (Hình 18).

Hinh 17: Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T

(A) (B)

Hình 18: Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng DH5α

A. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli và cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ

sung ampicillin 100 µg/ml (mẫu Ninh Bình-1).

B. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi S7-Fw/S7-Rv.

Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1: đối chứng dương ( khuôn là cDNA ); giếng 2-13: khuôn là

các khuẩn lạc trắng của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái

Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng 14: đối chứng

âm (không có DNA khuôn).

Để kiểm tra các khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp chứa phân đoạn S7 hay

không, chúng tôi chọn ngẫu nhiên mỗi mẫu một khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy để

tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu S7-Fw/S7-Rv. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên

gel agarose 1% của các mẫu cho thấy có tất cả 9 phản ứng PCR sử dụng khuôn là

khuẩn lạc trắng đã cho sản phẩm là một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình


47

18B, giếng 2-10), tƣơng tự nhƣ kích thƣớc băng DNA trên đƣờng chạy điện di sản

phẩm của phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng sản phẩm của phản ứng tổng hợp cDNA

làm khuôn (Hình 18B, giếng 1). Ngƣợc lại, với sản phẩm của phản ứng đối chứng âm

không sử dụng DNA khuôn (Hình 18B, giếng 11), chúng tôi không thu đƣợc băng

DNA nào. Kết quả này cho phép chúng tôi bƣớc đầu kết luận đã thu nhận đƣợc các

khuẩn lạc dƣơng tính mang plasmid tái tổ hợp có chứa phân đoạn S7 (pGEM-T/S7).

3.7.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tai tô hơp

Để tiếp tục khẳng định sự có mặt của phân đoạn S7 trong vector pGEM-T,

chúng tôichọn 1 khuẩn lạc dƣơng tính để tinh sạch plasmid và kiểm tra plasmid này

bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới hạn.

3.7.2.1. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S 7 trong plasmid tai tô hơp b ằng phản ứng

PCR.

Khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi cấy và tách chiết plasmid theo quy trình của bộ

kit GenJETTM

Plasmid Miniprep (mục 2.2.6). Plasmid tinh sạch sau khi đƣợc điện di

kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc plasmid hoàn

toàn tinh sạch, không bị lẫn RNA (Hình 19).

Hình 19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh sạch trên gel agarose 1%

Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-11: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch từ các khuẩn lạc tương

ứng với các mẫu; giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Huế-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4:

Mẫu Lào Cai; giếng 5: Mẫu Thái Bình-1; giếng 6: Mẫu Thái Bình-2; giếng 7: Mẫu Hòa Bình; giếng

8:Mẫu Nghệ An; giếng 9: Mẫu Nam Đinh; giếng 10: Mẫu Quảng Trị-1; giếng 11: Mẫu Quảng Trị-2;

giếng 12: Mẫu Huế-1


48

Sản phẩm plasmid tinh sạch đƣợc chúng tôi sử dụng làm khuôn cho phản ứng

PCR với hai cặp mồi khác nhau: cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7 (S7-Fw/S7-Rv) và

cặp mồi đặc hiệu của vector (T7-Fw/SP6-Rv). Trong đó, cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv là hai

trình tự nằm trên vector pGEM-T, có khoảng cách 126 bp (Hình 16). Theo tính toán lý

thuyết, sản phẩm PCR từ khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T/S7 sẽ có kích thƣớc

tƣơng ứng 2302 bp với cặp mồi vector và 2176 bp với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn

S7.

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (Hình 20) cho thấy sản

phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7-Fw/S7-Rv cho một băng DNA có

kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình 20, giếng 1-12). Đối với sản phẩm PCR sử dụng cặp

mồi vector T7-Fw/ SP6-Rv (Hình 21), chúng tôi thu đƣợc một băng DNA có kích

thƣớc khoảng 2,3 kb (Hình 21, giếng 1-12), kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc

đoạn DNA theo tính toán lý thuyết, bao gồm 2176 bp của phân đoạn S7 và 126 bp của

plasmid. Đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, chúng tôi

không thu đƣợc băng DNA nào (Hình 20 và 21, giếng (-)). Kết quả này cho phép chúng

tôi khẳng định plasmid tinh sạch thu đƣợc là plasmid tái tổ hợp mang trình tự phân

đoạn S7 đƣợc phân lập từ RNA genome của virus lùn sọc đen Phƣơng Nam.

Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch Sử dụng cặp mồi S7-Fw/S7-Rv

Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch của lần lượt các

mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng

Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng (+): đối chứng dương; giếng (-): đối chứng âm


49

Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch sử dụng cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv

Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch của lần lượt các

mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng

Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng (+): đối chứng dương; giếng (-): đối chứng âm

3.7.2.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tai tô hơp b ằng cách xử lí với

enzyme cắt giới hạn EcoRI

Để khẳng định chắc chắn đoạn DNA đã đƣợc chèn vào vector pGEM-T là phân

đoạn S7, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp đã đƣợc tinh

sạch từ khuẩn lạc dƣơng tính (Mục 2.2.6).Theo lý thuyết, trên vector pGEM-T/S7 có

hai vị trí cắt giới hạn của EcoRI nằm trong vùng đa điểm cắt, phân đoạn S7đƣợc chèn

vào giữa hai vị trí này, trong khi phân tích bản đồ enzyme giới hạn của phân đoạn S7

không có điểm nhận biết của enzyme này. Nhƣ vậy, khi đƣợc xử lí bằng EcoRI, vector

tái tổ hợp pGEM-T/S7 sẽ bị cắt thành 2 đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng

3 kb và 2,1kb.

Sản phẩm phản ứng cắt giới hạn đƣợc chúng tôi điện di kiểm tra trên gel agarose

1%. Kết quả thu đƣợc cho thấy sản phẩm cắt vector tái tổ hợp mang phân đoạn S7 có 2

băng DNA, trong đó băng DNA 3 kb là bộ khung nguyên bản của vector, và đoạn

DNA kích thƣớc 2,1 kb là kích thƣớc tƣơng ứng của phân đoạn S7 (Hình 22).


50

Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pGEM-T/S7 bằng enzyme EcoRI

Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb; giếng 1: plasmid pGEM-T/S7 (đối chứng âm); giếng 2-13:

sản phẩm cắt giới hạn pGEM-T/S7 bằng EcoRI của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-

2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng

Trị-2, Huế-1, Huế-2.

Kết quả thu đƣợc ở trên cho phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn việc nhân

dòng thành công phân đoạn S7 phân lập đƣợc từ RNA hệ gen SRBSDV.

3.8. Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV

Hình 23: Một phần kết quả giải trình tự phân đoạn S7 của virus SRBSDV (mẫu Nghệ An)

A. Kết quả đọc trình tự sử dụng mồi S7-Fw; B. Kết quả đọc trình tự sử dụng mồi S7-Rv.

Để khẳng định chính xác đoạn gen đƣợc nhân bản và nhân dòng vào vector

pGEM-T có đúng là trình tự phân đoạn S7 của virus lùn sọc đen Phƣơng Nam hay

không, chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong vector tái tổ hợp pGEM-


51

T/S7 theo phƣơng pháp của Sanger và cộng sự và đọc bằng hệ thống máy giải trình tự

ABI 3100 (Mục 2.2.8)

A

B

Hình 24: Trình tự amino acid suy diễn của 2 khung đọc mở nằm trên phân đoạn S7 (mẫu Nghệ An)

A: Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của ORF 1 trên phân đoạn S7.

B: Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của ORF 2 trên phân đoạn S7.

Trong thành phần phản ứng, mỗi loại ddNMP đƣợc đánh dấu bằng một loại chất

phát huỳnh quang khác nhau. Đầu đọc laser trong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến


52

chúng hấp thụ và phát ra các màu. Nhƣ vậy, mỗi màu ứng với một nucleotide và đƣợc

biểu thị bằng một đỉnh (Hình 23).

Kết quả giải trình tự phân đoạn S7 virus SRBSDV có chiều dài 2176 bp. Trình

tự phân đoạn S7 đƣợc phân tích bằng phần mềm Genetyx 6.0 cho thấy phân đoạn S7

chứa 2 khung đọc mở (ORF) có độ dài 1071 và 927 bp, mã hóa cho 2 chuỗi amino acid

nhƣ hình 24.

3.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV

3.9.1. So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu

SRBSDV trên thế giới

Các mẫu plasmid tái tổ hợp sau khi tinh sạch đƣợc gửi tới hãng Macrogene cho

việc giải trình tự. Kết quả giải trình tự cho thấy cả 12 plasmid tái tổ hợp đều mang

phân đoạn S7 của SRBSDV thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam.

