Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan

8/16/2019 Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan

1/25

LAPORAN

PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Acara II

(Teknik Aseptik)

Oleh

Winda !i Ast"ti

NIM# $$%&$%$'%$'

Pr*ra+ ,t"di Pendidikan Bil*i

LABORATORIUM KULTUR -ARINGAN TUMBU.AN

-URU,AN BUIA/A PERTANIAN

0AKULTA, PERTANIAN

UNI1ER,ITA, -EMBER

&%$2


2/25

BAB $# PENA.ULUAN

$#$ Latar Belakan*

Pada dasarnya bahwa banyak kita ketahui bahwa dalam setiap

laboratorium terdapat banyak sekali kontaminasi yang terjadi. Hal ini

dikarenakan mikroorganisme ada dimana-mana. Namun kita tidak pernah

menyadari keberadaannya. Bakteri dapat ditemukan pada tangan kita yang tidak

tampak jika dilihat dengan mata telanjang. Jamur yang berasal dari saluran udara

AC dengan pintu yang terbuka. Ineksi dari kedua nya dapat menyerang media

atau serum yang steril. !arena itu laboratorium yang sangat sering digunakan

untuk berbagai penelitian dan praktikum yang diantaranya praktikum kultur

jaringan perlu adanya upaya untuk men"apai keberhasilan.

#alam keberhasilan praktikum kultur in $itro membutuhkan tidak adanya

kontaminasi mikroba yang terjadi dengan adanya upaya untuk selalu steril selama

pelaksanaanya. %paya untuk steril tidak hanya diperuntukkan hanya mediumnya

yang steril namun juga ruang kerja& eksplan yang digunakan dan juga

praktikan. 'leh karena itu& untuk menjamin semuanya steril sebelum memulai

suatu praktikum maka dilakukan suatu teknik aseptik. Prosedur kontrol

pada teknik ini adalah kualitas yang akan memastikan bahwa dalam praktikum

tersebut memang dilakukan dengan aseptik& teknik yang mengutamakan tidak

adanya kontaminasi.

(ehingga sebagian besar praktikum kultur jaringan selalu dilakukan

dengan menggunakan alat sterilisasi dengan bantuan Auto"la$e untuk

mensterilkan alat dan bahan serta medium yang telah dibuat beserta )aminar Air

*low +)A*, yang selalu digunakan untuk menjaga kesterilan ruang kerja dalam

proses menanam. Praktikum kultur jaringan yang bera"arakan teknik asepti" ini

dilaksanakan yang salah satunya guna mengetahui beberapa proses sterilisasi yaitu

sterilisasi ruang kerja dengan prinsip kerja )aminar Air *low +)A*,& sterilisasi

alat dan media dengan prinsip kerja Auto"la$e yang sering dipergunakan dalam

setiap praktikum dan sterilisasi bahan tanam yang akan digunakan sebagai eksplan

sebelum ditanam pada medium. 'leh karena itu dilakukan pengamatan dengan


3/25


4/25


5/25

Namun biasanya masalah lain atau kendala teknis yang sering mun"ul

adalah tanaman hasil kultur jaringan sering berbeda dengan tanaman induknya

atau mengalami mutasi. utasi dapat disebabkan metode perbanyakan& jenis dan

konsentrasi 4at pengatur tumbuh yang digunakan& penggunaan kumpulan sel

somatik yang memang berbeda se"ara genetis pada tanaman induknya& rekuensi

pemindahan biakan pada media baru& dan tipe jaringan yang digunakan +ayta&

/112,. Hal ini dapat terjadi karena penggunaan metode perbanyakan yang sering

tidak sesuai& seperti rekuensi subkultur yang terlalu tinggi& perbanyakan melalui

organogenesis yang tidak langsung +melalui ase kalus, atau konsentrasi 4at

pengatur tumbuh yang digunakan terlalu tinggi. (elain itu aklimatisasi yang

berupa adaptasi tanaman hasil kultur jaringan pada lingkungan yang baru diluar

botol se"ara in vivo sering mengalami kegagalan. (terilisasi bahan tanam yang

digunakan dan kontaminasi yang terjadi pada biakan karena lingkungan yang

kurang memadai +ariska et al.& 22/ dalam buku yang dikarang oleh #eden&

/110,.

!arena se"ara umum& produksi bibit melalui metode kultur jaringan

memerlukan beberapa tahap& yaitu penyediaan bahan tanaman +eksplan, dari

induk terpilih& proses sterilisasi eksplan yang akan ditanam pada media yang akan

d inisiasi& penanaman pada media untuk penggandaan atau multiplikasi tunas&

penanaman pada media untuk perakaran atau pembentukan planlet& dan

aklimatisasi +urashige& 2567 8eorge dan (herrington& 296 dalam :a4id&

/11,. Pada salah satu metode perbanyakan tanaman yang umumnya tidak

dilakukan tahap multiplikasi tunas dan perakaran tetapi diganti menjadi tahap

induksi tunas dan elongasi& sedangkan tahap perakaran dilakukan pada saataklimatisasi. etode ini "ukup sederhana dan mirip dengan "ara perbanyakan

dengan stek se"ara kon$ensional. 'leh karena itu& metode perbanyakan ini sering

disebut se"ara stek mikro. !euntungan penggunaan metode ini adalah tanaman

yang dihasilkan stabil se"ara geneti" +Nur Ajijah& /11,.

