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ISBN : 978-2-8073-0205-1
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EXERCICES : MÉTHODOLOGIE
Réussirl’internat
en pharmacie
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Réussirl’internat
en pharmacie
Cet ouvrage regroupe les items du nouveau programme de 2010 de l’internat en Phar-macie en lien avec l’épreuve des exercices. Il propose un large éventail de méthodes et formules utiles à la préparation du concours. C’est également une aide précieuse pour la résolution des épreuves d’exercices pour les étudiants des trois premières années de pharmacie ainsi qu’en première année des études de santé (PACES). Il permet de réviser facilement et rapidement l’une des épreuves les plus sélectives de l’examen grâce à des chapitres synthétiques contenant l’essentiel du cours. Il a été élaboré selon de nombreuses sources des quatre coins de la France afin d’obtenir un contenu des plus exhaustifs, ceci pour éviter le maximum de surprises le jour du concours.
Guillaume Grzych est interne en biologie médicale à Lille. Diplômes universitaires de Biostatistiques (CESAM), Cytogénétique et Séquençage Haut Débit. Spécialisé en Génétique.
Claire Duployez est interne en biologie médicale à Lille. Diplôme universitaire d’Antibiothérapie. Spécialisée en Microbiologie.
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Exercices : Méthodologie
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Duployez N., Hématologie
Menu E., Mehring M., Toxicologie
Guillaume Grzych | Claire Duployez
Exercices : Méthodologie
© De Boeck Supérieur s.a., 2016Fond Jean Pâques, 4B-1348 Louvain-la-Neuve
Tous droits réservés pour tous pays.
Il est interdit, sauf accord préalable et écrit de l’éditeur, de reproduire (notamment par photocopie) partiellement ou totalement le présent ouvrage, de le stocker dans une banque de données ou de le communiquer au public, sous quelque forme ou de quelque manière que ce soit.
Imprimé aux Pays-Bas
Dépôt légal :Bibliothèque nationale, Paris : janvier 2016Bibliothèque royale de Belgique : 2016/13647/008ISBN : 978 2 8073 0205 1
1re édition 2016
Pour toute information sur notre fonds et les nouveautés dans votre domaine de spécialisation, consultez notre site web :
www.deboecksuperieur.com
V
SommaireChapitre 1 Méthodes d’extraction (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Chapitre 2 Méthodes spectrales (Claire Duployez) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Chapitre 3 Chromatographie (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Chapitre 4 Méthodes électrophorétiques (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Chapitre 5 Réactions d’oxydo-réduction (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Chapitre 6 Osmose (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Chapitre 7 Chimie organique (Claire Duployez et Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Chapitre 8 Biophysique (Claire Duployez) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Chapitre 9 Les ions en solution (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Chapitre 10 Validation de méthodes analytiques (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Chapitre 11 Statistique (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Chapitre 12 Epidémiologie (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Chapitre 13 Enzymologie (Claire Duployez) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
Chapitre 14 Biochimie – Génétique (Claire Duployez) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Chapitre 15 Physiologie respiratoire (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
Chapitre 16 Physiologie cardio-vasculaire (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Chapitre 17 Hématologie (Claire Duployez) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Chapitre 18 Toxicologie de l’éthanol (Claire Duployez) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Chapitre 19 Bactériologie (Claire Duployez) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Chapitre 20 Pharmacologie (Claire Duployez) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Chapitre 21 Galénique (Guillaume Grzych) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Chapitre 1 Méthodes d’extraction
2 méthodes d’extraction
Items du programme présentés dans ce chapitre
SECTION I : Sciences mathématiques, physiques et chimiques
– Principes et applications de : 1. Méthodes de séparation fondées sur l’extraction (solide-liquide et liquide-liquide).
I. Définitions
L’extraction est un procédé correspondant au déplacement d’une espèce (le soluté), d’un milieu vers un autre qui sera enrichi et permettra son isolement.Dans les exercices l’important est d’identifier au mieux les différents acteurs, qui sont dans la plupart des cas au nombre de 3, le soluté et 2 solvants ayant chacun leur affinité propre au soluté, affinité dépendant de la solubilité du soluté dans chacun des solvants (notée Sa ou Sb).
On nommera (a) la phase aqueuse, , et (b) la phase organique.Le procédé d’extraction peut être représenté schématiquement comme ceci :
N’hésitez pas à refaire ce type de schéma en début d’exercice, il vous permettra d’identifier tous les acteurs et d’ajouter toutes les données qui seront calculées au cours de l’exercice.
La concentration du soluté dans la phase organique (B) à terme du procédé sera donc plus importante que dans la phase aqueuse (A).
La quantité de soluté sera stable au cours de l’extraction, cela obéit à la loi de conservation de la matière :Q0 = Qa + Qb
La répartition entre phase aqueuse et phase organique dépend du solvant utilisé. Elle est caractérisée par son coefficient de partage λ (sans unités) et les concentrations à l’équilibre:
λorg aqorg
aq
CC/ = ou λaq org
aq
org
CC/ =
Extraction solide-liquide : Il s’agit d’extraire une substance présente dans un solide à l’aide d’un solvant liquide. Parmi les méthodes utilisées, on compte la macération, l’infusion et la décoction.
II. Formules usuelles
Abbréviation SignificationCao , Qao Concentration ou quantité dans la phase (a) au début de l’extraction.Ca , Qa Concentration ou quantité dans la phase (a) à la fin de l’extraction.