Sử dụng công cụ tìm kiếm trực tuyến BLAST trên NCBI cho thấy tất cả các

mẫu S7 Việt Nam đều trùng khớp với các mẫu S7 tƣơng ứng sẵn có trên GenBank

(Hình 25,26). Mƣời hai mẫu S7 Việt Nam và 8 mẫu S7 sẵn có của Trung Quốc đƣợc

căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm MEGA5. Kết quả phân tích cho thấy, trình tự

nucleotide phân đoạn S7 của các mẫu virus Việt Nam có mức đông nhât r ất cao so với

nhau và so với các mẫu củaTrung Quốc, đạt từ 99-100% (Bảng 5).

Trình tự nucleotide phân đoạn S7 giữa các chủng virus có độ tƣơng đồng cao

phản ánh đúng thực tế virus SRBSDV mới xuất hiện ở Việt Nam trong thời gian chƣa

lâu, từ năm 2009 nên chƣa có khả năng phân ly hình thành chủng mới. Kết quả này

cũng phù hợp với nghiên cứu trƣớc đây về phân đoạn S10 của SRBSDV [12]. Tuy

nhiên, mức độ tƣơng đồng phân đoạn S7 cao hơn phân đoạn S10 chứng tỏ phân đoạn

này có vai trò quan trọng trong tiến hóa của vius SRBSDV. Vì vậy, sự thay đổi trình tự

nucleotide của phân đoạn S7 chỉ xảy ra mạnh khi có áp lực tiến hóa cao và một khoảng

thời gian nhất định.


53

Hình 25 : Một phần kết quả so sánh trình tự nucleotide phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV thu

đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới

Hình 26 : Một phần kết quả so sánh trình tự amino acid phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV thu

đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới


54

Bảng 5: So sánh mức đồng nhất trình tự phân đoạn S7 phân lập của các mẫu Việt Nam và Trung Quốc

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1 ID 0.95 0.95 0.95 0.95 0.94 0.95 0.97 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.95 0.95 0.95 0.95 0.94 0.94 0.94

2 0.95 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 1.00 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99

3 0.95 1.00 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99

4 0.95 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99

5 0.95 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99

6 0.94 0.99 1.00 1.00 1.00 ID 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99

7 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99

8 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 ID 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.98 0.98 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97

9 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 ID 1.00 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99

10 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 1.00 ID 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99

11 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 ID 0.99 0.99 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99

12 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 1.00 1.00 0.99 ID 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99

13 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99

14 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.98 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99

15 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.98 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99

16 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 ID 1.00 0.99 0.99 0.99

17 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.97 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 1.00 ID 0.99 0.99 0.99

18 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.99 0.99

19 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.99

20 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID

1 (Huế-2), 2 (SRBSDV-HM998850), 3 (Lào Cai), 4 (Ninh Bình-1), 5 (Sơn La-1), 6 (Nghệ An), 7 (SRBSDV-HM585273),

8 (Thái Bình-2), 9 (SRBSDV-JQ692578), 10 (Nam Định), 11 (Ninh Bình-2), 12 (SRBSDV-JN388912), 13 (Huế-1), 14

(SRBSDV-EU784841), 15 (SRBSDV-FN563995), 16 (SRBSDV-HQ731498), 17 (SRBSDV-JQ034354), 18 (Quảng Trị-

1), 19 (Quảng Trị-2), 20 (Thái Bình-1)


55

3.9.2. Phân tích đặc điểm di truyền

Vì hiện nay, virus SRBSDV mới chỉ phát hiện tại Việt Nam và Trung Quốc nên chúng tôi

đã phân tích mối quan hệ của các mẫu virus Việt Nam với các mẫu virus Trung Quốc. Hai

cây pha hê đa đƣơc xây dƣng dƣa trên toàn b ộ trình tự phân đoạn S7 và gen mã hóa protein

P7-1 của 12 mẫu virus Việt Nam trong nghiên cứu này và 8 mẫu virus Trung Quốc săn co

trên GenBank (Hình 27).

NinhBinh-2

SRBSDV-JN388912

NamDinh

SRBSDV-JQ692578

ThaiBinh-2

SRBSDV-FN563995

SRBSDV-EU784841

Hue-1

SRBSDV-HQ731498

SRBSDV-JQ034354

SonLa-1

NinhBinh-1

LaoCai

NgheAn

SRBSDV-HM998850

Hue-2

SRBSDV-HM585273

ThaiBinh-1

QuangTri-1

QuangTri-2

100

9599

50

64

50

2

NinhBinh-2

SRBSDV-JN388912

NamDinh

SRBSDV-JQ692578

ThaiBinh-2

SRBSDV-HQ731498

SRBSDV-FN563995

SRBSDV-EU784841

Hue-1

SRBSDV-JQ034354

SonLa-1

NinhBinh-1

LaoCai

NgheAn

SRBSDV-HM998850

Hue-2

SRBSDV-HM585273

ThaiBinh-1

QuangTri-1

QuangTri-2

71

95

7697

66

71

1

(A) (B)