Persiapan Bahan 3anaman menjadi salah satu kun"i keberhasilan untuk

mendapatkan bahan tanaman yang responsi dan dapat diperbanyak se"ara kultur

in vitro adalah bahan tanaman yang masih muda. %ntuk tanaman kehutanan atau

tanaman tahunan lainnya daya tumbuh bahan yang akan ditanam sangat


6/25

diperhatikan +ariska dan Purnamaningsih& /11 dalam #eden& /110,. #aya

tumbuh tunas muda akan hilang se"ara isik apabila jarak antara ujung tunas dan

akar semakin jauh karena pertumbuhan +8eorge dan (herrington& 296 dalam

Nugraha& /10,.

Pada tanaman tahunan dewasa& tunas muda yang memiliki daya tumbuh

tinggi +ju$enil, sering mun"ul pada bagian tanaman yang dekat dengan tanah atau

sering disebut tunas air. 3unas ju$enil dari tanaman berkayu tahunan dewasa yang

akan digunakan sebagai bahan tanaman untuk kultur jaringan& juga dapat

diperoleh dengan "ara melakukan pemangkasan berat. 3unas yang mun"ul setelah

pemangkasan dapat digunakan sebagai bahan tanaman. (elain itu& ase ju$enil

kadang-kadang dapat juga diinduksi dengan "ara melakukan penyemprotan

tanaman dewasa dengan 8A0 atau "ampuran antara auksin dan 8A0 +8eorge dan

(herrington& 296 dalam #eden& /110,.

%ntuk memudahkan proses sterilisasi bahan tanaman& sangat dianjurkan

bahwa tanaman induk berada atau ditanam di kamar ka"a. !eberadaan tanaman

induk di kamar ka"a memudahkan perlakuan penyemprotan dengan ungisida dan

bakterisida se"ara periodik sehingga dapat mengurangi tingkat kontaminasi bahan

tanaman yang akan disterilisasi. (terilisasi bahan tanaman dan inisiasi kultur

dilakukan se"ara aseptik. (terilisasi bahan tanaman +eksplan, merupakan langkah

awal yang "ukup penting dan dapat menentukan keberhasilan penanaman se"ara

in vitro. ;ksplan yang akan ditanam pada media tumbuh harus bebas dari

mikroorganisme kontaminan. 3ahap sterilisasi sering menjadi kendala utama

keberhasilan perbanyakan tanaman se"ara in vitro. 3erlebih iklim tropis seperti

Indonesia yang memungkinkan kontaminan seperti "endawan dan bakteri terus

tumbuh sepanjang tahun. %ntuk tanaman tertentu& sterilisasi sulit dilakukan

karena kontaminan berada pada bagian internal dari jaringan tanaman +Patoni&

/1/,.

(terilisasi eksplan biasanya dilakukan dengan merendam bahan tanaman

dalam larutan kimia sistemik pada konsentrasi dan waktu perendaman tertentu&

baik dengan menggunakan satu ma"am maupun dengan ma"am-ma"am sterilan.

Bahan-bahan yang biasanya digunakan untuk sterilisasi antara lain alkohol&

natrium hipoklorit +Na'Cl,& kalsium hipoklorit atau kaporit +Ca'Cl,& sublimat


7/25

+HgCl/,& dan hidrogen peroksida +H/'/, +ariska& /110,. Jenis bahan&

konsentrasi& dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi bahan tanaman yang

disajikan pada tabel .

+(umber< ariska& /110,

Cara lain yang digunakan dalam sterilisasi eksplan atau bahan tanam yang

pertama eksplan di"u"i dengan deterjen atau bahan pen"u"i lain& selanjutnya

direndam dalam bahan-bahan sterilan baik yang bersiat sistemik atau desinektan.

Bahan-bahan yang biasa digunakan untuk sterilisasi antara lain "loro=& kaporit

atau sublimat. 3unas yang akan digunakan sebagai eksplan di"u"i dengan deterjen

sampai benar-benar bersih. (etelah itu& tunas diambil dari rimpang dan direndam

berturut-turut dalam benlate +1&>?, selama > menit& alkohol +51?, selama >

menit& "loro= +/1?, selama /1 menit& dan HgCl/ +1&/?, selama > menit.

Akhirnya eksplan dibilas dengan a@uades steril +0-> kali, sampai larutan bahan

kimia hilang. #engan perlakuan tersebut& 91-21? eksplan yang disterilkan tidak

terkontaminasi setelah dikulturkan +ariska& /110,.

Apabila kontaminan tetap ada maka konsentrasi dan lamanya perendaman

sterilan dapat ditingkatkan. Bahan yang digunakan serta metode sterilisasi biasanya berbeda untuk setiap bahan tanaman& sehingga bahan dan "ara tersebut

belum tentu berhasil apabila diaplikasikan pada bahan yang berbeda serta waktu

yang berlainan. (ehingga bahan tanam tertentu memiliki "ara yang berbeda antara

satu sama lain +ayta& /112,.

