IMAM WAHYU DWI KARTASASMITA

IMAM MUNANDAR

IMRAN

ILZA ADE PRATAMA

IDHAM HOLID

INE KARNI

HILIDA SUCI IRAWANI

HIKMAWATI

HIJRATUL KAHFI

LAPORAN PRAKTIKUM

PENGANTAR BIOTEKNOLOGI

Oleh,

KELOMPOK 10

IMAM WAHYU DWI KARTASASMITA B1D 012 133

IMAM MUNANDAR B1D 2

B1D 012 134

ILZA ADE PRATAMA

IDHAM HOLID

HILIDA SUCI IRAWANI B1D 012 125

HIKMAWATI

HIJRATUL KAHFI

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS MATARAM

2013

i

PENGANTAR BIOTEKNOLOGI

B1D 012 133

B1D 212 132

B1D 012 134

B1D 012 125

ii

HALAMAN PENGESAHAN

Laporan Ini Disusun Guna Memenuhi Sebagian Syarat untuk Menyelesaikan

Mata Kutliah Pengantar Bioteknologi

Mataram, 23 Desember 2013

Mengetahui,

Co. Assisten,

Susila Wati

(Yendri Junaidi)

B1D 010 180

Ima Milawati

(Filman Hayadi)

B1D 010 225

iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur senantiasa terucapkan dari lisan kita kepada Allah SWT.

Tuhan Yang Maha Besar yang telah menciptakan ilmu yang berguna dalam hidup

dan kehidupan manusia. Dengan ridho dan pertolongan-Nya kami dapat

menyelesaikan penulisan laporan praktikum Pengantar Bioteknologi ini secara

berjamaah. Laporan ini berisi tentang cara-cara melakukan isolasi plasmid DNA

dari bakter E. Colly, cara-cara melakukan reaksi berantai polimerasi atau yang

sering disebut dengan PCR dan cara-cara melakukan elektroforesis protein dengan

tujuan untuk dapat mengetahui berat mulekul protein suatu bahan. Laporan ini

disusun guna memenuhi sebagian syarat dalam mengikuti mata kuliah pengantar

bioteknologi.

Terimakasih kami ucapkan kepada semu pihak dari dosen, Co. Assisten

dan rekan-rekan yang telah membantu dan membimbing dalam melaksanakan

praktikum.

Dalam penulisan laporan ini kami menyadari bahwa kami adalah manusia

biasa yang tidak terlepas dari kekurangan dan kesalahan karena tidak ada gading

yang tak retak, baik dalam penulisan maupun dalam isi laporan. Oleh karena itu

kami dari kelompok 10 sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun

dari semua pihak sebagai langkah untuk mendapatkan hasil yang lebih baik di

kemudian hari.

Akhirnya kami mengkarapkan semoga laporan ini dapat brmanfaat dan

dapat digunakan sebagai referensi tambahan bagi yang membutuhkan.

Mataram, 20 Desember 2013

Penyusun

iv

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................ i

KATA PENGANTAR ......................................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................. iii

DAFTAR ISI ........................................................................................ iv

ACARA I ISOLASI PLASMID DNA BAKTERI E. COLLY

BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................... 1

1.2 Tujuan ................................................................................. 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .......................................................... 3

BAB III MATERI dan METODE PRAKTIKUM ............................... 5

3.1 Materi Praktikum ................................................................ 5

3.2 Metode praktikum .............................................................. 6

3.3 Waktu dan Tempat Praktikum ........................................... 7

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN ................................................ 8

4.1 Hasil Praktikum .................................................................. 8

4.2 Pembahasan ........................................................................ 8

BAB V PENUTUP ............................................................................... 11

5.1 Kesimpulan ........................................................................ 11

5.1 Saran ................................................................................... 11

ACARA II POLYMERASE CHAIN REACTION

BAB I PENDAHULUAN .................................................................... 12

1.1 Latar Belakang ................................................................... 12

1.2 Tujuan ................................................................................. 13

1.3 Kegunaan ............................................................................ 14

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .......................................................... 15

BAB III MATERI dan METODE PRAKTIKUM ............................... 17

3.1 Materi Praktikum ............................................................... 17

3.2 Metode praktikum .............................................................. 18

3.3 Waktu dan Tempat Praktikum ........................................... 18

v

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN ................................................ 19

4.1 Hasil Praktikum .................................................................. 19

4.2 Pembahasan ........................................................................ 19

BAB V PENUTUP ............................................................................... 22

5.1 Kesimpulan ........................................................................ 22

5.1 Saran ................................................................................... 22

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................... 23

LAMPIRAN ......................................................................................... 24

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang.

Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (Deoxyribonucleic

Acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun

berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti

sel.

Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi

genetik artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku

umum bagi setiap organisme. Di antara pengecualian yang menonjol adalah

beberapa jenis virus (virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human

Immunodeficiency Virus).

Maka dari itu, DNA sangat berpengaruh pada bidang penelitian yang

menggunakan tehnologi dalam membantu umat manusia untuk memcahkan

berbagai maslah, telah banyak ilmuan yang telah menemukan cara penanganan

pada DNA yang mempunyai runtutan yang teratur, bicara teantang runtutan atau

langkah dalam perlakuan DNA ada satu materi yang mendasar yang harus

dikuasai oleh para peneliti baru yaitu, isolasi plasmid DNA.

Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri

berutas ganda dan berbentuk sirkuler. Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil

dan terletak di luar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel

eukariot tingkat rendah seperti khamir. Plasmid mengalami duplikasi sebelum

pembelahan sel inang.

Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan

menggunakan Escherichia coli sebagai inang sehingga dalam rekayasa genetika,

plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang

diinginkan ke dalam suatu sel inang. Pada bakteri Eschericia coli, bahan genetik

utamanya terdiri atas sekitar 4.600 kb (4,6 x 106 bp). Plasmid dapat dijadikan

sebagai vektor karena dapat melakukan replikasi, terletak ekstra kromosom,

ditransfer secara stabil, berukuran kecil, susunan DNA sudah diketahui, harus

2

mempunyai jumlah salinan yang banyak di dalam sel inang, memiliki titil Ori,

memiliki marker seleksi, memiliki marker kedua yang berguna untuk tanda

apabila plasmid disisipkan gen asing dan memiliki situs retriksi yang unik sebagai

tanda untuk menyisipkan gen asing.

Pada dasarnya plasmid merupakan identitas genetik yang ditemukan secara

alami di dalam sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot. Dengan teknik

rekayasa genetik, sekarang telah dikembangkan plasmid artifisial dengan cara

menggabungkan gen-gen dari plasmid alami maupun genom tertentu.

Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui proses isolasi plasmid,

elektroforesis, dan visualisasi menggunakan sinar ultraviolet (UV). Tahapan

pengendapan dalam isolasi plasmid adalah pemecahan sel, keluarnya plasmid dari

nukleus dan pengendapan atau presipitasi plasmid. Tahapan selanjutnya adalah

elektroforesis DNA yaitu, teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan

atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya dengan menggunakan

medan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA plasmid yang

bermuatan negatif. Gel yang biasanya digunakan dalam proses elektroforesis

adalah agarosae. Elektroforesis biasa digunakan untuk analisa ukuran dan

konfirmasi sampel DNA, kuantifikasi DNA, pemisahan dan ekstraksi DNA.

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari isolasi plasmid ini addalah untuk memisahkan

DNA plasmid dari bakteri E. Coli.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

DNA (deoxyribonucleic acid) adalah materi genetik yang terdapat di

dalam inti sel makhluk hidup. Materi itu berbentuk seperti tangga. Bukan tangga

yang lurus, tetapi tangga yang berpilin. Kedua sisi tangga dihubungkan oleh anak

tangga. Pada DNA, hanya ada dua jenis anak tangga, yaitu anak tangga yang

dibentuk oleh pasangan basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan basa Guanin-

Citosin (G-C) (Warta Medika, 2008).

DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu

DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel

berinti, seperti darah, semen, akar rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang

paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut

beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh. DNA dapat

diisolasi sekalipun dengan menggunakan bahan kering seperti, bercak

darah maupun preparat autan, selain itu DNA juga dapat diisolasi dari produk

olahan (Anonim, 2011).

Laju migrasi DNA tergantung dari ukuran, struktur, dan muatan total

molekul. Molekul DNA tidak bisa dilihat dengan mata telanjang, namun bisa

dilihat pada gel agarose melalui teknik pewarnaan dengan menggunakan pewarna

yang disebut etidhium bromida. Etidhium bromida merupakan agen interkalasi

yang menyisip ke antara busa-busa molekul DNA dan berfluoresensi (Standfield,

2006).

Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara

autonom dan bisa ditemukan pada sel hidup. Di dalam satu sel dapat ditemukan

lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua

plasmid tidak mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut.

Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan

pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali

normal, DNA plasmid dapat dibuang (Royston 1972).

4

Keberadaan plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA

rekombinan. Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil

mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian

DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang

berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa protein. Pada praktikum ini

DNA plasmid diisolasi dari bakteri Escherichia coli, sehingga dengan

dilakukannya pengisolasian dan pemurnian DNA plasmid diharapkan dapat

memaksimalkan hasil DNA rekombinan dan rekayasa genetic dapat tercapai

(Sambrook& Russell 2006).

Menurut (Muladno, 1994) ada beberapa hal penting yang dapat

menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara

lain adalah :

a. Plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya

lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi.

b. DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama

diisolasi secara kimia.

c. Mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat

memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi.

d. Jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam

sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah

diamplifikasi.

e. Mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik

tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang

membawa gen tertentu.

.

5

BAB III

MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

3.1.Materi praktikum

3.1.1 Alat praktikum

1. Mikropipet

2. Evendorf

3. Sentrifius

4. Sentrifius

5. Vorteks

6. Yelow tip

7. Es box

8. Gloves

3.1.2 Bahan praktikum

a) Larutan I

50 mM glucose

25mM tris-Cl (ph 8.0)

10 Mm EDTA (8.0)

b) Larutan II

0.2 NaOH (harus fresh)

1% SDS

c) Larutan III

5 M potasium acetate 60 ml

Acetic acid glacial 11.5 ml

H2O 28.5 ml

d) Pelet Bakteri e colli

6

3.2.Metode praktikum

Adapun langkah-langkah dalam melakukan melaksanakan pratikum

ini adalah sebagai berikut:

1. Meresuspensikan pellet dengan 100 l larutan I dingin, kemudian campur

dengan merata dengan menggunakan vortex

2. Menambahkan 200 l larutan II campur dengan merata dengan cara

membolak-balik tabung dengan cepat beberapa kali (jangan menggunakan

vortex !!!)

3. Menambahkan 150 l larutan III dingin. Vortex selama beberapa detik

kemudian balikan posisi tabung (inverced) selama 10 detik.

Mengembalikan tabung ke posisi semula dan simpan dalam es selama 4-5

menit.

4. Melakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menitpada suhu 40C.

Setelah itu ambil supernatant dan dipindahkan kedalam tabung lain.

5. Menambahkan phenol:chloroform dengan perbandingan 1:1 dengan

jumlah supernatant yang diperoleh. Minsalnya volume supernatant yang

diperoleh adalah 300 l, maka tambahkan phenol: chloroform sebanyak

300 l.

6. Campur dengan merata menggunakan vortex kemudian melakukan

sentrifugasi (12000 rpm) selama 2 menit pada suhu 4 0C.

7. Setelah sentrifugasi, mengambil supernatant dan pindahkan kedalam

tabung lain.

8. Menambahkan ethanol (2 X volume supernatant) unntuk

mempresipitasikan DNA. mencampur dengan vortex, kemudian biarkan

pada suhu kamar selama 2 menit.

9. Melakukan sentrifugasi 12000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 0C.

10. Membuang supernatant perlahan-laha. Balikkan tabung dan biarkan

kering udara selama beberapa menit.

11. Membilas DNA pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian

sentrifugasi seperti cara no 9

7

12. Membuang supernatant, balikkan tabung dan membiarkan kering udara

selama 10 menit.

13. Meresuspensi DNA dengan 25 l buffer TE (pH 8.0).

3.3. Tempat dan Waktu Praktikum

3.3.1 Tempat Praktikum

Praktikum ini diadakan di Labolatorium Mikrobiologi dan Bioteknologi,

Fakultas Peternakan, Universitas Mataram.

3.3.2 Tanggal Prktikum

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, 9 Desember 2013, pukul

09.00 11.30 WITA.

8

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Praktikum

Setelah melaukan isolasi plasmid DNA bakteri E. Coli makahasil yang

diperoeh adalah sebagai berikut :

Gambar 1 Plasmid DNA bakteri E. Coli

4.2 Pembahasan

Umumnya prinsip yang digunakan dalam mengisolasi DNA plasmid

adalah sama dengan isolasi DNA/RNA dari suatu sel. Prinsip yang digunakan

adalah melakukan isolasi plasmid dengan sentrifugasi dan presipitasi. Hal ini

9

dilakukan dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan

terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian

ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung plasmid.

