Las balsas de lípidos: poner orden en el caos.Pike LJ .

Fuente

Universidad de Washington Escuela de Medicina, Departamento de Bioquímica y Biofísica Molecular, 660 menos. Euclid, Caja 8231, St. Louis, MO 63110, EE.UU..pike@biochem.wustl.edu

AbstractoLas balsas de lípidos son los subdominios de la membrana plasmática que contienen altas concentraciones de colesterol y glicoesfingolípidos. Ellos existen como distintas regiones líquido-ordenada de la membrana que son resistentes a la extracción con detergentes no iónicos. Balsas parecen ser pequeño en tamaño, pero pueden constituir una fracción relativamente grande de la membrana plasmática. Mientras balsas tienen una proteína distintiva y composición de los lípidos, todas las balsas no parecen ser idénticas en términos de cualquiera de las proteínas o los lípidos que contienen. Una variedad de proteínas, especialmente aquellos involucrados en la señalización celular, se ha demostrado que partición en las balsas de lípidos. Como resultado, se cree que las balsas lipídicas de estar involucrados en la regulación de la transducción de señales. La evidencia experimental sugiere que hay probablemente varios mecanismos a través del cual las balsas controlan la señalización celular. Por ejemplo, balsas pueden contener vías de señalización incompletas que se activan cuando un receptor u otra molécula requerida se reclutaron en la balsa. Las balsas también pueden ser importantes en la señalización limitantes, ya sea por el secuestro física de los componentes de señalización para bloquear las interacciones no específicas, o mediante la supresión de la actividad intrínseca de las proteínas de señalización presentes en las balsas. Esta revisión ofrece una visión general de las características físicas de las balsas de lípidos y resume los estudios que han ayudado a aclarar el papel de las balsas lipídicas en la señalización a través de receptores tirosina quinasas y los receptores acoplados a proteínas G.

Complementarias palabras clave: colesterol, transducción de señales, liquidordered. Dominios

Durante 30 años, el modelo de mosaico fluido de Singer y Nicolson (1) ha sentado las bases para nuestra comprensión de la estructura de las membranas celulares. En este modelo, las proteínas de membrana son vistos como icebergs flotando en un mar de lípidos. Sin embargo, el trabajo en la última década ha aportado pruebas de que la membrana plasmática no es un océano al azar de los lípidos. Más bien, hay una estructura dentro de este mar de los lípidos que a su vez impone organización en la distribución de las proteínas en la bicapa. Las "estructuras" de lípidos en la membrana del océano se llaman balsas lipídicas. Las balsas de lípidos son regiones localizadas de niveles elevados de colesterol y contenido de glicoesfingolípidos dentro de las membranas celulares (véase la fig. 1). Las cadenas laterales de ácidos grasos de los fosfolípidos presentes en las balsas de lípidos tienden a ser más altamente saturada que los de la membrana que rodea. Esto permite que el embalaje final con las cadenas de acilo saturadas de esfingolípidos, y probablemente conduce a la separación de fases. Debido a la presencia de colesterol, se forma un dominio de líquido-ordenada que exhibe menos fluidez de la membrana plasmática que rodea. Este acondicionamiento hermético de los lípidos y separación de fases es probablemente

responsable de la propiedad de la firma de las balsas lipídicas: su insolubilidad en detergentes no iónicos (2). Caveolae son pequeñas invaginaciones de la membrana plasmática que se pueden ver como un subconjunto de las balsas lipídicas. Al igual que las balsas de lípidos, caveolae tiene un alto contenido de colesterol y glicoesfingolípidos, sin embargo, caveolae se distinguen de las balsas de lípidos por la presencia de la proteína de unión a caveolina colesterol-1 (3) que parece ser responsable de la estabilización de la estructura de invaginado de caveolas ( 4, 5).

La presencia dentro de las balsas de lípidos (y caveolae) de una variedad de proteínas de membrana que participan en la señalización celular (6, 7) ha llevado a la consenso de que estos dominios lipídicos juegan un papel importante en el proceso de transducción de señales. Esta revisión se centrará en las balsas de lípidos que se encuentran en las membranas plasmáticas y su papel en la transducción de señales. Salvo en casos específicos, no se hace una distinción entre las balsas planas y caveolae invaginada, ya la mayoría de estudios no distinguen inequívocamente entre estos subtipos de balsas. Opiniones centrados en la estructura y función de caveolas invaginado se han publicado recientemente (7-9).

Aislamiento de las balsas lipídicas

Históricamente, las balsas de lípidos se han definido funcionalmente por su baja densidad y la insolubilidad en frío 1% de Triton X-100 (10). Esto ha dado lugar a las siglas DRM (membrana de detergente-resistente), TIM (membranas Triton insolubles), y TIFF (fracción insoluble en Triton flotante).

figura 1. Estructura de las balsas lipídicas. Las balsas de lípidos bicapa (azul) son dominios de la membrana especializados que contienen altas concentraciones de colesterol, esfingomielina, y gangliósidos. También se enriquecen en fosfolípidos que contienen cadenas de acilo grasos saturados (líneas rectas en las colas de lípidos). Esta composición da lugar a la separación de fases lateral y la generación de un dominio líquido-ordenada. Granel membrana plasmática (gris) contiene menos colesterol, esfingomielina y gangliósidos, y más fosfolípidos con cadenas acilo insaturados. Como resultado, es más fluido que las balsas de lípidos. Una variedad de partición de

proteínas en balsas lipídicas: proteínas glycosylphosphatidylinositolanchored, proteínas transmembrana (TM), proteínas doblemente aciladas (Acil). Como se muestra en el diagrama, no todas las balsas de lípidos tienen la proteína idéntica o composición de lípidos (Balsa 1 vs Balsa 2). No se muestran invaginada caveolae, una subclase de las balsas de lípidos que contiene caveolina. PC, fosfatidilcolina, PE, fosfatidiletanolamina, PS, fosfatidilserina, PI, fosfatidilinositol, SPM, esfingomielina, Chol, colesterol, Gang, gangliósidos.

El método tradicional de preparación de las balsas de lípidos resistentes al detergente incluye raspar las células en tampón frío que contiene 1% de Triton X-100, y homogeneizar el lisado (10). Las balsas se aislaron por flotación en un gradiente de densidad lineal de sacarosa de 5% a 30% donde distribuyen en la parte superior unos fracciones del gradiente (10). Este procedimiento produce un producto bastante consistente que está enriquecida en colesterol y balsa proteínas marcadoras como flotillin y glicosilfosfatidilinositol proteínas (GPI)-vinculados. Las diferencias pueden surgir, sin embargo, si la medida de la manipulación física de los lisados con detergente es variada. Por ejemplo, los receptores de factor de crecimiento epidérmico (EGF) se retienen en las balsas de lípidos Triton X-100-resistentes si el lisado se coloca en un tubo y simplemente invierte varias veces antes de la centrifugación y flotación de las balsas. Por el contrario, los receptores de EGF se pierden de DRM si el lisado de detergente original se homogeneizó antes de la centrifugación (observaciones no publicadas). Por lo tanto, se debe tener cuidado de ser coherente en todos los aspectos del procedimiento de aislamiento para obtener preparaciones que son comparables a través de experimentos.

