Laporan Praktikum Bioteknologi

Laporan Praktikum Bioteknologi Hutan

Oleh : Ardityo Hendi PrastowoNIM : 09 / 295564 / PKT / 914

PROGRAM PASCASARJANA PROGRAM STUDI ILMU KEHUTANAN UNIVERSITAS GADJAH MADA 2010

Daftar Isi

Pendahuluan Bab I Bab II Bab III Bab IV Bab V Bab VI Bab VII

.................................................................................................. .................................................................................................. .................................................................................................. .................................................................................................. .................................................................................................. .................................................................................................. .................................................................................................. ..................................................................................................

Pendahuluan Penanda genetik merupakan suatu marker atau penanda yang digunakan untuk mengetahuisifat dan keragaman genetic dari suatu makhluk hidup. Penanda ini dibagi menjadi tiga jenis penanda berdasarkan media yang digunakan untuk melihat karakteristik genetik dari suatu makhluk hidup, yakni penanda morfologi, penanda biokimia dan penanda molekuler. Penanda morfologi merupakan penanda genetik yang menilai karakter genetik makhluk hidup berdasarkan penampakan morfologinya. Ciri ciri dari penanda ini antara lain menggunakan

polimorfisme morfologi sebagai dasar penentuan karakteristik genetik seperti misalnya berupa perbedaan warna, bentuk biji dan sebagainya. Selain itu identifikasi gen dengan menggunakan

penanda ini tidak mudah karena amat dipengaruhi oleh lingkungan, dimana Fenotipe = Genotipe + Lingkungan. Sedangkan penanda biokimia dan penanda molekuler memiliki kesamaan satu sama lain dimana keduanya tidak dipengaruhi lingkungan (Fenotip = Genotip), dapat dilakukan pengamatan multilokus dalam waktu singkat, dapat diidentifikasi dari berbagai jaringan, dapat mendeteksi mutan dengan lebih baik, mampu mendeteksi pertautan antar lokus serta ada yang memiliki sifat kodominan, yang berarti dapat mendeteksi alel penyusun genotipe. Penanda biokimia memanfaatkan protein sebagai media penentu karakteristik genetik, misalnya dengan menggunakan isoenzim. Isoenzim merupakan suatu variasi yang terdapat pada enzim yang sama, yang memiliki kemiripan fungsi dan terdapat pada individu yang sama. Kelebihan dari penggunaan isoenzim antara lain bersifat kodominan, juga lebih murah dan mudah dibandingkan dengan marka molekuler. Kelemahan penanda ini, tidak semua mutasi gen menghasilkan perubahan muatan pada molekul enzim. Yang artinya tidak semua mutasi gen dapat dideteksi oleh penanda ini dan mengurangi ketepatan hasil analisis nantinya. Di samping itu, enzim hanya mewakili satu

kelompok dari gen, sehingga tidak dapat mewakili seluruh genom yang ada. Untuk penanda molekuler, penanda genetic jenis ini memanfaatkan DNA sebagai media atau bahan penentuan karakteristik genetik dari makhluk hidup tertentu. Penanda ini memiliki ciri-ciri antara lain tidak dipengaruhi lingkungan, mahal dan lebih tinggi tingkat kesulitannya dibandingkan dengan kedua penanda lainnya dan juga dapat mengamati hingga tingkat basa penyusun DNAnya (pada metode DNA sequencing misalnya). Dengan memanfaatkan teknologi Polymerase Chain

Reaction (PCR), penanda ini terbagi lagi menjadi beberapa macam, dibedakan berdasarkan jumlah basa nukleotida yang dipakai sebagai sekuens hingga jumlah siklus dalam PCR dan metode elektroforesisnya. Beberapa metode tersebut antara lain metode RAPD, RFLP, AFLP, SSR, SCAR dan sebagainya.

Bab I Prosedur Analisis IsoenzimTujuan Mengetahui prinsip prosedur laboratorium untuk analisis isoenzim Mengenal teknik optimalisasi prosedur laboratorium

Landasan teori Isoenzim merupakan enzim yang memiliki bentuk berbeda tetapi memiliki fungsi identik. Kedudukan isoenzim sebagai produk translasi RNA sejajar dengan protein, sedangkan RNA merupakan hasil transkripsi dari segmen DNA tertentu. Isoenzim dapat dimanfaatkan sebagai penanda/marker biokimia. Enzim dari jaringan organisme yang telah diekstraksi sekanjutnya dipisahkan dengan proses elektroforesis. Gel hasil elektroforesis yang telah diwarnai dengan suatu enzim akan memunculkan pola pita (binding pattern) tertentu. Kejelasan pola pita yang dihasilkan sangat dipengaruhi oleh seluruh tahapan prosedur kerja yang dilakukan. Alat dan bahan Peralatan laboratorium isoenzim Sampel jaringan tanaman

Cara kerja 1. Mempelajari prosedur keamanan penggunaan peralatan laboratorium 2. Mempelajari urutan kerja analisis isoenzim di dalam laboratorium 3. Membuat diagram alur analisis isoenzim Pembahasan Pola pita yang dihasilkan dalam proses elektroforesis dengan isoenzim, ditentukan dan dipengaruhi oleh salah satunya penggunaan alat dan bahan yang tepat dan benar. Peralatan dan bahan pada prosedur analisis isozim mencakup peralatan laboratorium serta sampel jaringan tanaman. Peralatan laboratorium terdiri dari beberapa alat yang digunakan untuk melakukan proses elektroforesis gel secara vertikal, antara lain : 1. Aspirator Merupakan suction pump menggunakan prinsip tekanan air, untuk menghisap bahan-bahan sisa pada gel elektroforesis 2. Alat elektroforesis Sebuah alat yang bekerja, dengan prinsip dan teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Westermeier, 2004).

Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. 3. Lemari es Berfungsi sebagai pendingin gel hasil elektroforesis serta sampel.

4. Nampan plastik Berfungsi untuk meletakkan gel atau alas pencuci kaca tempat gel, paska kegiatan elektroforesis 5. Cawan petri Sebuah wadah yang bentuknya bundar dan terbuat dari plastik atau kaca yang digunakan untuk membiakkan sel. Cawan petri selalu berpasangan, yang ukurannya agak kecil sebagai wadah dan yang lebih besar merupakan tutupnya. 6. Sentrifuge Menurut Elsa, 2008 Sentrifuge merupakan sebuah alat yang berfungsi untuk memisahkan cairan dari cairan yang berbeda, serta memiliki massa atau berat jenis yang berbeda. Sentrifuge merupakan suatu alat yang memiliki fungsi untuk mempercepat pemisahan partikel dari suspensi (bila didiamkan akan mengendap karena memiliki gaya berat atau grafitasi), menggunakan prinsip gaya sentrifugal ke arah luar. 7. Sentrifuge tube Tabung dengan ujung merucing dan membulat serta berbahan kaca ataupun plastik, yang digunakan untuk tempat peletakan sampel saat proses sentrifugasi atau pengendapan. 8. Power Supply pada Alat Elektroforesis Suatu alat untul menjaga kestabilan dan fluktuasi aliran listrik ke alat elektroforesis secara konstan, agar tidak mengganggu jalannya proses elektroforesis. 9. Freezer Kotak khusus yang berfungsi untuk membekukan atau mendinginkan sampel, pada suhu di bawah nol derajat celcius.

10. Kertas saring Kertas yang berfungsi untuk penahan padatan pada saat proses filtrasi sehingga tidak terjadi chanelling atau rongga. 11. Labu Erlenmeyer Suatu wadah untuk proses kimia, pada proses praktikum ini yakni untuk mencampur dua atau lebih zat kimia bahan proses elektoforesis seperti pembuatan gel.

12. Stirer Magnetik dan Magnetic Bar Alat pengaduk dan pemanas yang berfungsi untuk proses homogenisasi larutan pada proses persiapan sampel maupun bahan elektroforesis. 13. Mikropipet Alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 l, berfungsi untuk memindah sejumlah volume larutan. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1l sampai 20 l, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette). Misalnya mikropipet 5 l. Mikropipet memerlukan tip, yang dapat digantipasang setelah dipakai untuk menghindari kontaminasi. 14. Mortar dan Pestel Alat penumbuk sampel daun yang ditambahkan N cair di dalamnya, sehingga menjadi halus dan lembut. 15. Pompa vakum Alat berbentuk tabung besar yang berfungsi memompa udara keluar sehingga dicapai kondisi mampat atau vakum. 16. Suntikan @ 1 ml Alat injeksi untuk memasukkan bahan atau sampel ke dalam gel elektroforesis. 17. Slab Gel Making Stand Alat penahan dan pembentuk gel

18. Tabung dan pipet ukur Tabung pencampur reaksi, dan alat untuk memindahkan larutan dengan volume yang diketahui. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur, diantaranya pipet berukuran 1 ml, 5 ml dan 10 ml. 19. Timbangan analitik Timbangan yang memiliki tingkat ketelitian hingga 1 mg, terdapat dua versi digital dan analog. Versinya digitalnya dapat diatur dengan men-setting zero balance sehingga lebih akurat.

Contoh urutan kerja dari analisis isoenzim dikutip dari penelitian Irfan (2005) yang dimodifikasi dari Wendel dan Weeden (1989). Tahapan kegiatan analisis isozim tesebut terdiri atas pembuatan bufer, pembuatan gel pati, ekstraksi enzim, elektroforesis, dan pewarnaan. 1. Penyiapan Bahan Tanaman Bahan tanaman yang akan dianalisis perlu dipersiapkan terlebih dahulu. Untuk mengekstrak enzimnya bagi keperluan elektroforesis diguna-kan sampel daun, yaitu daun yang masih segar. 2. Pembuatan Bufer Pengekstrak Jaringan daun yang dianalisis berupa ekstrak bahan kasar tanpa pemurnian protein. Bufer pengekstrak berfungsi membantu menghancurkan sel dalam suatu jumlah minimum tanpa menimbulkan panas terhadap ekstrak dan perubahan warna terhadap daun yang diekstrak. Bufer pengekstrak (untuk 40 ml) terdiri atas: 10 mM L-asam askorbat 0,07045 g 40 mM L-sistein 0,19390 g Triton-X-100 0,12 ml PVP-40 0,25 g Na2HPO4.2H2O 0,1 M pH 7,0 3. Pembuatan Bufer Gel dan Elektrode Persiapan gel pati diperlukan untuk mendapatkan gel yang dapat memisahkan isoenzim dengan baik dan benar. Selain bufer dalam gel dan elektrode, faktor penting yang perlu diperhatikan adalah alat elektroforesis dan metode pemasakan gel. Pengaruh yang paling penting yang me-nentukan kualitas hasil adalah pemilihan bufer elektroforesis yang sesuai dengan jenis bahan tanaman yang akan dianalisis. Bufer Gel L-histidin monohidrat 5 mM 1,048 g Diatur dengan tris sampai pH 6,0 Bufer elektrode Asam sitrat monohidrat 50 mM 10,5507 g Tris hidroksimetil aminometan 150 mM 150 18,1650 g Diatur sampai pH 6,0