Hình 27: Hai cây phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự S7 (A) và trình tự gen P7-1 (B) cho thây

môi quan hê cua các mâu virus phân lâp tư Viêt Nam va Trung Qu ốc. Cây được xây dựng

bằng phương pháp MP (maximum parsimony) dung phần mềm MEGA 5. Các số trên mỗi nốt

là giá trị boostrap tính theo % (1000 lần lặp) và chi trình bày các giá trị > 50%. Mẫu Việt

Nam được chi rõ bằng chấm đen. Thanh bar là số thay thế nucleotide.


56

Phân tich pha hê cho thây khó đánh giá m ối quan hệ phả hệ của chúng do mức độ đồng

nhất trình tự khá cao nhƣ trình bày ở trên. Tuy nhiên, có thể nhận thấy:

(i) Quan hệ của các mẫu virus dựa trên toàn bộ phân đoạn S7 tƣơng tự nhƣ dựa trên gen

P7-1.

(ii) Trên cả 2 cây, có 7 mẫu Việt Nam hinh thanh 2 cụm rõ rệt vơi gia tri thông kê

boostrap rât cao (95 - 100 %). Cụm 1 gồm 2 mẫu Quảng Trị (Quảng Trị -, Quảng Trị -2) và 1

mẫu thu tại Thái Bình (Thái Bình-2). Cụm 2 gồm 4 mẫu thu tại miền Tây Bắc kể cả Nghệ An

(Sơn La-1, Lào Cai, Ninh Bình -1 và Nghệ An).

(iii) Các mẫu còn lại không hình thành các cụm phân biệt mà xuất hiện rải rác thành các

nhánh với giá trị thống kê boostrap thấp (<75%).

Nhìn chung, sự xuất hiện xen kẽ của các mẫu Việt Nam và Trung Quốc trên toàn cây và

sự xuất hiện của các mẫu virus thuộc các tỉnh cách xa nhau trong 2 cụm phân biệt ở trên cho

thấy chúng là một quần thể virus duy nhất, phản ánh sự xuất hiện bệnh trong cùng khu vực

địa lý, thƣờng tại cùng thời điểm, do sự di cƣ của vector rầy lƣng trắng từ miền Bắc và miền

Trung Việt Nam sang Trung Quốc và ngƣợc lại.

(iv) Xét độ dài cành và mức độ đa dạng có thể thấy quần thể virus Viêt Nam đang tiến hóa

khá nhanh. Quan sát này là quan trọng đặc biệt khi xét quan hệ của virus trên cây P7-1. Một

chức năng quan trọng của protein P7-1 của virus LSĐPN mới đƣợc xác định gần đây. P7-1

chịu trách nhiệm tạo thành các cấu trúc ống (tubular) cho phép virus di chuyển qua tế bào

biểu mô ruột [28], chứng tỏ protein này có vai trò rất quan trong trong lan truyền của virus

qua vector. Có lẽ mức độ sử dụng thuốc trừ rầy cao ở Việt Nam đã đóng vai trò quan trọng

trong tiến hóa của rầy xét về khả năng lan truyền virus dẫn tới mức độ biến động của trình tự

gen mã hóa protein P7-1.


57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Từ các kết quả thu đƣợc trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận

sau:

1. Đã nhân bản thành công phân đoạn S7 của 12 mẫu virus LSĐPN thu tại miền Bắc

và miền Trung Việt Nam có chiều dài khoảng 2,2 kb và nhân dòng thành công phân

đoạn S7 của 12 mẫu virus LSĐPN vào vector pGEM-T..

2. Đã giải đƣợc trình tự đầy đủ phân đoạn S7 của 12 mẫu virus LSĐPN thu tại miền

Bắc và miền Trung Việt Nam có kích thƣớc 2176 bp chứa 2 khung đọc mở mã hóa

cho 2 chuỗi polypeptide có kích thƣớc 357 và 310 amino acid.

3. Kết quả so sánh trình tự phân đoạn S7 của 12 mẫu virus LSĐPN thu tại miền Bắc

và miền Trung Việt Nam với trình tự S7 các chủng virus thuộc họ Reoviridae cho

thấy 12 chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen thu đƣợc tại Việt Nam là virus

SRBSDV, thuộc họ Reoviridae, chi Fijivirus và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Phân

đoạn S7 của các mẫu virus Việt Nam có mức độ đồng nhất trình tự nucleotide từ

99-100% so với nhau và với mẫu virus của Trung Quốc.