Cbo , Qbo Concentration ou quantité dans la phase (b) au début de l’extraction.Cb , Qb Concentration ou quantité dans la phase (b) à la fin de l’extraction.
Sb Solubilité de l’espèce dans la phase (b).Sa Solubilité de l’espèce dans la phase (a).Vb Volume de la phase (b).Va Volume de la phase (a).
3Méthodes d’extraction
En fonction de l’affinité pour chaque phase, b est ici par convention la phase ayant le plus d’affinité pour le soluté (organique ou aqueuse). Cependant, vous pouvez également inverser les formules, et b deviendra la phase avec une affinité moindre, nous aurons donc des coefficients de partage très bas dans ce cas de figure.
1) Extraction simple
a. Coefficient de partage λ
λb ab
a
b
a
CC
SS/ = =�
b. Coefficient de partage relatif α
α = = =QQ
CC
VV
Rb
a
b
a
b
a0* .λ R
VVb
a=
c. Rendement ρ
ρ = =+
=+
QQ Q Q
Q
b
a
b
a b a
b
1
1 ρ =
+= −
+α
α α11
11
d. Concentration du soluté
C Cb a=+0 1
*λ
α Q Qb a=
+0 1*
αα
C Ca a=+0
11
*α
Q Qa a=+0
11
*α
2) Extractions multiplesFormule générale avec le nombre d’extractions (n), et le volume total de solvant utilisé (Vtb)
ρα λ
nb
an
t
a
n
Q
Q
nVV
b
= = −+( )
= −
+
∑0
11
11
1
1 *
3) Extraction en fonction du degré d’ionisationQuand on extrait un soluté d’une solution aqueuse vers une solution organique, seule la forme non ionisée sera extraite du fait de la polarité des solvants. Ci-dessous l’exemple d’un acide.
Dans le milieu aqueux on retrouvera donc toutes les formes du soluté alors que dans le solvant organique on retrouvera seulement la forme moléculaire (ou non ionisée).
Pour l’extraction, on ne doit donc plus tenir compte du coefficient de partage λ, mais du taux de distribution D qui sera dépendant de la constante d’équilibre du soluté.
4 Méthodes d’extraction
a. Cas d’un acide
Ha + H2O H3O+ + a-
KaH o a
aH=
+ −[ ].[ ][ ]
3 λ =[ ][ ]AHAH
b
a D =
+ −[ ]
[ ] [ ]AH
AH Ab
a a
DAAH
KH O
a
a
a
a
pH pKa=+
=+
=+−
+
−λ λ λ
1 1 1 103
[ ][ ] [ ]
( )
L’extraction d’un acide est donc plus efficace, à mesure qu’on se place à un pH faible, de manière à augmenter la proportion de soluté non ionisé (pH < pKa-2).
b. Cas d’une base
b + H2O bH+ + OH-
KaH o bbH
=+
+[ ].[ ][ ]3 λ =
[ ][ ]bb
b
a D =
+ +[ ]
[ ] [ ]b
b bHb
a a
DAAH
H OKa
a
a
apKa pH=
+=
+=
+− + −λ λ λ
1 11 103[ ]
[ ][ ] ( )
L’extraction d’une base est donc plus efficace à mesure qu’on se place à un pH élevé , de manière à augmenter la proportion de soluté non ionisé (pH>pKa+2).
5Méthodes d’extraction
c. Cas d’un ampholyte
DK
H OH OKa
a
a
a=
+ ++
+λ
11
23
3
[ ][ ]
d. Extractions diversesi. Distillation simple
La distillation est un procédé de séparation de mélange de substances liquides dont les températures d’ébullition sont différentes. Elle permet de séparer les constituants d’un mélange homogène. Sous l’effet de la chaleur ou d’une faible pression (Loi des gaz parfaits), les substances se vaporisent successivement, et la vapeur obtenue est liquéfiée pour donner le distillat. La Constante de Volatilité K est d’autant plus grande que la substance est volatile.
KYX
= �
Y = concentration de la substance volatile dans la phase vapeurX = concentration de la substance volatile dans le liquide restant dans le ballon
MM
K21
21
= ( )
Q1 = quantité initiale de la substance dans le ballonQ2 = quantité restant dans le ballon après distillationM1 = volume initial dans le ballonM2 = volume restant dans le ballon après distillation
Rendement : ρ =−Q Q
Q1 21
ii. Entrainement à la vapeurUn flux de vapeur d’eau est injecté au contact d’un liquide organique. Ce dernier est chauffé par la vapeur d’eau puis distillé avec elle.
Y QeM
K N=
− −.
.1
Y = quantité de substance volatile entrainée.Q = quantité de substance volatile au départN = quantité d’eau sous forme vapeurM = prise d’essaiK = constante de volatilité
Rendement : ρ =YQ
iii. Extraction par paire d’ionsLes paires d’ions sont des associations coulombienne entre deux ions de charges opposées. Les charges électriques impliquent que la constante diélectrique du solvant ε, la distance entre les ions, la température auront une influence sur l’appariement des ions.
A-+B+ A-B+
En effet, les forces diélectriques qui maintiennent la cohésion de la paire d’ions (AB) sont données par la loi de coulomb :
Fq qd
=. '. ²ε
F = force d’attraction entre les 2 ions en Newton (N)q et q’ = charge des 2 ions en Coulomb (C)ε = constante diélectrique du solvant d = distance entre les 2 ions en mètres (m)
Chapitre 2 Méthodes spectrales
8 méthodes spectrales
Items du programme présentés dans ce chapitre
SECTION I : Sciences mathématiques, physiques et chimiques
2. Spectrophotométrie d’émission et d’absorption atomiques3. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire UV-visible4. Spectrofluorimétrie moléculaire
I. Généralités
Radiations lumineuses :
– Rayonnements électromagnétiques à caractère ondulatoire continu, composés d’un vecteur champ magnétique et un vecteur champ électrique
– Considérées comme une série discontinue de quantums d’énergie ou photons
On en définit : – La longueur d’onde λ (m et ses dérivés) : distance qui sépare 2
passages du vecteur champ électrique ou magnétique à la même valeur.