Langkah yang medasar untuk mendapatkan DNA plasmid adalah

menumbuhkan sel-sel bakteri (house) dalam sebuah media. Bakteri yang

digunakan adalah Escherichia coli sedangkan media yang digunakan adalah

media NB (Nutrien Broth). Bakteri Escherichia coli digunakan karena bakteri ini

mudah didapatkan. Selain itu, Escherichia coli dapat menghasilkan keturunan

yang banyak dalam waktu singkat. Kemampuanya berkembang biak dengan fission binary (pembelahan sel) yang cepat, mampu tumbuh pada media yang

murah, pertumbuhan tidak rewel.

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen,

sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid

mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk

memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda

dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan

detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein

dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan

potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara

sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang

tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk

mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi

menggunakan etanol.

Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial

bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali

menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa

genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen

tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya

akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan

berbagai enzim.

10

Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai

proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1- 20 g. Sedangkan

untuk jumlah yang lebih besar (100 200 g) dinamakan midi preparation dan

maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 g.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel

sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal

serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus

dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya.

Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with

detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang

paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi

bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel,

yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi,

beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah

berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan

mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan

yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-

100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus

disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis,

remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel

dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan

fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan

dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari

protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu

ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang

telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat

dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

11

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dari hasil praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa:

1. Plasmid adalah molekul DNA berbentuk sirkular (bundar), bereplikasi

sendiri dan membawa beberapa gen yang tidak terlalu penting.

2. Bakteri E. Coli merupakan bakteri yang paling mudah untuk diisolasi.

3. Isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga

semua organel sel dapat keluar

5.2 Saran

Kepada semua praktikan supaya melakukan praktikum lebih aktif.

12

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Polymerase chain reaction merupakan teknik yang sangat berguna dalam

membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA

tertentu di salin hingga jutaan kali untuk di perbanyak sehingga dapat di analisis,

atau di modifikasi secara tertentu.

PCR dapat di gunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau

untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat di

gunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sempel. PCR

memnfaatkan enzim DNA polymerase yang secara alami memang berperan dalam

perbanyakan DNA pada proses replikasi.

Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary, B. Mullis pada tahun

1985. Impian Mullis dimulai ketika di bulan April 1983, malam Jumat, saat

membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara

bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inspirasi yang bermakna

dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari

DNA. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific,

1990, yang memberinya peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel

dalam kimia atas penemuan PCR. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow

fragmen E.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan potongan DNA

yang spesifik. Namun, enzim ini tidak dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi

dari PCR, sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi pada setiap

siklus PCR. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis, khususnya pada

teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis.

Setiap siklus PCR terdiri dari tiga tahap, berikut adalah tiga tahap

bekerjanya PCR dalam siklus :

1. Tahap Peleburan (melting) atau Denaturasi

Pada tahapan ini berlangsung pada suhu 94 - 960 C. ikatan

hydrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berbekas tunggal.

13

Biasanya pada tahap awal PCR ini dilakukan beberapa lama (sampai

menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemesihan ini

menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template (patokan) bagi

primer. Durasi tahap ini 1- 2 menit.

2. Tahap Penempelan atau Anealing

Primer menempel pada bagian DNA templet yang komplementer

urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu 45 - 6000 C. penenmpelan ini

bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya

penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini

1- 2 menit.

3. Tahap Pemanjangan atau Elongasi

Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polymerase yang

di pakai. Dengan taq-polymerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu

760 C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Selain DNA template yang akan

digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang di butuhkan

adalah Primer, primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau

oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi

pemanjangan rantai atau polymerase DNA. dNTP ( deoxynucleos ide

triphosphate ) atau building blocks sebagai batu bata penyusun DNA

yang baru. Buffer, buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia

untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan

enzim DNA polymerase. Ion logam terbagi menjadi dua yaitu Ion logam

bivalen, tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekrja.

Sedangkan ion logam monovalen ( kalsium ).

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dilaksanakannya praktikum ini adalah sebagai berikut:

1. Untuk mengetahui teknik dan cara melakukan PCR

2. Untuk memperbanyak DNA yang di inginkan secara invitro atau

diluar sel.

14

3. Digunakan dalaam penelitian biolog seperti mengamati penyakit

keturunan dan identitas sidik jari.

