LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

KUANTITASI MIKROBA: HITUNGAN CAWAN

KELOMPOK I

Rabu, 9 Maret 2011

Yustin Nurwulandari 260110090057

Mahardias Fadillah 260110090058

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

20011

I. Tujuan

Melatihuntukmelakukanpengenceran serial

danmenentukankonsentrasisuspensibakteridenganmetodehitungancawan.

II. Prinsip

1. Teknis Aseptis

a. SanitasiDasar

Mejadansekitarnyadisemprotdenganalkohol

70% .Tangandisemprotdenganalkohol,dandiusapkankeseluruhtangan.

Alatdanbahan yang

diperlukandisiapkan.Alatdanbahandisemprotdengan alkohol.

b. Penuangan Media

Erlemeyeryang berisi media

didekatkanbunsen,danpenutupdibukadenganjarikelingking .

Erlemeyerdisterilkandengancaraperlahandiputardidekatbunsen. Cawan petri

diambil, pastikanjaritidakmenyentuhmulutcawan petri.Cawan petri

didekatkandenganbunsendandiputar. Cawan petri

dibukadenganmenghadapkebunsen,janganbukaterlalulebar. Media

dipindahkandari Erlenmeyerkecawan petri,

pastikankeduaalattetapdekatdenganbunsen. Cawanpetriditutup,

dandisterilkankembali .

c. 3.Pemindahan Isolat

Bunsen

dinyalakan,Tabungreaksididekatkandenganbunsen,penutupdibukadenganjar

ikelingking.

Tabungreaksidisterilkandengandidekatkanpadabunsendandiputar.Jarumdiba

karpadabunsensampaiberwarnamerah.Jarumdikibas-

kibaskanhinggadinginIsolatdiambildenganjarumdandipindahkecawan petri

yangtelahsteril, keduaalatharustetap di dekatbunsen.

Tabungreaksiditutupdanletakkanpadameja.Cawan petri

kembalidisterilkanJarumoasekembalidibakarhinggamerah.

2. Sterilisasi

Sterilisasiadalahsuatu proses untukmembunuhsemuajasadrenik

yang ada, sehinggajikaditumbuhkan di dalamsuatu medium

tidakadalagijasadrenik yang

dapatberkembangbiak.Sterilisasiharusdapatmembunuhjasadrenik yang

paling tahanpanasyaitusporabakteri

3. Pembiakan

Pembiakanadalah proses biologiuntukmenghasilkan

organismebaru. Pada praktikum mikrobiologi pembiakan bakteri

dilakukan pada berbagai macam media umumnya NB (suspensi cair) dan

NA (suspensi padat).

4. Counting

Counting adalah tindakan untuk menemukan jumlah koloni bakteri.

III. Teori Dasar

Bakteri adalah salah satu makhluk hidup yang tergolong dalam kingdom protista. Bakteri tergolong dalam sel prokariot, yaitu tidak memiliki membrane inti sel. Sehingga organel sel yang terdapat dalam sel bakteri hanyalah nukleotida, ribosom, sitoplasma, membran sel, dan dinding sel (beberapa ada yang memiliki mesosom). Adapun bentuk bakteri yang dapat dilihat secara mikroskopis adalah kokus (bulat), basil (batang), dan spiral. Bakteri yang khas berdiameter sekitar 0,5 sampai 1,0 µm dan panjangnya 1,5 sampai 2,5 µm. Reproduksi bakteri adalah dengan pembelahan biner sederhana, yaitu proses aseksual. Beberapa bakteri menyebabkan penyakit. Berperan penting dalam peredaran alamiah unsure-unsur yang menambah kesuburan tanah. Bermanfaat dalam industry untuk membuat senyawa-senyawa penting. Beberapa merusak makanan, dan beberapa membuat makanan (Pelczar, 1986).

