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大阪大学大学院生命機能研究科ﾋﾞﾙﾃﾞｨﾝｸﾞﾌﾞﾛｯｸｻｲｴﾝｽ共同研究講座
特任教授（常勤） 明石 満
平成31年2月5日
創薬と再生医療のためのLbL-3D生体組織の構築
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競争に勝てるかな？
創薬研究・再生医療の課題の克服と成功に向けて
高分子科学の理論に裏付けられたLbL法がその問題を解決します
特許の網をかいくぐれるか？
LbLとは？
再生医療に参画したが・・・
安定したデータがとれない
どの方法が良いのだろう？
三次元組織構築本当にできる？
細胞に元気がない・・・
3
ヒト培養組織キットスフェロイド（培養プレート）
細胞シート積層LbL-3D組織モデル
技術ヒト細胞を培養したアッセイキット（市販）
特殊プレート上で培養した細胞凝集塊
単層培養した細胞をシート状にして重層
ECM成分でコーティングした細胞を積層
参画者 皮膚モデル: J-TEC, SkinEthic, MatTex
肝モデル: Hepergen
血液脳関門モデル:ファーマコセル
東洋合成, Scivax, 日立テクノ, 住友べ, サイフューズ他
東京女子医大セルシード,テルモ
大阪大学共同講座参画企業
血管・リンパ管網の導入 × ×血管構造が不明瞭
△リンパ管不可
○両方可能
多種細胞への適応性 ×皮膚・肝臓・BBBのみ
×細胞間接着が弱い細胞は不適
×シート状に回収できない細胞有
○細胞種を問わずコーティング可
複数細胞の空間的配置制御
－ ×混合培養のため不可
△同一シート内の配置制御不可
○細胞積層・集積法・IJPを利用
組織化細胞を含むアッセイキットの製造・販売
○Ready-to-Use
×培養プレートのみ販売
×再生医療用、キット化不向き
○多種組織モデルに適応可
ニーズに対応した受顧客注製造 × × × ○
三次元培養組織および構築技術
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• 基盤
ナノ薄膜・細胞コーティング
技術
• 応用
三次元組織モデル構築
Layer-by-Layer (LbL) 技術
・物理的ストレスから細胞を守る
・細胞接着の足場↓
・高い細胞の生存率・細胞の定着性の向上
・短時間で細胞積層可能・複数の種類の細胞の
組合せが可能・バイオ３Dプリンターの
利用も可能・長期間安定、機能維持・各種臓器で検討中
血管網含有積層組織
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LbL細胞コーティング技術
細胞を細胞外マトリックス(ECM)成分であるフィブロネクチン(FN)およびゼラチン(G)の溶液に交互浸漬することで, 細胞膜表面にFN/G 薄膜が形成される．
Angew. Chem. Int. Ed. 46, 4689-4692 (2007). Adv. Mater. 23, 3506-3510 (2011).
ナノ薄膜
6
LbLコートは細胞増殖に影響なし
肝がん細胞株HepG2細胞に約10 nmのFN/G 薄膜
(○) フィブロネクチン(F)とゼラチン(G)でLbLコートした細胞(□) 4型コラーゲン(Col Ⅳ)とラミニン(LN)でLｂLコートした細胞(△) コートしていない細胞
コーティングされた細胞は良好に増殖Langmuir 29, 7362-7368 (2013).
7
LｂLは細胞を保護する基盤技術
細胞の生存率(viability)向上は再生医療の重要課題
Langmuir 29, 7362-7368 (2013).
8
単一細胞表面へのFN-Gナノ薄膜の形成によって、一段階で積層組織が構築
FN/G薄膜形成ヒト皮膚線維芽細胞
フィブロネクチン（FN）ゼラチン（G） 細胞集積 1日 三次元培養組織
FN-G coated cells
1234 567
FN/G薄膜の形成によって細胞間の接着・組織化が誘起できた
8
100 um
HE切片
Defect
Non-coated cells
足場がないので接着が困難
FN/G薄膜を足場として細胞間接着
LbLコートが足場（接着剤）の役目を果たし, 一工程で短期間(1日)で積層組織を構築
LbLコートにより細胞積層が短期間で容易に
Adv. Mater. 23, 3506-3510 (2011).