'leh karena itu baik media maupun eksplan yang akan digunakan harus

selalu dalam keadaan steril. (ehingga pada tahap persiapan& sebelum digunakan

semua peralatan yang akan digunakan di"u"i dengan menggunakan deterjen dan

larutan pemutih atau Bay"lin& membilasnya sampai bersih dan kemudian


8/25

disterilisasi menggunakan o$en atau auto"la$e. Bahan atau alat yang lain adalah

tutup botol plastik& peralatan gelas& peralatan diseksi& pipet& air murni& dan media

kultur untuk mendapatkan perlakuan sesuai dengan jenis alatnya. (emua peralatan

diseksi dibungkus dengan menggunakan kertas "oklat atau kertas merang dan juga

!oran sebelum diautokla$. Aluminium oil tidak direkomendasikan untuk

membungkusnya dikarena uapnya tidak dapat menembus pembungkus.

(ebelumnya kondisi autokla$ diatur pada temperatur yang digunakan untuk

sterilisasi dengan autokla dengan suhu /oC serta tekanan >-5&> psi selama

>/1 menit. Peralatan yang terbuat dari logam& wadah-wadah gelas& dan lain-

lain& disterilsasi dengan pemanasan dalam o$en pada suhu 0151 oC selama /6

jam +3uhuteru& /1/,.

(etelah dio$en& alat-alat ini bisa langsung digunakan atau disimpan dalam

lemari. )aminar Air *low adalah alat yang ditemukan pada tahun 2>1 yang

dikolaborasikan struktur yang dilengkapi dengan ruangan udara dengan udara

yang steril. Ada dua ma"am dari jenis ini yaitu hori4ontal dan $erti"al )aminar Air

*low steril system yang terkadang membutuhkan biaya yang sangat mahal dalam

proses perawatannya. Pengembangan alat ini diharapkan memanipulasi dan

mempertahankan suatu ruangan dalam keadaan yang selalu steril. Alat ini telah

disempurnakan dengan adanya aliran udara steril melalui sebuah prefilter dan alat

yang dialirkan melalui sebuah ilter H;PA + High Efficiency Particulate Air , untuk

menggerakkan aliran udara yang steril di dalam ruang kerja di laboratorium.

)aminar dilengkapi dengan adanya lampu % +Ultra Violet , yang digunakan

untuk memastikan bahwa tidak adanya kontaminan di setiap sisi ruangan +(tignor&

/112,. Hal ini sangat diperuntukan untuk kegiatan praktikum dan pembuatan stok

biologi yang harus dalam kondisi yang steril. Cara kerja laminar air low sebagai

HACD + Heating, Ventilation, Air-Conditioning, and Refrigeration, sebelum

digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 51 ? pada

dinding dan alasnya serta meratakannya menggunakan tissue atau kertas yang

steril. !emudian mendiamkannya selama kurang lebih 01 menit. )ampu

ultra$iolet yang berada di dalam laminar air low dinyalakan selama 1&>- jam

untuk membunuh kontaminan yang berada di dalamnya +(tignor& /112,.


9/25

*aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah

kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati.

!ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi +jamur, dan

bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau "endawan yang

menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi

"endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. !ontaminasi

pada media perlakuan sebelum proses penanaman tidak dapat digunakan untuk

menanam. (ehingga sebelumnya harus diganti dengan pembuatan media yang

baru untuk selanjutnya dapat dilakukan proses penanaman +3uhuteru& /1/,.

edia tanam dapat digunakan setelah diinkubasi selama 6-5 hari dan

memastikan bahwa media yang digunakan terbebas dari kontaminasi& namun

kontaminasi pada planlet mulai terlihat pada umur satu (P dengan rekuensi E

-> botol planlet. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh "endawan

dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak

langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka "endawan tersebut akan

menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang

disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan

mun"ulnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet. Hal ini dapat

disebabkan dari kurang bersihnya botol& peralatan pada saat pembuatan media&

suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di

rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam

+3uhuteru& /1/,.

'leh karena itu hal yang perlu mendapatkan diperhatian dalam teknik

asepti" se"ara in $itro yaitu dalam beberapa tahapan antara lain pemilihan

eksplan& proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang telah dipilih& keadaan

selama proses kultur yang terdiri dari suhu atau temperatur& kelembaban relati$e

serta waktu yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangannya

selama proses kultur in $itro. !ondisi pertama yang membawa keberhasilan

dalam proses kultur adalah aseptik. 3eknik untuk mempertahankan asepti" disebut

teknik asepti" yang berarti bebas dari semua jenis mikroorganisme atau kondisi

yang steril dan layak untuk melakukan proses kultur in $itro. %ntuk menjaga

lingkungan yang aseptik maka harus semua komponen kultur baik alat dan bahan


10/25

serta media dan juga eksplan yang akan digunakan harus dalam keadaan yang

steril sehingga harus dilakukan proses sterilisasi untuk semua komponen dalam

kultur jaringan. Hal penting yang lain yaitu menjaga udara& permukaan lantai

bebas dan bersih dari debu. (ehingga semua pengerjaan dari praktikum kultur

harus dilakukan dalam )aminar Air *low Cabinet yang steril +Chawla dalam

Anoop& /112,.

