lIsolasi Enzim Protease dan Amilase dari Paru Tikus

Paru Tikus

Dipotong kecil-kecil

Ditambah pasir kuarsa

Digerus dalam mortar dingin

Ditambah PBST PMSF 5 x V (5ml)

Disonikasi 50 Hz selama 10 menit

Divortex selama 5 menit

Difreezer selama 5 menit

Disentrifuse 6000 rpm selama 15 menit

Endapan

Buang

Supernatan

Disonikasi 10 menit

Difreezer selama 5 menit

Disentrifuse 1000 rpm selama 15 menit

Supernatan

Ditambah etanol absolut 1:1

Didiamkan dalam freezer selama 1 jam

Disentrifuse 1000 rpm selama 15 menit

Endapan

Ditutup plastik wrap

Dikeringanginkan semalam

Ditambah 2 ml Tris Cl

Di sweling dengan aquadest selama semalam

Glass wool

Ditambah sampel sebanyak 250 µl

Ditambah buffer Tris-Cl

Diambil 11 fraksi dan dimasukkan mikro tube

Ditambah etanol absolut (1:1)

Disimpan dalam refri selama semalam

Dilihat profil protein dengan menggunakan elektroforesis

Pemurnian Enzim dengan Sephadex

Larutan Glukosa dengan berbagai konsentrasi (100, 200, 300, 400, 500 ppm)

Ditambah air bebas reduktor 1 mlDitambah 1 ml nelson Dipanaskan 800C selama 20 menitDidinginkan sampai mencapai suhu ruangDitambah 1 ml larutan arsenomolibdatDihomogenkanDidiamkan selama 2 menitDimasukkan dalam labu ukur 10 mlDitambah air bebas reduktor sampai tanda batasDiukur absorbansinya pada λ=540 nm/740 nm

Data

Dibuat kurva hubungan antara konsentrasi (ppm) dan absorbansi (A)Ditentukan persamaan regresi liniernyaDitambah akuades sampai tanda batas

Kurva Baku Glukosa

Pembuatan Kurva Standar Glukosa

Larutan stok BSA 10000 ppm

Dipipet masing-masing 1,2,3,4,5,6,7,8 dan 9 mlDimasukkan dalam 9 labu ukur 10 ml yang berbedaDitambah akuades sampai tanda batas

Larutan BSA dengan berbagai konsentrasi (1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 ppm)

Dipipet masing-masing 2 mlDimasukkan dalam 9 tabung reaksi yang berbedaDitambah 8 ml reagen biuret dan 1 ml akuadesDikocokDidiamkan selama 30 menitDiukur absorbansinya masing-masing pada λ = 540 nm dengan spektrofotometer UV-Vis

Data

Dibuat kurva hubungan antara konsentrasi (ppm) dan absorbansi (A)Ditentukan persamaan regresi liniernyaDitambah akuades sampai tanda batas

Kurva Baku BSA

Pembuatan Kurva Standar BSA

Elektroforesis

1. Pembuatan Gel Elektroforesis

a. Bahan

Jenis Bahan Separating Gel (Konsentrasi 12%) (µl)

Stacking Gel (Konsentrasi 3%) (µl)

UGBT-AcylddH2O

APSTemed

130020001700

707

415267975202

b. Prosedur Kerja

Separating Gel

Stacking Gel

UGB + T-Acyl + ddH2O + APS + Temed

- Dicampur jadi satu- Dimasukkan dalam kaca elektroforesis- Ditambah dengan akuades- Didiamkan sampai terbentuk gel (±10-30 menit)- Dibuang akuades

Hasil

UGB + T-Acyl + ddH2O + APS + Temed

- Dicampur jadi satu- Dimasukkan dalam kaca elektroforesis (di atas stacking gel)- Diberi sisiran- Didiamkan sampai terbentuk gel (±10-30 menit)- Sisiran diangkat

Hasil

Hasil

Dilakukan pewarnaan dengan commasie briliant blue

Sampel (usus dan serum)

Dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit

Didinginkan

Diambil 30 µl dan dimasukkan dalam gel

Dirunning dengan voltase 200 volt

2. Running Elektroforesis