9
(ヒト臍帯静脈内皮細胞)
(ヒト皮膚線維芽細胞)
HSP70: Heat shock protein(ストレスタンパク質) IL-6 production(炎症性サイトカイン)
積層組織は熱刺激に応答してHSP70の産生量が増加
積層化することによって内皮細胞のIL-6産生量が著しく減少した
細胞をLbL法で三次元的に積層化することによって、従来のポリスチレン基板上よりも、より細胞に適した細胞培養が可能
LbL法による３次元積層構造は細胞機能を維持
Biophys. Res. Commun. 402, 153-157 (2010).
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0~24 hours 24~72 hours
ネットワーク構造は3週間後も維持された
vWF (Factor VIII)
50 umシンプル, 合理的, 高い再現性
血管含有組織の構築: 血管形成動画
HUVEC labeled with cell tracker green
線維芽細胞積層体で血管内皮細胞をサンドイッチ培養
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LbL法による血管・リンパ管のネットワーク構築
NHDF: LbLコートしたヒト皮膚線維芽細胞 NHDLMEC: LbLコートしたヒトリンパ管内皮細胞
HUVEC: LbLコートしたヒト臍帯静脈内皮細胞
免疫染色血管 ：抗CD31抗体(緑)リンパ管：抗LYVE-1(赤)
LbL法により血管、リンパ管を有する均質な三次元組織モデルが作製可能
J. Biomed. Mater. Res. Part A 103, 3386-3396 (2015)
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50 mm50 mm
皮膚モデルⅠ
心筋モデル
肝臓モデル
腸モデル 動脈壁モデル
HepG2細胞
線維芽細胞
結腸上皮細胞
平滑筋細胞
血管内皮細胞
ケラチノサイト
がん浸潤モデル
線維芽細胞
皮膚モデルⅡ
J. Biomed. Mater. Res. Part A 103A, 1554 (2015).J. Biomed. Mater. Res. Part A, 103A, 3386 (2015).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 363 (2015). Angew. Chem. Int. Ed. 50, 7557 (2011).
iPS由来心筋細胞Acta Biomaterialia 33, 110 (2016).
hAlb/hVim/DAPI
CK18/CD31/DAPI
Tissue Eng. Part A 23, 481 (2017). Biomaterials 133, 263 (2017).
ヒト凍結肝細胞
100 mm
Sci. Rep. 7, 13708 (2017).
膵島モデル 膵β細胞スフェロイド
Biomaterials 160, 82 (2018).
Tissue Eng. Part C. 24, 56 (2018).
腹膜モデル
Biochem. Biophys. Res. Commun. 494, 213 (2017).Biomaterials 78, 296 (2018).
20 mm
20 mm
300 mm
LbL-3D組織の各臓器モデルへの展開
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分化誘導日数の増加に伴い，角質層の厚さが増加する傾向.
線維芽細胞の積層体からなる真皮層の上に，ケラチノサイトの分化誘導に伴う基底層，有棘層，顆粒層，角質層の階層構造が確認された
LbL法による三次元皮膚モデル構築
LbL-3D Skin
J. Biomed. Mater. Res. Part A 103, 3386-3396 (2015) Tissue Eng. Part A 23, 481-490 (2017).
ヒト生体皮膚
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【Participating laboratories】 試験参加施設（試験責任者）〇田口浩之（花王（株） 基盤研究セクタープロジェクト・上席主任研究員）
〇宮崎裕美（防衛医科大学 防衛医学研究センター・学内講師）
〇池田英史（（株）マンダム製品保証部評価分析室・主任）
【Experts】 専門家〇橋本公二（愛媛県立医療技術大学・学長）