Recientemente, una amplia variedad de detergentes distintos de Triton X-100 se han utilizado para aislar fracciones de membrana detergentinsoluble de baja densidad. Estos incluyen NP-40, octil-glucósido, CHAPS, Lubrol, y Brij 98, así como las concentraciones de menos de 1% de Triton X-100 (11-13). Mientras que hay un solapamiento sustancial en el contenido de proteínas y lípidos de las balsas lipídicas preparadas por estos diversos métodos, también existen diferencias significativas entre ellos (11-13). Esto sugiere que los diversos métodos para la preparación de lípidos balsa no producen fracciones de membrana idénticos. Por lo tanto, en gran medida, las balsas de lípidos insolubles en detergente son realmente el producto único del método por el cual se han hecho.

También se han reportado varias preparaciones libres de detergente de las balsas de lípidos. Una preparación implica la lisis de células enteras en un tampón de carbonato de sodio (pH 11). Este tampón se utiliza debido a que el pH elevado ayuda en la eliminación de proteínas de membrana periféricas. Después de sonicación del lisado, balsas se centrifugan en un gradiente discontinuo de sacarosa y la banda en el 5% y la interfaz de sacarosa 35% (14). Esta es una preparación relativamente sencilla, pero de flotación a través de 35% de sacarosa no es una prueba particularmente estrictos para las membranas de baja densidad. Además, pueden surgir problemas debido a que el material que en última instancia se sometió a ultrasonidos y se separó por centrifugación en gradiente de densidad contiene todas las membranas intracelulares.

Debido a que las balsas están presentes en las membranas intracelulares, así como la membrana de plasma, no hay garantía de que una proteína que se encuentra en la fracción de luz al final de

este procedimiento estaba realmente presente en la membrana plasmática al inicio de la preparación. Un procedimiento más selectiva para la purificación de las balsas de lípidos no detergentes se informó por Smart et al. (15). En este método, las células se lisaron en tampón de sacarosa isotónica, y un sobrenadante postnuclear se aísla. Una fracción de membrana de plasma purificado se prepara por sedimentación del sobrenadante postnuclear en un gradiente de Percoll auto-formada. Las membranas plasmáticas se separan fácilmente del aparato de Golgi, retículo endoplásmico, mitocondrias y por este método. El patrón de bandas de estas diversas fracciones de membrana se puede modificar mediante la alteración del pH y la composición iónica de la gradiente de Percoll para obtener una separación óptima (16). Las membranas plasmáticas purificadas se sometieron a ultrasonidos para liberar las balsas de lípidos (y caveolae), que están aisladas por flotación en un gradiente continuo de Opti-Prep en solución isotónica.

Este método produce una balsa lipídica preparación altamente purificada, que probablemente refleja estrechamente la composición de estos dominios en células intactas.

Todas las preparaciones anteriores aislar todas las formas de las balsas de lípidos presentes en la célula, es decir, balsas planas y caveolae invaginado. Las balsas de lípidos caveolina que contienen se pueden separar de balsas noninvaginated por anticaveolin purificación de inmunoafinidad (17). Si caveolae son para ser aislado de las células endoteliales vasculares, está disponible un procedimiento que separa físicamente caveolae de las balsas de lípidos (18). Rata vasculatura pulmonar se perfunde con partículas de sílice coloidales catiónicos para recubrir el lado extracelular de la membrana plasmática. Las balsas de lípidos, siendo plana, son con recubrimiento de superficie en este procedimiento. Sin embargo, debido a los cuellos de caveolae son tan estrechas, el interior de estas invaginaciones no está revestido. Las células endoteliales se aislaron a partir de estos vasos perfundidos y, posteriormente, se preparan las membranas plasmáticas. Las membranas plasmáticas se homogeneizan para liberar el caveolae, que flotan en una menor densidad en gradientes de densidad de sacarosa de hacer las membranas plasmáticas de sílice recubiertas que contienen las balsas lipídicas planas. Las membranas plasmáticas, despojados de caveolae, se pueden lavar con una solución rica en sal para eliminar la sílice. La extracción de estas membranas con Triton X-100 y flotación en un gradiente de densidad resultados en el aislamiento de una fracción de membrana de baja densidad que está desprovisto de la caveolina pero enriquecido en otros marcadores de balsas de lípidos, y probablemente corresponde a balsas lipídicas planas purificada. Esta preparación, aunque engorroso y no en general aplicable a todos los tipos de células, genera lo que probablemente son las preparaciones más altamente purificadas de caveolas y balsas de lípidos.

Tamaño de las balsas lipídicas

Debido a caveolas representan un dominio morfológicamente identificable, el tamaño de esta subclase de las balsas de lípidos se puede determinar fácilmente a través de microscopía electrónica. Caveolae, en general, resultó ser invaginaciones en forma de matraz de 100 nm de diámetro (19). Sin embargo, caveolae se encuentra a menudo en racimos de uvas que tienen un tamaño total mucho mayor. Además, la caveolina-3, la forma específica de músculo de la proteína

estructural caveolar, caveolina-1, está involucrado en el desarrollo de túbulos T que puede ser micras de longitud (20).

El tamaño de las balsas lipídicas aplanados no se puede medir directamente, debido a que los dominios no se pueden distinguir de la membrana que rodea. Por lo tanto, los métodos relativamente indirectos se han empleado para determinar el tamaño de estos dominios. Estos estudios han generado estimaciones muy variables de tamaño de la balsa. Las proteínas unidas a GPI se conocen a partición en las balsas de lípidos y se utilizan a menudo como marcadores para estos dominios (10, 18). Análisis de la velocidad de difusión lateral de las proteínas unidas a GPI, así como gangliósidos, un marcador de lípidos balsa, sugieren que los dominios son de 200 nm a 300 nm de diámetro (21-23). Estudios de despolarización de la fluorescencia del receptor de folato unido a GPI obtienen resultados consistentes con un tamaño de 70 nm para las balsas de lípidos (24). Sola partícula de seguimiento de pista de las proteínas ancladas a GPI produjo un tamaño de 26 nm (25). Se obtuvieron valores algo más altos (0,2-2 m) en un estudio que utiliza un solo colorante rastreo para examinar la fluorescencia de una sonda de lípidos fluorescente (26). Por el contrario, varios estudios que utilizan la transferencia de energía de resonancia fluorescente no han encontrado evidencia de dominios lipídicos estables de este tamaño, y sugieren que estos dominios pueden existir sólo transitoriamente en algunas membranas (27, 28). Cada técnica aplicada al estudio de lípidos balsa tamaño tiene sus propias fortalezas y debilidades. Basado en la suma de los datos disponibles en la actualidad, una interpretación conservadora es que las balsas de lípidos son probablemente las estructuras con un diámetro medio en el intervalo de 100 nm a 200 nm, muy por debajo de la resolución del microscopio de luz. Otra consideración importante con respecto al tamaño de balsa es la fracción de la membrana plasmática que está realmente cubierta por las balsas de lípidos. Si se supone que las balsas lipídicas representan todo lo que queda después de una célula ha sido sometido a extracción con 1% de Triton X-100, a continuación, las balsas de lípidos parecen representar el 50% del área de superficie de la membrana de plasma (29, 30). Sin embargo, las estimaciones significativamente más bajos para la fracción de membrana plasmática se presentan como balsas (13%) se han derivado de los estudios de microscopía de una sola molécula (26, 30). La superficie abarcada por las balsas de lípidos es casi seguro que varía entre los tipos de células, y esto podría explicar la variabilidad en las estimaciones publicadas de la cobertura de balsa.