4. Dựa trên phân đoạn S7, mặc dù các mẫu virus Việt Nam và Trung Quốc phân thành

ít nhất 3 nhóm phân biệt, song sự xuất hiện xen kẽ của các mẫu giữa Việt Nam và

Trung Quốc cho thấy chúng là một quần thể virus duy nhất trong cùng một khu vực

địa lý.

Kiến nghị

Cần tiến hành những nghiên cứu ở mức độ protein, đặc biệt là hai protein do hai

gen nằm trên phân đoạn S7 mã hóa để tìm hiểu chức năng của phân đoạn này đối với sự tiến

hóa và diễn biến phát sinh gây hại của vius.

Mặc dù mới xuất hiện song SRBSDV có xu hƣớng tiến hóa nhanh, do đó cần

thƣờng xuyên nghiên cứu ở mức độ phân tử để nhanh chóng phát hiện diễn biến phát sinh

chủng mới, từ đó có biện pháp kịp thời nhằm ngăn chặn sự bùng phát của dịch bệnh nếu

chúng xảy ra trong tƣơng lai.


58

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Báo Nông nghiệp Việt Nam (7/9/2009). Chuyện khẩn cấp ở Nghệ An: Trên 5.500 ha lúa

HT bị VL – LXL. Tác giả Sao Mai.

2. Báo Nông nghiệp Việt Nam (14/9/2009). Nghệ An: Ra quân tiêu diệt nguồn bệnh dịch

“lùn lụi” lúa. Tác giả Nguyễn Đình Hƣơng.

3. Báo Nông nghiệp Việt Nam (24/9/2009). “Bắt bệnh” lúa lùn: Chƣa ngã ngũ nguyên nhân .

Tác giả Lê Bền.

4. Báo Nông nghiệp Việt Nam (24/9/2009). “Bắt bệnh” lúa lùn: Chƣa ngã ngũ nguyên nhân .

Tác giả Lê Bền.

5. Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, ”Báo cáo đề tài

Nghiên cứu xây dựng qui trình chẩn đoán virus gây bệnh lúa lùn sọc đen ở Việt Nam bằng

kỹ thuật sinh học phân tử”, Bộ NN&PTNT, 2013.

6. Cục Bảo vệ Thực vật, ”Quy trình chẩn đoán bệnh virus lùn sọc đen Phƣơng Nam hại lúa”.

Quyết định sô 73/QĐ-BVTV.

7. Đinh Văn thành, Nguyễn Thị Dƣơng, Lại Tiến Dũng, Phan Thị Bích Thu (2008). Một số

kết quả nghiên cứu về sinh thái rầy lƣng trắng ở Phía bắc Việt Nam. Hội nghị côn trùng

toàn quốc Việt Nam lần thứ 6, Hà Nội, 9-10/5/2008, 281-287.

8. GS.TS. Nguyễn Thơ (2007). “Một số suy nghĩ về phòng trừ bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá

trên lúa”, Hội thảo khoa học phòng trừ rầy nâu, bệnh vàng lùn – lùn xoắn lá, Sở

NN&PTNT Vĩnh Long.

9. Hà Viết Cƣờng, Nhuyễn Viết Hải, Vũ Triệu Mân (2009). Xác định nguyên nhân lúa lùn

sọc đen (lùn lụi) trên lúa mùa năm 2009 tại miền Bắc. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật, 6: 24-31.

10. Ngô Vĩnh Viễn, Phạm Thị Vƣợng, Nguyễn Nhƣ Cƣờng, Tạ Hoàng Anh, Nguyễn Thị Me,

Phan Bích Thu, Phạm Hồng Hiển, Hà Viết Cƣờng và nnk (2009), Kết quả chẩn đoán

bệnh virus lúa lùn sọc đen ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật,

6: 8-18.


59

11. Nguyễn Văn Hiệp (2011). Khóa luận tốt nghiệp, “Phân lập phân đoạn S10 của Virus gây

bệnh lùn sọc đen trên một số vùng sinh thái trồng lúa ở miền Bắc Việt Nam”. Đại học

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

12. Nguyễn Hoàng Quang, Đỗ Thị Hạnh, Phạm Thị Vân, Trần Thị Nhƣ Hoa, Hà Viết Cƣờng,

Phạm Xuân Hội (2013). Phân tích trình tự phân đoạn S10 của các chủng virus gây bệnh

lúa lùn sọc đen phƣơng nam ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Nông nghiệp Việt Nam,

2(41): 26-32

13. Tạ Hoàng Anh, Ngô Vĩnh Viễn, Nguyễn Tuấn Anh, Trần Thị Thu Huyền, Nguyễn Văn

Chung, Nguyễn Doãn Phƣơng, 2009. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật one-step RT-PCR

chẩn đoán nhanh virusgây bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá hại lúa. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật

2009.