%ntuk itu pada dasarnya teknik aseptik yang dilakukan dalam kultur

jaringan sangat perlu digunakan untuk dapat mendukung kondisi yang dibutukan

eksplan yang ditanam dalam media mengalami proses pertumbuhan dan

perkembangan. 3eknik asepti" dapat terlaksana dengan baik apabila juga disertai

dilakukannya proses sterilisasi terutama pada eksplan yang harus bebas dari

kontaminan sebelum dilakukan proses penkulturan. Berbagai proses sterilisasi

yang disertai dengan agen sterilisasi digunakan untuk men"egah adanya

kontaminasi pada jaringan dalam eksplan. Agen sterilisasi "ontohnya yaitu Cloro=

atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan yang dapat

membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik berupa jamur& $irus&

bakteri& maupun kontaminan yang lain +Hariyadi& /11,. Hal ini dikarenakan

kedua bahan tersebut merupakan ra"un untuk tanaman oleh karena itu dalam

penggunaanya diperlukan dosis atau ukuran yang sesuai agar tidak melukai

ataupun mematikan jaringan dalam eksplan.


11/25

BAB # METOE PRAKTIKUM

#$ Wakt" dan Te+pat

Praktikum !ultur Jaringan 3umbuhan dengan a"ara 3eknik Aseptik

dilaksanakan pada hari inggu& ei /16 pukul /.11 sFd selesai bertempat di

)aboratorium !ultur Jaringan 3umbuhan Jurusan Budidaya Pertanian& *akultas

Pertanian& %ni$ersitas Jember.

#& Alat dan Bahan

0./. Alat

. )aminar Air *low +)A*,

/. Botol semprot0. Pinset

6. Pisau

>. (eal +segel,

G. !ertas label

5. Alat tulis

9. Bunsen

2. Petri dish

0././ Bahan

. edium padat kultur jaringan yang telah dibuat pada praktikum

sebelumnya

/. PestisidaF *ungisida

0. A@uades

6. Alkohol 51?

# Prsed"r Ker3a

,terilisasi Peralatan


12/25

. en"u"i dengan detergen dan membilasnya sampai bersih dengan

menggunakan a@uades& kemudian meniriskannya hingga kering

/. ensterilkan dengan auto"la$e dan menyimpannya dalam o$en untuk

menjaga peralatan agar tidak kontaminasi

0. (etelah proses sterilisasi& dapat menggunakan semua peralatan dengan

menekan kontaminasi

,terilisasi Media

. enggunakan media tanam yang steril

/. ensterilkan menggunakan auto"la$e untuk menghindari kontaminasi

0. emasukkan media yang telah jadi ke dalam botol kultur dan menutupnya

dengan aluminium oil

6. elakukan sterilisasi pada temperature /oC dengan tekanan 5&> Psi

selama /1-01 menit

,terilisasi Bahan Tana+ (Men4es"aikan den*an praktik"+ k"lt"r r*an)

. en"u"i bersih bahan tanam dengan menggunakan air mengalir

/. engojog bahan tanam dengan menggunakan pestisida atau ungisida

0. erendam bahan tanam dengan bahan kimia tertentu atau antisepti" di

)aminar Air *low +)A*,

6. embilas bahan tanam dengan menggunakan air steril dan kemudian

menanamnya

#2 Para+eter Pen*a+atan

engamati kontaminasi media pada hari ke-5 dan ke-6 berdasarkan parameter<

. Jenis mikroorganisme dan "iri-"iri yang menyebabkan kontaminasi

/. Prosentase keberhasilan dari teknik aeptik yang di lakukan

3abel . Jumlah kultur yang terkontaminasi dan jenis kontaminan

at Pengatur

3umbuh

Bahan 3anam 3embakau

Hari ke-5 Hari ke-6

! !


13/25

( 1 1 - j

NAA 1&/> ppm dan BAP

ppm

NAA ppm

dan BAP 1&/>

ppm

BAP 1&> ppm

/&6 # 1&> ppm dst dst

!eterangan <

Jumlah kontaminasi

! Jenis kontaminasi

J&B Jamur& Bakteri


14/25

BAB 2# .A,IL AN PEMBA.A,AN

2#$ .asil Pen*a+atan

Ta5el $# -"+lah k"lt"r 4an* terknta+inasi dan 3enis knta+inan

pada hari ke67 dan ke6$2

8at Pen*at"r

T"+5"h

Bahan Tana+ Te+5aka"

.ari ke67 .ari ke6$2

9 K 9 K

M, : % % 6

NAA %;&'

pp+ dan

BAP $ pp+

% 6

NAA $ pp+

dan BAP %;&'

pp+

% 6

BAP %;' pp+ % 6

&;2 %;' pp+ % 6

Keteran*an <

9 : -"+lah knta+inasi

K : -enis knta+inasi

-; B : -a+"r; Bakteri


15/25

2#& Pe+5ahasan

Pada praktikum kultur jaringan dengan a"ara teknik aseptik yang bertujuan

untuk mengetahui pelaksanaan teknik septik yang baik dan benar dalam kultur

jaringan serta mengetahui alat yang serig digunakan dalam setiap teknik asepti".