Los valores más firmes para el tamaño y la fracción de membrana de las balsas lipídicas esperan el desarrollo de mejores métodos físicos. Sin embargo, la información disponible en la actualidad proporciona una explicación para la observación de que muchas proteínas que se pueden localizar en balsas bioquímicamente a menudo parecen estar distribuidos difusamente en la membrana de la célula en lugar de presentar en un patrón puntiforme. Un diámetro balsa por debajo del límite de resolución del microscopio de luz acoplada con la más amplia cobertura de la superficie de la membrana plasmática por estos dominios se traduciría en un aparentemente una distribución uniforme de las proteínas balsa-localizados, como se visualiza mediante métodos de inmunofluorescencia.

Composición de las balsas lipídicas

Varios diferentes preparaciones de lípidos balsa han sido analizados mediante diversas metodologías para determinar su composición de lípidos. En general, estos estudios han demostrado que las DRM son enriquecidos en colesterol y glicoesfingolípidos, pero a menudo son pobres en glicerofosfolípidos. En un estudio de 1% de Triton X-100 insolubles en membranas, de baja densidad a partir de células MDCK, Brown y Rose (10) informaron de que las vesículas contenían 32% en moles de colesterol y 14% en moles de esfingomielina en comparación con 12% en moles de colesterol y 1 mol % esfingomielina en células enteras. Los sistemas DRM también se enriquecieron aproximadamente 5 veces en glicolípidos, tales como sulfátidos y gangliósidos, en comparación con las células intactas. Resultados similares fueron reportados por Prinetti et al. utilizando un enfoque de marcaje metabólico (31). Un análisis de espectrometría de masas en tándem de alta resolución de

0,1% de Triton X-balsas lipídicas 100-resistentes aislados a partir de células cebadas RBL-2H3 proporcionan un extenso análisis de la composición de ácidos grasos de los diferentes fosfolípidos presentes en estos sistemas DRM (32). Estos estudios demostraron que el 50% de las cadenas laterales de ácidos grasos en los lípidos de las membranas plasmáticas contenía enlace doble cero o uno, pero esto aumentó a 60% en lípidos de los DRM. Por lo tanto, los sistemas DRM mostró un aumento moderado en ácidos grasos saturados en comparación con las membranas plasmáticas.

Análisis de las balsas lipídicas preparadas a partir de células KB por un protocolo libre de detergente demostró muchas similitudes pero también algunas diferencias con respecto a los análisis anteriores de gestión de derechos digitales (33). Se encontraron las balsas de lípidos no detergente a ser 2 veces enriquecido en colesterol y 30% de aumento en el contenido de esfingomielina en comparación con la membrana plasmática mayor.

Curiosamente, las balsas no detergentes fueron enriquecidos en plasmalógenos etanolamina, en particular los de ácido araquidónico que contiene. Dado que se espera que los DRM a ser baja en PUFAs, la preferencia por araquidónico lípidos que contienen ácido fue inesperada. Este hallazgo sugiere que estos

que contiene ácido araquidónico plasmalógenos puede ser importante para la función de las balsas lipídicas. En este sentido, un informe reciente que se requieren plasmalógenos etanolamina para el transporte de colesterol desde la membrana plasmática hacia el retículo endoplásmico es particularmente intrigante (34).

La mayoría de los lípidos balsa típica (por ejemplo, colesterol, esfingomielina y glucoesfingolípidos) tienden a encontrarse principalmente en el folleto exofacial de la membrana. Por el contrario, glicero-fosfolípidos que contienen etanolamina son preferentemente localizados en el folleto cytofacial de la membrana plasmática. El hallazgo de que las balsas contienen un subconjunto distinto de estos lípidos cytofacial (33) sugiere que la composición de ambos los folletos exofacial y cytofacial de balsas son específicos para estos dominios, e implica que las balsas son probablemente estructuras bicapa.

Análisis de DRM preparadas a partir de estas mismas células KB (33) indica que los DRM son bajos en glicerofosfolípidos, en comparación con balsas no detergentes (Fig. 2A). Los sistemas DRM son particularmente baja en lípidos prospecto interior tales como fosfolípidos aniónicos y fosfatidiletanolamina, y no se enriquecen en plasmalógenos etanolamina como son las balsas no detergentes. Estas diferencias entre la composición de los lípidos de DRM y balsas no detergentes sugieren que el tratamiento con detergente de las membranas puede extraer selectivamente el folleto exofacial de balsas y dejar detrás de los lípidos de la hoja interna.

También se evaluó el grado de saturación-insaturación de cadenas laterales de ácidos grasos en balsas en comparación con las membranas plasmáticas en los estudios en células KB (33). El por ciento de las especies de fosfolípidos que contienen cadenas laterales de ácidos grasos saturados o monoinsaturados sólo era 40% en las membranas plasmáticas, así como en las balsas de lípidos no detergentes. Sin embargo, en las membranas preparada a partir de las mismas células por extracción con 1% de Triton X-100, 60% de las especies de fosfolípidos contenía sólo cadenas laterales de ácidos grasos saturados o monoinsaturados. Por lo tanto, sólo las balsas preparados por extracción con detergente mostraron un nivel elevado de las cadenas laterales acilo grasos saturados.

figura 2. Comparación de la composición de los lípidos y la insaturación de la cadena lateral en las balsas de lípidos no detergentes y Triton X-100 balsas de lípidos insolubles. Membranas plasmáticas purificadas (PM), balsas lipídicas no detergentes (balsas) y membranas resistentes a detergentes (DRM) se preparan a partir de células KB (33). Electrospray espectrometría de ionización de masas se utilizó para determinar la estructura de los fosfolípidos presentes en cada preparación de membrana. A: Composición lipídica de DRM y balsas no detergentes. Los resultados se muestran como nmol de lípido / mg de proteína. B: Distribución de dobles enlaces en las cadenas laterales de acilo por clase de lípidos. El por ciento de dos o más enlaces dobles se calcula mediante la determinación de la fracción de las especies de fosfolípidos individuales que contenía un total de dos o más dobles enlaces entre los dos grupos acilo presentes en el lípido.

Análisis de la distribución por clase de las insaturaciones en las cadenas laterales de ácidos grasos indica que el mayor nivel de lípidos saturados presentes en las DRM puede explicarse en gran medida por la exclusión de estas preparaciones de lípidos prospecto interior que contienen dobles enlaces en su lateral de ácido graso cadenas (Fig. 2B). La fracción de las especies de fosfatidilcolina y esfingomielina que contienen menos de dos dobles enlaces en total es más o menos equivalente en las membranas plasmáticas, balsas no detergentes, y DRM. Sin embargo, las membranas plasmáticas y las balsas no detergentes exhiben muchas especies más fosfatidiletanolamina y aniónicos fosfolípidos que contienen dos o más dobles enlaces que hacen DRM. Como fosfatidiletanolamina y los fosfolípidos aniónicos están normalmente asociados con la hoja interna de la membrana, esta observación es consistente con la hipótesis de que el tratamiento con detergente extrae selectivamente el prospecto exterior de las balsas.