Mikroskop adalah instrument yang paling banyak digunakan dan paling bermanfaat di laboratorium mikroskopi. Dengan alat ini diperoleh perbesaran sehingga memungkinkan untuk melihat organism dan struktur yang tak tampak dengan mata bugil. Mikroskop memungkinkan perbesaran dalam kisaran luas – dari seratus kali sampai ratusan ribu kali. Mikroskop terdiri dari banyak jenis, diantaranya mikroskop medan terang, mikroskop

medan gelap, mikroskop fluoresensi, mikroskop kontras fase, dan mikroskop electron (pelczar, 1986).

Bagian-bagian mikroskop beserta fungsinya (Indriani, 2010):

a. Lensaokuler, yaitulensa yang dekatdenganmatapengamatlensainiberfungsiuntukmembentukbayanganmaya, tegak, dandiperbesardarilensaobjektif.

b. Lensaobjektif, lensainiberadadekatpadaobjek yang diamati, lensainimembentukbayangannyata, terbalik, diperbesar. Dimanalensainidiaturolehrevoleruntukmenentukanperbesaranlensaobjektif.

c. Tabungmikroskop (tubus), tabunginiberfungsiuntukmengatur focus danmenghubungkanlensaobjektifdanlensaokuler.\

d. Makrometer (pemutarkasar), makrometerberfungsiuntukmenaikturunkantabungmikroskopsecaracepat.

e. Micrometer (pemutarhalus), pengaturiniberfungsiuntukmenaikturunkanmikroskopsecaralambat, danbentuknyalebihkecildaripadamakrometer.

f. Revolver, berfungsiuntukmengaturperbesaranlensaobjektifdengancaramemutarnya.

g. Reflector, terdiridariduajeniscermin, yaitucermindatardancermincekung. Reflector iniberfungsiuntukmemantulkancahayadaricerminkemejaobjekmelaluilubang yang terdapat di mejaobjekdanmenujumatapengamat. Cermindatardigunakanketikacahaya yang dibutuhkanterpenuhi, sedangkanjikakurangcahayamakamenggunakancermincekungkarenaberfungsiuntukmengumpulkancahaya.

h. Diafragma, berfungsiuntukmengaturbanyaksedikitnyacahaya yang masuk.

i. Kondensor, berfungsiuntukmengumpulkancahaya yang masuk, alatinidapatdiputardandinaikturunkan.

j. Mejamikroskop, berfungsisebagaitempatmeletakkanobjek yang akandiamati.

k. Penjepitkaca, berfungsiuntukmenjepitkaca yang melapisiobjek agar tidakmudahbergeser.

l. Lenganmikroskop, berfungsisebagaipengangangpadamikroskop.

m. Kaki mikroskop, berfungsiuntukmenyanggaataumenopangmikroskop

n. Sendiinklinasi (pengatursudut), untukmengatursudutatautegaknyamikroskop.

mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrient yang disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia; macamnya yang dipakai bergantung kepada banyak factor, salah satu diantaranya adalah macam mikroorganisme yang akan ditumbuhkan (Pelczar, 1986).

Andaikan kita ingin mengisolasikan biakan murni bakteri dari mulut kita, maka air liur dari mulut diisolasikan sedikit saja pada medium yang cocok sedemikian rupa sehingga sel-sel mikroba tumbuh terpisah-pisah pada medium tersebut. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum (Pelczar, 1986).

Beberapa cara dapat digunakan untuk mengukur atau menghitung jumlah jasad renik di dalam suspense atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok, yaitu (Fardiaz, 1989):

A. Perhitunganjumlahsel1. Hitunganmikroskopik2. Hitungancawan3. MPN (Most Probable Number)

B. Perhitunganmassaselsecaralangsung1. Volumetrik2. Gravimetrik3. Kekeruhan (turbidimetri)

C. Perhitunganmassaselsecaratidaklangsung1. Analisiskomponensel (protein, DNA, ATP, dansebagainya)2. Analisisprodukkatabolisme (metabolit primer atausekunder,

panas)3. Analisiskonsumsi nutrient (karbon, nitrogen, oksigen, asam

amino, mineral, dansebagainya).