– Le nombre d’onde υ’ = 1/λ (m-1 et ses dérivés) – La période T (s) : temps qui sépare 2 passages du vecteur champ électrique ou magnétique à la même valeur. – La fréquence υ = 1/T (Hz = s-1)
E = h.υ = h.c/λ = h.c.υ’
Avec : E : énergie d’un photon (J) h : constante de Planck = 6,63.10-34 J.s c : célérité de la lumière dans le vide = 2,998.108 m.s-1
Méthodes spectrales :
Spectrométrie atomique Spectrométrie moléculaire
Emission Absorption Fluorimétrie Absorption UV-visible
Spectre Spectre de raies Spectre de bandes
PrincipeMesure de l’intensité
lumineuse émise à la longueur d’onde de la raie de résonance
Mesure de l’intensité absorbée ;
Loi de Beer Lambert
Mesure de l’intensité de fluorescence émise
Mesure de l’intensité absorbée ;
Loi de Beer Lambert
II. Spectrophotométrie d’émission et d’absorption atomiques
A l’état normal, les électrons de l’atome se trouvent à l’état fondamental E0 de niveau énergétique le plus bas. Lors de l’absorption d’un photon, l’atome passe à un niveau excité par gain d’énergie. Cet état est instable et tend à redescendre au niveau fondamental par réémission de photons.
Champ magnétique(ou électrique)
Distance (nm)ouTemps (s)
λ (nm) ou T (s)
9Méthodes spectrales
Les spectres atomiques mettent en jeu des transitions électroniques des électrons de valence.Les mesures sont effectuées sur des éléments à l’état d’atomes libres (vapeur atomique), portés à très haute température pour obtenir un gaz d’atomes libres (vapeur atomique) : la loi de Boltzmann permet de calculer pour une transition donnée, le rapport du nombres d’atomes passés à l’état excité de ceux restés à l’état fondamental, en fonction de la température appliquée.
Pour chaque atome, on obtient un spectre de raies (chaque raie correspond à une transition électronique possible) – La longueur d’onde d’une raie est généralement caractéristique d’un élément donné. – Les atomes ne peuvent émettre que les radiations qu’ils sont en mesure d’absorber (et inversement). – La transition la plus intense (la moins énergétique) correspond au passage du niveau fondamental au niveau
immédiatement supérieur (1ère excitation) : c’est la raie de résonance.
1) Emission atomique
• Rayonnements émis par l’atome lors de sa relaxation électronique après excitation par la chaleur – Utilisation d’atomes excités – Mesure de l’intensité d’un rayonnement caractéristique (émis à la longueur d’onde de la raie de résonance) lors du
retour à l’état fondamental
I k C K .N= = ′.
I : intensité lumineuse émise pour un élément et une raie caractéristique donnéek et K’ : constantes dépendant de l’élément à doser, de la longueur d’onde et de la températureN : nombre d’atomes de l’espèce considérée dans la flamme (proportionnel au nombre d’atomes qui retournent à l’état fondamental par unité de temps)C : concentration de l’espèce
Appareillage
Photométrie de flamme (émission de flamme) Spectrométrie par plasma (PIHF = plasma induit par haute fréquence)
• Nébuliseur
• Flamme (~ 2000°C) : vaporisation, atomisation, excita-tion
• Monochromateur ou polychromateur
• Détecteur : – Cellule photoélectrique ou photomultiplicateur
(si monochromateur) – Barrettes de diodes (si polychromateur)
• Système de recueil et d’analyse des données
• Nébuliseur
• Torche à plasma (~ 5000-6000°C) : vaporisation, atomi-sation, excitation
• Monochromateur ou polychromateur
• Détecteur : – Cellule photoélectrique ou photomultiplicateur
(si monochromateur) – Barrettes de diodes (si polychromateur)
• Système de recueil et d’analyse des données
Applications : utilisé pour les atomes facilement excitables � Flamme : alcalins (Na, K, Li), alcalinoterreux (Ca…) et quelques métaux lourds � Plasma : quasi tous les éléments (y compris halogènes)
• Analyses qualitatives – Identification d’élément par analyse spectrale : en repérant les raies émises par rotation du réseau du monochromateur
(++ par PIHF ; températures atteintes supérieures donc raies d’émission plus intenses)
• Analyses quantitatives – Mesure des concentrations d’éléments dans un échantillon grâce à l’intensité des raies (++ émission de flamme)
NB : plusieurs éléments peuvent être analysés simultanément (à la différence de l’absorption atomique)
Loi de Boltzmann
NN
e*
0
E KT= −∆∆ /
N* : nombre d’atomes à l’état excitéN0 : nombre d’atome à l’état fondamentalΔE = En – E0 : énergie du niveau excité – énergie du niveau fondamental (J)K : constante de Boltzmann = 1,38.10-23 J.K-1
T : température absolue (K)
10 Méthodes spectrales
2) Absorption atomique
• Rayonnements absorbés par l’atome – Utilisation d’atomes à l’état fondamental – Mesure de l’absorption d’un rayonnement émis par une lampe à cathode creuse, à une ou plusieurs longueurs d’onde
caractéristiques de l’élément (++ raie de résonance)
Loi de Beer Lambert
Cf. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire UV-visiblel correspond ici à la longueur de la flamme ou du four en graphite
Appareillage
• Source lumineuse � à faisceau d’intensité et de longueur d’onde connues – Lampe à cathode creuse constituée de l’élément à analyser et d’un gaz rare � délivre un rayonnement constitué des
raies caractéristiques de l’élément – Lampe à décharge � s’il n’existe pas de lampe à cathode creuse pour l’élément à analyser
• Nébuliseur
• Four en graphite = atomiseur électrothermique, ou flamme : vaporisation, atomisation – Contient l’élément à analyser à l’état fondamental (cf. loi de Boltzmann avec une température de flamme ~ 2000°C) �
les atomes passent à l’état excité sous l’effet du rayonnement qui est en partie absorbé.