1.2 Kegunaan Praktikum

Adapun kegunaan praktikum ini adalah sebagai berikut:

1. Mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR.

2. Mahasiswa dapat mengetahui alat-alat yang di gunakan dalam

melakukan praktikum PCR.

3. Mahasiswa dapat mengetahui metode-metode yang digunakan

dalam PCR.

15

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah cara in vitro untuk

memperbanyak target sekuen spesifik untuk analisis cepat atau karakterisasi,

walaupun material yang digunakan pada awal pemeriksaan sangat sedikit. Pada

dasarnya PCR meliputi tiga perlakuan yaitu: denaturisasi, hibridisasi dari "primer"

sekuen DNA pada bagian tertentu yang diinginkan, diikuti dengan perbanyakan

bagian tersebut oleh Tag polymerase; dikerjakan dengan mengadakan campuran

reaksi dalam tabung mikro yang kemudian diletakkan pada blok pemanas yang

telah diprogram pada seri temperatur yang diinginkan (Prijanto, 1992).

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang

biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan

untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000

pasang basa (bp) (Yuwono, 2005).

Laju migrasi DNA tergantung dari ukuran, struktur, dan muatan total

molekul. Molekul DNA tidak bisa dilihat dengan mata telanjang, namun bisa

dilihat pada gel agarose melalui teknik pewarnaan dengan menggunakan pewarna

yang disebut etidhium bromida. Etidhium bromida merupakan agen interkalasi

yang menyisip ke antara busa-busa molekul DNA dan berfluoresensi (Standfield,

2006).

Agarose yang disari dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar

struktur D-galaktosa dan 3,6 - anhidro L-galaktosa. Gel agarose mempunyai daya

pemisah lebih rendah jika dibandingkan dengan gel poliakrilamid, tetapi

mempunyai rantang pemisahan lebih serius. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo

basa dapat dipisahkan denagn gel agarose dengan berbagai konsentrasi agarose.

Gel agarose biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan

medan listrik dan arah tetap (Sudjadi 2008).

Gel agarose dibuat dengan melelehkan agarose dalam buffer dan kemudian

dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarose

16

membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarose.

Jika medan magnet diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan

negatif pada pH netral akan bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan

oleh ukuran DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarose, dan besaran tegangan

yang digunakan (Sudjadi 2008).

17

BAB III

MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

3.1. Materi praktikum

3.1.1 Alat praktikum

Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah

sebagai berikut:

1. Mesin PCR

2. Sinar UV

3. Elektropolisis DNA

4. Mikro pipet

5. Efendorf

3.1.2 Bahan praktikum

Bahan yang dugunakan dalam praktikum ini adalah sebagai

berikut:

Campuran reksi terdiri dari :

1. Air steril : 6,7 l

2. 10 x buffer taq : 1 l

3. 2,5 mMdNTP mix : 0,4 l

4. 10 M primer forward : 0,4 l

5. 10 M primer reverse : 0,4 l

6. Template : 1 l

7. Enzim : 0.1 l

10 l

Bahan gel elektroforesis DNA

Agarose

Buffer TAE

18

EtB (ethibium bromide )

3.2. Metode praktikum

Adapun langkah-langkah dalam melaksanakan praktikum ini adalah

sebagai berikut :

1) Mencampur bahan-bahan yang digunakan untuk melakukan PCR

a. Memasukkan air steril sebanyak 40 l ke dalam evendorf

b. Menambahkan 10 x buffer tag sebanyak 1 l ke dalam evendorf

c. Menambahkan 2,5 mM primer forward sebanyak 0,4 l

d. Menambahkan 10 M primer forward sebanyak 0,4 l

e. Menambahkan 10 M primer reverse sebanyak 0,4 l

f. Menambahkan template sebanyak 1 l

g. Menambahkan enzim sebanyak 0,1 l

2) Memasukkan tabung PCR ke dalam mesin PCR

3) Mengatur mesin PCR

4) Mencapur cairan PCR dengan buffer TAE kemudian memasukkan cairan

tersebut ke agarose

5) Melihat sample di bawah sinar UV

3.3.Tempat dan Waktu Praktikum

3.3.1 Tempat Praktikum

Praktikum ini diadakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi,

Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

3.3.2 Waktu Praktikum

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin tanggal 9 Desember 2013,

pukul 09.00 11.30 WITA.