Proteína de composición de balsas lipídicas

Una variedad de proteínas se han encontrado para ser enriquecido en las balsas de lípidos y / o caveolae. Esto incluye caveolinas, flotillins, las proteínas unidas a GPI, de bajo peso molecular y las proteínas G heterotriméricas, quinasas de la familia src, receptores de EGF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), los receptores, los receptores de endotelina, la fosfotirosina fosfatasa syp, Grb2, Shc, MAP quinasa (MAPK), proteína quinasa C, y la subunidad p85 de la PI-3-quinasa (7, 10, 14, 35-41).

Los mecanismos mediante los cuales se produce la asociación de balsa parecen ser variable. Caveolina, una proteína de la membrana intrínseca, es una proteína de unión colesterol y probablemente se concentra en caveolae debido a su capacidad para unirse a este esterol (3). Por el contrario, las proteínas ancladas a GPI, quinasas de la familia src, y la sintasa de óxido nítrico endotelial parecen localizar a las balsas de lípidos como consecuencia de modificaciones de lípidos (42, 43). Para algunas proteínas transmembrana, que abarca el dominio membrana parece mediar la distribución de la proteína en los dominios de membrana enriquecida en colesterol (44). Los estudios del comportamiento de otras proteínas de transmembrana (TM) han sugerido que la asociación de las proteínas con dominios enriquecida en colesterol se ve influenciada por la longitud de sus dominios transmembrana (45). Extracelulares motivos que contienen carbohidratos también se han implicado en la dirección de la asociación de TMs con dominios cholesterolenriched (46, 47). Más recientemente, Yamabhai y Anderson (48) demostraron que las secuencias en la porción más proximal a la membrana del dominio extracelular del receptor de EGF se dirigen a las balsas de lípidos, independientes de cualquier modificación de hidratos de carbono de la secuencia. Por lo tanto, aparece una variedad de mecanismos para ser empleados para la localización de proteínas de las balsas de lípidos.

Segregación de componentes en balsas de composición distinta

Cada vez hay más pruebas de que no todas las balsas de lípidos son equivalentes. Una variedad de estudios han demostrado que las balsas de lípidos con claramente diferente de proteína y / o componentes lipídicos coexisten dentro de las células (véase la fig. 1). Madore et al. (49)

examinaron la distribución de Thy-1 y la proteína prión (PrP), dos proteínas ancladas a GPI, en fracciones de baja densidad de Brij membranas de cerebro de rata de 96 solubilizadas. Purificación por inmunoafinidad de la preparación con anti-Thy-1 anticuerpos condujo al aislamiento de una fracción que contenía Thy-1 además de gran parte de la PrP. Sin embargo, la purificación por inmunoafinidad utilizando anticuerpos anti-PrP resultó en el aislamiento de las membranas que contenían esencialmente la totalidad de la PrP, pero sólo el 10% de la Thy-1. Del mismo modo, Drevot et al. (12) demostraron que el agotamiento de DRM de células T con anti-Thy-1 anticuerpos cuantitativamente extraídos receptores de células T (TCR) de las balsas. Sin embargo, predepletion de las balsas con anticuerpo anti-TCR retira poco Thy-1. Estos datos son consistentes con la interpretación de que Thy-1 está presente en la mayor parte de las balsas lipídicas de células T, mientras que sólo un subconjunto de las balsas contienen expresa PrP (49) o de TCR (12). En términos más generales, esto implica que no todas las balsas contienen el mismo subconjunto de proteínas.

Microscopía de inmunofluorescencia también se ha utilizado para identificar clases distintas de las balsas de lípidos. La proteína anclada a GPI, fosfatasa alcalina placentaria, y prominin (una proteína de membrana pentaspan), se mostró a estar presente en una fracción de baja densidad-detergente resistente,. Sin embargo, por inmunofluorescencia, estas proteínas exhiben distribuciones de la superficie celular, puntiformes distintos (11). Metodología similar fue usado por Gómez-Mouton et al. (50) para demostrar que en la migración de las células T, que conducen balsas borde contenían receptores de quimioquinas y un receptor activador del plasminógeno uroquinasa, así como GM pero carecían de GM. Por el contrario, las balsas urópodo contenidos CD44 y GM, pero carecían de GM. En la levadura, existe una agrupación de ergosterol (el equivalente de levadura de colesterol) y proteínas balsa de apareamiento-específicas en la punta de la proyección de acoplamiento. Raft proteínas que no están involucrados en el apareamiento no se localizan de manera similar (51). Estos experimentos indican claramente que existen distintas poblaciones de balsas en células y que pueden movilizarse a diferentes regiones de la célula después de un estímulo.

Balsas lipídicas Y Señalización Celular

La existencia de diferentes clases de las balsas de lípidos (además de caveolae invaginado) tiene implicaciones significativas para la función de estos dominios de la membrana en la señalización celular. Un número de posibilidades se resumen a continuación para proporcionar un marco para la interpretación de la miríada de observaciones experimentales a veces en conflicto en relación con balsas y de señalización celular. Esto es seguido por una discusión de los estudios sobre el papel de las balsas lipídicas en dos sistemas de señalización diferentes: los receptores de tirosina quinasas y los sistemas de receptor acoplados a proteína G. En el caso más simple, balsas pueden ser vistos como una señal de plataformas que sirven para colocalize los componentes necesarios, facilitando su interacción y el apoyo de señalización. En este escenario, receptores, factores de acoplamiento, enzimas efectoras, y los sustratos se colocalized en una sola balsa. La vía se activa por la unión de hormonas. La transducción de señales se produciría rápidamente y de manera eficiente debido a la proximidad espacial de los componentes que interactúan. Especificidad de la

señalización se podría mejorar mediante la restricción de la localización del receptor a una clase particular de balsas que contiene un subconjunto específico de los componentes de señalización.

Esta restricción sería limitar el acceso del receptor a los componentes de otras vías de señalización y prevenir de señalización no específicos. Además, el potencial para la localización espacial de los propios balsas lipídicas podría admitir la activación focal de la vía, la introducción de especificidad adicional en la respuesta.

En un modelo más complicado, componentes complementarios de una vía de señalización serían segregados en diferentes balsas lipídicas en condiciones basales. La estimulación de la célula con un factor o la hormona de crecimiento daría lugar a la fusión transitoria de las balsas lipídicas. Alternativamente, balsas podrían contener una vía de señalización casi completa que se activa cuando un receptor u otra molécula requerida que se localiza normalmente en la parte nonraft de la membrana se reclutaron en la balsa. Esto colocalize los diversos componentes, la promoción de interacciones y que conduce a la activación de una vía de señalización. En estos escenarios, balsas pueden ofrecer regulación a través de compartimentación, el flujo a través de una vía de señalización propuesta está restringido debido a la localización de los componentes que interactúan en diferentes compartimientos físicos. En esta situación, la localización de las proteínas a las balsas no se requiere específicamente para el funcionamiento de la vía. Más bien, las balsas proporcionan una separación física de las proteínas que de otra manera interactuar, lo que lleva a la activación no regulada de una vía. Esto implica que la interrupción de las balsas lipídicas podría conducir a la desregulación de algunas vías de señalización, una predicción que se ha confirmado experimentalmente.