14. Viện Bảo Vệ Thực Vật (2013), “Báo cáo Tình hình bệnh Vàng lá di động (VLDĐ) trên

lúa vụ mùa năm 2013 tại Bắc Giang“.

15. Vũ Triệu Mân (2010), “Bệnh virus hại thực vật ở Việt Nam“, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

16. Bong-Choon Lee, Yeon-Kyu Hong, Sung-Jun Hong, Sung-Tae Park, Key-Woon Lee

(2005). “Occurrence and Detection of Rice black-streaked dwarf virus in Korea”. Plant

Pathol. J. 21(2) : 172-173 (2005).

17. Cuong H. V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J. L. (2006).Corchorus

yellow vein virus, a New World geminivirus from the Old World. J .Gener. Virol., 87:

997-1003.

18. Cuong H. V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J. L.(2008). “Molecular

characterization of begomovirus ADN DNA satellites from Vietnam: additional evidence

that the New World geminivirus were present in the Old World prior to continental

separation”. J. Gener. Virol., 89: 312-326.

19. Cuong H. V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J. L.(2008). Identification

ADN sequence analysis of potyvirus infecting crops in Vietnam. Arch. virol., 153:45-60


60

20. Đinh Văn Thanh , Lại Tiến Dũng , Nguyên Thi Dƣơng , Phan Thi Bich Thu , Nguyên Nhƣ

Cƣơng. (2008). Management of rice plant hoppers in Vietnam. Proceedings of the JSPS.

International seminar. Kyushu University, Fukuoka, Japan. 22-24 November: 86-94.

21. Dodds J. A., Morris T. J., Jordan R. L.(1984). Plant viral double-stranded RNA. Annu

Rev Phytopathol, 22: 151―168

22. GuoHui Z., Jung W. J., Jiang C. D., Peng L., Lin X. D., Guang Z. S.(2008). Souhthern

rice black–streaked dwarf virus: A new proposed Fijivirus species in the family

Reoviridae. Chin. Sci. Bullet., 53: 3677-3685.

23. Hibino H, Cabauatan PQ.(1985). Rice grassy stunt virus strain causing tungro–like

symptoms in the Philippines. Plant Dis., 69:538–41

24. Hibino H. (1986). Rice grassy stunt virus. CMI/AAB Descr. Plan. Virus. No. 320

25. Hibino H.(1979). Rice ragged stunt, a new virus disease occurring in tropical Asia.Rev.

Plant Prot. Res., 12:98–110.

26. Hibino H.(1989). Insect-borne virus of rice. In Advances in Disease Vector Research, ed.

KF Harris, 6:209–41. New York.

27. Isogai M, Uyeda I, Lee BC (1998). “Detection and assignment of proteins encoded by

rice black streaked dwarf fijivirus S7, S8, S9 and S10”. J Gen Virol 79:1487–1494.

28. Liu, Y., Jia, D., Chen, H., Chen, Q., Xie, L., Wu, Z. & Wei, T. (2011) The P7-1 protein of

southern rice black-streaked dwarf virus, a fijivirus, induces the formation of tubular

structures in insect cells. Archives of Virology, 56 (10): 1729-1736.

29. LI You-zhi, CAO Yang, ZHOU Qian, GUO Hai-ming , OU Gao-cai. “The Efficiency of

Southern rice black-streaked dwarf virus Transmission by the Vector Sogatella furcifera

to Different Host Plant Species”. Journal of Integrative Agriculture , 2012, Vol. 11. Issue

(4): 621-627

30. Milne R. G., de Vas M, Harding R. M., et al. Genus Fijivirus. In: Fauquet C M, Mayo M

A, Maniloff J, et al, eds. Virus Taxomony: Classification and nomenclature of viruses.

Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses. San Diego:

Elsevier Academic Press, 2005. 534―542

http://211.155.251.135:81/Jwk_zgnykxen

http://211.155.251.135:81/Jwk_zgnykxen/EN/article/showTenYearVolumnDetail.do?nian=2012

http://211.155.251.135:81/Jwk_zgnykxen/EN/article/showTenYearVolumnDetail.do?nian=2012

http://211.155.251.135:81/Jwk_zgnykxen/EN/volumn/volumn_1144.shtml




61

31. Morgan, David "Protein Degradation in Cell-Cycle Control", The Cell Cycle; Principles

of Control 2007.