4. Pembuatan Gel Pati Gel pati dibuat dari pati kentang khusus untuk keperluan hidrolisis. Untuk setiap cetakan yang biasa dilakukan dengan konsentrasi 10% sampai 13%. Banyaknya pati yang diperlukan bergantung pada besar kecilnya cetakan yang digunakan. Pembuatan Gel Pati dengan Pemanas Pati dan bufer gel dicampur merata dalam labu lalu dimasak pada pemanas air yang telah mendidih dengan cara diputar perlahan sampai matang, warna menjadi bening, kemudian divakum sampai gelembung udara dalam gel habis. Pembuatan Gel Pati dengan Micro Wage Pati dicampur dengan sepertiga bagian dari bufer gel. Dua pertiga bagian lagi dimasak lebih dulu memakai erlemeyer dalam micro wage sam-pai mendidih. Setelah matang diangkat lalu di-campurkan dengan campuran pati dan kemudian dimasak lagi sampai kelihatan bening lalu di-vakum sampai gelembung udara dalam gel habis. Selanjutnya gel secepat mungkin dituang pada cetakan yang terlebih dahulu diolesi parafin cair dan lubang pada kaki cetakan ditutup dengan selotip. Sesudah gel menjadi dingin, ditutup dengan plastik yang telah diolesi parafin. Sebelum digunakan gel disimpan pada suhu 5 10C. 5. Ekstraksi Enzim Contoh daun segar ditimbang antara 100 200 mg, lalu digunting halus ke dalam mortar yang telah diberi pasir kuarsa, dengan menambahkan bufer pengekstrak sebanyak 0,5 ml, lalu digerus sampai halus. Selanjutnya kertas saring yang ukurannya disesuaikan dengan kebu-tuhan dimasukkan ke dalam mortar untuk me-nyerap cairan sel daun yang telah hancur. Kemudian kertas saring yang telah menyerap cairan sel dari setiap contoh atau mortar tadi dibersihkan untuk disisip pada gel yang telah dilubangi. 6. Elektroforesis Cetakan yang telah disisipkan kertas saring yang telah mengandung contoh daun dimasukkan ke dalam tray yang telah berisi bufer elektrode. Sebelum dimasukkan selotip pada kaki cetakan dilepas dan kaki cetakan harus terendam dalam bufer elektrode lalu diletakkan dalam ruangan atau lemari es pada suhu antara 5 10C. Elektroforesis awal selama 30 menit pada 100 volt dan dielektroforesis tetap pada 150 atau 200 volt selama 3 sampai 4 jam. Kemudian untuk mengontrol jarak migrasinya di salah satu sisinya diberi penanda bromofenol biru. 7. Pembuatan Larutan Pewarna Setelah elektroforesis, gel dibelah menjadi dua atau tiga (sesuai ketebalannya) pada posisi horizontal di atas alat pemotong. Sebelumnya kertas saring dikeluarkan dari lubanglubangnya. Lembaran gel dimasukkan ke dalam nampan ke-mudian diberi pewarna yang masing-masing telah disiapkan sebelumnya. Selanjutnya nampan ditu-tup dengan alumunium foil atau yang lainnya dan diinkubasi pada suhu ruang sampai muncul pita-pita pada gel yang cukup jelas. Perendaman da-lam larutan pewarna memerlukan waktu antara 1 sampai 2 jam atau lebih bergantung dari sistem enzimnya. Larutan pewarna yang digunakan terdiri atas: Pewarna Esterase (EST) 100 mM sodium fosfat pH 7,0 1-Naftil asetat 2-Naftil asetat

100 ml 50 mg 50 mg

Aseton Fast blue RR salt

5 ml 100 mg

Pewarna Peroksidase (PER) 50 mM Natrium asetat pH 5,0100 ml CaCl2 H2O2 3% 3-Amino-9 etilkarbasol Aseton/N,N-dimethylformamid

50 mg 0,5 ml 50 mg 5 ml

8. Pencucian dan Fiksasi Selesai pewarnaan gel dicuci dengan air mengalir sampai bersih. Selanjutnya potongan gel yang berisi garis-garis (pita) dapat difiksasi dengan 50% gliserol : 50% etanol atau dengan etanol : akuades : asam asetat : gliserol (5 : 4 : 2 : 1). 9. Dokumentasi Langkah yang terakhir dari kegiatan analisis isoenzim adalah pengamatan atau dokumentasi. Karena daya tahan gel tidak terlalu lama bisa disimpan, maka sehabis pencucian kalau tidak diawetkan segera digambar atau dipotret. Untuk memudahkan pengamatan atau pemotretan, maka gel dipindahkan dari bak pewarna dengan plastik transparan. Analisis Data Untuk mempelajari keragaman tanaman kentang, maka perlu dilakukan penafsiran dan interpretasi pita-pita isoenzimnya. Selanjutnya dilakukan transformasi data, yaitu dengan merubah data kualitatif menjadi data biner (0,1). Satu jenis alel dengan nilai 1 pada kolom yang sesuai dan 0 untuk kolom lainnya. Data kuantitatif hasil transformasi kemudian dilakukan analisis gerombol (similarity) dengan menggunakan perangkat lunak NTSYS-pc (Exeter Software, New Yok). Fungsi dari kegiatan ektraksi sampel daun pada urutan kerja di atas, berfungsi untuk memisahkan antara protein dengan pengotor, sehingga dapat menghasilkan produk pita isoenzim yang jelas, yang dapat menggambarkan polimorfisme lokus dan alel suatu individu tertentu. Keberadaan pengotor dapat mengakibatkan kemunculan produk pita yang seharusnya tidak ada setelah proses staining (yang disebut kontaminasi). Pembuatan buffer secara tepat, berguna untuk menghasilkan gel interpretasi pita isozym yang bersih dan jelas,sehingga tidak menyulitkan pembaca. Di samping itu, kualitas buffer elektrode juga akan menentukan cepat lambatnya laju pita saat proses elektroforesis.

Diagram alur dari analisis isoenzim ini berdasarkan urutan kerja di atas dapat digambarkan sebagai berikut, : Sampel daun yang masih segar Pembuatan Bufer Pengekstrak

Pembuatan Bufer Gel dan Elektrode

Pembuatan Gel Pati

Ekstraksi Enzim

Elektroforesis

Pembuatan Larutan Pewarna

Analisis Keragaman

Foto Hasil Elektroforesis

Bab II Interpretasi Gel Hasil Elektroforesis IsoenzimTujuan Mengetahui cara pembacaan gel hasil elektroforesis isoenzim Mengetahui cara mendokumentasikan hasil pembacaan gel

Landasan teori Gel hasil elektroforesis yang telah diwarnai dengan enzim selanjutnya dapat dibaca pola pitanya. Pola pita yang nampak merupakan hasil pemisahan berdasarkan berat molekul melalui proses elektroforesis. Molekul yang memiliki ukuran paling besar / berat akan berjalan lambat sedangkan molekul yang ringan akan berjalan lebih cepat. Pola pita menunjukkan kedudukan lokus gen dan allele-allele yang ada pada tiap lokus tersebut. Kedudukan allele pada tiap lokus ditetapkan berdasarkan nilai Rf, yaitu jarak atau kedudukan suatu allele secara relatif terhadap penanda Bromophenol blue. Alat dan bahan Sampel gel hasil elektroforesis Blangko pengamatan

Cara kerja 1. Mempelajari cara pembacaan pola pita gel hasil elektroforesis 2. Mengamati salah satu gel yang merupakan hasil pewarnaan dengan sistem enzim tertentu 3. Menentukan nilai Rf dari allele tiap lokus yang anda baca 4. Membuat zimmogram

Hasil PengamatanEnzim Lokus No Individu Allele Jml Allel Rf Frek Allele Gntp Jml Gntp Frekwensi Genotipe Rf masing-masing allele (%) a b c d

GDH (17-7-95) ShDH (1-8-95)

GDH-1 SHDH-1 060

a a b a b a b a b

40 0 10 0 10 0 10 0 0

0,83

1 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 1,00 0,00 0,00

aa aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab

20 0 0 5 0 0 5 0 0 5 0 0

1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00

83 0 77 0

0,77

204

227

001

ShDH (1-8-95)

SHDH-2

060

a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b

10 6 4 9 1 10 0 0 8 2 8 0 10 0 10 5 5 6 4 1 9 10

0,68 0,72

0,00 1,00 0,60 0,40 0,90 0,10 1,00 0,00 0,00 0,80 0,20 0,80 0,00 1,00 0,00 1,00

204

227

001

ShDH (12-8-95)

SHDH-1

228

0,77 0,81

250

054

056

ShDH (12-8-95)

SHDH-2

228

0,72 0,68

0,50 0,50 0,60 0,40 0,10 0,90 1,00 0,00

250

054

056

bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb aa ab bb

0 0 0 5 3 0 2 4 1 0 5 0 0 0 4 0 1 0 4 5 0 0 0 5 0 2 1 2 3 0 2 0 1 4 5 0 0

0,00 0,00 0,00 1,00 0,60 0,00 0,40 0,80 0,20 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,80 0,00 0,20 0,00 0,80 1,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,40 0,20 0,40 0,60 0,00 0,40 0,00 0,20 0,80 1,00 0,00 0,00

72

68

81

77

72

68

Hasil Zimogram DNA digambarkan sebagai berikut

a 68 72 77 81 83

b

c

d

Keterangan : ShDH-1 (1-8-95) ShDH-2 (1-8-95) GDH-1 ShDH-1 (12-8-95) ShDH-2 (12-8-95)

Pembahasan Proses pembacaan (interpretasi) pita hasil proses elektroforesis dilakukan dengan beberapa tahapan. Pertama, dilakukan pengamatan pada gel seberapa banyak lokus yang dihasilkan oleh sebuah individu tertentu dengan menggunakan suatu sistem enzim. Misalkan pada gambar 2 (ShDH,1.8.95), dapat terlihat bahwa terdapat 3 lokus yakni ShDH-1, ShDH-2 dan ShDH-3 dari empat individu yang digunakan (individu 060, 204, 227, 001). Tahap kedua, menentukan berapa allele yang dimiliki oleh suatu individu yang terdapat dalam lokusnya. Untuk ShDH-1, pada individu 060 diperoleh allele A dan C dengan genotipe AC (lihat tanda panah). Individu 204 memiliki dua lokus, yaitu ShDH-1 dan ShDh-2 dimana diperoleh allele A, B dan C dengan genotipe AC dan AB. Pada individu 227, diperoleh satu lokus yaitu ShDH-1 dengan allele A dan B pada genotipe AB. Terakhir pada individu 0001, dimiliki satu lokus yaitu lokus ShDH-3 dengan allele B pada genotipe BB. Berikutnya, tahap ketiga dilakukan penentuan presentase allele pada tiap-tiap lokus dan setiap sistem enzim. Ini dilakukan untuk mengetahui berapa besar nilai sebaran allele yang akan berguna untuk penggambaran zimmogram.