3ujuan yang terakhir yaitu mengetahui jenis kontaminan yang terjadi karena

beberapa a"tor. (ebelum memulai praktikum ini maka praktikan harus

mempersiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Alat yang digunakan dalam

praktikum ini yaitu& )aminar Air *low +)A*,& Botol semprot yang berisi alkohol

51?& Pinset& Pisau& (eal wrap +segel,& !ertas label& Alat tulis& Bunsen dan Petri

dish. (edangkan bahan yang harus disediakan yaitu medium padat kultur jaringan

yang telah dibuat pada praktikum sebelumnya& PestisidaF *ungisida& A@uades serta

Alkohol 51?.

(etelah alat dan bahan sudah lengkap tersedia& maka praktikan dapat

memulai praktikum a"ara teknik aseptik dengan prosedur yang sudah terdapat

dalam modul. Prosedur kerja dalam praktikum ini dibagi menjadi 0 prosedur yaitu

prosedur kerja dalam sterilisasi peralatan& prosedur kerja dalam sterilisasi media&

dan yang terakhir prosedur kerja sterilisasi bahan tanam yanga akan digunakan.

Prosedur kerja yang pertama yaitu proses sterilisasi peralatan yang dimulai

dengan men"u"i dengan detergen dan membilasnya sampai bersih dengan

menggunakan a@uades& kemudian meniriskannya hingga kering. ensterilkan

dengan auto"la$e dan menyimpannya dalam o$en untuk menjaga peralatan agar

tidak kontaminasi. (etelah proses sterilisasi& dapat menggunakan semua peralatan

dengan menekan kontaminasi.

Prosedur kerja kedua yaitu proses sterilisasi media yang diawali dengan

menggunakan media tanam yang steril. ensterilkan menggunakan auto"la$e

untuk menghindari kontaminasi. emasukkan media yang telah jadi ke dalam

botol kultur dan menutupnya dengan aluminium oil. (etelah selesai semuanya

lalu melakukan sterilisasi pada temperature /oC dengan tekanan 5&> Psi selama

/1-01 menit. Prosedur kerja yang terakhir yaitu proses sterilisasi bahan tanam atau

eksplan yang akan digunakan dengan men"u"i bersih bahan tanam dengan


16/25

menggunakan air mengalir. Hal yang perlu diperhatikan adalah pada saat

pembilasan air yang digunakan harus dengan air yang mengalir agar semua

kontaminan dapat di singkirkan dan agar eksplan tidak mudah terkontaminasi

dengan air bekas bilasan yang telah digunakan apabila menggunakan air yang

tidak mengalir. engojog bahan tanam dengan menggunakan pestisida atau

ungisida. erendam bahan tanam dengan bahan kimia tertentu atau antisepti" di

)aminar Air *low +)A*, dan yang terakhir membilas bahan tanam dengan

menggunakan air steril dan kemudian menanamnya.

(etelah praktikum selesai dilakukan maka dilakukanlah pengamatan pada

hari ke-5 dan hari ke-6. Namun yang dapat diperoleh hanya pada hari ke-5.

Parameter yang digunakan untuk mengamatinya adalah mengetahui jumlah dan

jenis kontaminan yang terjadi pada media dan berapa prosentase keberhasilan

teknik aseptik yang telah dilakukan. Berdasarkan tabel hasil pengamatan dapat

diperoleh bahwasanya pada hari ke-5 dengan bahan tanam tembakau& media yang

telah ditanami dengan perlakuan (1 menunjukkan bahwa tidak ada

kontaminan yang terjadi dalam media tanamnya. Pada perlakuan ( dengan P3

NAA 1&/>ppm dan BAP ppm diperoleh hasil bahwa tidak ada akti$itas

kontaminasi yang terjadi& sehingga tidak adanya kontaminan dalam media

tanamnya. Pada perlakuan selanjutnya dengan menggunakan media ( yang di

tambahi dengan P3 NAA ppm dan BAP 1&/>ppm menunjukkan hal yang sama

bahwa tidak adanya akti$itas kontaminan yang dibuktikan dengan tidak adanya

kontaminasi yang terjadi.

Pada perlakuan ke-6 dengan media ( menggunakan P3 BAP 1&>ppm

menunjukkan tidak adanya kontaminasi baik dari jamur ataupun bakteri.

Perlakuan yang terakhir dengan media ( yang ditambahi dengan /&6 # 1&> ppm

tidak terjadi adanya kontaminan yang disebabkan oleh akti$itas jamur ataupun

bakteri. (ehingga dapat disimpulkan berdasarkan hasil pengamatan hari ke-5

dapat diketahui prosentase keberhasilan teknik asepti" yang telah dilakukan

men"apai 11?. Hal ini dibuktikan dengan tidak adanya kontaminan baik yang

berasal dari jamur ataupun bakteri.


17/25

*aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah

kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati.

!ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi +jamur, dan

bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau "endawan yang

menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi

"endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. !ontaminasi

pada media perlakuan sebelum proses penanaman tidak dapat digunakan untuk

menanam. (ehingga sebelumnya harus diganti dengan pembuatan media yang

baru untuk selanjutnya dapat dilakukan proses penanaman +3uhuteru& /1/,.

edia tanam dapat digunakan setelah diinkubasi selama 6-5 hari dan

memastikan bahwa media yang digunakan terbebas dari kontaminasi& namun

kontaminasi pada planlet mulai terlihat pada umur satu (P dengan rekuensi E

-> botol planlet. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh "endawan

dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak

langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka "endawan tersebut akan

menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang

disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan

mun"ulnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet +3uhuteru& /1/,.