• Monochromateur – Prisme ou réseau ++
• Détecteur – Cellule photoélectrique ou photomultiplicateur ++ � mesure de l’intensité transmise
• Système de recueil et d’analyse des données
NB : pour éliminer les raies parasites : – Dues à la flamme : monochromateur placé après la flamme, modulateur placé avant la flamme – Dues à la source : monochromateur, montage en bifaisceau
Applications : utilisé pour les atomes non excitables par la chaleur (températures inatteignables) ; nombreux éléments >> émission atomique
� Nombreux métaux, quelques métalloïdes (inutilisable pour halogènes, oxygène, azote, carbone, soufre et phosphore)
• Analyses quantitatives : réaliser plusieurs manipulations s’il y a plusieurs éléments à doser (sources différentes)
• Pas d’analyse qualitative : nécessité de connaitre l’élément à doser pour choisir la source adaptée
III. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire UV-visible
UV lointain : 100-200 nm UV proche : 200-400 nm Visible : 400-800 nm
1) GénéralitésUne molécule possède une énergie totale : ET = Ee + Ev + Er + Etr avec Ee >> Ev >> Er >> Etr � ET = Ee + Ev + Er
– Ee : énergie électronique � concerne les électrons de valence – Ev : énergie de vibration � mouvement des liaisons formées par les électrons dans la molécule – Er : énergie de rotation � mouvement des atomes autour du centre de gravité de la molécule – Etr : énergie de translation � mouvement de la particule ; négligeable
Spectrométrie UV-visible – Met en jeu des énergies élevées, en particulier une variation de l’énergie électronique, (avec modification concomitante
des énergies de vibration et de rotation) � les spectres UV–visible sont aussi nommés spectres électroniques – (≠spectres de micro-ondes = spectres de rotation ; spectres infrarouges = spectres de vibration-rotation) – La molécule absorbe une radiation lumineuse de longueur d’onde λ, lui apportant une énergie ΔE qui la fait passer de
son état fondamental (E0) à un état excité (E’) (passage d’un électron d’une orbitale à une autre plus énergétique) � ΔE = E’ - E0
NB : ΔE = = h.c/λ = hυ = E’ - E0 � υ = ′ −
Eh
Eh0 � υ’ =
′ −Ehc
Ehc0 (
Ehc
est appelé terme spectral)
11Méthodes spectrales
À SavoIr
– Molécules saturées : les liaisons σ sont très stables : transition σ � σ* très énergétique, λ très faible, non exploité – Molécules insaturées : les liaisons π sont moins stables : transition π � π* moins énergétique, λ plus grandes
• Doubles liaisons conjuguées : délocalisation des électrons � effet bathochrome
2) Propriétés qualitatives : spectre d’absorption (spectre de bandes)Modifications de l’absorption :
– Par les substituants – Par le solvant : polarité et constante diélectrique, liaisons hydrogène, pH (état moléculaire/ état ionisé des bases et
acides faibles ont des spectres différents)
A A
λ(nm)λmax
λ(nm)λmax
λ(nm)λmax
λ(nm)λmax
A A
Effet bathochrome Effet hypsochrome Effet hyperchrome Effet hypochrome
Effet bathochrome Le chromopore a besoin de moins d’énergie pour passer à l’état excité � déplacement vers des λ plus élevées.
Effet hypsochrome Le chromopore a besoin de plus d’énergie pour passer à l’état excité � déplacement vers des λ plus faibles.
Effet hyperchrome Le passage à l’état excité est favorisé par le solvant ou un groupement � augmentation du coefficient d’extinction.
Effet hypochrome Le passage à l’état excité est défavorisé par le solvant ou un groupement � diminution du coefficient d’extinction.
On appelle groupement auxochrome un groupement fonctionnel qui produit ces effets (sa présence modifie la longueur d’onde et l’intensité de l’absorption.)