Gambar 1. Gel hasil elektroforesis dengan sistem enzim GDH dan POD-4

Alel C Alel B Alel A

Gambar 2. Gel hasil elektroforesis dengan sistem enzim ShDH Penentuan Rf dilakukan dengan cara membandingkan jarak antara garis awal bergeraknya pita hingga ujung pangkal gel, dengan garis awal gel hingga pita allele tertentu dikalikan dengan 100 % (lihat tanda panah hijau pada gambar 2, untuk Rf pada allele A). . Dari hasil perhitungan, dilanjutkan pada tahap keempat dengan pembuatan zimmogram, yakni suatu diagram garis yang menggambarkan pita hasil elektroforesis berdasarkan perhitungan Rf. Secara sederhana, zimmogram menjelaskan variasi fenotipe individu berdasarkan mobilitas pita-yang variatif, yang dimunculkan oleh perbedaan allele penyusun genotipe. Tahap terakhir ialah perhitungan frekuensi genotipe dan frekuensi allele dari masingmasing individu. Pada gambar 2 (ShDH,1.8.95), diperoleh hasil frekuensi allele pada tiap individu ialah sebagai berikut : Untuk individu 060, memiliki frekuensi genotipe AC sebesar jumlah genotipe AC dibagi jumlah genotipe total, yaitu 5 / 5 = 1,00. Sedangkan frekuensi allele dari individu ini yakni untuk allele A sebesar = jumlah allele A dari genotipe homozigot + (1/2 x allele A dari genotip heterozigot) = 0 + 0,5 = 0,5. Untuk allele C yakni sebesar jumlah allele C dari genotipe homozigot + (1/2 x allele C dari genotipe heterozigot) = 0 + 0,5 = 0,5. Pada individu lainnya yakni individu 204, 227 dan 001 dengan cara dan perhitungan yang sama diperoleh hasil sebagai berikut : Individu 204 : Frekuensi genotipe AC = 2/5 dan AB = 3/5 Frekuensi allele A = 0,5 ; B = 0,3 ; C = 0,2 Individu 227 : Frekuensi genotipe AB = 5/5 Frekuensi allele A = 0,5 ; B = 0,5 Individu 001 :

Frekuensi genotipe BB = 5/5 Frekuensi allele B = 1,00 Hasil frekuensi genotipe dan frekuensi allele di atas menggambarkan, seberapa besar keragaman genetik (allele dan genotipe) pada suatu individu. Artinya, hasil ini dapat menjadi patokan atau dasar penentuan kegiatan pemuliaan maupun konservasi jenis tanaman tersebut pada masa mendatang.

Bab III Interpretasi Hasil Elektroforesis Molekul DNATujuan Mengetahui cara pembacaan hasil elektroforesis DNA dengan penanda genetik yang dominan dan kodominan

Landasan teori Cara interpretasi hasil elektroforesis molekul DNA (dapat berupa gel atau dalam bentuk lain) dilakukan berdasarkan tipe penanda genetik yang digunakan. Prinsipnya, untuk penanda yang dominan (misalkan RAPD, AFLP) dibaca berdasarkan ada tidaknya fragmen DNA, sedangkan untuk penanda kodominan (misalnya PCR-RFLP, SSR) dibaca berdasarkan polimorfisme dari jumlah pasangan basa tiap fragmen DNA. Interpretasi dapat dilakukan secara manual dengan membaca langsung pita (misal RAPD, PCR-RFLP) atau secara otomatis dengan bantuan program komputer (misal AFLP, SSR). Perhitungan jumlah pasangan basa dengan bantuan program komputer sangat membantu di dalam melakukan analisis. Perhitungan secara manual, misalnya pada analisis data PCR-RFLP, memerlukan kecermatan di dalam melakukan rekonstruksi fragmen. Alat dan bahan Sampel data hasil elektroforesis dari berbagai penanda molekuler Blangko pengamatan

Cara kerja 1. Mempelajari cara membaca pola pita hasil elektroforesis 2. Menggunakan contoh pola pita dari berbagai penanda molekuler Analisa data Contoh 1Populasi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 0 1 1 1 0 0 0 0 1

1 0 0 0 0 0 0 1 1 1

1 0 1 1 1 0 1 0 0 0

1 0 1 1 0 1 0 1 0 0

1 0 1 0 1 1 1 0 1 1

1 0 0 0 0 1 1 1 0 0

1 0 0 1 1 1 0 0 1 1

1 1 0 1 0 0 1 1 0 0

1 0 1 1 0 0 0 0 1 1

1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1 1 0 0 0 0 0 0

Contoh 2Populasi 0,51 kb 0,53 kb 0,59 kb 0,79 kb 1,21 kb 1,56 kb 1,74 kb 4A 0 0 0 0 1 1 0 4B 1 0 0 0 1 1 0 4C 1 0 0 1 1 1 0 4D 1 0 0 1 1 1 1 5A 1 0 0 0 1 1 0 5B 0 0 0 0 0 1 1 5C 0 1 1 0 1 1 0 5D 0 0 1 1 1 1 0 6A 1 0 0 1 1 1 0 6B 1 0 0 1 1 1 0 6C 0 0 0 1 1 1 0 6D 0 0 0 1 1 1 0

Populasi 4A 4B 4C 4D 5A 5B 5C 5D 6A 6B 6C 6D

0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0

0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0

0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0

Contoh 3 Populasi 1 200 bp 250 bp 400 bp 500 bp 550 bp 600 bp 700 bp 720 bp 750 bp 800 bp 850 bp 900 bp 1000 bp 1100 bp 1200 bp 1300 bp 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 2 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 3 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 4 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 5 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 8 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 9 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 10 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 11 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 12 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 13 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 14 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0

Populasi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0

0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1

1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0

Hasil pengamatan pada zimogram individu 1,2 dan 31 2 3 1300 bp 1200 bp 1100 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

Data hasil pembacaan DNAEco 700 350 Bgl 900 150 mbo 850 150 50 1050 EcoBgl 550 350 150 1050 EcoMbo 330 250 150 50 780 BglMbo 850 150 50 1050

1050

1050

Eco-Bgl-EcoBgl

Susunan pemotongan yang tepat ditunujukkan oleh garis disamping

Eco-Mbo-EcoMbo

Pada pembacaan potongan EcoMbo ini terdapat kesulitan, dikarenakan jumlah totalnya tidak sama karena mungkin ada pita yang tidak tampak, sehingga jumlah total bp tidak dapat diperkirakan.

Mbo-Bgl-BglMbo

Susunan urutan potongan ditunujukkan oleh garis yang menghubungkan ketiganya

Pembahasan Penanda genetik merupakan salah satu penanda yang saat ini sering diaplikasikan dalam rangka membentuk informasi dasar genetik suatu jenis untuk tujuan program pemuliaan maupun konservasi dari jenis tersebut. Penanda genetik mengikuti prinsip Hukum Pewarisan Mendel dan terbagi menjadi tiga jenis yakni penanda morfologi, penanda protein dan penanda molekuler atau DNA. Pada acara ini, dilakukan interpretasi gel hasil elektroforesis dari salah satu penanda genetik tersebut, yakni penanda molekuler atau lebih dikenal dengan penanda DNA. Penanda DNA sendiri terbagi ke dalam dua jenis yakni penanda dominan dan penanda kodominan. Menurut RVC (2004) sebagaimana dijelaskan dalam artikel Wikipedia, penanda kodominan merupakan penanda yang dapat membedakan kelas genotipe resesif dari kelas-kelas genotipe yang lain. Sedangkan penanda dominan, tidak dapat memisahkan heterozigot dari salah satu kelas homozigot yang berarti tidak dapat membedakan genotipe resesif. Penanda genetik dominan yang digunakan sebagai bahan interpretasi pada praktikum ini ialah produk RAPD. Random Amplified Polymorphism DNA, demikian kepanjangan dari RAPD, merupakan penanda yang dapat dikatakan paling banyak digunakan dengan adanya efisiensi biaya, meskipun reliabilitasnya rendah sehingga cenderung jarang digunakan untuk keperluan diagnostik yang membutuhkan banyak ketelitian hasil (misalkan analisis sidik jari manusia). Penanda kodominan yang digunakan yakni AFLP dan SSR, yang interpretasinya dapat dilakukan dengan bantuan program komputer. Tingkat ketelitian dari keduanya dapat dikatakan tinggi, namun terimbas pada mahalnya biaya penggunaan yang menyebabkan kurang aplikatif di pelbagai perusahaan perusahaan kehutanan. Tabel berikut dapat memberikan gambaran perbandingan biaya, teknik, ketelitian pada beberapa penanda genetik.

Tabel 1. Perbandingan beberapa marka molekuler dan penggunaannyaRFLP RAPD DAF STS(CA PS)Kadang membutu hkan endonukle ase restriksi pada hasil PCR

SSR

AFLPEndonukl ease restriksi digunakan dalam adaptor dan primer yang selektif

SAMPL

REMAP/I RAPAmplifikas i DNA mengguna kan retrotransp oson dan primer SSR

SNP

Prinsip

Endonuk lease restriksi, Southern blot hibridisa si

Amplifi kasi DNA dengan primer acak

Amplifi kasi DNA dengan primer acak

Amplifik asi dari repeat sekuens membutu hkan primer khusus

Sama dengan AFLP kecuali perlu primer berlabel

Analisis sekuens

Tipe polimorfi sme yang dideteksi Informasi sekuens yang dibutuhk an Metoda deteksi (radioisot op) Hasil yang dapat diperoleh Jumlah lokus yang dideteksi Pewarisa n Kesulitan teknis Kemungk inan automasi Kemungk inan komputas i Biaya Pengguna an untuk (1) varia si finge rprint ing dan kerag aman genet ic (2) gen kualitatif sasaran

Pertuka ran basa (I,D,S)

Pertuk aran basa (I,D,S)

Pertuk aran basa (I,D,S)

Pertukar an basa (I,D,S)

Variasi dari panjang nya repeat sekuens



Variasi dlm panjang

Pertukar an satu basa

Tidak

Tidak

Tidak

Ya

Ya

Tidak

Tidak

Ya

Ya

Ya/tida k

Tidak

Ya/tid ak

Ya/tidak

Ya/tida k

Ya/tidak

Ya/tidak

Tidak

Tidak

Tinggi

Renda h

Renda h

Tinggi

Tinggi

Tinggi

Tinggi

Tinggi

Tinggi

1-5

1-10

20-30

1-4

1-3

>70

~50

3-5

1 (bialel)

Codomina n Sedang -

Domin an Renda h -

Domin an Sedan g -

Codominan Rendah +

Codomina n Rendah +

Umumn ya dominan Sedang/t inggi +

Dominan / codominan Sedang/t inggi +

Codominan Sedang +

Dominan

Sedang/t inggi +

+

+

+

++

+++

+++

+++

+++

+++

Sedang

Renda h

Sedan g

Sedang/t inggi

Tinggi

Tinggi

Tinggi

Tinggi

Tinggi

+

++

++

+

+++

+++

+++

++

++

++

++

++

++

++

+++

+++

+

+

(3) QTL mapping (4) MAS (5) pembandi ngan mapping

++ + ++

-/+ +

-

+ ++ ++

++ ++ ++

++ ++ ++

++ ++ ++

+ -

+ ++ ++

Keterangan : Pertukaran basa I (penambahan), D (pengurangan), S (penggantian) Sumber : Gupta et al., (2002)