*aktor penyebab kontaminasi yang terjadi berasal dari kurang bersihnya

botol& peralatan pada saat pembuatan media& suhu ruang kultur yang sering

berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di rak kultur dan adanya bakteri

yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam oleh karena itu harus

dilakukan proses sterilisasi bahan tanam sebelum dilakukan proses penanaman

dan juga kontaminasi sangat ditentukan oleh sterilitas ruangan yang sebab itu

sangat perlu dilakukannya proses sterilisasi ruangan sebelum digunakan untuk

menanam eksplan dalam medium. Proses sterilisasi ruangan yang termasuk dalam

teknik aseptik menggunakan )aminar Air *low +)A*, untuk menjaga sterilitas

ruangan.

Prinsip kerja alat ini dapat dikolaborasikan dengan struktur yang

dilengkapi dengan ruangan udara dengan udara yang steril. Ada dua ma"am dari

jenis ini yaitu hori4ontal dan $erti"al )aminar Air *low steril system yang


18/25

terkadang membutuhkan biaya yang sangat mahal dalam proses perawatannya.

Pengembangan alat ini diharapkan memanipulasi dan mempertahankan suatu

ruangan dalam keadaan yang selalu steril. Alat ini telah disempurnakan dengan

adanya aliran udara steril melalui sebuah prefilter dan alat yang dialirkan melalui

sebuah ilter H;PA + High Efficiency Particulate Air , untuk menggerakkan aliran

udara yang steril di dalam ruang kerja di laboratorium. )aminar dilengkapi

dengan adanya lampu % +Ultra Violet , yang digunakan untuk memastikan

bahwa tidak adanya kontaminan di setiap sisi ruangan +(tignor& /112,.

Hal ini sangat diperuntukan untuk kegiatan praktikum dan pembuatan stok

biologi yang harus dalam kondisi yang steril. Cara kerja laminar air low sebagai

HACD + Heating, Ventilation, Air-Conditioning, and Refrigeration, sebelum

digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 51 ? pada

dinding dan alasnya serta meratakannya menggunakan tissue atau kertas yang

steril. !emudian mendiamkannya selama kurang lebih 01 menit. )ampu

ultra$iolet yang berada di dalam laminar air low dinyalakan selama 1&>- jam

untuk membunuh kontaminan yang berada di dalamnya +(tignor& /112,.

Proses sterilisasi media dan peralatan dengan menggunakan alat sterilisasi

auto"la$e yang mempunyai prinsip sebelum digunakan atau dinyalakan bahan

atau alat yang lain adalah tutup botol plastik& peralatan gelas& peralatan diseksi&

pipet& air murni& dan media kultur mendapatkan perlakuan sesuai dengan jenis

alatnya. (emua peralatan diseksi dibungkus dengan menggunakan kertas "oklat

atau kertas merang dan juga !oran sebelum diautokla$. Aluminium oil tidak

direkomendasikan untuk membungkusnya dikarena uapnya tidak dapat menembus

pembungkus. Cara kerja yang harus dipatuhi dalam menggunakan auto"la$e

mengkondisikan autokla$ diatur pada temperatur yang digunakan untuk sterilisasi

dengan autokla dengan suhu /oC serta tekanan >-5&> psi selama >/1

menit. Peralatan yang terbuat dari logam& wadah-wadah gelas& dan lain-lain&

disterilsasi dengan pemanasan dalam o$en pada suhu 0151oC selama /6 jam.

'leh karena itu hal yang perlu mendapatkan diperhatian dalam teknik

asepti" se"ara in vitro yaitu dalam beberapa tahapan antara lain pemilihan eksplan&

proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang telah dipilih& keadaan selama


19/25

proses kultur yang terdiri dari suhu atau temperatur& kelembaban relati$e serta

waktu yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangannya selama

proses kultur in vitro. !ondisi pertama yang membawa keberhasilan dalam proses

kultur adalah aseptik. 3eknik untuk mempertahankan asepti" disebut teknik

asepti" yang berarti bebas dari semua jenis mikroorganisme atau kondisi yang

steril dan layak untuk melakukan proses kultur in vitro. %ntuk menjaga

lingkungan yang aseptik maka harus semua komponen kultur baik alat dan bahan

serta media dan juga eksplan yang akan digunakan harus dalam keadaan yang

steril sehingga harus dilakukan proses sterilisasi untuk semua komponen dalam

kultur jaringan. Hal penting yang lain yaitu menjaga udara& permukaan lantai

bebas dan bersih dari debu. (ehingga semua pengerjaan dari praktikum kultur

harus dilakukan dalam )aminar Air *low Cabinet yang steril +Chawla dalam

Anoop& /112,.