3) Propriétés quantitativesTransmittance et Absorbance
I0 : intensité incidenteIt : intensité transmiseTransmittance ou transmission : T = It/I0Pourcentage de transmission : %T = 100. It/I0 (%)Absorbance : A = -logT = log (1/T) = log (I0/It) (sans unité)
12 Méthodes spectrales
Loi de Beer Lambert
A DO l c K l c= = =εε. . . . = a1 %.l.cA : absorbance (sans unité)DO : densité optique (sans unité)c : concentration du solutéε : coefficient d’extinction molaire du soluté à la longueur d’onde considérée (L.mol−1.cm−1) si c est en mol.L-1
K : coefficient d’extinction spécifique du soluté à la longueur d’onde considérée (L.g-1.cm-1) si c est en g.L-1
A1 % : coefficient d’extinction du soluté à la longueur d’onde considérée (100mL.g-1.cm-1) si c est en g.100mL-1
l : longueur du trajet optique (longueur de la cuve) (cm)
Conditions d’application de la loi de Beer Lambert – Radiation monochromatique – Solution diluée (c ~ 10-2 mol.L-1) – Solution limpide et homogène – Stabilité photochimique du composé
Application aux mélanges de chromophores : additivité de la loi de Beer Lambert : si 2 composés absorbent à la même longueur d’onde, l’absorbance de leur mélange est égale à la somme de leurs absorbances respectives à cette longueur
d’onde donnée : pour n chromophores : A = i
i ni il c
=
=∑ 1( . . )ε
4) Appareillage
• Source lumineuse – Visible et UV proche � lampe à incandescence à filament de tungstène, arc au xénon – UV � lampe au deutérium, arc au xénon
• Monochromateur (pour isoler la radiation monochromatique sélectionnée) – Prisme ou réseau
• Cuve – Visible : verre ou plastique (ou quartz) – UV : quartz seul matériau utilisable (le verre absorbe le rayonnement)
• Détecteur : – Détecteur unicanal : photomultiplicateur – Détecteur multicanaux : barrette de diodes (lecture simultanée de plusieurs λ)
5) Applications
• Analyses qualitatives : – contrôle de pureté d’une substance – identification d’une substance – détermination des pKa des acides et bases faibles (pH = pKa + log (base/acide))
• Point isobestique : se trouve à une longueur d’onde spécifique à laquelle deux espèces chimiques (par exemple réactif et produit d’une réaction, ou formes acide et base d’un couple acide-basique) ont le même coefficient d’extinction ; deux substances peuvent avoir plusieurs points isobestiques dans un même spectre.
• Analyses quantitatives : ++ à λmax – détermination de la concentration de solutions pures – détermination des concentrations de solutions en mélange (additivité de la loi de Beer Lambert)
13Méthodes spectrales
IV. Spectrofluorimétrie moléculaire
1) GénéralitésLa molécule absorbe une radiation lumineuse de longueur d’onde λ (visible ou proche UV), lui apportant une énergie ΔE qui la fait passer de son état fondamental à un état excité, et revient à l’état fondamental par :
– Relaxation non radiative : collision avec les molécules environnantes – Emission d’un photon de fluorescence d’énergie E = hυ � émission lumineuse immédiate (10-7 à 10-9s), passage d’un
état excité singulet à l’état fondamental singulet. (Transitions donnant lieu à la fluorescence : π π et n π)(≠Phosphorescence : perte d’énergie différée (10-6s à quelques s), avec passage d’un état excité triplet à l’état fondamental)NB :
– Photoluminescence = fluorescence + phosphorescence (phénomène radiatif consécutifs à une radiation lumineuse) – Autres luminescences (phénomènes radiatifs consécutifs à des réactions enzymatiques ou chimiques)
Loi de Stokes
λmax lumière émise ≥ λ max lumière excitatrice Elumière émise ≤ Elumière excitatrice
Déplacement de Stokes : λmax lumière émise - λmax lumière excitatrice
Si λmax lumière émise = λmax lumière excitatrice : raie de résonance
NB : fluorescence anti-Stokes
λmax lumière émise < λmax lumière excitatrice (si les molécules sont initialement déjà à un niveau énergétique plus élevé)
2) Propriétés qualitatives : spectre d’excitation (absorption) – fluorescence (émission) (spectre de bandes)
λ lumière émise > λ lumière excitatrice
Spectre d’excitation et Spectre d’émission présentent entre eux une image en « miroir » et se recouvrent partiellement (nécessité d’utiliser des monochromateurs performants si maximas proches).
3) Propriétés quantitatives
Rendement quantique de fluorescence (efficacité de fluorescence)
φ = IIF
A
Avec : φ : rendement de fluorescence ou rendement quantique : 0≤φx≤1
IF : intensité de fluorescence émise (nombre de photons de fluorescence émis)
IA : intensité absorbée (nombre de photons absorbés)
NB : φ dépend de la substance, du solvant et de la température (diminue quand la température augmente).
Durée de vie de fluorescence ou temps de déclin
Durée de vie moyenne de l’état excité : plus ce temps est court, plus la sensibilité du fluorochrome est élevée
τ = φ.τN
Avec : τ : durée de vie de fluorescence φ : rendement quantique τN : constante de temps intrinsèque de l’état
excité (fluorescence seule).
Décroissance exponentielle de l’intensité de fluorescence à l’arrêt de l’excitation
λ(nm)
Absorption ou fluorescence émise
λlumière excitatrice
λlumière émise
14 Méthodes spectrales
Intensité de fluorescence
IF = φ.Ia = φ (I0-IT) ≈ 2,3.φ.I0.ɛ.l.c si ɛ.l.c < 0,02
Avec : φ : rendement de fluorescence IF : intensité de fluorescence émise IA : intensité absorbée par l’échantillon I0 : intensité de la lumière excitatrice incidente IT : intensité transmise ɛ : coefficient d’extinction molaire du soluté à la longueur d’onde considérée (L.mol−1.cm−1) :
plus ɛ est grand, plus la fluorescence est élevée à intensité lumineuse incidente égale l : longueur du trajet optique (cm) c : concentration de la molécule absorbante (mol.L-1)
Intensité exprimée en einstein par seconde (1 einstein = 6.1023 photons)
NB : « Brillance » = ɛ.φ
4) Appareillage
• Source lumineuse : lampe au xénon ++, deutérium, LASER…
• Monochromateur d’excitation : sélection de λ photon d’excitation
• Cuve – Visible : verre ou plastique – UV : quartz
• Monochromateur d’émission : sélection de λ photon émis (placé dans une direction perpendiculaire à celle de la source)
• Détecteur : photomultiplicateur � Mesure du faisceau émis perpendiculairement au faisceau incident, pour éviter que la lumière venant de la source ne fausse les mesures.