Penggunaan penanda genetik tersebut di atas memiliki kelebihan dan kelemahan masing-masing, sehingga umumnya dipilih berdasarkan tujuan penggunaannya. Misalkan SSR amat cocok untuk analisis fingerprint, RAPD biasa dipilih untuk analisis keragaman genetik dan seterusny, dimana tujuan penggunaan pada penelitian biasanya ditentukan dari desain dan konsep Gambar 1. Gel RAPD dalam penelitian K.Harada et al (1994) penelitiannya. Cara pembacaan dari pita penanda molekuler juga dibedakan berdasarkan sifatnya, apakah dominan atau kodominan. Pada penanda dominan semacam RAPD, dilakukan pembacaan berdasarkan ada tidaknya kemunculan pita pada gel. Menurut K. Harada et al (1994) dalam penelitiannya mengenai analisis RAPD pada tiga spesies Shorea, pita pada gel RAPD diskor sebagai 1 untuk pita yang muncul, dan 0 untuk pita yang tidak muncul. Ini dilakukan secara manual oleh peneliti dengan bantuan pembimbing maupun pengajar yang sudah berpengalaman dalam pembacaan, sehingga faktor subjektivitas pembacaan pita dapat diminimalkan. Dapat dilihat pada gambar 1, terlihat bahwa pada huruf a dan b menggambarkan lokus yang monomorfik, untuk huruf c menggambarkan lokus polimorfik, sedangkan huruf d dapat dikatakan sebagai lokus unik. Sedangkan pada penanda kodominan, pembacaan dilakukan dengan polimorfisme dari jumlah pasangan basa tiap fragmen DNA. Pada RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphysm) misalnya, hal ini dilakukan dengan mengetahui letak pemotongan fragmen DNA yang dilakukan oleh enzim restriksi. Dapat dilihat pada contoh gambar 2, mengenai RFLP analisis. Terdapat 126 kilo basepair (bsp) yang dipotong dengan enzim RsaI. Terlihat pemotongan pada 4 spesies Thunnus sp. (1,2,3,4) sedangkan M sebagai ladder dengan tempat pemotongan fragmen seperti angka yang ditunjukkan dengan tanda panah. Pada data yang dilakukan pada praktikum ini terlihat bahwa terdapat gel yang serupa namun berbeda kualitas pita,terutama pada RAPD. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya pengaruh

penggunaan buffer yang tentunya memiliki formula dan penggunaan yang berbeda (sekali pakai, dua kali pakai, dan sebagainya), kualitas ekstraksi dan purifikasi sampel, atau dapat dikarenakan pengaruh ada-tidaknya proses staining gel (metode pengecatan, mirip pada analisis isozim) yang dapat dilakukan, tidak dilakukan pun bisa (dengan tahapan ethidium bromide dicampur langsung pada bahan pembuatan gel).

Bab IV Diversitas Genetik Dalam PopulasiTujuan Mengetahui prinsip perhitungan diversitas genetik dalam populasi

Landasan teori Berdasarkan hasil pengamatan dengan menggunakan marker biokimia ataupun molekuler, selanjutnya dapat dihitung struktur atau frekuensi allele dan genotipe, serta diversitas genetik dalam suatu populasi. Beberapa parameter yang dapat dipergunakan untuk mengukur diversitas dalam populasi yaitu : Jumlah lokus yang polimorfik (PP = percentage of polymorphic loci) Rerata jumlah allele per lokus (A/L = allele / locus) Jumlah efektif allele per lokus (v = allelic diversity) Diversitas genetik; Heterozigositas harapan (He = Expected heterozigosity) Heterozigositas yang teramati (Ho = Observed heterozigosity)

Alat dan bahan Contoh simulasi hasil pengamatan Kalkulator

Cara kerja 1. Mempelajari prosedur perhitungan diversitas genetik dalam populasi 2. Menghitung parameter diversitas genetik dalam populasi yang dapat diamati

Analisa dataSampel 1 Genotipe No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Allele 299 299 297 299 299 297 297 299 300 300 299 300 299 300 299 300 301 298 301 299 300 299 298 299 300 299 299 299 299 298 297 299 Allele 300 300 300 301 300 299 299 300 300 301 299 301 299 300 301 300 301 301 301 300 300 300 301 299 300 301 299 300 299 299 300 301 Genotipe 299/300 299/300 297/300 299/301 299/300 297/299 297/299 299/300 300/300 300/301 299/299 300/301 299/299 300/300 299/301 300/300 301/301 298/301 301/301 299/300 300/300 299/300 298/301 299/299 300/300 299/301 299/299 299/300 299/299 298/299 297/300 299/301 Homosigot = 12 Ho = Ho = (32-12)/32 0,6250 He = He = He = 1 - Pi2 1-0,2896 0,7104 Alel 297 298 299 300 301 Jml 4 3 24 21 12 64 Alel Frek(Pi) 0,0625 0,0469 0,3750 0,3281 0,1875 1,0000 Pi^2 0,0039 0,0022 0,1406 0,1077 0,0352 0,2896 Gen 297/299 297/300 298/299 298/301 299/299 299/300 299/301 300/300 300/301 301/301 Jml 2 2 1 2 5 7 4 5 2 2 32 Frek 0,0625 0,0625 0,0313 0,0625 0,1563 0,2188 0,1250 0,1563 0,0625 0,0625 1

Primer 1 Genotipe Jml 1 2 2 1 1 1 1 3 2 1 3 2 2 1 2 25

No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Allele 102 106 106 98 100 104 104 100 104 108 108 98 98 104 104 100 108 112 104 108 114 114 110 110 100

Allele 108 112 112 104 100 104 104 100 108 108 108 104 98 112 108 108 108 112 108 112 114 114 110 114 108

Genotipe 102/108 106/112 106/112 98/104 100/100 104/104 104/104 100/100 104/108 108/108 108/108 98/104 98/98 104/112 104/108 100/108 108/108 112/112 104/108 108/112 114/114 114/114 110/110 110/114 100/108

Gen 98/98 98/104 114/114 112/112 110/114 110/110 108/112 108/108 106/112 104/112 104/108 104/104 104/104 102/108 100/100 Total

Frek 0,0400 0,0800 0,0800 0,0400 0,0400 0,0400 0,0400 0,1200 0,0800 0,0400 0,1200 0,0800 0,0800 0,0400 0,0800 1,0000

Alel 98 100 102 104 106 108 110 112 114 Total

Alel Jml Frek(Pi) 4 0,0800 6 0,1200 1 0,0200 10 0,2000 2 0,0400 13 0,2600 3 0,0600 6 0,1200 5 0,1000 50 1,0000

Pi^2 0,0064 0,0144 0,0004 0,0400 0,0016 0,0676 0,0036 0,0144 0,0100 0,1584

He = He =

1 - Pi2 0,8416

Homozigot = 12 Ho = (25-12)/25 Ho = 0,5200

Primer 2 Genotipe No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Allele 100 109 126 109 126 126 100 109 109 126 109 109 122 136 109 109 122 136 122 100 136 122 136 122 100 Allele 100 148 136 122 136 136 126 136 148 126 122 109 122 136 122 148 122 136 122 148 136 122 136 122 148 Genotipe 100/100 109/148 126/136 109/122 126/136 126/136 100/126 109/136 109/148 126/126 109/122 109/109 122/122 136/136 109/122 109/148 122/122 136/136 122/122 100/148 136/136 122/122 136/136 122/122 100/148 Gen 100/100 100/126 100/148 109/109 109/122 109/136 109/148 122/122 126/126 126/136 136/136 Total Jml 1 1 2 1 3 1 3 5 1 3 4 25 Frek 0,0400 0,0400 0,0800 0,0400 0,1200 0,0400 0,1200 0,2000 0,0400 0,1200 0,1600 1

Alel 100 109 122 126 136 148 Total

Alel Jml Frek(Pi) 5 0,1000 9 0,1800 13 0,2600 6 0,1200 12 0,2400 5 0,1000 50 1,000

Pi^2 0,0100 0,0324 0,0676 0,0144 0,0576 0,0100 0,1920

He = He =

1 - Pi2 0,8080

Homozigot = 12 Ho = (25-12)/25 Ho = 0,5200

Primer 3 Genotipe No Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Allele 195 195 180 160 150 210 195 180 160 195 180 210 195 160 210 180 160 195 180 210 180 195 160 195 195 Allele 210 195 180 160 180 210 195 195 160 195 180 210 195 160 210 180 160 195 210 210 180 210 180 210 210 Genotipe 195/210 195/195 180/180 160/160 150/180 210/210 195/195 180/195 160/160 195/195 180/180 210/210 195/195 160/160 210/210 180/180 160/160 195/195 180/210 210/210 180/180 195/210 160/180 195/210 195/210 Gen 150/180 160/160 160/180 180/180 180/195 180/210 195/195 195/210 210/210 Total Jml 1 4 1 4 1 1 5 4 4 25 Frek 0,0400 0,1600 0,0400 0,1600 0,0400 0,0400 0,2000 0,1600 0,1600 1,000

Alel 150 160 180 195 210 Total

Jml

Alel Frek(Pi) 1 0,0200 9 0,1800 12 0,2400 15 0,3000 13 0,2600 50 1,000

Pi^2 0,0004 0,0324 0,0576 0,0900 0,0676 0,2480

He = He =

1 - Pi2 0,7520

Homozigot = 12 Ho = (25-17)/25 Ho = 0,3200

Pembahasan Pengertian populasi secara genetik dapat diterjemahkan sebagai populasi Mendelian. Menurut buku bahan ajar genetika populasi, populasi Mendelian merupakan sekelompok individu suatu spesies yang bereproduksi secara seksual, hidup di tempat tertentu pada saat yang sama, dan di antara mereka terjadi perkawinan (interbreeding) sehingga masing-masing akan memberikan kontribusi genetik ke dalam lungkang gen (gene pool). Setiap populasi memiliki struktur maupun frekuensi allele yang khas, serta diversitas (keragaman) genetik yang berbeda beda. Faktor-faktor yang mempengaruhi diversitas genetik pada suatu populasi antara lain ialah frekuensi genotipe dan frekuensi allele dalam populasi tersebut. Frekuensi genotipe merupakan proporsi kemunculan individu di dalam suatu populasi yang memiliki genotipe tertentu, sedangkan frekuensi allele merupakan proporsi terdapatnya allele tertentu pada suatu lokus. Dengan diketahuinya frekuensi allele dan frekuensi genotipe, dapat ditentukan nilainilai yang menjadi parameter diversitas genetik, yakni jumlah lokus polimorfik (PP), rerata jumlah allele per lokus (A/L), jumlah efektif allele per lokus (v), serta heterozigositas harapan (He) dan heterozigositas teramati (Ho). Dalam praktikum ini terdapat data 5 populasi tanaman yang terbagi menjadi populasi 1, 2, 3, 4 dan 5 dengan masing-masing populasi sebanyak 60 individu dengan 5 lokus yang berbeda (Mdh-1, Mdh-2, Got-1, Lap-1, Lap-2). Pada populasi pertama, genotipe yang relatif memiliki frekuensi besar atau frekuensi genotipe yang besar nilainya, ialah genotipe bb, yakni pada lokus Mdh-1, Got-1 dan Lap-1 sebesar 0,63, 0,88 dan 0,40. Artinya, sebagian besar individu populasi 1 memiliki genotipe tersebut. Berikutnya pada populasi 2, 3, 4 dan 5 masing-masing didominasi genotipe bb (pada lokus Mdh-1, Mdh-2, Got-1 dan Lap-1), dd (pada lokus Lap-1 dan Lap-2) serta bb pada populasi 4 dan 5 (pada lokus Mdh-1, Mdh-2, Got-1 dan Lap-1). Selanjutnya, frekuensi allele yang dimiliki oleh lokus Lap-1 merupakan frekuensi allele yang paling ideal pada populasi 1 (sebesar 0,3410), mengingat proporsinya cenderung paling merata di antara lokus lainnya sehingga keturunannya masih dapat memiliki jaminan diversitas genetik. Berbeda dengan frekuensi allele dari lokus Lap-2, dimana allele-nya terfiksasi pada allele C, sehingga diperlukan perhatian lebih dalam migrasi maupun gene flow dalam upaya mengembalikan diversitas genetik pada keturunannya. Frekuensi allele pada populasi 2, 3, 4 dan 5 yang relatif ideal dan dapat menjamin diversitas genetik pada populasi tersebut, masing-masing ialah pada lokus Lap-1 (0,3168), pada lokus Lap-1 (0,3376), pada lokus Lap-2 (0,3756) dan pada lokus Lap-1 (0,2910). Dari sini, dapat diketahui jumlah allele efektif per lokus atau nilai v, dengan membandingkan antara total proporsi allele (1) dibagi dengan jumlah kuadrat frekuensi allele. Diperoleh nilai v tertinggi pada populasi satu yakni 2,9328 dari lokus Lap-1, yang menunjukkan bahwa efektivitas allele atau sumbangan kinerja allele pada lokus Lap-1 relatif besar. Hal ini dapat dibandingkan dengan efektivitas allele terfiksasi pada populasi 1 yakni dari lokus Lap-2 (sebesar 1,00) yang menunjukkan rendahnya sumbangsih allele tersebut terhadap keragaman genetik lokus ini.