%ntuk itu pada dasarnya teknik aseptik yang dilakukan dalam kultur

jaringan sangat perlu digunakan untuk dapat mendukung kondisi yang dibutukan

eksplan yang ditanam dalam media mengalami proses pertumbuhan dan

perkembangan. 3eknik asepti" dapat terlaksana dengan baik apabila juga disertai

dilakukannya proses sterilisasi terutama pada eksplan yang harus bebas dari

kontaminan sebelum dilakukan proses penkulturan. Berbagai proses sterilisasi

yang disertai dengan bahan sterilisasi digunakan untuk men"egah adanya

kontaminasi pada jaringan dalam eksplan. Bahan sterilisasi "ontohnya yaitu

Cloro= atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan yang dapat

membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik berupa jamur& $irus&

bakteri& maupun kontaminan yang lain +Hariyadi& /11,. Hal ini dikarenakan

kedua bahan tersebut merupakan ra"un untuk tanaman oleh karena itu dalam

penggunaanya diperlukan dosis atau ukuran yang sesuai agar tidak melukai

ataupun mematikan jaringan dalam eksplan +:a4id& /11,.

Pentingnya teknik aseptik dalam kultur jaringan tepatnya pada saat

penanaman eksplan harus selalu dalam keadaan yang steril& maka harus dilakukan

sterilisasi. (etiap bahan yang akan kita gunakan harus dalam kondisi yang steril.

3ermasuk juga praktikan yang hendak menanam eksplan pada media tanam harus


20/25

steril dimulai dari penggunaan jas lab& sarung tangan dan masker. (elain itu

sebelum praktikan memulai melakukan penanaman eksplan di dalam )aminar air

*low Cabinet& harus menyemprotkan al"ohol ke tangan walaupun sudah memakai

sarung tangan lateks. Begitu juga dengan peralatan yang akan digunakan sebelum

memasuki )aminar Air *low Cabinet seperti pinset dan s"alpel& harus direndam

dengan al"ohol yang disediakan dalam beaker glass ke"il apabila alat tersebut

tidak digunakan. Namun apabila akan digunakan kembali harus di panaskan

terlebih dahulu di atas nyala api Bunsen.

Proses sterilisasi yang merupakan langkah penting dalam teknik aseptik

dilakukan dengan tujuan agar semua proses penanaman yang dilakukan dengan

alat dan bahan yang steril karena penanaman eksplan ini sangat mudah terjadi

kontaminan yang dapat mempengaruhi keberhasilam penanaman eksplan. 'leh

karena itu teknik aseptik sangat penting untuk dilakukan untuk memperoleh

keberhasilan pada proses penanaman dalam kultur jaringan.


21/25

BAB '# KE,IMPULAN AN ,ARAN

'#$ Kesi+p"lan

. 3eknik aseptik dalam kultur jaringan dilakukan pada saat sebelum& pada

waktu penanaman eksplan dan sesusadah penanaman harus selalu dalam

keadaan yang steril& maka harus selalu dilakukan sterilisasi. (etiap bahan

yang akan kita gunakan harus dalam kondisi yang steril. 3ermasuk juga

praktikan yang hendak menanam eksplan pada media tanam harus steril

dimulai dari penggunaan jas lab& sarung tangan dan masker. (elain itu

sebelum praktikan memulai melakukan penanaman eksplan di dalam

)aminar air *low Cabinet& harus menyemprotkan al"ohol ke tangan

walaupun sudah memakai sarung tangan lateks. Begitu juga dengan

peralatan yang akan digunakan sebelum memasuki )aminar Air *low

Cabinet seperti pinset dan s"alpel& harus direndam dengan al"ohol yang

disediakan dalam beaker glass ke"il apabila alat tersebut tidak digunakan.

Namun apabila akan digunakan kembali harus di panaskan terlebih dahulu

di atas nyala api Bunsen. (terilisasi setelah penanaman dengan

membersihkansemua alat dan bahan yang digunakan untuk tidak berada

dalam )A* pada saat setelah proses penanaman.

/. Proses sterilisasi yang merupakan langkah penting dalam teknik aseptik

dilakukan dengan tujuan agar semua aspek yang terdiri dari peralatan dan

bahan serta media& praktikan dan eksplan atau bahan tanama yang akan

digunakan dan juga lingkungan kerja pada saat proses kultur jaringan

mempunyai alat tertentu yang digunakan untuk melakukan proses

sterilisasi pada semua aspek. Proses sterilisasi peralatan& dan media

dilakukan dengan menggunakan auto"la$e dengan suhu /oC dan tekanan

5&> Psi. Proses sterilisasi lingkungan kerja beserta praktikan dengan

selalu berada dalam )aminar Air *low Cabinet dengan dilengkapi lampu

% untuk mempertahankan sterilitas ruangan selama proses penanaman.


22/25

Proses sterilisasi bahan tanam dngan menggunakan bahan sterilisasi

seperti Cloro= atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan

yang dapat membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik

berupa jamur& $irus& bakteri

0. *aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah

kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet

mati. !ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi

+jamur, dan bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau

"endawan yang menjadi penyebab paling dominan karena media yang

telah terkontaminasi "endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau

disterilkan kembali. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh

"endawan dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi

media yang berkontak langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan

maka "endawan tersebut akan menutupi seluruh permukaan media. Hal ini

berbeda dengan kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yang terjadi

langsung pada eksplan yang ditandai dengan mun"ulnya lendir berwarna

putih keruh disekeliling planlet. *aktor penyebab kontaminasi yang terjadi

berasal dari kurang bersihnya botol& peralatan pada saat pembuatan media&

suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol

disimpan di rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam

atau bahan tanam yang digunakan.