〇畠 賢一郎（株式会社J-TEC・代表取締役社長）〇大須賀 俊裕（株式会社J-TEC ・取締役専務執行役員）〇加藤雅一（株式会社J-TEC研究開発部・主任研究員）〇 Patrick Couvreur (Institut Galien Paris-Sud・Professor)〇 Simona Mura (Institut Galien Paris-Sud・Associate Professor)
【Trial coordinator】 試験コーディネーター〇小島 肇（日本動物実験代替法評価センター
（JaCVAM）・事務局長）
【Chemical management group】 化学物質管理部〇小島 肇（JaCVAM ・事務局長）〇足利 太可雄（JaCVAM・事務局）
【Data analysis group】 データ解析部〇山田知美（大阪大学医学部附属病院未来医療開発部
データセンター・特任教授、センター長）
【Record management group】 記録管理部〇小島 肇（JaCVAM ・事務局長）
【Lead laboratory】 主導施設〇明石 満（大阪大学大学院生命機能研究科・特任教授）
〇赤木隆美（大阪大学大学院生命機能研究科・特任准教授）
日本動物実験代替法評価センター
国立医薬品食品衛生研究所
LbL-3D Skinを用いた皮膚刺激性試験代替法のバリデーション研究
LbL-3D Skinの国際標準化に向けて
表記の運営委員会のもと、国際標準化に向けたバリデーション研究を進行中
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ヒトiPS細胞由来心筋細胞
500 μm
中胚葉誘導 心筋分化誘導 増殖・維持
DAY 6DAY13～ DAY15
hiPS-CM
hiPSC 253G1バイオリアクターで分化誘導（撹拌培養）
DAY14DAY 8DAY 5DAY 3DAY 1
大阪大学、協和発酵バイオ株式会社特許 PCT/JP2018/002321第16回日本再生医療学会総会O-18-3（2016年3月）
大阪大学、長瀬産業株式会社第17回日本再生医療学会総会 P-03-043（2017年3月）
Isotype control: Grey Negative:Blue, cTnT: Green
心筋マーカー トロポニンT(cTnT)陽性率: 95.74%
DAY 3
Ca2+ イメージング(細胞内におけるCa2+イオンの濃度変化)
有償提供準備中ご連絡下さい
DAY 0
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ヒトiPS由来心筋細胞を用いた心筋モデル
iPSC-CM：ヒトiPS 細胞由来心筋細胞NHCF：正常ヒト心臓線維芽細胞NHCMEC：正常ヒト心臓微小血管内皮細胞
遠心分離操作を無くし、細胞ロスとダメージを減らすフィルトレーションLｂL法適用
断面のHE染色 血管を染色（抗CD31 抗体）
拍動速度(線維芽細胞の配合%比較)
ヒトiPS 細胞から分化誘導した心筋細胞を用いて毛細血管様ネットワークを有する拍動可能な３次元心筋組織体の構築に成功
・心毒性評価系や薬効評価系に応用可能・移植用心筋組織（バイオハート）開発の基礎
Acta Biomaterialia 33, 110–121 (2016).
LbL-3D Heart
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LbL-3D Heartを用いた薬剤評価
心臓と同様の構造を持つLbL-3D Heart高機能化LbL-3D Heartの開発
特許（大阪大学, NTN 出願）
澤 芳樹教授（阪大院医心臓血管外科）との共同研究
アステラス製薬,大阪大学による国際学会発表(2018年9月,米国)
Cardiotoxicity evaluation using three-dimensional
cardiac tissues consisting of human iPS cell-derived
cardiomyocytes and fibroblasts by cell coating
technique. (Tadano, Akashi, Sawa et al.)
薬剤による心拍数減少 薬剤による心拍数増加
前スライドの2016年に比較して20倍以上の拍動実現
LbL-3D Heartの配向制御500 μm
LbL-3D Heartを用いた心毒性評価
Tissue Eng. Part C 24, 56-67 (2018).
Tissue Eng. Part C 23, 357-366 (2017).