• Système de recueil et d’analyse des données
5) Applications (méthode très sensible et spécifique)
• Analyses qualitatives : – Etude de spectres
• Analyses quantitatives : – Dosages de substances naturellement fluorescentes, ou rendues fluorescentes par dérivation de fluorescence – Immunodosages …
Chapitre 3 Chromatographie
16 chromatographie
Items du programme présentés dans ce chapitre
SECTION I : Sciences mathématiques, physiques et chimiques
5. Méthodes chromatographiques : chromatographie en phase gazeuse ; chromatographie liquide (exclusion-diffusion, échange d’ions, partage).
I. Généralités
1) PrincipeLa chromatographie est un principe de séparation basé sur la différence de rétention d’un soluté entre deux phases, la phase mobile (PM) qui entraine avec elle l’espèce à extraire et la phase stationnaire (PS) qui la retient.On utilise pour cela une colonne, constituée de la phase stationnaire, la phase mobile est injectée dans cette colonne et entraine avec elle le soluté.
2) AppareillageUn injecteur permet d’introduire la phase mobile et l’espèce à analyser. La séparation se fait ensuite dans la colonne chromatographique dont la composition et la longueur varient en fonction du type de chromatographie. On utilise ensuite un détecteur qui permet d’élaborer un chromatogramme permettant l’exploitation des résultats.
II. Caractéristiques chromatographiques
Pour s’assurer d’une bonne séparation lors d’une chromatographie, il faut pouvoir qualifier et quantifier cette séparation. Pour cela, plusieurs « théories » sont utilisées. Elles permettent d’affiner et de moduler les paramètres de l’expérience. On peut alors jouer sur la rapidité, la sensibilité et la résolution de la technique.
17Chromatographie
1) Pics chromatographiquesLa détection des espèces sortantes se fera sur un chromatogramme, grâce à des pics chromatographiques. Ces pics ne correspondent pas à un seul point fixe mais à une « déformation » qui tend vers un profil gaussien. Cette déformation est due aux nombreux transferts entre la phase mobile et la phase stationnaire.
On définit un pic chromatographique par plusieurs éléments : – la hauteur du pic h – la largeur à mi-hauteur δ = 2.35 σ – la largeur à la base du pic ω = 4 σ = 1.7 δ
Le premier pic à apparaitre sur un chromatogramme permet de déterminer le temps mort tm, qui est le temps que met la phase mobile pour traverser la colonne. En chromatographie, les différents pics correspondent, soit à des temps de rétention (temps que mettra le composé pour traverser la colonne), soit à des volumes de rétention (volume de phase mobile nécessaire pour éluer le composé) ou encore à des distances de rétention (distance relative à l’apparition du pic sur le chromatogramme par rapport au début du tracé). Il est très aisé de passer de l’un à l’autre. Attention toutefois dans les formules mathématiques à ne pas mélanger temps, distance et volumes. Dans les formules on peut donc extrapoler l’ensemble des formules (qui seront ici données en temps de rétention) en distance et en volume.
18 Chromatographie
2) Théorie des plateauxLa colonne chromatographique est séparée en plateaux de hauteurs équivalentes. Plus le nombre de plateaux (N) sera élevé, plus la séparation sera fine et la résolution (Rs) élevée.
On définit ainsi plusieurs grandeurs en utilisant L la longueur de la colonne ainsi que les paramètres des pics chromatographiques vus précédemment.
La hauteur équivalente à un plateau théorique HEPT = H = NL
Le nombre de plateaux théoriques N = LH
tr= = = =2
σσ ωω δδ2
2 2
2 2
4²
16 5.54tw
t tr r r
( )
2
On peut augmenter N en réduisant le débit de la phase mobile mais l’analyse en sera plus longue.
3) Théorie cinétiqueIci, on prend en compte des paramètres propres à la colonne chromatographique pour expliquer la séparation. En plus de la vitesse moyenne de déplacement des molécules de la phase mobile (u), 3 paramètres mathématiques entrent en jeu (A, B et C).
uLtm
=
L est la longueur de la colonne.tm est le temps mort (temps qu’un composé n’ayant aucune affinité pour la PS mettra à traverser la colonne)
a. La diffusion turbulente (A)
Elle dépend de la taille et de la répartition des particules de la phase stationnaire. Le cheminement emprunté par la molécule déterminera ce facteur (en effet plusieurs chemins étant possibles au travers de ces particules). Plus les particules seront fines, plus ce facteur sera petit et l’efficacité de la colonne augmentera.Ca facteur est nul pour une chromatographie à colonne capillaire.
A dp= 2 . .λ
λ, constante de régularité du remplissagedp, diamètre des particules
b. La diffusion moléculaire longitudinale (B/u)
19Chromatographie
Elle traduit la dispersion des particules du soluté dans la colonne, celles-ci se dispersant d’autant plus dans toutes les directions à mesure que le débit est faible.En travaillant en hautes pressions (ex : CLHP), les débits obtenus permettent d’avoir de bonnes séparation.