Nilai heterozigositas teramati (Observed Heterozigocity atau Ho) dan heterozigositas harapan (Expected Heterozigocity atau He) dapat dibandingkan untuk dijadikan sebagai dasar, sejauh mana kinerja lokus dalam suatu populasi berperan dalam membentuk heterozigositas yang menjadi sumber keanekaragaman genetik. Pada populasi 1 diperoleh nilai Ho dan He terbesar pada lokus Lap-1, yakni masing-masing sebesar 0,1500 dan 0,6590. Artinya, sumbangsih heterozigositas yang telah terjadi (Ho) dari lokus Lap-1 baru sebesar 0,1500 dari prediksi kemampuan sebesar 0,6590, atau baru sekitar 23 % saja. Sehingga dapat dikatakan,perlu tindakan pengelolaan, diutamakan pada lokus Lap-1, agar heterozigositas observed (Ho) dari lokus tersebut dapat meningkat dan optimal sesuai harapan (He) demi kepentingan diversitas genetik populasi 1 secara keseluruhan. Selanjutnya, berturut-turut Ho dan He dari populasi 2, 3, 4 dan 5 yang masih potensial untuk dikelola dan diotimalkan untuk sumbangsih diversitas genetik dalam populasi masing-masing pada lokus Lap-1 (0,2333 ; 0,6832), pada lokus Got-1 (0,100 ; 0,5050), pada lokus Lap-1 (0,1833 ; 0,4832) dan pada lokus Got-1 (0,1500 ; 0,5113).

Bab V Diversitas Genetik Antar PopulasiTujuan Mengetahui prinsip prosedur laboratorium untuk analisis isoenzim Mengenal teknik optimalisasi prosedur laboratorium

Landasan teori Berdasarkan hasil pengamatan dengan menggunakan marker biokimia ataupun molekuler, diversitas genetik antar populasi dapat dihitung, di samping diversitas genetik dalam populasi. Salah satu cara yang dapat digunakan ialah melakukan analisa kelompok (cluster analysis) berdasarkan jarak genetik antar setiap pasangan populasi yang dibandingkan. Terdapat beberapa rumus yang disusun untuk menghitung jarak genetik. Analisis kelompok menghasilkan dendrogram yang menggambarkan jauh dekatnya hubungan genetik antar populasi. Alat dan bahan Contoh simulasi hasil pengamatan Kalkulator

Cara kerja 1. Mempelajari prosedur perhitungan diversitas genetik dalam populasi 2. Menghitung jarak genetik antar populasi yang anda amati 3. Membuat dendrogram berdasarkan nilai jarak genetik yang diperoleh

Analisa DataFrek Alle Lokus Mdh-1

Mdh-2

Got-1

Lap-1

Lap-2

Alel a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e a b c d e

Pop I Pop II Pop III Pop IV Pop V 0,0000 0,0083 0,0000 0,1583 0,0000 0,7000 0,7833 0,1917 0,6667 0,2917 0,3000 0,0000 0,8083 0,1750 0,7083 0,0000 0,2083 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,8500 0,0000 0,7667 0,5583 0,7667 0,1500 0,8833 0,2333 0,3500 0,2333 0,0000 0,1167 0,0000 0,0917 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0167 0,0167 0,4833 0,0167 0,9000 0,8833 0,4167 0,5167 0,5417 0,1000 0,1000 0,5667 0,0000 0,4417 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0583 0,0750 0,1250 0,5917 0,1917 0,4250 0,4833 0,1333 0,4083 0,2000 0,3667 0,2250 0,2500 0,0000 0,1833 0,1500 0,0667 0,4917 0,0000 0,4250 0,0000 0,1500 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,4917 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,4000 0,0000 0,1667 0,0000 1,0000 0,1083 0,0250 0,4000 0,0000 0,0000 0,0000 0,9750 0,4333 1,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000

I D = -ln I

I - II I - III I - IV I * II I^2 II^2 I * III I^2 III^2 I * IV I^2 IV^2 0,0000 0,0000 0,0001 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0251 0,5483 0,4900 0,6136 0,1342 0,4900 0,0367 0,4667 0,4900 0,4444 0,0000 0,0900 0,0000 0,2425 0,0900 0,6534 0,0525 0,0900 0,0306 0,0000 0,0000 0,0434 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,7225 0,0000 0,6517 0,7225 0,5878 0,4746 0,7225 0,3117 0,1325 0,0225 0,7803 0,0350 0,0225 0,0544 0,0525 0,0225 0,1225 0,0000 0,0000 0,0136 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0084 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,0000 0,0000 0,0003 0,0000 0,0000 0,2336 0,7950 0,8100 0,7803 0,3750 0,8100 0,1736 0,4650 0,8100 0,2669 0,0100 0,0100 0,0100 0,0567 0,0100 0,3211 0,0000 0,0100 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0044 0,0034 0,0056 0,0073 0,0034 0,0156 0,0345 0,0034 0,3501 0,2054 0,1806 0,2336 0,0567 0,1806 0,0178 0,1735 0,1806 0,1667 0,0825 0,1344 0,0506 0,0917 0,1344 0,0625 0,0000 0,1344 0,0000 0,0100 0,0225 0,0044 0,0738 0,0225 0,2417 0,0000 0,0225 0,0000 0,0000 0,0000 0,0225 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,2417 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1600 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0278 0,1083 1,0000 0,0117 0,0250 1,0000 0,0006 0,4000 1,0000 0,1600 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,9506 0,0000 0,0000 0,1878 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 1,8965 3,4860 2,9718 1,7494 3,4860 3,1163 2,1193 3,4860 2,3357 0,5892 0,5308 0,7427 0,5290 0,6334 0,2974

I-V II - III II - IV I*V I^2 V^2 II*III II^2 III^2 II*IV II^2 IV^2 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0000 0,0013 0,0001 0,0251 0,2042 0,4900 0,0851 0,1501 0,6136 0,0367 0,5222 0,6136 0,4444 0,2125 0,0900 0,5017 0,0000 0,0000 0,6534 0,0000 0,0000 0,0306 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0434 0,0000 0,0000 0,0434 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,6517 0,7225 0,5878 0,0000 0,0000 0,5878 0,0000 0,0000 0,3117 0,0350 0,0225 0,0544 0,2061 0,7803 0,0544 0,3092 0,7803 0,1225 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0136 0,0000 0,0107 0,0136 0,0084 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,0003 0,0003 0,0003 0,0081 0,0003 0,2336 0,4875 0,8100 0,2934 0,3681 0,7803 0,1736 0,4564 0,7803 0,2669 0,0442 0,0100 0,1951 0,0567 0,0100 0,3211 0,0000 0,0100 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0112 0,0034 0,0367 0,0094 0,0056 0,0156 0,0444 0,0056 0,3501 0,0850 0,1806 0,0400 0,0644 0,2336 0,0178 0,1974 0,2336 0,1667 0,0672 0,1344 0,0336 0,0563 0,0506 0,0625 0,0000 0,0506 0,0000 0,0638 0,0225 0,1806 0,0328 0,0044 0,2417 0,0000 0,0044 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0225 0,0000 0,0000 0,0225 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,2417 0,0000 0,0000 0,2417 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1600 0,0000 0,0667 0,1600 0,0278 0,0000 1,0000 0,0000 0,0027 0,0117 0,0006 0,0433 0,0117 0,1600 0,0000 0,0000 1,0000 0,0000 0,0000 0,9506 0,0000 0,0000 0,1878 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 1,8622 3,4860 3,0088 0,9468 2,9718 3,1163 1,6596 2,9718 2,3357 0,5750 0,3111 0,6299 0,5534 1,1676 0,4622

II - V II*V 0,0000 0,2285 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,2061 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,4785 0,0442 0,0000 0,0000 0,0144 0,0967 0,0413 0,0283 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 1,1381 0,3806 0,9660 II^2 0,0001 0,6136 0,0000 0,0434 0,0000 0,0000 0,7803 0,0136 0,0000 0,0000 0,0003 0,7803 0,0100 0,0000 0,0000 0,0056 0,2336 0,0506 0,0044 0,0225 0,2417 0,1600 0,0117 0,0000 0,0000 2,9718 V^2 0,0000 0,0851 0,5017 0,0000 0,0000 0,5878 0,0544 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,2934 0,1951 0,0000 0,0000 0,0367 0,0400 0,0336 0,1806 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 1,0000 0,0000 3,0088 III*IV 0,0000 0,1278 0,1415 0,0000 0,0000 0,4281 0,0817 0,0000 0,0000 0,0000 0,0081 0,2153 0,0000 0,0000 0,0000 0,0740 0,0544 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,4225 0,0000 1,5632 0,5794 0,5457

III - IV III^2 0,0000 0,0367 0,6534 0,0000 0,0000 0,5878 0,0544 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,1736 0,3211 0,0000 0,0000 0,0156 0,0178 0,0625 0,2417 0,0000 0,0000 0,0000 0,0006 0,9506 0,0000 3,1163 IV^2 0,0251 0,4444 0,0306 0,0000 0,0000 0,3117 0,1225 0,0084 0,0000 0,0000 0,2336 0,2669 0,0000 0,0000 0,0000 0,3501 0,1667 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0278 0,1600 0,1878 0,0000 2,3357 III*V 0,0000 0,0559 0,5726 0,0000 0,0000 0,5878 0,0544 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,2257 0,2503 0,0000 0,0000 0,0240 0,0267 0,0458 0,2090 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,9750 0,0000 3,0274 0,9887 0,0114

III - V III^2 0,0000 0,0367 0,6534 0,0000 0,0000 0,5878 0,0544 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,1736 0,3211 0,0000 0,0000 0,0156 0,0178 0,0625 0,2417 0,0000 0,0000 0,0000 0,0006 0,9506 0,0000 3,1163 V^2 0,0000 0,0851 0,5017 0,0000 0,0000 0,5878 0,0544 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,2934 0,1951 0,0000 0,0000 0,0367 0,0400 0,0336 0,1806 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 1,0000 0,0000 3,0088 IV*V 0,0000 0,1944 0,1240 0,0000 0,0000 0,4281 0,0817 0,0000 0,0000 0,0000 0,0081 0,2799 0,0000 0,0000 0,0000 0,1134 0,0817 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,4333 0,0000 1,7444 0,6580 0,4185

IV - V IV^2 0,0251 0,4444 0,0306 0,0000 0,0000 0,3117 0,1225 0,0084 0,0000 0,0000 0,2336 0,2669 0,0000 0,0000 0,0000 0,3501 0,1667 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0278 0,1600 0,1878 0,0000 2,3357 V^2 0,0000 0,0851 0,5017 0,0000 0,0000 0,5878 0,0544 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,2934 0,1951 0,0000 0,0000 0,0367 0,0400 0,0336 0,1806 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 1,0000 0,0000 3,0088