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70 mm70 mm
ラット心筋梗塞モデル
移植
移植4週後
165 mm165 mm
成熟した太い心筋
発達した血管網
2倍以上に厚くなった移植組織
LbL-3D Heart
未熟でまだ貧弱な心筋
形成中の血管網電子顕微鏡像
素早い血管連結で血流を確保
3D心筋組織が短期間で発達！
電子顕微鏡像
移植前 移植後
10 mm
共同研究弘前大学大学院医学研究科下田 浩教授成田大一 助教浅野義哉 助教
移植組織血管と生体血管との連結
J. Tissue Eng. Reg. Med 11, 1303-1307 (2017). Sci. Rep 7, 13708 (2017).
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Bar = 100 μmLbL-3D Skin血管（+）
LbL-3D Skin血管（－）
人工真皮
血管網を含むLbL-3D Skin移植群では、移植後早期（7日目）からは、創周辺及び創下部から移植片への血液供給の亢進が認められた。
免疫不全マウスへの皮膚移植
Bar = 100 μm
血管網を含むLbL-3D Skin
防衛医大齋藤教授・
佐藤教授・宮崎学内講師との共同研究第44回日本熱傷学会総会・学術集会（2018.5.18）にて発表
「血管構造を備えた次世代型人工皮膚の開発」（防衛医大・宮崎先生）
再生医療への展開: 血管含有LbL-3D Skin
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【仮説】LbL法で作成したhiPS心筋組織を慢性心不全モデルラットに
移植することで心機能が改善するか。
心筋構築組織の収縮作成した心筋構築組織
【方法】
【結果】
【考察】移植心筋組織が血管新生を促し、3次元組織内に血管を誘導することで、残存している可能性が考えられる。移植群では心機能は改善
線維化は同等血管新生は移植群で増大
移植組織は残存host由来の血管が移植組織に入っている。
「LBL法で作成したヒトiPS由来3D心筋構築組織のラット慢性心不全モデルへの移植」第16回再生医療学会（2017）にて発表 大阪大学心臓血管外科 横山淳也、宮川繁、澤 芳樹
再生医療への展開: LbL-3D Heart
VEGF, HGFは移植群で増大
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防衛医大
LbL-3D Skin
装置
細胞大阪大学共創機構産学共創本部
広島大学医
LbL-3D Heart
iPS由来心筋細胞製造
皮膚モデル開発・評価
心筋モデル開発・評価
LbL 3D組織自動製造システム開発
品質規格組織モデル製造
流通・販売
LbL-3D Skin皮膚刺激性試験代替法のバリデーション研究（国際標準化）
【バリデーション運営委員会】
・国立医薬品食品衛生研究所（NIHS）・日本動物実験代替法評価センター（JaCVAM）・日本動物実験代替法学会（JSAAE）・阪大院生命機能 ・阪大医学部附属病院
・花王 ・防衛医大 ・マンダム
・J-TEC ・パリ南大学
関西大学
細胞操作による高次生体組織の構築と再生医療および創薬研究への展開
阪大院生命機能 ビルディングブロックサイエンス共同研究講座
パリ南大学
阪大院医呼吸器外科
阪大院歯・口腔外科
阪大院医心臓血管外科
阪大院医消化器外科
H30年度～
産・学連携講座
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細胞コーティング三次元組織化
組織培養・観察
細胞培養
創薬研究 再生医療細胞外マトリックスの交互積層（LbL）による三次元組織体（LbL 3D組織）の全自動構築・機器開発・販売・組織キットの製造・販売
自動遠心細胞コーティング装置
微細塗布装置 細胞分注装置
自動培養・観察装置
LbL-3D HeartLbL-3D Skin
安全性・薬効評価
NTNのパラレルリンク技術を活用
ものづくり基盤技術組織キット販売
機器販売
機器販売
JST A-STEP 産学共同シーズ育成タイプ（2018年10月～2021年3月）『三次元生体組織（LbL 3D 組織）の全自動製造システムの開発』NTN（株）, 長瀬産業（株）, （株）J-TEC, 大阪大学, 弘前大学, 防衛医科大学校
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Angew. Chem. Int. Ed. 46, 4689-4692 (2007). J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 18, 1565-1573 (2007).Chem. Lett. 39, 42-43 (2010). Langmuir 26, 5670-5678 (2010).
Biophys. Res. Commun. 402, 153-157 (2010).
Adv. Mater. 23, 3506-3510 (2011).
Angew. Chem. Int. Ed. 50, 7557-7561 (2011).
J. Biomater. Sci.: Polymer Edn. 23, 63-79 (2012).
Bull. Chem. Soc. Jpn. 85, 401-414 (2012).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 419, 32-37 (2012).
Chem. Lett. 41, 523-524 (2012). Biochem. Biophys. Res. Commun. 420, 662-665 (2012).Adv. Mater. 24, 454-474 (2012).
Integrat. Biol. 4, 1207-1214 (2012).
Acta Biomaterialia 9, 4698-4706 (2013).Adv. Healthcare Mater. 2, 534-539 (2013).
J. Biosci. Bioeng. 116, 231-234 (2013).
Langmuir 29, 7362-7368 (2013).
Microscopy 63, 219-226 (2014).
Atherosclerosis 233, 590-600 (2014).
Adv. Drug Deliv. Rev. 74, 95-103 (2014).
Biomaterials 35, 4739-4748 (2014).
Polymer J. 46, 524-536 (2014).
Exp. Neurol. 261, 386-395 (2014).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 451, 107-111 (2014).RSC Adv. 4, 46141-46144 (2014).【コラーゲンコート】
Biomicrofluidics 8, 064113/1-064113/10 (2014).
Macromol. Biosci. 15, 312-317 (2015).