B Dm= 2γ .
γ, constante liée à l’espace entre les particules de remplissageDm, coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile (en cm².s-1)
c. La résistance au transfert de masse (Cu)
Elle représente la résistance qui existe entre les échanges de soluté entre phase mobile et phase stationnaire. Plus le débit de la phase mobile est important, plus C augmente. Elle empêche la formation de l’équilibre entre le soluté dans la PM et la PS. L’efficacité sera donc fonction du diamètre des particules et de la diffusion du soluté.
CdDp
m=
2
dp, le diamètre des particulesDm, coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile (en cm².s-1)
d. Equation de Van DeemterCette représentation mathématique permet de rassembler les termes précédemment décrit, ceci afin d’optimiser la largeur des pics chromatographiques, en modulant le débit de la phase mobile.La courbe de Van Deemter est la résultante des paramètres (A, B et C) qui représenteront des constantes, et le débit de la phase mobile (u) sera la variable. On cherchera donc à obtenir H le plus faible possible, afin d’avoir la meilleur efficacité.
Le débit optimal est alors obtenu au point d’inflexion de la courbe. Pour le calculer il faut utiliser la dérivée mathématique et la résoudre.
H= + +ABu
C u.
H’= -B/u² + COn veut H’=0 soit -B/u² + C = 0
Après résolution on trouve uBCoptimal =
20 Chromatographie
e. Equation de Knox (CLHP)Le raisonnement est semblable au paragraphe précédent mais les calculs sont un peu plus complexes pour la résolution.
HA
uBu
C u= + +1 3/ .
4) Eléments de mesuresa. Rétention
i. DistributionLe soluté se répartit entre la phase stationnaire et la phase mobile. La distribution se mesure alors par le rapport des concentrations dans chacune des phases, on obtient alors le coefficient de distribution K.
KCCs
m=
CS, la concentration dans la phase stationnaireCm, la concentration dans la phase mobile
ii. Temps et volume de rétentionIl s’agit du temps ou du volume nécessaire de phase mobile que pour qu’un composé traverse la colonne chromatographique. Au niveau du chromatogramme, c’est l’endroit où le pic chromatographique est maximal.En connaissant le débit D de la phase mobile, on peut facilement déterminer le temps de rétention tr grâce au volume de rétention Vr.
Vr = tr.D que l’on peut extrapoler à Vm = tm.D (volume et temps mort)
On peut relier le volume de rétention aux volumes de phases mobiles et stationnaire grâce au facteur de distribution.
Vr=Vm+K . Vs
Le temps (ou volume de rétention) est dépendant de plusieurs paramètres : – La vitesse de la phase mobile – Le coefficient de distribution du soluté – Le rapport des volumes
On peut donc le modifier en changeant la composition de la phase mobile ou en modifiant la température car K est dépendant de la température.
iii. Facteur de rétentionOn utilise le facteur de rétention k’ plutôt que le facteur de distribution pour s’affranchir des paramètres géométriques de la colonne.
′ = =kC VC V
KVV
s s
m m
s
m
.
..
En extrapolant avec les formules précédentes :
VV V
Ksr m=
−
′ =−
=−
=−
k KV VK V
V VV
t tt
r m
m
r m
m
r m
m.
.On en déduit également
tr = tm(1+k’) et Vr = Vm(1+k’)
b. SélectivitéLe facteur de sélectivité α caractérise la distance qui sépare les sommets de deux pics.
α = =′′
=−
−KK
kk
t t
t tb
a
b
a
r m
r m
b
a
α diminue à mesure que l’on augmente la température.Ce facteur mesure la différence de distribution thermodynamiques des deux composés.Si Δ(ΔG°) = ΔG°b- ΔG°a, on a Δ(ΔG°) = -RT ln α
c. RésolutionPour avoir une bonne séparation des composés, les pics chromatographiques doivent être les plus distincts possibles (chevauchements minimums), ceci est mesuré grâce à la résolution (Rs). Il a été démontré que la résolution est optimale si il y a plus de 99,8 % de séparation des pics, ce qui correspond à une Rs>1.5.Cela correspond à une résolution optimale, on pourra par exemple moduler le débit (donc le temps d’analyse) pour améliorer la résolution. Il n’est cependant pas nécessaire d’avoir une résolution trop élevée sous peine que le temps d’analyse ne s’allonge inutilement.
21Chromatographie
Rst t
w wr r
b a
b a= −
+2. =1.18. �
t tr r
b a
b a−
+δ δ
Avec : – la largeur à mi-hauteur δ = 2.35 σ – la largeur à la base du pic ω = 4 σ = 1.7 δOn peut également estimer la résolution grâce à des approximations prenant en compte le nombre de plateaux théoriques N, le coefficient de sélectivité α, et le facteur de rétention k’.Approximations de Purnell :Si on suppose que ωa=b
Rs Nkkbb
b=
− ′+ ′
14
11
. .α
α
Si on prend en compte la moyenne du nombre de plateaux théoriques N et du facteur de rétention � ′k des composés A et B
Rs Nkk
=−+
′+ ′
12
11 1
. .αα
On peut alors optimiser la séparation en : – Augmentant N par modification de la vitesse d’élution. – Augmentant kb par modification de la phase mobile PM. – Diminuant α par augmentation de la température.