Teknik aseptis atau steril adalah suatu system cara bekerja (praktek) yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar digunakannya teknik aseptic adalah adanya banyak partikel debu yang mengandung mikroorganisme (bakteri

atau spora) yang mungkin dapat masuk dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba yang tidak dapat mempengaruhi atau mengganggu hasil dari suatu percobaan (pradhika, 2009).

IV. Alat dan Bahan

a. Alat

Cawan petri

Erlenmeyer

Ose

Pembakar bunsen

Tabung reaksi

Volume pipet

b. Bahan

Aquadest steril

Nutrient agar

Sampel (air dispenser)

V. Prosedur

Pertama-tama alat-alat disterilkan dengan metode autoclave (telah dilakukan pada minggu sebelumnya). Kemudian alat-alat dan bahan disiapkan di atas meja yang telah disterilkan dengan disinfektan. Selanjutnya Bunsen dinyalakan. Aqudest steril dimasukkan ke dalam tiga tabung masing-masing sebanyak 9 mL dengan cara memipet aqudest dengan pipet volume, dilakukan dekat api, dan pipet dilewatkan di atas api sebelum digunakan untuk memipet. Penutup wadah aqudest steril dibuka di dekat api, dan mulut wadah dilewatkan sebentar di atas api, begitu juga ketika akan ditutup. Kemudian sampel sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung pertama, dikocok, lalu disisihkan. Pengambilan sampel juga dilakukan seperti pengambilan aquadest steril, namun sampel tidak ditutup sehingga mulut wadah sampel tidak perlu dilewatkan di atas api.

Campuran dari tabung pertama diambil sebanyak 1 mL dengan menggunakan pipet volume dengan metode yang sama dengan pengambilan aquadest steril, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kedua. Kemudian tabung kedua dikocok dan disisihkan.

Campuran dari tabung kedua diambil sebanyak 1 mL dengan menggunakan metode yang sama dengan pengambilan campuran dari tabung pertama, kemudian campuran dimasukkan ke dalam tabung ketiga. Kemudian tabung kedua dikocok dan disisihkan.

Nutrient agar disiapkan dalam suhu + 40oC, kemudian dimasukkan ke dalam tiga cawan petri masing-masing sebanyak 19 mL. Pengambilan nutrient agar juga harus dekat dengan api, mulut wadah nutrient agar dilewatkan di atas api sebelum dan setelah diambil, kemudian saat membuka cawan petri tidak boleh terlalu lebar, dan setelah diberi nutrient agar, mulut cawan petri dilewatkan di atas api.

Kemudian campuran dari tabung pertama diambil 1 mL dengan metode yang sama dengan saat pengambilan campuran sebelumnya, kemudian campuran dimasukkan dalam cawan petri dengan metode yang sama dengan penambahan nutrient agar. Selanjutnya cawan petri digoyang-goyang. Begitupula campuran dari tabung kedua ditambahkan pada cawan petri kedua, dan campuran dari tabung ketiga ditambahkan pada cawan petri ketiga dengan metode yang sama (aseptis) dan setelah itu digoyang-goyang kemudian ditiriskan.

Kemudian cawan petri ditumpuk dalam keadaan terbalik, dibungkus dengan kertas koran dengan rapi dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37oC selama 18-24 jam.

Setelah itu cawan petri diambil, dilepaskan dari pembukus koran, kemudian koloni yang terlihat dihitung dan dimasukkan dalam data pengamatan.

VI. Data Pengamatan

Gambar 5.1 koloni bakteri dengan pengenceran 10-1

Gambar 5.2 koloni bakteri dengan pengenceran 10-2

Gambar 5.3 koloni bakteri dengan pengenceran 10-3

Koloni banyak dan padat sehingga tidak diperoleh hasil

perhitungan karena dipastikan lebih dari 300 koloni bakteri yang ada.

Perhitungan

JumlahKoloni = (∞ x 10) + (∞ x 100) + (∞ x 1000) = ∞

3

VII. Pembahasan

Setiap prosedur pada praktikum harus dilakukan secara aseptik,

yaitu dengan melakukan setiap langkah-langkah kerja di dekat panas api

spiritus. Hal ini bertujuan agar tidak terjadi kontaminasi dari lingkungan luar

terhadap sampel ataupun biakan bakteri yang akan dibuat.