Las balsas de lípidos también podrían controlar la señalización celular mediante la modulación de las actividades intrínsecas de proteínas localizadas dentro de ellos. Esto podría ser debido al lípido específico medio ambiente presente en balsas o podría ser el resultado de la estrecha aproximación en balsas de una proteína de señalización con una molécula reguladora. La observación de que algunas tirosina quinasas receptoras comportan de manera diferente cuando están en las balsas de lípidos que cuando están en las membranas nonraft apoya un papel de balsas en la modulación de la actividad de las proteínas balsa (ver más abajo).

En algunos sistemas, balsas pueden desempeñar un papel más sutil en la señalización.

Muchas proteínas balsa no están completamente localizados en balsas lipídicas, pero en lugar de partición a varios grados entre la balsa y nonraft porciones de la membrana. Este es el caso de las tirosina quinasas receptoras. Si estas tirosina quinasas funcionar de manera diferente en balsa y membranas nonraft y tener acceso a diferentes subconjuntos de señalización asociados en los diferentes compartimentos, es posible que el mismo receptor podría activar diferentes vías de señalización, dependiendo de donde estaba localizado. Por lo tanto, los cambios en la partición de las moléculas entre balsa y compartimentos nonraft (debido a cambios en los niveles de colesterol?) Podría alterar la relación de señalización a través de diferentes vías. Las balsas también pueden desempeñar un papel en la terminación de la señal. Las balsas se sabe que están

implicados en los acontecimientos endocítica (5, 8), y podría limitar la señalización celular mediante la internalización de los componentes específicos, que les impide seguir participando en un camino particular.

Las balsas de lípidos en los receptores de tirosina quinasa SEÑALIZACIÓN

Muchos receptores de tirosina quinasas, incluyendo el receptor de EGF, el receptor de PDGF, y el receptor de la insulina, se ha demostrado que estar localizado en las balsas de lípidos (35, 36, 52-54).

A diferencia de algunas otras proteínas de lípidos balsa, estas tirosina quinasas receptoras de transmembrana son, en general, no se ha recuperado en 1% fracciones X-100-resistentes Triton sino más bien están aislados con otros marcadores de balsas lipídicas sólo cuando se utilizan métodos no detergentes de preparación (55-57 ), sin embargo, los métodos que utilizan menores concentraciones de Triton X-100 o más suaves detergentes a veces producir material en el que estos receptores balsa-localizados se conservan en la fracción de detergente-resistente (57, 58). Por lo tanto, es evidente que la naturaleza de la asociación de los receptores de tirosina quinasas con balsas difiere de la de otros marcadores de balsas, tales como proteínas GPIanchored, que son altamente resistentes a detergente.

Esto ha dado lugar a la hipótesis de que los depósitos de lípidos pueden ayudar a centrar las memorias de balsas (59).

Aunque muchos receptores tirosina quinasas se localizan en balsas de lípidos, el efecto del ligando sobre esta asociación es muy variable (que se resumen en la Tabla 1). Receptores de EGF se mueven rápidamente fuera de las balsas de lípidos tras la activación por ligando (60), un comportamiento que es único entre los receptores de tirosina quinasas. En las células que contienen caveolae, receptores de insulina están constitutivamente secuestradas en caveolas (58). Sin embargo, en las células que carecen de caveolae, receptores de insulina son reclutados en las balsas mediante la adición de insulina. La localización de receptores de factor de crecimiento nervioso (NGF) y PDGF a las balsas parece ser relativamente poco afectada por ligando (35, 61). Las implicaciones funcionales de tales cambios en la compartimentación del receptor no está claro, sin embargo, una correlación aproximada entre el efecto del ligando sobre la localización del receptor y el efecto de agotamiento de colesterol en la señalización mediada por el receptor (Tabla 2) sugiere que los receptores que permanecen en, o son contratado para, después de la unión del ligando balsas son mucho más dependientes de la integridad de balsa para la función de receptores que son balsas de salida tras la unión del ligando.

Varios métodos han sido utilizados para investigar el papel de las balsas lipídicas en la señalización celular. Un enfoque ha sido estimular las células con un factor de crecimiento y luego aislar la balsa y las membranas nonraft y determinar en qué compartimento se ha producido un evento de señalización específica. El uso de este enfoque, se ha demostrado que la autofosforilación del receptor de PDGF, así como la fosforilación de tirosina de otros sustratos celulares se produce principalmente en las balsas de lípidos y es muy débil en las membranas nonraft (35, 62).

TABLA 1. Resumen de los efectos de la unión del agonista en el receptor de localización

EGF, factor de crecimiento epidérmico; NGF, factor de crecimiento nervioso; PDGF, factor de crecimiento derivado de las plaquetas.

a) ErbB2 no se une directamente a un ligando agonista, pero se activa mediante la formación de heterodímeros con receptores de EGF activados por ligando.

b) Los receptores de insulina residen constitutivamente en caveolas en las células que expresan caveolina pero para moverse en las balsas de lípidos tras la unión a la insulina en las células que no expresan caveolina.

TABLA 2. Resumen de los efectos del agotamiento de colesterol en la señalización a través de receptores tirosina quinasas

MAPK, MAP quinasa -. Indica un efecto positivo. - Indica un efecto negativo. 0 indica que no hay cambio.

Del mismo modo, la fosforilación del receptor de NGF a TrkA se produce en gran medida dentro de las balsas de lípidos, y sólo en este compartimento es TrkA se ha encontrado asociada con las moléculas de señalización corriente abajo, Shc y la fosfolipasa C-(61). En consonancia con su movimiento de salida de balsas después de la unión del ligando, receptor de EGF autofosforilada aparece tanto en balsa y compartimentos nonraft (observaciones no publicadas), sin embargo, el receptor de EGF parece activar la vía de señalización MAPK en una manera que implica las balsas de lípidos. Se encontró estimulación de Rat-1 células con EGF para dirigir a la contratación de Raf-1 a las balsas de lípidos en 30 segundos (36). Dado que el reclutamiento de Raf-1 a las membranas es un paso inicial en la activación de MEK y MAPK posteriormente, esta localización inducida por EGF de Raf-1 a las balsas de lípidos sugiere que la señalización de MAPK puede ser iniciada dentro de este compartimiento. De acuerdo con esta interpretación es la constatación de que la

activación de MAPK por PDGF puede ser recapitulado in vitro utilizando únicamente aislados membranas de lípidos balsa (63).