J. Biomed. Mater. Res. Part A 103A, 1554-1564 (2015).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, 392-397 (2015).
Polymer J. 47, 391-399 (2015).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 363-369 (2015).
Adv. Healthcare Mater. 4, 1164-1168 (2015).
J. Biomed. Mater. Res. Part A 103, 3386-3396 (2015).
ACS Biomater. Sci. Eng. 1, 639-645 (2015).
ACS Biomater. Sci. Eng. 1, 816-824 (2015).
Chem. Rec. 16, 783-796 (2016).
J. Biomed. Mater. Res. Part A 104A, 94-103 (2016).
Acta Biomater. 33, 110-121 (2016).ChemNanoMat 2, 466-471 (2016).
Angew. Chem. Int. Ed. 55, 4461-4466 (2016).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 472,131-136 (2016).
Adv. Healthcare Mater. 5, 1969-1978 (2016).
Biochem. Biophys. Res. Commun. 474, 515-521 (2016).
Anal. Sci. 32, 1-6 (2016).
J. Biomed. Mater. Res. A 105A, 814-823 (2017).
J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 28, 958-973 (2017).
Biomaterials 133, 263-274 (2017).Tissue Eng. Part A 23, 481-490 (2017).Tissue Eng. Part C 23, 357-366 (2017).
Adv. Healthcare Mater. 6, 1700057 (2017).
J. Tissue Eng. Reg. Med. 11, 1303-1307 (2017).Sci. Rep. 7, 13708 (2017).J. Tissue Eng. Regen. Med 12, e1501-e1510 (2018).
Tissue Eng. Part C 24, 56-67 (2018).
Small 14, 1701521 (2018).
J. Biomed. Mater. Res. A. doi: 10.1002/jbm.a.36319.
細胞積層法 LbLコーティング LbL細胞コーティング
血管・リンパ管血管壁モデル
組織モデルがんモデル
Biochem. Biophys. Res. Commun. 494, 213-219 (2017).
Biomaterials, in press Acta Biomaterialia 78, 296-307 (2018).Biomaterials 179, 144-55 (2018).
J. Biotechnol. 276-277, 46-53 (2018).ACS Biomater. Sci. Eng. 4, 1833-1842 (2018).
Biofabrication 10, 025001 (2018).
Biomaterials 160, 82-91 (2018).
LbL細胞コーティング・LbL-3D組織関連論文
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3D hiPS-CM組織体（LbL-3D Heart）FN-GコートhiPS-CM
G 細胞集積法
hiPS-CM
薬剤評価試験への応用
健常者・患者の体細胞
正常・疾患ヒトiPS細胞
山中因子
正常ヒトiPS由来心筋細胞（hiPS-CM）
分化誘導
LbL
毛細血管網様構造の導入
心筋細胞
線維芽細胞
血管内皮細胞
Y. Amano, S. Miyagawa, Y. Sawa, M. Akashi et al., Acta Biomater. 33, 110 (2016).
M. Takeda, S. Miyagawa, M. Akashi, Y. Sawa et al., Tissue Eng. Part C 24, 56 (2018).
ヒトiPS由来心筋細胞を用いたLbL-3D組織構築と創薬研究への展開
FN
特願2017-033322（大阪大学、協和発酵バイオ）幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導用培地および中胚葉系細胞の製造方法
有償提供準備中
三次元生体組織（LbL-3D組織）を用いた創薬研究、動物実験代替法に興味（新規
組織構築、安全性評価、試験法開発）ある
企業との共同研究を希望
企業への期待
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本技術に関する知的財産権［特許１］
• 発明の名称：三次元組織の製造方法およびそれを用いる
細胞外マトリックスの製造方法
• 登録番号 ：4919464• 出願人 ：大阪大学、住友ベークライト（株）
• 発明者 ：明石満 他3名
［特許2］• 発明の名称：細胞の三次元構造体、及び、これを製造する方法
• 登録番号 ：5850419• 出願人 ：大阪大学、住友ベークライト（株）
• 発明者 ：明石満 他2名
［注記］上記2件の基本特許を含めた複数の特許群からなるLbL-3D知財プラットフォームをライセンス（非独占実施）可能
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お問い合わせ先
大阪大学共創機構 産学共創本部
イノベーション共創部門
リエゾン支援室 鍵谷 圭
TEL 06-6879-4875
FAX 06-6879-4208
e-mail contact＠uic.osaka-u.ac.jp