Percobaan metode hitungan cawan ini menggunakan sampel air

dispenser dari laboratorium mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas

padjadjaran. Sejumlah tertentu sampel disediakan dalam erlenmeyer.

Kemudian sampel diencerkan dengan metode pengenceran tabung.

Pertama, sampel dipipet sebanyak 1 ml dengan menggunakan volum pipet 1

ml. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi I. setelah itu,

aquadest steril dipipet sebanyak 9 ml dengan menggunakan volum pipet 10

ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi I. Tabung reaksi digoyang

perlahan untuk menghomogenkan larutan.

Sampel dari tabung reaksi I yang telah diencerkan dipipet sebanyak 1

ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi II. Setelah itu, sampel

ditambahkan aquades steril yang dipipet sebanyak 9 ml dengan

menggunakan volum pipet 10 ml. tabung reaksi digoyang perlahan untuk

menghomogenkan larutan.

Sampel dari tabung reaksi II yang telah diencerkan dipipet sebanyak 1

ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi III. Setelah itu, sampel

ditambahkan aquades steril yang dipipet sebanyak 9 ml dengan

menggunakan volum pipet 10 ml. tabung reaksi digoyang perlahan untuk

menghomogenkan larutan.

Dari tiap-tiap tabung reaksi (I, II, III) dipipet sebanyak 1 ml dengan

menggunakan volum pipet dan dituang ke dalam cawan Petri. Kemudian

nutrient agar sebanyak 9 ml dimasukkan ke dalam cawan petri. Setelah itu,

campuran dihomogenkan dengan cara memutar cawan secara perlahan di

atas permukaan datar. Setelah homogen, sampel didiamkan beberapa saat

sampai nutrien agar membeku.

Sampel diinkubasi di dalam incubator selama 24 jam dengan suhu

37°C. Posisi cawan dibalik agar uap air dari kondensor tidak tercampur

dengan sampel. Alasancawanpetriharusdiinkubasikan agar

suspensibakterimendapatsuhuoptimaluntukpertumbuhanhidupnya. Setelah

sampel diinkubasi, pada cawan petri terlihat koloni-koloni bakteri dengan

warna putih kekuningan. Pada cawan petri hasil percobaan kami terlihat

koloni yang hanya berbentuk titik – titik. Namun, koloni bakteri tersebut

berjumlah sangat banyak sehingga sulit untuk dihitung secara kasat mata.

Perhitungan dilakukan dengan cara membagi cawan petri menjadi 4

bagian sama besar dengan menggunakan spidol pada bagian luar cawan.

Koloni sangat banyak dan padat sehingga sulit dihitung Hal ini

kemungkinan terjadi karena kerja kurang aseptis sehingga terdapat

kontaminan yang mempengaruhi hasil biakan. Selain itu juga air yang

digunakan mungkin memang sudah terkontaminasi.

VIII. Kesimpulan

Pengenceran serial dapat dilakukan tetapi konsentrasi suspense bakteri dengan

metode hitungan cawan tidak berhasil dilakukan karena adanya kontaminan yang

berlebihan dari berbagai faktor.

DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, Srikandi. 1989. MikrobiologiPangan.

DepartemenPendidikandanKebudayaanDirektoranJenderalPendidikanTin

ggiPusatAntarUniversitasPangandanGiziInstitutPertanian Bogor. Bogor.

Indriani, Sulistya. 2010. Bagian-bagianMikroskopdanFungsinya.

sulistyaindriani.wordpress.com/2010/07/12/bagian-bagian-mikroskop-

dan-fungsinya/

Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid I. Penerjemah: Ratna Srihadioetomo. UI Press. Jakarta.

Pradhika, Indra. 2009. Bekerja Tanpa Kontaminasi. http://ekmonsaurus.blogspot.com/2009/05/bekerja-tanpa-kontaminasi-dasar-tehnik.html