'#& ,aran

#alam hal menaikkan keberhasilan pada praktikum ini& adapun beberapa

saran yang pastinya perlu untuk diperhatikan& yaitu

. (angat memperhatikan kesterilan alat dan bahan dan memastikan semuanya

dalam keadaan steril.

/. (elalu memakai jas praktikum saat praktikum maupun pada saat

pengamatan baik pada praktikan maupun asisten laboratorium untuk

menghindari adanya kontaminasi.


23/25

A0TAR PU,TAKA

Anoop& Badoni and J. (. Chauhan. /112. In itro (terili4ation Proto"ol or

i"ropropagation o (olanum tuberosum. Academia Arena& /1127

+>,-9K. I((N >>0-22/L.

#eden& (ukmadjaja dan ariska& Ika. /110. Perbanyaan !ibit "ati melalui

#ultur "aringan I(BN 252-2>G/5-9-0. Bogor< Balai Penelitian

Bioteknologi dan (umberdaya 8enetik Pertanian.

Hariyadi& Purwiyatno. /11. $terili%a%i UH& dan Pengema%an A%epti .

Jakarta< Ikatan #okter Indonesia

)ili Herawati (iregar& )uthi A. (iregar& )ollie A. P. Putri. /10.

P;N8AD%H M- B;NI) AIN' P%DINA #AN M- A(A A(;3A3

NA*3A);NA 3;DHA#AP P;D3%B%HAN A!AD !oe%enbergia

flava (;CADA IN-I3D'. "urnal 'nline Agroeotenologi ol.&

No.0& Juni /10

ariska& Ika. /112.Perkembangan Penelitian !ultur In itro pada 3anaman

Industri& Pangan& dan Hortikultura. !uletin Agro!io ()*+(-( ') >&

N'. /

ariska& Ika dan #eden (. /110. Perbanyaan !ibit Abaa melalui #ultur

"aringan I(BN 252-2>G/5-2-. Bogor< Balai Penelitian Bioteknologi

dan (umberdaya 8enetik Pertanian.

ayta No$ali4a Isda dan Iran (ulianyah. /112. IN#%!(I !A)%( Centella

a%iatica ;)A)%I AP)I!A(I A%!(IN #AN (I3'!ININ +3he Doleo Au=in and Cytikinin in Callus Indu"tion o Indian Pennywort

+Centella a%iatica,. "erami olume / No. 0& (eptember - #esember

/112 I((N 252-1//9

. :a4id& Aris Bastianudin. /11. P;N8AD%H (3I%)AN A(A

A(;3A3 3;DHA#AP ;*I(I;N(I P;N8I!A3AN %DANI%

#A)A BI'D;;#IA(I )IN8!%N8AN ;N88%NA!AN

!acillu% sp. dan P%eudomona% sp. Pro%iding PP/ - P0/P&1 *2

Pu%te A%elerator dan Pro%e% !ahan 3 !A&A1 I((N 1/G 0/9.


24/25

Nur Ajijah& Ireng #arwati& :udiwanti& #an Doostika. /11. P;N8AD%H

(%H% IN!%BA(I 3;DHA#AP P;D3%B%HAN #AN

P;D!;BAN8AN ;BDI' ('A3I! P%D'C;N8 + Pimpinella

pruat4an olk.,. "urnal 5ittri G+/,& Juni /11 Hlm. >G G0 I((N

19>0-9//.

Nugraha Pratama #hanal& )ahmuddin )ubis& )isnawita. /10. I(')A(I

JA%D 'ncoba%idium theobromae P.H.B 3A)B'3 !;AN;

P;N:;BAB P;N:A!I3 A(C%)AD (3D;A! #I;BAC! PA#A

3ANAAN !A!A' #I )AB'DA3'DI%. "urnal 'nline

Agroeotenologi I((N No. /005- G>25 ol./& No.< /99-/20#esember /10.

Patoni A. 8aar dan (usi Heryani. /1/. P;N8;BAN8AN PD'(;(

P;N8')AHAN IN%AN NIDA AD;N #;N8AN 3;!NI!

%)3DA*I)3DA(I #AN #;'#'DI(A(I +3he #e$elopment o Aren

(ap #rink Pro"essing 3e"hnology by %sing %ltrailtration and

#eodori4ation 3e"hni@ues,. "UR1A5 HA$/5 PE1E5/&/A1 /10U$&R/

olume />& No. & April /1/.

(tignor& Caroline Haglund. /112. 5aminar-flo6 5i7uid-to-air Heat

E8changer%-Energy-effeciency 0i%play Cabinet Application%. (weden<

)und %ni$ersity.

3uhuteru& . ). Hehanussa& (.H.3. Daharjo. /1/. P;D3%B%HAN #AN

P;D!;BAN8AN AN88D;! 0endrobium ano%mum PA#A

;#IA !%)3%D IN I3D' #;N8AN B;B;DAPA

!'N(;N3DA(I AID !;)APA. Agrologia& ol. & No. & April /1/&

Hal. -/. I((N /01-5/95.


25/25

Documents

Laporan Teknik Aseptik Dalam Kultur Jaringan