d. Perte de charge dans une colonneOn la détermine grâce à la loi de Darcy :
∆ ΦP Ludp
= . . .η 2
ΔP, la perte de charge en PaΦ, le facteur de résistance à l’écoulementη, la viscosité en Pa.sL, la longueur de la colonne en cmu, la vitesse de la phase mobile en cm.s-1
dp, le diamètre des particules en cme. Volume, porosité et débit
La colonne chromatographique est définie selon plusieurs paramètres.Le volume de la phase mobile : Vpm=Vi(volume interstitiel)+Vp(volume des pores)Le volume total de la colonne : VT=Vpm+Vps(volume phase stationnaire)Volume de la colonne (si on l’apparente à un cylindre de rayon r et de longueur L) Vc r L= π . .2
La porosité de la colonne : ε =VVpm
T
Le débit de la phase mobile : D u rVtc
m= =. . . .ε π ε2
Avec u la vitesse de la phase mobile (u = Ltm
) et r le rayon de la colonne.
22 Chromatographie
III. Analyse quantitative
Afin de déterminer la quantité ou la concentration d’un soluté analysé, il faudra réaliser des étalonnages. La quantité recherchée sera proportionnelle à l’aire des pics chromatographiques. L’étalonnage peut être direct ou faire appel à un étalonnage interne.
mi(masse de la substance ayant traversée)=Ki.(facteur de proportionnalité)Ai(aire du pic)
On pose Cx la concentration du soluté analysé, Ce la concentration de l’étalon utilisé.
1) Etalonnage directOn mesure directement l’aire du pic d’un étalon que l’on transpose à une quantité connue, et on utilise ceci pour déterminer la quantité de notre substance analysée après mesure de l’aire du pic.
C CAAX EX
E= .( )
2) Etalonnage interneOn introduit un étalon interne en même temps que notre analyte. Cet étalon sera soumis aux même contraintes analytiques (ex : le volume injecté), ce qui permet alors de s’affranchir des imprécisions liées aux conditions expérimentales.
C CRRX EX
E= .( )
Avec RAAXX
EI=
′ et R
AAEX
EI=
IV. Types de chromatographie
1) Chromatographie phase gazeuse (partage)Elle est utilisable pour des substances volatiles par élévation de la température. On ne peut donc pas l’utiliser sur des substances thermolabiles ou non volatiles.
a. PhasesLa phase stationnaire est greffée sur la colonne de silice, les plus répandues sont des polymères siliconés qui ont une bonne inertie chimique et supportent bien la température.La phase mobile est un gaz de faible viscosité, on utilise l’azote, l’hydrogène et l’hélium.
b. DétecteursOn peut utiliser des détecteurs électriques, des détecteurs à ionisation de flamme, des détecteurs à absorption électronique ou un spectromètre de masse.
23Chromatographie
2) Chromatographie phase liquide (partage)a. Phases
En phase normale, la phase mobile est un solvant peu polaire (éther, …) et la phase stationnaire, un gel de silice ou d’alumine.En phase inversée, la phase mobile est un solvant polaire (eau, méthanol …) et la phase stationnaire un liquide greffé sur un gel de silice.
b. DétecteursLes détecteurs utilisés en CLHP sont les détecteurs UV, les détecteurs à fluorescence, les détecteurs électrochimiques ou un spectromètre de masse.
3) Chromatographie d’exclusion-diffusionOn l’appelle également chromatographie sur gel filtration. Le principe se base sur la rétention des molécules en fonction de leur taille. Ces molécules migreront à travers un gel possédant des pores, les plus petites molécules rentreront avec dans les pores et seront donc plus difficiles à éluer. Les grosses molécules seront quant à elles éluées en premier. Le partage se fait donc selon la taille et la masse moléculaire des molécules à séparer.
On déterminera alors plusieurs temps lors de ce type d’analyse : l’exclusion où les plus grosses molécules ne rentrant pas du tout dans les pores seront éluées. La diffusion où les molécules voyageront dans le gel en fonction de leur taille, et la diffusion totale où on éluera les molécules les plus petites ayant diffusées totalement dans les pores du gel.On désigne alors Vm le temps d’exclusion d’une molécule n’ayant aucune affinité pour le gel, Vi le volume de la phase stationnaire (ici les pores), Vr le volume de rétention de la molécule étudiée et Vt le volume total.
Vt=Vm+Vi
Le coefficient de partage kV VV Vr m
t m=
−−
Le volume de rétention est donc Vr=Vm+K . Vi
24 Chromatographie
4) Chromatographie d’échanges d’ionsLe principe repose ici sur le fait que la phase stationnaire est un support sur lequel on trouve des groupements chargés. Les espèces à analysés seront donc éluées selon leur charge après échange ionique.On note ici S le groupement de la phase stationnaire, X le soluté, Y le contre ion.Echange d’anions :
S+Y- + X- S+X- + Y-
Constante d’équilibre KS X Y
S Y XXY =
+ − −
+ − −
Groupements fonctionnels utilisés : ammonium (-N+RX)Echange de cations :
S-Y+ + X+ S-X+ + Y+
Constante d’équilibre KS X Y
S Y XXY =
− + +
− + +
Groupements fonctionnels utilisés : sulfonate (-SO3-), carboxylate (-COO-)
ISBN : 978-2-8073-0205-1
METEX
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Guillaume Grzych est interne en biologie médicale à Lille. Diplômes universitaires de Biostatistiques (CESAM), Cytogénétique et Séquençage Haut Débit. Spécialisé en Génétique.
Claire Duployez est interne en biologie médicale à Lille. Diplôme universitaire d’Antibiothérapie. Spécialisée en Microbiologie.
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