D Standard Pop I Pop II Pop III Pop IV 0,5290 0,6334 1,1676 0,2974 0,4622 0,5457 0,5534 0,9660 0,0114 0,4185

Pop II Pop III Pop IV Pop V

Frek Alle Lokus Mdh-1

Mdh-2

Got-1

Lap-1

Lap-2



PI-PII PI-PIII PI-PIV PI-PV PII-PIII PII-PIV PII-PV PIII-PIV PIII-PV PIV-PV 0,0001 0,0000 0,0251 0,0000 0,0001 0,0225 0,0001 0,0251 0,0000 0,0251 0,0069 0,2584 0,0011 0,1667 0,3501 0,0136 0,2417 0,2256 0,0100 0,1406 0,0900 0,2584 0,0156 0,1667 0,6534 0,0306 0,5017 0,4011 0,0100 0,2844 0,0434 0,0000 0,0000 0,0000 0,0434 0,0434 0,0434 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,7225 0,0069 0,0851 0,0069 0,5878 0,3117 0,5878 0,0434 0,0000 0,0434 0,5378 0,0069 0,0400 0,0069 0,4225 0,2844 0,4225 0,0136 0,0000 0,0136 0,0136 0,0000 0,0084 0,0000 0,0136 0,0006 0,0136 0,0084 0,0000 0,0084 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,0003 0,2336 0,0003 0,0000 0,2178 0,0000 0,2178 0,0000 0,2178 0,0003 0,2336 0,1469 0,1284 0,2178 0,1344 0,1167 0,0100 0,0156 0,0006 0,0000 0,2178 0,0100 0,1167 0,2178 0,0100 0,1167 0,3211 0,0156 0,1951 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003 0,0044 0,2844 0,0178 0,0025 0,2669 0,0136 0,2178 0,0044 0,1600 0,0034 0,0851 0,0003 0,0506 0,1225 0,0056 0,0803 0,0756 0,0044 0,0434 0,0201 0,0136 0,1344 0,0336 0,0006 0,0506 0,0017 0,0625 0,0044 0,0336 0,0069 0,1167 0,0225 0,0756 0,1806 0,0044 0,1284 0,2417 0,0044 0,1806 0,0225 0,0000 0,0000 0,0000 0,0225 0,0225 0,0225 0,0000 0,0000 0,0000 0,2417 0,0000 0,0000 0,0000 0,2417 0,2417 0,2417 0,0000 0,0000 0,0000 0,1600 0,0000 0,0278 0,0000 0,1600 0,0544 0,1600 0,0278 0,0000 0,0278 0,7951 0,9506 0,3600 1,0000 0,0069 0,0851 0,0117 0,1406 0,0006 0,1600 0,0000 0,9506 0,1878 1,0000 0,9506 0,1878 1,0000 0,2934 0,0006 0,3211 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,2665 0,3103 0,1583 0,2770 0,4194 0,1988 0,3704 0,2326 0,0070 0,1856

D min Pop I Pop II Pop III 0,2665 0,3103 0,4194 0,1583 0,1988 0,2326 0,2770 0,3704 0,0070 Pop IV


0,1856


Mdh-2

Got-1

Lap-1

Lap-2



PI-PII PI-PIII PI-PIV PI-PV PII-PIII PII-PIV PII-PV PIII-PIV PIII-PV PIV-PV 0,0083 0,0000 0,1583 0,0000 0,0083 0,1500 0,0083 0,1583 0,0000 0,1583 0,0833 0,5083 0,0333 0,4083 0,5917 0,1167 0,4917 0,4750 0,1000 0,3750 0,3000 0,5083 0,1250 0,4083 0,8083 0,1750 0,7083 0,6333 0,1000 0,5333 0,2083 0,0000 0,0000 0,0000 0,2083 0,2083 0,2083 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,8500 0,0833 0,2917 0,0833 0,7667 0,5583 0,7667 0,2083 0,0000 0,2083 0,7333 0,0833 0,2000 0,0833 0,6500 0,5333 0,6500 0,1167 0,0000 0,1167 0,1167 0,0000 0,0917 0,0000 0,1167 0,0250 0,1167 0,0917 0,0000 0,0917 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0167 0,0167 0,4833 0,0167 0,0000 0,4667 0,0000 0,4667 0,0000 0,4667 0,0167 0,4833 0,3833 0,3583 0,4667 0,3667 0,3417 0,1000 0,1250 0,0250 0,0000 0,4667 0,1000 0,3417 0,4667 0,1000 0,3417 0,5667 0,1250 0,4417 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0167 0,0667 0,5333 0,1333 0,0500 0,5167 0,1167 0,4667 0,0667 0,4000 0,0583 0,2917 0,0167 0,2250 0,3500 0,0750 0,2833 0,2750 0,0667 0,2083 0,1417 0,1167 0,3667 0,1833 0,0250 0,2250 0,0417 0,2500 0,0667 0,1833 0,0833 0,3417 0,1500 0,2750 0,4250 0,0667 0,3583 0,4917 0,0667 0,4250 0,1500 0,0000 0,0000 0,0000 0,1500 0,1500 0,1500 0,0000 0,0000 0,0000 0,4917 0,0000 0,0000 0,0000 0,4917 0,4917 0,4917 0,0000 0,0000 0,0000 0,4000 0,0000 0,1667 0,0000 0,4000 0,2333 0,4000 0,1667 0,0000 0,1667 0,8917 0,9750 0,6000 1,0000 0,0833 0,2917 0,1083 0,3750 0,0250 0,4000 0,0000 0,9750 0,4333 1,0000 0,9750 0,4333 1,0000 0,5417 0,0250 0,5667 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,4567 0,4917 0,4133 0,4517 0,7033 0,5183 0,6583 0,5383 0,0767 0,4767

D nol Pop I Pop II Pop III 0,4567 0,4917 0,7033 0,4133 0,5183 0,5383 0,4517 0,6583 0,0767 Pop IV


0,4767

Pembahasan Diversitas genetik merupakan suatu keanekaragaman genetik yang terdapat dalam skala antar individu dalam suatu populasi, antara individu dengan total populasi maupun antara populasi satu dengan yang lain. Terdapat parameter penentu jauh dekatnya hubungan kekerabatan antara satu individu dengan individu yang lain, atau antara populasi yang satu dengan populasi yang lain yang disebut sebagai jarak genetik (genetic distance). Jarak genetik ditentukan oleh frekuensi masing-masing allele pada tiap lokus dalam populasi. Metode perhitungan jarak genetik dalam praktikum in menggunakan tiga dasar : Dmin, Dnol dan Dstandar. Pada penerapan dasar Dmin, jarak genetik ini diperoleh dengan membandingkan antar populasi nilai frekuensi allele tersebut dengan cara mengkuadratkan selisih antara frekuensi allele antar populasi. Sebagai contoh pada data praktikum ini, terdapat nilai perbandingan jarak antara frekuensi allele a pada populasi 1 dan 2 dari lokus Mdh-1 sebesar (0,000 0,083)2 yakni sebesar 0,001. Dasar penerapan untuk Dstandar, menggunakan cara perkalian antara frekuensi allele yang sama pada setiap lokus dari dua populasi yang dibandingkan. Hasulnya kemudian dijumlahkan dan ditambahkan dengan akar kuadrat dari jumlah kuadrat frekuensi allele tiap populasi yang diperbandingkan. Hasilnya diperoleh dengan cara menggunakan formula = - ln (jumlah hasil). Sehingga diperoleh jarak genetik dengan dasar Dstandar. Sedangkan untuk Dnol, dilakukan proses perhitungan jarak genetik antar populasi dengan cara menghitung selisih absolut frekuensi allele yang sama pada tiap lokus dari dua populasi tersebut. Artinya, hasil pengurangan yang diperoleh selalu positif. Kemudian hasil tersebut dijumlahkan untuk mengetahui jarak genetik antar populasi yang diamati. Demikian seterusnya hingga diperoleh jumlah total dari seluruh allele di semua lokus dalam populasi sehingga diperoleh hasil berikutTabel 1. Hasil Perhitungan Jarak Genetik Antar Populasi dengan Dmin,Dnol dan Dstandar

D min Pop II Pop III Pop IV Pop V D nol Pop II Pop III Pop IV Pop V

Pop I Pop II Pop III Pop IV 0,2665 0,3103 0,4194 0,1583 0,1988 0,2326 0,2770 0,3704 0,0070 0,1856 Pop I Pop II Pop III Pop IV 0,4567 0,4917 0,7033 0,4133 0,5183 0,5383 0,4517 0,6583 0,0767 0,4767

D Standard Pop II Pop III Pop IV Pop V

Pop I 0,5290 0,6334 0,2974 0,5534

Pop II 0 1,1676 0,4622 0,9660

Pop III 0 0 0,5457 0,0114

Pop IV 0 0 0 0,4185

Dari hasil perhitungan tersebut, bisa diketahui bahwa setiap dasar memiliki hasil yang berbeda-beda. Nilai minimum yang menjadi awal pembentukan dari dendrogram nantinya, memiliki nilai yang berbeda meskipun sama-sama muncul pada nilai 2 populasi yang diamati yakni antara populasi 3 dan populasi 5 (tanda lingkaran merah pada tabel 1). Hal ini akan menjadi perbedaan dalam penentuan nilai awal penggambaran jarak genetik antar populasi dalam dendrogram. Pada pembuatan dendrogram, terdapat 4 metode penentuan analisis klaster atau pengelompokan, yakni UPGMA (Unweighted Pair G M A), Complete Linkage, WPGMA (Weighted Pair G M A) serta Single Linkage. Perbedaan dari keempat metode tersebut terletak pada penentuan nilai awal dari jarak genetik berdasarkan nilai Dmin, Dstandar atau Dnol, yang akan digunakan. Pada UPGMA dicari jarak yang terkecil terlebih dahulu (dengan angka pada lingkaran merah dan biru) sebagai populasi awal yang terdekat jarak genetiknya. Setelah itu, penentuan nilai jarak genetik terdekat selanjutnya dilakukan dengan penjumlahan jarak genetik antara populasi dan dipilih yang terendah. WPGMA memiliki konsep yang berkebalikan dengan UPGMA, yakni dipilih nilai penjumlahan tertinggi dari jarak genetik terekat yang bisa dikonstruksi. Hanya saja pada penentuan awal sama dengan UPGMA maupun metode lain,yakni dipilih dua nilai jarak terkecil dari tabel 1. Sedangkan untuk single lingkage dan complete lingkage, penentuan jarak genetik dilakukan berdasarkan jarak genetik yang telah dihitung pada tabel 1, dengan tidak dilakukan penambahan (konstruksi penentuan nilai berdasarkan nilai pada penentuan Dmin, Dnol dan Dstandar). Dari metode UPGMA, terlihat bahwa jarak genetik untuk nilai jarak Dmin membentuk klaster antara populasi III V serta antara populasi I IV dengan populasi II cenderung lebih dekat pada klaster populasi I - IV. Sedangkan pada analisis klaster nilai jarak Dnol dan Dstandar, menunjukkan hasil masing-masing pembentukan klaster pada populasi III V serta antara populasi I IV dengan populasi II memiliki kecenderungan lebih dekat kepada klaster I IV. Hal ini terjadi karena jauhnya jarak genetik antara klaster III V dengan klaster populasi I IV - II dengan analisis UPGMA. Penggunaan metode WPGMA dari data praktikum ternyata memiliki hasil bervariatif bila dibandingkan dengan UPGMA, dimana terjadi perbedaan klaster pada penerapan Dmin, Dnol dan Dstandar. Pada analisis WPGMA menggunakan Dmin, diperoleh klaster populasi I IV dan klaster populasi III V dengan populasi II cenderung lebih dekat dengan klaster populasi III V. Penggunaan Dnol menghasilkan klaster I IV dan klaster III V dengan populasi II cenderung lebih dekat dengan klaster populasi I IV. Sedangkan pada penerapan nilai Dstandar, terbentuk klaster populasi III V dan klaster populasi I IV dengan populasi II cenderung lebih dekat pada

klaster populasi I IV. Perbedaan ini mungkin timbul karena adanya signifikansi perbedaan nilai tertinggi antara nilai Dmin, Dnol dan D standar yang terlalu jauh. Penggunaan metode Single Linkage pada data praktikum menghasilkan dendrogram yang klaster populasinya relatif sama. Penggunaan nilai Dmin, Dnol dan Dstandar membentuk klaster populasi III V dan klaster populasi I IV, dengan populasi II cenderung dekat pada klaster I IV. Sedangkan untuk metode Complete Linkage, menghasilkan variasi klaster populasi pada dendrogram dengan nilai Dmin,dimana klaster populasi yang terbentuk ialah klaster populasi III V dan klaster populasi I IV dengan populasi 2 cenderung dekat dengan klaster populasi III V.