32. Qian Wang, Tao Tao, Chenggui Han (2013). “Nonstructural protein P7-2 encoded

by Rice black-streaked dwarf virus interacts with SKP1, a core subunit of SCF ubiquitin

ligase”, Virology Journal. 2013; 10:325.

33. Xiao Yin, Fei-fei Xu, Fang-qiang Zheng, Xiang-dong Li, Bao-shen Liu, Chun-qing

Zhang (2011), “Molecular Characterization of Segments S7 to S10 of a Southern Rice

Black-streaked Dwarf Virus Isolate from Maize in Northern China”. Virologica Sinica,

February 2011, 26 (1):47-53

34. Ying Liu, Dongsheng Jia, Hongyan Chen, Qian Chen, Lianhui Xie, Zujian Wu (2011).

“The P7-1 protein of southern rice black-streaked dwarf virus, a fijivirus, induces the

formationof tubular structures in insect cells”. Arch Virol (2011) 156:1729–1736.

35. Taiyun WeiWang Z., Fang S., Xu J., et al (2003). “Sequence analysis of the complete

genome of rice black-streaked dwarf virus isolated from maize with rough dwarf

disease”. Virus Gens, 27: 163―168

36. Wang Q, Yang J, Zhou G H, et al. 2010. “The complete genome sequence of two isolates

of southern rice black-streaked dwarf virus, a new member of the genus Fijivirus.J

Phytopathol”, 158: 733-737

37. Wang Z., Fang S., Xu J., et al (2003). “Sequence analysis of the complete genome of rice

black-streaked dwarf virus isolated from maize with rough dwarf disease”. Virus Gens,

27: 163―168

38. Zhang H. M. , Yang J., Chen J. P., Adams M. J. (2008). A black-streaked dwarf disease

on rice in China is caused by a novel fijivirus. Arch. Virol., 153:1893–1898.

39. Zhou G H, Wen J J, Cai D J, et al. 2008. Southern rice black-streaked dwarf virus: A new

proposed Fijivirus species in the family Reoviridae. Chin Sci Bull, 53: 3677-3685.

40. Zhou T., Du L. L., Fan Y. J., Zhou Y. J. (2012), "Reverse transcription loop-mediated

isothermal amplification of RNA for sensitive and rapid detection of southern rice black-

streaked dwarf virus", J. Virol. Methods, 180, pp. 91–95.


62

TRANG WEB

41. http://www.expasy.org/all_by_protein/260.html

42. Hồ Xuân Thiện (2006), Các virus hại lúa, nguồn:

http://hx.thienbac.net/index.php/giaoduc-khoahoc/47-cac-virus-hai-lua

http://www.expasy.org/all_by_protein/260.html

http://hx.thienbac.net/index.php/giaoduc-khoahoc/47-cac-virus-hai-lua


63

PHỤ LỤC 1

Các virus hại lúa đƣợc công bố hiện nay [24,26]

STT Virus Bộ Giống Vector Ký chủ tự

nhiên Phân bố

1

Rice black-

streaked

dwarf virus

(RBSDV)

Reoviridae Fijivirus

Rầy

Laodelphax

striatellus.

Lúa, ngô,

lúa mỳ, lúa

miến,

Alopecurus

aequalis

và một số

loài cỏ.

Trung Quốc,

Nhật Bản và

Triều Tiên

2

Southern

rice black-

streaked

dwarf virus

Reoviridae Fijivirus Rầy Sogatella

furcifera

Lúa, ngô

và một số

loài cỏ

Trung Quốc

và Việt Nam

3

Rice

bunchy

stunt virus

(RBSV)

Reoviridae Phytoreo-

virus

Rầy

Nephotettix

cincticeps và

N. virescens.

Lúa

Trung Quốc

(bao gồm các

tỉnh Phúc

Kiến, Quảng

Đông, Quảng

Tây, Hồ Bắc


nhiên Phân bố


64

4

Rice dwarf

virus

(RDV)


virus

Rầy

Nephotettix

cincticeps, N.

nigropictus,

Recilia

dorsalis, và

một số loài

Nephotettix

spp.

Lúa và một

vài loài cỏ

dại.