19

BABA IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.2 Pembahasan

PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Teknik ini

merupakan teknik perbanyakan DNA secara in vitro. Dalam sistem kerjanya, PCR

dilandasi oleh struktur DNA. Dalam keadaan nativenya, DNA merupakan double

helix, yang terdiri dari dua buah pita yang berpasangan antiparalel antara satu

dengan yang lain dan berikatan dengan ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen terbentuk

antara basa-basa yang komplementer, yaitu antara basa Adenin (A) dengan

Thymine (T), dan Guanine (G) dengan Cytosin (C) (Muladno 2002). Diamana

pada alat ini kami memasukan hasil isolasi dari DNA bakteri E.Coly.

PCR memiliki beberapa komponen, diantaranya yaitu enzim

Taqpolymerase, primer, dNTP dan buffer. Enzim Taq polymerase memiliki

keaktifan dalam suhu tinggi, oleh karena itu penambahan enzim tidak perlu

dilakukan dalam setiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin.

Pemakaian Taq polymerase dalam konsentrasi yang terlalu besar akan

mengakibatkan munculnya background produk non-spesifik. Sebaliknya, bila

konsentrasi Taq polymerase terlalu rendah, maka proses amplifikasi berlangsung

20

secara inefisien, dan produk amplifikasi yang diperoleh akan mempunyai

konsentrasi yang relatif rendah. Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau

oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi

pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Fungsi dari primer yaitu menghindari

adanya polipurin atau polipirimidin dan menghindari adanya struktur sekunder.

Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template,

jadi dirancang agar menempel dan mengapit daerah tertentu yang diinginkan.

Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan

keberhasilan reaksi PCR. dNTP sebagai penyusun DNA yang baru yang terdiri

atas 4 macam, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Buffer untuk mengkondisikan

reaksi agar PCR berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase

(Innis et al. 1990).

Dalam kegiatan praktikum biologi molekuler, elektroforesis merupakan

salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk

PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya

berdasark anmigrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi

DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan,

maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr),

kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap

sinar ultraviolet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat

molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas

sinar ultra violet. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila

diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub

positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh: 1) ukuran molekul DNA, 2)

prosentase atau kerapatan gel yang dilalui DNA, 3) arus listrik yang diberikan

untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin

cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi

prosentaseny, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus

yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi.

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA

berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul

21

menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan

molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil

keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika

diletakkan didalam medan listrik, molekul DNA menuju kekutub positif (anoda)

dan menjauhi kutub negatif (katoda).

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus

ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk 1) menambah densitas,

sehingga DNA akan selalu berada didasar sumur, 2) pewarna untuk memudahkan

meletakkan sampel DNA kedalam sumur, 3) agar dapat bergerak ke arah anoda

dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda

migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol

bluedanxylenecyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA didalam gel yang telah

diwarnai dengan ethidium bromida diatas lampu UV yang dibandingkan dengan

DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA

(Suharsono dan Widyastuti, 2006).

22

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

5.2 Saran

23

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. ht tp://www. scribd. com/doc/302 75768/Laporan-

Praktikum

Bioselmol-Isolasi-Dna-Plasmid Diakses tanggal 20 Desember 2013.

Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White JT. 1990. PCR Protocols, A guide to

Metods and Applications. Sanm Diego: Academic Press Inc.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka

Wirausaha Muda.

Prijanto, Muljati. 1992. Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Diagnosis

Human

Royston C Clowes. 1972. Molecular Structure of Bacterial Plasmids.

Bacteriological Reviews

Sambrook, Russell. 2006. The Condensed Protocols From Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press

Standfield W.D, Jaime S.C Raul J.C. 2006. Schaums Easy Outline Biologi

Molekuler dan sel. Penerjemah: Varian Fahmi, terjemahan dari:

Schaums Easy Outline Molecular and Cell Biology. Jakarta: Erlangga.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.

SuharsonodanWidyastuti,U. 2006.PenuntunPraktikum Pelatihan Teknik

Pengklonan Gen . Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan

Bioteknologi, IPB Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika.

Warta Medika. 2008. Sidik DNA. (http://www.wartamedika.com/2008/07/sidik-

dna.html). Diakses 20 Desember 2013.

Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlang.

24

LAMPIRAN

FOTO-FOTO PRAKTIKUM

Gambar 1 Vortex Gambar 2 Yellow Tip

Gamabar 3 Sentrifuse Gambar 4 Micro Pipet