Bab VI Komponen Variasi Genetik Dalam dan Antar PopulasiTujuan Mengetahui prinsip perhitungan penambahan komponen variasi terhadap variasi total populasi

Landasan teori Variasi genetik yang diamati dapat diperinci berdasarkan komponen penambahan variasi terhadap variasi total populasi. Variasi total populasi merupakan hasil penambahan dari variasi antar populasi dan variasi dalam populasi. Hal ini dapat diamati dengan membandingkan parameter HT, HS dan DST Alat dan bahan Contoh simulasi hasil pengamatan Kalkulator

Cara kerja 1. Mempelajari prosedur perhitungan penambahan komponen variasi terhadap variasi total populasi. 2. Menghitung nilai HT, HS dan DST.

Analisa Data



Mdh-2

Got-1

Lap-1

Lap-2

Pop I 0,0000 0,7000 0,3000 0,0000 0,0000 0,8500 0,1500 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,9000 0,1000 0,0000 0,0000 0,0583 0,4250 0,3667 0,1500 0,0000 0,0000 0,0000 1,0000 0,0000 0,0000 5,0000

Pop II 0,0083 0,7833 0,0000 0,2083 0,0000 0,0000 0,8833 0,1167 0,0000 0,0000 0,0167 0,8833 0,1000 0,0000 0,0000 0,0750 0,4833 0,2250 0,0667 0,1500 0,4917 0,4000 0,1083 0,0000 0,0000 5,0000

Pop III 0,0000 0,1917 0,8083 0,0000 0,0000 0,7667 0,2333 0,0000 0,0000 0,0000 0,0167 0,4167 0,5667 0,0000 0,0000 0,1250 0,1333 0,2500 0,4917 0,0000 0,0000 0,0000 0,0250 0,9750 0,0000 5,0000

Pop IV 0,1583 0,6667 0,1750 0,0000 0,0000 0,5583 0,3500 0,0917 0,0000 0,0000 0,4833 0,5167 0,0000 0,0000 0,0000 0,5917 0,4083 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1667 0,4000 0,4333 0,0000 5,0000

Pop V 0,0000 0,2917 0,7083 0,0000 0,0000 0,7667 0,2333 0,0000 0,0000 0,0000 0,0167 0,5417 0,4417 0,0000 0,0000 0,1917 0,2000 0,1833 0,4250 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 1,0000 0,0000 5,0000

Avg 0,0333 0,5267 0,3983 0,0417 0,0000 0,5883 0,3700 0,0417 0,0000 0,0000 0,1067 0,6517 0,2417 0,0000 0,0000 0,2083 0,3300 0,2050 0,2267 0,0300 0,0983 0,1133 0,3067 0,4817 0,0000 5,0000

KPopII-V 0,0417 0,4833 0,4229 0,0521 0,0000 0,5229 0,4250 0,0521 0,0000 0,0000 0,1333 0,5896 0,2771 0,0000 0,0000 0,2458 0,3063 0,1646 0,2458 0,0375 0,1229 0,1417 0,1333 0,6021 0,0000

Kpop II 0,0396 0,4625 0,4979 0,0000 0,0000 0,7354 0,2417 0,0229 0,0000 0,0000 0,1292 0,5938 0,2771 0,0000 0,0000 0,2417 0,2917 0,2000 0,2667 0,0000 0,0000 0,0417 0,3563 0,6021 0,0000

Kpop III 0,0417 0,6104 0,2958 0,0521 0,0000 0,5438 0,4042 0,0521 0,0000 0,0000 0,1292 0,7104 0,1604 0,0000 0,0000 0,2292 0,3792 0,1938 0,1604 0,0375 0,1229 0,1417 0,3771 0,3583 0,0000

Kpop IV 0,0021 0,4917 0,4542 0,0521 0,0000 0,5958 0,3750 0,0292 0,0000 0,0000 0,0125 0,6854 0,3021 0,0000 0,0000 0,1125 0,3104 0,2563 0,2833 0,0375 0,1229 0,1000 0,2833 0,4938 0,0000

Kpop V 0,0417 0,5854 0,3208 0,0521 0,0000 0,5438 0,4042 0,0521 0,0000 0,0000 0,1292 0,6792 0,1917 0,0000 0,0000 0,2125 0,3625 0,2104 0,1771 0,0375 0,1229 0,1417 0,3833 0,3521 0,0000

D1 0,2167

D2 0,5292

D3 0,5125

D4 0,3313

D5 0,3875

Dj 0,3954

0,3271

0,7354

0,2229

0,0625

0,2229

0,3142

0,3104

0,2896

0,4063

0,4708

0,2500

0,3454

0,3208

0,3667

0,3875

0,5771

0,2479

0,3800

0,8667

0,8500

0,6167

0,1833

0,6479

0,6329

0,4083

0,5542

0,4292

0,3250

0,3513

0,4136

Pop I Mdh-1 Mdh-2 Got-1 Lap-1 Lap-2 0,4200 0,2550 0,1800 0,6590 0,0000 0,3028

Pop II 0,3429 0,2061 0,2094 0,6832 0,5865 0,4056

Pop III 0,3099 0,3578 0,5050 0,6624 0,0488 0,3768

Pop IV 0,4999 0,5574 0,4994 0,4832 0,6244 0,5329

Pop V 0,4132 0,3578 0,5113 0,7090 0,0000 0,3983

Hs rerata 0,3972 0,3468 0,3810 0,6394 0,2519 0,4033

Ht 0,5611 0,5152 0,5056 0,7534 0,6514 0,5973

Dst 0,1639 0,1684 0,1245 0,1140 0,3995 0,1941

Fst 0,2922 0,3269 0,2463 0,1514 0,6132 0,3249

Fis 0,38733 0,50020 0,44886 0,52035 0,47078 0,4710

Fit 0,5663 0,6636 0,5846 0,5930 0,7953 0,6429

Dari hasil pengamatan ini dapat disimpulkan bahwa sebagian besar dari total keragaman genetik (Ht = 0,5973) didistribusikan dalam populasi yaitu sebesar 0,4033 atau dan sisanya didistribusikan antar populasi (Dst) yakni sebesar 0,1941 atau, Populasi antar variasinya (Fst = 32,5 %), nilai inbreeding individu terhadap populasi (Fis = 47,1 %) dan nilai inbreeding individual terhadap total populasi (Fit = 64,3 %).

Nilai Ho Mdh-1 Mdh-2 Got-1 Lap-1 Lap-2 Pop I 0,1333 0,1333 0,0333 0,1500 0,0000 0,0900 Pop II 0,2500 0,2333 0,2333 0,2333 0,2333 0,2367 Pop III 0,3167 0,1000 0,1000 0,4833 0,0500 0,2100 Pop IV 0,2000 0,3000 0,5333 0,1833 0,3833 0,3200 Pop V 0,3167 0,1000 0,1500 0,4833 0,0000 0,2100 Rerata 0,2433 0,1733 0,2100 0,3067 0,1333 0,2133

Nilai He Mdh-1 Mdh-2 Got-1 Lap-1 Lap-2 Pop I 0,4200 0,2550 0,1800 0,6590 0,0000 0,3028 Pop II 0,3429 0,2061 0,2094 0,6832 0,5865 0,4056 Pop III 0,3099 0,3578 0,5050 0,6624 0,0488 0,3768 Pop IV 0,4999 0,5574 0,4994 0,4832 0,6244 0,5329 Pop V 0,4132 0,3578 0,5113 0,7090 0,0000 0,3983 Rerata 0,3972 0,3468 0,3810 0,6394 0,2519 0,4033

Nilai V Mdh-1 Mdh-2 Got-1 Lap-1 Lap-2 Pop I 1,7241 1,3423 1,2195 2,9328 1,0000 1,6437 Pop II 1,5219 1,2596 1,2649 3,1565 2,4185 1,9243 Pop III 1,4490 1,5571 2,0202 2,9617 1,0512 1,8079 Pop IV 1,9994 2,2592 1,9978 1,9350 2,6627 2,1708 Pop V 1,7041 1,5571 2,0460 3,4368 1,0000 1,9488 Rerata 1,6797 1,5951 1,7097 2,8846 1,6265 1,8991

Pembahasan Diferensiasi genetik merupakan perbedaan genetik yang terjadi pada variasi antar populasi maupun variasi di dalam populasi. Diferensiasi genetik atau lebih dikenal dengan variasi genetik merupakan hasil penambahan dari keduanya, dengan parameter yang diamati berupa HT, HS dan DST. HT merupakan heterosigositas total populasi, sedangkan HS merupakan variasi genetik dalam populasi dan DST merupakan pengurangan antara HT - HS atau variasi antar populasi. Dalam praktikum ini, HT dihitung dengan menggunakan frekuensi rerata allele dari 5 populasi sampel. Pada tabel 1, terlihat nilai HT, HS dan DST sebagai berikut :Pop I Mdh-1 Mdh-2 Got-1 Lap-1 Lap-2 0,4200 0,2550 0,1800 0,6590 0,0000 0,3028 Pop II 0,3429 0,2061 0,2094 0,6832 0,5865 0,4056 Pop III 0,3099 0,3578 0,5050 0,6624 0,0488 0,3768 Pop IV 0,4999 0,5574 0,4994 0,4832 0,6244 0,5329 Pop V 0,4132 0,3578 0,5113 0,7090 0,0000 0,3983 Hs rerata 0,3972 0,3468 0,3810 0,6394 0,2519 0,4033 Ht 0,5611 0,5152 0,5056 0,7534 0,6514 0,5973 Dst 0,1639 0,1684 0,1245 0,1140 0,3995 0,1941 Fst 0,2922 0,3269 0,2463 0,1514 0,6132 0,3249 Fis 0,38733 0,50020 0,44886 0,52035 0,47078 0,4710 Fit 0,5663 0,6636 0,5846 0,5930 0,7953 0,6429

