残存シラノール基が分離に及ぼす影響

Vol.052007年03号LC Technical Report

シリカゲルのシラノール基と金属不純物

シリカゲルの化学的性質は、シラノール基によって決まりま

す。そのシラノール基には主に3種類あり、それぞれ性質が

異なります。

孤立シラノールの多いシリカゲルから合成された充填剤は塩

基性化合物に対する吸着が強いと言われ、その割合はシリ

カゲルの合成条件によって異なります ※1。

シリカゲルに含まれる金属不純物はシラノール基の酸性度を

高くし、活性を高めます ※4。また充填剤表面に残った金属不

純物は吸着点となり ※5、配位性化合物の分析に支障をきた

します。

テトラサイクリン類の分析

［Analytical conditions］Column：2.1×150 mmL or 2.0×150 mm（C18）Mobile phase：0.1％HCOOH in CH3CN/0.1％HCOOH in H2O（15/85）Flow rate：0.2 mL/min　Temp.：40℃　Detection：ESI-MS（+）　OTC（461→426） TC（445→410） CTC（479→444）Inj.vol：10μL（50 ppb in H2O）

L-column2 ODS 登場

※1　J.J.Kirkland etc., J. Chromatogr., 352 (1986) 275.　　※2　M.L.Miller etc., J. Chromatogr., 319 (1985) 9.※3　K.K. Unger, Porous Silica, Elsevier, Amsterdam, 1979.※4　P.C. Sadek, etc., J. Chromatogr. Sci., 25 (1987) 489.　　※5　B.Buszewski, Chromatographia, 34 (1992) 573.