Trung Quốc,

Nhật Bản,

Triều Tiên,

Nê Pan, và

Philippin

5

Rice gall

dwarf virus

(RGDV)


virus

Rầy

Nephotettix

cincticeps, N.

nigropictus,

Recilia

dorsalis, và

một số loài

Nephotettix

spp.

Lúa và cỏ

Alopecurus

aequalis

Trung Quốc

(Phúc Kiến

và Quảng

Đông),

Malaysia và

Thái Lan

6

Rice

giallume

virus

(RGV)

Luteoviridae

Luteovirus

Rệp

Rhopalosiphu

m padivà một

số loài rệp

muội khác.

Lúa, một

số cây ngũ

cốc và cỏ

dại

Ý (miền Bắc)

và Tây Ban

Nha

7 Rice grassy

stunt virus

Luteoviridae

Tenuivirus

Rầy nâu

Nilaparvata

Lúa

Trung Quốc,

Nhật Bản và


65

(RGSV)

lugens và 2

loài rầy khác

Nilaparvata

spp.

Đài Loan

8

Rice hoja

blanca

virus

(RHBV)

Luteoviridae Tenuivirus Sogatodes

orizicola Lúa

Châu Mỹ (cả

Trung Mỹ,

Nam Mỹ và

Hoa Kỳ)

9

Rice

ragged

stunt virus

(RRSV)

Reoviridae

Oryzavirus

Rầy nâu

Nilaparvata

lugens và các

loài rầy

Nilaparvata

spp. khác.

Lúa

Indonesia,

Malaysia,

Philippin,

Thái Lan,

Trung Quốc,

Ấn Độ, Sri

Lanka, Đài

Loan và Nhật

Bản


nhiên Phân bố

10

Rice

necrosis

mosaic

virus

Potyviridae Bymovirus

Nấm đất

Polymyxa

graminis

Lúa Nhật Bản, Ấn

Độ


66

(RNMV)

11

Rice stripe

necrosis

virus

RSNV

Potyviridae

Furovirus

Nấm đất

Polymyxa

graminis và có

thể lây nhiễm

cơ học

Lúa

Bở Biển Ngà,

Liberia,

Nigeria và

Sierra Leone

12

Rice stripe

virus

(RSV)

Potyviridae Tenuivirus

Rầy

Laodelphax

striatellus và

một số loài rầy

khác.

Lúa, lúa

mỳ, lúa

miến, đại

mạch, kê

đuôi cáo

và một số

cỏ dại

Trung Quốc,

Nhật Bản,

Triều Tiên,

Nga (Siberi)

và Đài Loan.

13

Rice

transitory

yellowing

virus

(RTYV)

Rhabdov-iridae

Nucleorha-

bdovirus

Rầy

Nephotettix

cincticeps, N.

nigropictus, và

N. virescens.

Lúa

Miền Trung

và miền Nam

Trung Quốc,

Nhật Bản,

Đài Loan,

Thái Lan,

Lào và Việt

Nam.


67

14

Rice

tungro

bacilliform

virus

(RTBV)

Caulimoviriada

e

Tungro-

virus

Rầy

Nephotettix

virescens, N.

nigropictus, N.

cincticeps,

Recilia

dorsalis, và

một số loài

Nephotettix

spp.

Lúa

Các nƣớc

trồng lúa

châu Á

15

Rice

tungro

spherical

virus

(RTSV)

Sequiviridae Waika-virus

Rầy

Nephotettix

virescens, N.

nigropictus, N.

cincticeps,

Recilia

dorsalis, và

một số loài

Nephotettix

spp.

Lúa

Các nƣớc

trồng lúa

châu Á

16

Rice

yellow

mottle

virus

(RYMV)

Sequiviridae

Sobem -

virus

Bọ cánh cứng

họChrysomeli

dae.

Lúa dại

Oryza

longistami

nata

Các nƣớc

trồng lúa

Châu Phi


68

PHỤ LỤC 2

Các loài và nhóm thuộc chi Fijivirus [26]

TT Loài Nhóm

1 Fiji disease virus (FDV) Nhóm 1

2 Maize rough dwarf virus (MRDV)

Nhóm 2

3 Mal de Rio Cuarto virus (MRCV)

4 Pangola stunt virus (PaSV)

5 Rice black streaked dwarf virus (RBSDV)

6 Southern rice black streaked dwarf virus

(SRBSDV)

7 Oat sterile dwarf virus (OSDV) Nhóm 3

8 Garlic dwarf virus (GDV) Nhóm 4

9 Nilaparvata lugens reovirus Nhóm 5

Documents

Lại Phương Liên – K20 Di truyền học