Dari hasil tersebut dapat dijelaskan bahwa nilai DST tertinggi diperoleh pada lokus Lap-2 dengan nilai 0,3995, yang menandakan bahwa variasi genetik antar populasi memiliki proporsi kemunculan terbesar dari lokus tersebut. Namun secara total, variasi genetik keseluruhan populasi dimiliki oleh lokus Lap-1 dengan nilai HT sebesar 0,7534. Artinya, heterosigositas total populasi tertinggi berasal dari lokus ini. Untuk nilai FST, FIS dan FIT diperoleh dari pembagian DST / HT, 1 (Ho/Hs) dan 1 (Ho/Ht) dengan hasil bilangan desimal. Nilai FST menunjukkan proporsi perbandingan variasi genetik antar populasi terhadap variasi genetik total, sedangkan FIS menunjukkan proporsi perbandingan variasi genetik suatu lokus dalam suatu populasi terhadap variasi genetik populasi tersebut. FIT berperan untuk menunjukkan proporsi perbandingan variasi genetik suatu lokus dalam suatu populasi terhadap variasi genetik total. Terlihat bahwa nilai FST tertinggi dimiliki oleh lokus Lap-2 (sebesar 0,6132), hal ini mengingat lokus ini memiliki nilai DST tertinggi. Ini mengindikasikan bahwa semakin besar variasi genetik total, semakin besar pula nilai FST yang diperoleh. Sedangkan pada nilai FIS tertinggi dimiliki oleh lokus Lap-1 dengan 0,5204, yang berarti mengindikasikan bahwa variasi genetik lokus tersebut memiliki sumbangsih tertinggi bagi variasi genetik populasi, bila dibandingkan dengan lokus yang lain dalam populasi tersebut. Sementara itu, untuk nilai FIT terbesar diraih oleh lokus Lap-2 dengan nilai 0,7953. Ini mengindikasikan bahwa lokus Lap-2 memiliki sumbangsih tertinggi bagi variasi genetik total dari semua lokus lain, baik pada populasi yang sama maupun populasi berbeda.

Bab VII Diversitas Genetik Berdasarkan Penanda DominanTujuan Mengetahui prinsip perhitungan diversitas genetik dan jarak genetik berdasarkan penanda dominan

Landasan teori Penanda molekuler yang bersifat dominan dapat digunakan untuk analisis keragaman genetik dari suatu kelompok individu berdasarkan jarak genetik antar dua individu. Jarak genetik ini dihitung melalui kuantifikasi dengan bandsharing index. Terdapat beberapa cara perhitungan bandsharing index yang dapat digunakan, misalnya Dice Index (Nei-Li Index), Jaccard Index (Tanimoto Index), dan Simple Matching. Untuk mengetahui distribusi keragaman dari kelompok individu selanjutnya dapat dilakukan analisis kelompok (cluster analysis) berdasarkan nilai jarak genetik yang telah diperoleh. Alat dan bahan Contoh simulasi hasil pengamatan Kalkulator

Cara kerja 1. Mempelajari prosedur perhitungan jarak genetik berdasarkan penanda dominan 2. Menghitung jarak genetik tiap pasangan individu dan tulislah dalam tabel . Gunakan perhitungan bandsharing index berdasarkan rumus Dice Index (Nei-Li Index), Jaccard Index (Tanimoto Index) dan Simple Matching 3. Melakukan analisis kelompok (cluster analysis) berdasarkan data jarak genetik yang diperoleh. Pembahasan Penanda molekuler dominan merupakan suatu penanda molekuler yang tidak dapat membedakan kelas resesif heterozigot dari kelas-kelas lainnya. Contoh penanda dominan ini antara lain RAPD dan AFLP. Penanda molekuler ini biasa digunakan dalam analisa keragaman genetik suatu populasi dengan menggunakan dasar jarak genetik antar dua individu. Untuk menghitung jarak genetik, dapat dilakukan perhitungan bandsharing index untuk mendasari distribusi keragaman dalam bentuk analisis pengelompokan atau klaster. Menurut jurnal penelitian dari Moraes et al (2002) tentang diversitas genetik antar populasi hewan, bandsharing index sering juga disebut dengan similarity index, yang biasanya memiliki rumus umum S = 2 x nab (na + nb). Namun pada praktikum ini diujicobakan juga mengenai indeks lain seperti Dice Index (Nei-Li Index), Jaccard Index (Tanimoto Index) dan Simple Matching dengan formula yang sedikit berbeda sesuai dengan prinsip penemu masing-masing indeks tersebut. Berdasarkan buku elektronik DNA

Fingerprinting In Plants and Fungi, perbedaan penggunaan indeks tidak menghasilkan perbedaan yang signifikan pada hasil jarak genetik yang diperoleh. Tabel 1. Data Jarak Genetik Berdasarkan Tiga Bandsharing Index yang BerbedaJarak (1 - Nei Index) Populasi 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,692308 0,222222 0,222222 0,466667 0,466667 0,466667 0,466667 0,466667 0,375 0,777778 0,555556 1 0,666667 0,666667 0,666667 0,285714 0,454545 0,636364 0,636364 0,818182 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,454545 0,636364 0,636364 0,636364

0,5 0,5 1

0,5 0,5

0,5 0,75 0,75 0,777778 0,777778

1 0,636364 0,636364 1 0,5 0,5

0,5 0,5 0,333333 0,555556

0,111111

Jarak (1-Jaccard Index) Populasi 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,818182 0,363636 0,875 0,363636 0,714286 0,444444 0,636364 1 0,625 0,625 0,636364 0,8 0,777778 0,777778 0,636364 0,8 0,777778 0,777778 0,636364 0,8 0,9 0,777778 0,636364 0,545455 1 0,777778 0,777778 1 0,666667 0,666667 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,666667 0,666667 0,666667 1 0,666667 0,666667 0,666667 0,5 0,714286

0,666667 0,857143 0,857143 0,875 0,875

0,2

Jarak (1 - Simple Matching Index) Populasi 1 1 2 3 4 5 0,818182 0,363636 0,363636 0,636364 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,636364 0,454545 0,545455

0,363636 0,454545

0,454545

6 7 8 9 10

0,636364 0,636364 0,636364 0,636364 0,545455

0,363636 0,363636 0,363636 0,545455 0,636364

0,636364 0,636364 0,818182 0,636364 0,545455

0,636364 0,636364 0,636364 0,636364 0,545455

0,363636 0,363636 0,727273 0,363636 0,272727

0,363636 0,363636 0,363636 0,454545

0,363636 0,545455 0,636364

0,545455 0,636364 0,091

Namun berdasarkan hasil data praktikum yang diperoleh, ternyata terjadi rata-rata perbedaan sebesar kurang lebih 0,05 untuk tiap tiap nilai terkecil dari jarak genetik yang diperoleh pada ketiga indeks yang digunakan (pada data tabel 1 yang dilingkari warna oranye). Hal ini dapat terjadi dimungkinkan karena prinsip penyusunan formula yang berbeda dari tiap tiap indeks. Perbedaan ini kemudian berlanjut pada nilai terkecil kedua dan ketiga dengan perbedaan yang semakin jauh. Hal ini membuktikan bahwa penggunaan bandsharing index yang berbeda ternyata juga memberikan hasil yang berbeda pada jarak genetik, terlebih nantinya pada analisis klaster. Mengingat perbedaan kecil tersebut dapat menjadi berbeda pada pengelompokan populasi yang secara genetik berdekatan. Pada analisis klaster menggunakan UPGMA, dari jarak genetik berbasis Nei Li Indeks terjadi klaster populasi sebagai berikut : Klaster populasi 1 3 4, klaster populasi 5 9 10 dan klaster populasi 2 6 7 8 yang mulai terpisah jauh. Hal ini mengindikasikan kedekatan jarak genetik antara klaster populasi 5 9 10 dengan klaster populasi 1 3 4, dan dapat dikatakan mulai terjadi spesiasi pada populasi 6, 7, 8 hingga populasi 2 yang memiliki jarak genetik terjauh (0,780627).

1 3 4 5 9 10 6 7 8 2

Gambar 1. Analisis Klaster UPGMA dari 10 Populasi Sample dengan Nei-Li Bandsharing Index

1 3 4 5 9 10 6 7 8 2

Gambar 2. Analisis Klaster UPGMA dari 10 Populasi Sample dengan Jaccard Bandsharing Index1 3 4 5 9 10 6 7 2 8

Gambar 3. Analisis Klaster UPGMA dari 10 Populasi Sample dengan Simple Matching Bandsharing Index

Sedangkan pada analisis klaster UPGMA pada Jaccard, diperoleh hasil yang relatif sama dengan analisis klaster UPGMA pada Nei dan Li, hanya saja memiliki nilai jarak genetik yang berbeda. Terlihat pada populasi 2 yang memiliki jarak genetik terjauh, memiliki nilai 0,8675,bila dibandingkan dengan jarak genetik pada populasi 2 dengan Nei Li indeks (0,7806) maka cukup signifikan perbedaannya. Namun secara klastering, keduanya menghasilkan kemiripan klaster. Perbedaan besar muncul pada analisis klaster dengan simple matching bandsharing index, dimana terbentuk klaster populasi yang berbeda dengan dua bandsharing index lainnya. Klaster populasi yang terbentuk yaitu : Klaster populasi 1 3 4 - 6, klaster populasi 5 9 10, dan masing-masing populasi 7, 2 berdiri sendiri dan populasi 8 yang memiliki jarak genetik terjauh. Patut diperhatikan bahwa ternyata klaster populasi yang terbentuk berbeda dari populasi jarak yang terjauh (pada indeks Jaccard dan Nei, populasi 2 memiliki jarak genetik terjauh) maka dapat terjadi perbedaan yang signifikan dengan penggunaan bandsharing indeks yang berbeda.

REFERENSI

http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-1-pengenalan-alat.html diakses pada 7 Juli 2010 pukul 8.37 WIB

http://www.fp.unud.ac.id/biotek/wp-content/uploads/2008/12/artikel-i-3.pdf diakses pada 7 Juli 2010 pukul 9.53 WIB

http://rudyct.com/PPS702-ipb/07134/imam_widodo.htm diakses pada 8 Juli 2010 pukul 9.25 WIB

http://www.aseanfood.info/Articles/11018622.pdf diakses pada 8 Juli,pukul 10.30 WIB

18bios1unsoed.files.wordpress.com/2008/03/buku-ajar-gen-15.doc diakses pada 8 juli pukul 8.30 WIB

http://nandarsuroso.wordpress.com/2008/04/21/makalah-identifikasi-keragaman-genetikkultivar-salak-jawa-berdasarkan-analisis-rapd/ diakses pada 8 juli pukul 21.30 WIB

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1519-69842002000300015 diakses pada 9 Juli 2010 pukul 07.00 WIB

http://books.google.co.id/books?id=AtkHlIks64YC&pg=PA140&lpg=PA140&dq=Bandshari ng+Index+adalah&source=bl&ots=sSAY_d8iA-&sig=npZIIllQG3SpMiebfqaBm0XSBY&hl=id&ei=t2Y2TNSwDsmekQWKkJzOAw&sa=X&oi=book_ result&ct=result&resnum=7&ved=0CD4Q6AEwBg#v=onepage&q&f=false diakses pada 9 Juli 2010 pukul 07.20 WIB

Anonim. Buku Petunjuk Kerja Analisis Isozim. Fakultas Kehutanan. Universitas Gadjah Mada. 2010. Yogyakarta.

Documents

Laporan Praktikum Bioteknologi