Además de la activación de MAPK, tirosina quinasas parecen activar otras vías de transducción de señal en gran medida desde el interior de las balsas. Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PTD-Ins (4,5) P2) es el principal sustrato para el factor de crecimiento estimulado rotación fosfatidilinositol, la generación de los dos segundos mensajeros intracelulares inositol trifosfato y diacilglicerol. Los estudios con células MDCK, células Neuro 2a, y las células A431 indican que tanto como la mitad de los celulares PtdIns (4,5) P2 está presente en las balsas de lípidos (56, 64, 65). La estimulación de las células A431, ya sea con EGF o la bradiquinina dado lugar a la pérdida dependiente del tiempo de PtdIns (4,5) P2 de la fracción de baja densidad con ningún cambio en el nivel de nonraft Ptd-Ins (4,5) P2, lo que indica que rotación de fosfatidilinositol se produce en las balsas de lípidos en lugar de en la membrana plasmática a granel (65). Del mismo modo, la estimulación de las células PC12 con NGF induce la hidrólisis de esfingomielina que sólo que está presente en las balsas de lípidos (54). Por lo tanto, una variedad de vías de señalización que utilizan proteínas y componentes de lípidos parece ser iniciado en las balsas de lípidos.

Un segundo enfoque para estudiar la función de las balsas de lípidos implica células ozono de colesterol. Las balsas de lípidos se mantienen unidas en gran medida a través de las interacciones entre el colesterol y esfingolípidos. Por lo tanto, la integridad de estos dominios puede ser alterada por el tratamiento de las células con agentes tales como filipin o metil-ciclodextrina que secuestran o eliminar el colesterol (66-68). En contraste con los estudios descritos anteriormente en el que el fraccionamiento de membrana se utiliza en última instancia para identificar la función de balsa, el agotamiento de colesterol permite un análisis de la función de las balsas lipídicas en la señalización celular en células intactas.

Consistente con un papel positivo para las balsas de lípidos en la transducción de la señal, el agotamiento de colesterol generalmente conduce a un deterioro significativo de la capacidad de los receptores de tirosina quinasas de la señal (que se resumen en la Tabla 2). El tratamiento con metil-ciclodextrina disminución de la fosforilación estimulada por insulina de su receptor, el IRS-1, y la ATP citrato lysase, así como la insulina estimula la captación de glucosa y la oxidación (52, 58, 69, 70). La insulina estimulada por la activación de PI-3-quinasa, tal como se mide a través de la activación de PKB / Akt, así como la activación de MAPK, también se redujo tras el agotamiento de colesterol (69). El agotamiento de colesterol celular, ya sea con filipin o lovastatina inhibe la activación estimulada por PDGF-PI-3 quinasa (71) y la actividad de la tirosina quinasa (62). Del mismo modo, el agotamiento de colesterol alterada NGF estimulada por la activación de MAPK y la autofosforilación del receptor (72), e inhibió la estimulada por EGF metabolismo de PI (68).

La excepción obvia a la regla de que el agotamiento de colesterol inhibe la señalización del receptor de tirosina quinasa es el receptor de EGF (Tabla 2). Para este receptor, la unión del ligando, la dimerización del receptor, y la autofosforilación, así como la activación de MAPK, son

todos mejorada siguiente interrupción de las balsas de lípidos (73-76). Teniendo en cuenta que el receptor de EGF es también el único receptor que se mueve fuera de las balsas tras la unión agonista, es tentador especular que estos dos comportamientos únicos están relacionados.

La observación de que el receptor de EGF puede activar MAPK en la aparente ausencia de balsas lipídicas sugiere que las balsas no pueden ser absolutamente necesarios para la activación de esta vía. En efecto, la evidencia experimental sugiere que la activación de los componentes de la cascada de señalización de MAPK no se produce exclusivamente en las balsas de lípidos. Por ejemplo, la unión de GTP a H-Ras conduce a la liberación de esta proteína de señalización de balsas (77). Por otra parte, la adición de señales de orientación a Raf-1, la proteína inmediatamente aguas abajo de Ras, ya sea para dirigir en balsas o evitar que entre en balsas, no altera la capacidad de la proteína Raf-1 modificado para participar en la activación de MAPK ( 78).

Por lo tanto, los pasos posteriores de la vía MAPK no pueden tener lugar en balsas en absoluto, y solamente los primeros pasos de la activación de MAPK pueden ocurrir tanto en balsa y fracciones nonraft, dependiendo del tipo de receptor.

La observación de que algunos eventos de señalización de hormonas estimuladas se han mejorado tras el agotamiento de colesterol revela un papel regulador negativo de balsas en la transducción de señal. Como se señaló anteriormente, el agotamiento de colesterol aumenta la actividad MAPK basal y estimulada por EGF aumenta la activación de MAPK (73, 74, 78). El aumento de la actividad MAPK basal parece ser dependiente de actividad de la PI (78) 3-quinasa y para implicar la activación independiente de ligando del receptor de EGF (79). Al parecer, este PI 3-quinasa vía dependiente de la activación se suprime normalmente en la presencia de balsas intactas. La base para mejorar la activación de MAPK estimulada por EGF en las células empobrecido en colesterol (73, 74, 78) no se conoce, pero puede ser debido a la activación de una vía no tradicional similar que se suprime normalmente cuando los componentes de señalización están restringidos a las balsas de lípidos . Alternativamente, esto puede ser el resultado de la capacidad del medio ambiente especializado de las balsas de lípidos para modular la actividad intrínseca del receptor de EGF. El agotamiento de colesterol por el tratamiento de las células con metil-ciclodextrina conduce a un aumento tanto de la actividad de quinasa intrínseca y la unión de EGF tirosina proteína (74-76). Estos hallazgos sugieren que la función del receptor de EGF puede ser suprimida por el colesterol o la localización de dominios cholesterolenriched. Por lo tanto, además de servir como plataformas para la iniciación de la señal, las balsas de lípidos puede proporcionar un nivel tónico de la regulación negativa de moléculas de señalización, lo que ayuda a suprimir la señalización espurias.

Si bien es evidente que los dominios de membrana enriquecida en colesterol son importantes en la transducción de señal de receptor de tirosina quinasa, un modelo general aún no se ha desarrollado por su papel en este proceso. Algunas vías, tales como metabolismo de PI, pueden requerir universalmente balsas para colocalize el receptor de activación con sus moléculas efectoras y una fuente de sustrato para la producción de segundos mensajeros. Esta vía puede representar el modelo en el que una balsa contiene algunos o todos los componentes de

señalización necesarios, que requiere sólo hormonas para reclutar los elementos finales y de activación del activador de la vía. Para otras vías tales como la activación de MAPK, el papel de las balsas de lípidos parece ser más compleja y receptor específico. Los receptores que son reclutados o restringidos a las balsas de lípidos pueden preferentemente iniciar MAPK señalización de ese compartimento, pero más tarde los acontecimientos pueden ocurrir fuera de ese dominio. En esta situación, balsas pueden facilitar la señalización mediante la localización de los componentes en un espacio restringido, lo que permite más rápida y eficiente de interacción para los receptores como el receptor de EGF que se puede mover fuera de las balsas, la función de las balsas lipídicas es menos claro. Algunos componentes de la cascada MAPK son reclutados para balsas tras la unión de hormonas, pero la activación de la vía no parece estar restringida a ese dominio, ya que los receptores que se encuentran fuera de las balsas son capaces de participar de la vía. A este respecto, el receptor de EGF se diferencia de otras tirosina quinasas receptoras que no parecen ser capaces de iniciar la señalización MAPK en la ausencia de balsas lipídicas. ¿Qué propiedad del receptor de EGF confiere esta capacidad única que queda por determinar, pero puede estar relacionado con los otros dos propiedades únicas del receptor de EGF: i) su capacidad para salir de balsas tras la unión del ligando, y ii) la inhibición del receptor de EGF de unión intrínseca y actividades quinasa de colesterol o lípidos balsas. Estas últimas observaciones apuntan a la posibilidad de que en algunos sistemas, balsas son más importantes para la supresión de la señalización que para el apoyo a la señalización.

Las balsas de lípidos en g SISTEMAS receptor acoplado a proteína

Se han mostrado un gran número de receptores acoplados a la proteína G para ser enriquecido en balsas de lípidos o caveolae. Esto incluye y los receptores adrenérgicos, receptores de adenosina, receptores de angiotensina II de tipo 1, los receptores EDG-1, receptores de endotelina, m receptores colinérgicos muscarínicos (80), rodopsina (81), y la bradiquinina y los receptores B B (39, 82-88) . Al igual que los receptores de tirosina quinasas, la localización de los receptores acoplados a la proteína G a las balsas de lípidos es modulada por ligando (Tabla 1). Para el receptor adrenérgico (89, 90) y el receptor de adenosina A (85), el tratamiento con agonista de causas translocación del receptor afín de las balsas de lípidos o caveolae. Por el contrario, la angiotensina II tipo 1 receptor (90), el receptor muscarínico (80), el receptor de EDG-1 (86), y la bradiquinina y los receptores B B (87, 88, 91) están dirigidas a las balsas tras la activación por agonista. La localización del receptor de endotelina es aparentemente afectada por agonista (39).

La importancia funcional de estos cambios inducidos por el agonista en la localización del receptor no se ha demostrado de manera inequívoca. Sin embargo, es posible que el movimiento ligandinduced de los receptores en las balsas de lípidos puede promover la asociación con el receptor de las proteínas G y enzimas efectoras que se enriquecen en este compartimiento. Además, muchos receptores acoplados a proteínas G son insensibilizados a través de un mecanismo que implica el secuestro de los receptores de la superficie celular (92). Las balsas de lípidos y caveolae se sabe que están implicados en la endocitosis (5, 8). Por lo tanto, para los receptores que son reclutados en las balsas de lípidos-caveolae después de la adición de agonista,

es posible que el reclutamiento a las balsas no sólo inicia la señalización, pero también representa la primera etapa de la desensibilización de esa señal.

Los experimentos en el receptor de acetilcolina muscarínico y el apoyo del receptor de angiotensina II tipo 1 esta hipótesis (89, 90).

Igual de importante que la localización de los receptores acoplados a la proteína G a las balsas de lípidos es la distribución de las proteínas G en sí. Una variedad de proteínas G se han notificado a ser enriquecido en balsas de lípidos y / o caveolae como Gs, Gi, Go, Gq y transducina (15, 37, 38, 68, 81, 93-95). La localización de las proteínas G a las balsas de lípidos parece ser el resultado de la acilación de la subunidad de estas proteínas (96). Ah, y Schnitzer (97) informaron que Gq interactúa con la caveolina, por lo que se concentra en caveolae, mientras que Gi y Gs no se unen caveolina y por lo tanto están dirigidos a las balsas lipídicas de forma predeterminada. Por lo tanto, diferentes proteínas G pueden separar en diferentes subtipos de balsas de lípidos dependiendo de la presencia de otros componentes en la célula. Una posibilidad interesante es que el diferencial de focalización de proteínas G para caveolae o balsas de lípidos podría conducir a una segregación inducida por el agonista en paralelo de los receptores que interactúan con las proteínas G en el mismo compartimiento. Este mecanismo podría mejorar la selectividad del receptor para la activación de vías de señalización específica localizada a un subconjunto de las balsas lipídicas o caveolae. Además del enriquecimiento de los receptores y proteínas G en las balsas de lípidos o caveolae, varias proteínas enzimas efectoras G se han notificado a estar presente en o reclutado a las balsas de lípidos después de la activación del receptor. El monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) fosfodiesterasa involucrada en el sistema de transducción de la señal visual ha demostrado ser reclutados por DRM después de la estimulación de la membrana externa del segmento barra con la luz y la guanosina trifosfato gamma tio (GTP-S) (81). Se han encontrado varias diferentes formas de la adenilato ciclasa, incluyendo los tipos III, IV, V, y VI, estar localizado en las balsas de lípidos (82, 84, 95, 98-100). Adenilato ciclasa endógena parece concentrarse constantemente en las balsas de lípidos, mientras que la adenilato ciclasa sobreexpresa distribuye a un grado variable entre las balsas y las membranas plasmáticas a granel, dependiendo del tipo examinado celular (82, 84, 100).

Enfoques similares a los utilizados para estudiar los sistemas de la tirosina quinasa del receptor se han empleado para investigar proteína G-receptor acoplado a la señalización en las balsas de lípidos. Uso de fraccionamiento de membrana, la rodopsina se muestra a estar presentes en las balsas de lípidos, y la activación por la luz induce la translocación de la transducina y GMPc fosfodiesterasa en balsas (81). Esto sugiere que los primeros pasos de la transducción de señal visual es probable que ocurran en este compartimento rodeado de membrana.

Más extenso trabajo ha demostrado la importancia de la localización balsa en el sistema de señalización del receptor 2-adrenérgico. En miocitos cardiacos neonatales, 2 - adrenérgicos son altamente enriquecido en lípidos balsas caveolae. Por el contrario, 2 - adrenérgicos y adenilato ciclasa distribuir entre balsas y la membrana plasmática mayor (82, 84). Receptores prostanoides EP2 están excluidos de las balsas.

La sobreexpresión de la adenilato ciclasa, que se enriquece en las balsas de lípidos, conducido a una mayor mejora de la 2 - adrenérgico actividad estimulada de 2 - adrenérgico actividad estimulada, y no para aumentar la respuesta a la prostaglandina E2 (84). Ostrom et al. (84) sugirieron que la capacidad de la adenilato ciclasa sobreexpresado para mejorar la señalización del receptor correlacionadas con el grado en que el 1 - y 2 - receptores colocalized con 2 - adenilato ciclasa en las balsas de lípidos. Se pensaba que los agonistas derivarse del hecho de que el receptor 1-adrenérgico se mantuvo en balsas después de la estimulación hormonal, mientras que los agonistas inducen la migración del receptor 2-adrenérgico de las balsas de lípidos - El aumento selectivo de la respuesta a 1 - 2 con ascompared.

Este sería separar el receptor 2-adrenérgico de su proteína G y adenilato ciclasa efector, y el límite de señalización. Este agonista-promovió la salida del receptor 2-adrenérgico de balsas fue inhibida por la expresión del péptido C-terminal de la cinasa del receptor adrenérgico-(-ARK), que bloquea la activación endógena de-ARK por subunidades G secuestrantes (101). Concomitante con este receptor de inhibición del movimiento hacia fuera de las balsas lipídicas, hubo una mejora de la producción de cAMP estimulada por _2-adrenérgico.

Juntos, estos datos son consistentes con la hipótesis de que la localización de los receptores _-adrenérgicos en raftscaveolae lípidos promueve su interacción con las proteínas G y adenilato ciclasa, y mejora su respuesta al agonista.

Otras vías de señalización de la proteína G-mediadas también parecen estar activada principalmente en balsas lipídicas. En las células A431, una gran parte de los PtdIns (4,5) P2 se concentra en las balsas de lípidos, y la hidrólisis de la bradiquinina-estimulada de Ptd-Ins (4,5) P2 utiliza sólo esta balsa-piscina localizada de Ptd Ins-(4 , 5) P2 (65). Del mismo modo, en las plaquetas de la producción de trombina-estimulada de ácido fosfatídico y de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato se concentra en gran medida en balsas (102).

La producción de ácido fosfatídico podría ser un resultado de la generación de diacilglicerol debido al metabolismo de PI, y es por lo tanto compatible con la compartimentación de la facturación fosfatidilinositol en las balsas de lípidos. La producción focal de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato sugiere que, además de metabolismo de PI, fosfatidilinositol 3-quinasa de activación de las plaquetas también se pueden localizar en balsas de lípidos. La endotelina estimula la activación de MAPK a través de un mecanismo que implica Gq y la fosfolipasa C-_ activación. La capacidad de la endotelina para estimular MAPK es dependiente de palmitoilación del receptor de la endotelina, una modificación que se orienten a las balsas de lípidos (103).

Esto implica que la localización del receptor de la endotelina a las balsas de lípidos es necesario para la estimulación de esta vía de señalización Gqmediated, y es consistente con la conclusión de que la rotación de PI se inicia en las balsas de lípidos.

En general, las conclusiones sugeridas por los estudios de fraccionamiento de membrana se confirman en gran medida en experimentos en los que G señalización del receptor acoplado a la proteína se sondea a través de agotamiento de colesterol (Tabla 3). Como fue el caso de los

receptores de tirosina quinasa de señalización, el agotamiento de colesterol generalmente afecta proteína G de señalización mediada. La bradiquinina estimulada por metabolismo de PI se encontró que estaba inhibida por el agotamiento de colesterol, que deslocaliza los PtdIns (4,5) P2 y otros componentes balsa (68). Del mismo modo, la trombina-estimulado la generación de ácido fosfatídico y la producción de 3,4,5-trifosfato de fosfatidilinositol es inhibida por el agotamiento de colesterol (102). Al igual que los estudios de fraccionamiento, estos datos sugieren que estos eventos de señalización mediada por la proteína G requieren balsas lipídicas intactas y proceden dentro de este compartimento.

Otros acoplados a la proteína G-receptor de rutas de señalización activadas también son sensibles a la depleción de colesterol. Estimulada por endotelina fosforilación de la tirosina quinasa de adhesión focal de MAPK y fue inhibida por el tratamiento de los astrocitos primarios con filipin (104). Del mismo modo, el tratamiento de la arteria de la cola de rata de endotelio denudado con ciclodextrina condujo a la inhibición de la endotelina-, 5-hidroxitriptamina-, y la vasopresina estimulada por contracción de la célula muscular lisa (105). Transactivación del receptor de EGF por la angiotensina, una vía que implica Ca2_ y c-src, también estaba alterada siguiente agotamiento de colesterol (106). Estos datos indican que las balsas intactos son necesarios para la activación de una variedad de proteína G-receptor acoplado a vías de señalización. Como fue el caso de los receptores de tirosina quinasas, existe una excepción a la conclusión general de que el agotamiento de colesterol inhibe T señalización del receptor acoplado a la proteína. Tanto la activación de adenilato ciclasa y la contracción de miocitos mediada a través del receptor _2-adrenérgicos se han mejorado por el agotamiento de colesterol (82, 83). Curiosamente, como el receptor de EGF, que es la excepción tirosina quinasa a lo general "inhibido-por-colesterol-agotamiento" regla, el receptor _2-adrenérgico migra fuera de las balsas lipídicas después de la unión agonista. Es posible que, al igual que el receptor de EGF, la actividad del receptor de _2-adrenérgico es inhibida por el colesterol o el medio ambiente balsa lipídica. Esta inhibición puede ser aliviado después de la liberación del receptor a partir de balsas, ya sea por el agotamiento de colesterol unión o ligando. La liberación de todos los componentes balsa en la membrana plasmática mayor mediante el tratamiento con ciclodextrina a continuación, puede permitir receptor de G-interacciones proteína-ciclasa más productivos, lo que resulta en la producción de AMPc elevada. Se necesitan más estudios sobre el efecto del colesterol en la función del receptor _2-adrenérgico para aclarar estas observaciones. El hallazgo de que el agotamiento de colesterol mejora la fracción de la rodopsina que se convierte en la conformación activado por fotólisis (107) es consistente con la posibilidad de colesterol y las balsas de lípidos puede regular negativamente la función de algunos receptores.

TABLA 3. Resumen de los efectos del agotamiento de colesterol en la señalización a través de receptores acoplados a proteínas G

_ Indica un efecto positivo. _ Indica un efecto negativo. 0 indica que no hay cambio.

RESUMEN

Las balsas de lípidos son subdominios organizados de la membrana plasmática y otras membranas intracelulares, tales como el aparato de Golgi. Parecen ser pequeño en tamaño, pero pueden constituir una fracción relativamente grande de la membrana plasmática.

Mientras balsas tienen una proteína distintiva y composición de los lípidos, los estudios sugieren que no todas las balsas son idénticos en términos de cualquiera de las proteínas o los lípidos que contienen. Además, las balsas de diferentes proteínas o composición de lípidos pueden espacialmente segregados en las células para llevar a cabo tareas específicas, como en la levadura de apareamiento o linfocitos que migran. Estas diferencias en la composición y espacial es probable que sean importantes para la función balsa en la señalización celular.

El cuadro general que emerge de estudios sobre el papel de las balsas lipídicas en la transducción de señal es uno en el que las balsas parecen ejercer un control tanto positivo como negativo en la transducción de señales. En su papel positivo, balsas que contienen diferentes proteínas de señalización pueden clúster o fusible a la estimulación agonista, que conduce a la mezcla de los componentes y que resulta en la activación de vías de señalización. En su papel negativo, balsas pueden segregar espacialmente componentes que interactúan para bloquear la activación de la vía no específica, o pueden suprimir directamente la actividad de las proteínas de señalización presentes en las balsas. A pesar de una extensa investigación se ha hecho sobre el papel de las balsas en la transducción de señales, muchos de los estudios utilizan métodos muy indirectos, tales como el agotamiento de colesterol, de implicar a las balsas en la señalización. Experimentos verdad inequívocos son raros. Por lo tanto, mientras que los datos son consistentes con un papel para balsas, hay un modelo unificador de exactamente cómo funcionan las balsas en la transducción de la señal ha evolucionado todavía. Seguir avanzando en la definición del papel de las balsas en la señalización celular requerirá el desarrollo de nuevas herramientas para visualizar con mayor eficacia las balsas de lípidos y para aislar y estudiar distintas poblaciones de estos dominios.