O

H

Si

O

H

Si

O

H

SiSi

OHHO

L-column2 ODS

Brand C-3

Brand D-1

L-column ODS

ODS 化後

エンドキャッピングなし

L-column2 ODS 残存シラノール吸収領域の

拡大スペクトルCH

CH

シラノール基のOH

① オキシテトラサイクリン（OTC）

② テトラサイクリン（TC）

③ クロルテトラサイクリン（CT）

② 4.11

① 3.38

③ 8.82

4.41

3.57

9.62

2.87

2.57

6.04

2.50

2.28

4.80

3.54

2.86

7.84

3.36

2.81

6.90

L-column2 ODS（5μm）

L-column ODS（5μm）

Brand D-1（3μm）

Brand E-1（3μm）

Brand H-1（5μm）

Brand B-1（3.5μm）

数値；保持時間

エンドキャッピングの効果

C18には、金属不純物の影響を避けるために高純度の

シリカゲルを用いますが、シリカゲル中の金属不純物

は完全に除去することができません。

しかし、エンドキャッピングによりシリカゲル表面を完全

に被覆すると、溶質は表面金属と接触できなくなります

が、従来のエンドキャッピング法では不可能でした。

テトラサイクリン類は金属に配位しやすく定量が難しい

物質です。シリカゲル基材表面に残っている金属により

ピークはテーリングして、定量性に欠けてしまいます。

L-column2 ODS は基材に高度に品質管理した高純

度シリカゲルを使用し、且つ新規エンドキャッピング法

により、ほぼ完全にシリカゲル表面を被覆することで、

シャープなピークが得られます。

シラノール基の種類

孤立シラノール

IR 3750 cm-1 ※3

ジェミナルシラノール

29 Si NMR ※2

会合したシラノール※3

IR 3750 cm-1 ※3

0 5 10 15　　　　　Time（min）

0 5 10 15　　　　　Time（min）

0 5 10 15　　　　　Time（min）

0 5 10 15　　　　　Time（min）

0 5 10 15　　　　　Time（min）

0 5 10 15　　　　　Time（min）

OH O OHOH

O O

OHH H

H NHO CH3

NH2

CH3

H3C

OH O OHOH

O O

OHH H

H NHO CH3H OH

NH2

CH3

H3C

OH O OHOH

O O

OHH H

H NHOCl CH3

NH2

CH3

H3C

FT-IRスペクトル比較

4000 3500 3000 2500　　　　　　（cm-1）

4000 3500 3000 2500　　　　　　（cm-1）

エンドキャッピング後

3800 3600 3400 3200　　　　　　 （cm-1）

シラノールの完全不活性化による効果

■ ピーク形状の向上塩基性化合物は残存シラノール基に吸着することによりピークがテーリングします。完全にエンドキャッピングすると残存シラノー

ル基との相互作用がなくなり、C18の持つ本来の保持挙動により、ピークはシャープに、再現性の良いデータが得られます。

■ 耐久性の向上耐久性はエンドキャッピングの密度により影響されます。エンドキャッピングが不十分だと修飾部分が加水分解されやすく、保持

時間が早くなり、またシラノール基が増加することにより、塩基性化合物のピーク形状が悪くなってしまいます。カラム温度を高くし

てカラム劣化を加速した試験結果では、L-column2 ODS はかなり長期間安定していることになり、H-1より20倍以上耐久性が

あると推察されます。シリカゲルベースのカラムでも表面の被覆をほぼ完全にすることで、シリカゲル表面に移動相が触れること

を防ぐことができるので、 L-column2 ODS はアルカリ移動相下でも高耐久性を示します。

■ ブリーディングの減少シリカゲル表面が完全に被覆されていなかったり、修飾基と

の結合が弱いと、充填剤基材由来のノイズが発生します。

GC用カラムの液相からのブリーディング（ブリード）が成分の

検出や定量に影響を及ぼすのと同様、HPLCでも微量成分分

析のLC/MS/MSで特に問題になります。

シラノール基を完全不活性化することで、ベースラインのノイ

ズを抑えることができます。　どのようなカラムも長時間使用

していれば、ベースラインは落ち着いてきますが、限界があり

ます。右は繰り返し使用した後のベースラインです。

L-column 及び Brand D-1 はグラジエント条件を8回繰り返

した状態ですが、L-column2 ODS は、5回目のベースライ

ンでノイズが少なくなっているのがわかります。

0

20

40

60

80

100

0 　50 100 150 200 250 300

通液時間（h）

保持

時間

[Nap

hth

alene]の

安定

率（％

）

L-column2 ODSL-column ODSBrand D-1

Brand H-1Brand F-2

加速耐久性試験（pH1以下） 加速耐久性試験（pH10）

L-column2 ODSL-column ODSBrand D-1

Brand H-1Brand F-2

0

20

40

60

80

100

0 　 20 40 60 80

通液時間（h）

保持

時間

[Nap

hth

alene]の

安定

率（％

）

[Durability test contidions]Column：4.6×150 mm（C18, 5μm）Mobile phase：50 mM TEA in CH3OH/50 mM TEA in H2O （10/90）Flow rate：1 mL/min　Temp：50℃

[Durability test contidions]Column：4.6×150 mm（C18, 5μm）Mobile phase：2％ TFA in CH3OH/2％ TFA in H2O（10/90）Flow rate：1 mL/min　Temp：90℃

Inte

nsi

ty

L-column2 ODS 5 回目

L-column ODS 8 回目

Brand D-1 8 回目

[×107]

LC/MSにおけるノイズ

0 5 10 15 20　　　　　　　　　　　　　 Time（min）

4

3

2

1

0

［Analytical conditions］Column：2.1×150 mm（C18, 5μm）Mobile phase：A）0.1％HCOOH in CH3CN　B）0.1％HCOOH in H2O 　　　A/B, 5/95→100/0→100/0（0→10→20 min）Flow rate：0.2 mL/min　Temp：40℃

塩基性医薬品（抗アレルギー剤）の分析

［Analytical conditions］Column：4.6×150 mm（C18, 5μm）Mobile phase：CH3CN/25 mM Phosphate buffer pH7.0（40/60）Flow rate：1 mL/min　Temp：40℃　Detection：220 nmInj.vol.：1μL（in CH3CN）Sample： 1. フェキソフェナジン

2. クロルフェニラミン 3. トリプロリジン 4. ジフェンヒドラミン 5. ジフェニルピラリン 6. ホモクロルシクリジン 7. ヒドロキシジン 8. アステミゾール 9. プロメタジン

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50　　　　　　　　　　　　　 Time（min）

CH3N

S

NCH3H3C

H

9. プロメタジン

H CH3Cl

NN

6. ホモクロルシクリジン

L-column2 ODS

L-column ODS

Brand C-3

Brand D-1

Brand E-1

Brand F-21 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 7 6 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

カラム比較

一言で「C18（ODS）」と言ってもメーカーや銘柄によって様々な特徴があります。使い慣れたカラムを選択するという方法もありま

すが、汎用性が高く分析メソッドを作成しやすいカラムを選択する方が効率的です。酸性化合物から塩基性化合物まで簡単なメ

ソッドでテーリングなくシャープなピークが得られるカラムが、どのような分析にも対応できるファーストチョイスカラムであるといえ

ます。

Rt

2.047

2.813

T.F.※

1.098

1.061

N

11647

15087

Rt

6.605

9.935

14.643

T.F.※

1.094

1.230

1.304

N

14753

13015

14207

Rt

5.763

8.100

13.142

T.F.※

2.168

1.175

1.962

N

11404

12262

12093

Rt

7.191

10.35

16.294

T.F.※

1.383

1.230

1.930

N

12719

12982

12597

Rt

7.763

11.737

18.882

T.F.※

2.265

1.124

5.735

N

10593

12549

12300

Rt

8.868

12.23

20.258

T.F.※

2.464

1.168

2.558

N

5.374

10020

4010

Rt

8.419

10.549

19.624

T.F.※

1.162

1.185

3.563

N

9821

11816

10152

Rt

2.107

2.892

T.F.※

1.249

1.134

N

9950

1298

Rt

1.900

2.537

T.F.※

1.205

1.098

N

9450

11693

Rt

2.149

3.169

T.F.※

1.364

1.091

N

8273

12320

Rt

2.137

2.970

T.F.※

2.034

1.239

N

5285

13621

Rt

2.054

2.932

T.F.※

1.164

1.091

N

10768

12855

L-column2 ODS L-column ODS Brand C-3 Brand D-1 Brand E-1 Brand F-2

Rt

6.640

T.F.※

1.158

N

9858

Rt

7.167

T.F.※

1.277

N

10497

Rt

N.D.

T.F.※

N.D.

N

N.D.

Rt

8.647

T.F.※

6.638

N

2150

Rt

7.910

T.F.※

3.229

N

287

Rt

7.686

T.F.※

3.661

N

511

O

CH3H3C

OH

［Analytical conditions］　Column：4.6×150 mm（C18, 5μm）　Flow rate：1 mL/min　Temp：40℃★配位化合物 Mobile phase：CH3CN/20 mM H3PO4（40/60）　Detection：UV 254 nm　Sample：ヒノキチオール（0.5 mg/L）　注入量：10μL ★塩基性化合物 Mobile phase：CH3CN/25 mM Phosphate buffer pH 7.0（30/70）　Detection：UV 220 nm Sample：1.プロプラノール（50 mg/L）　2.ベナゼプリル（400 mg/L）　3.マプロチリン（500 mg/L）　注入量：1μL★酸性化合物 Mobile phase：CH3CN/20 mM H3PO4（2/98）　Detection：UV 210 nm　Sample：1.ぎ酸（0.5％）　2.酢酸（1％）　注入量：1μL

■ 配位化合物（ヒノキチオール）

■ 再現性シラノールを完全にエンドキャッピングすると、残存シラノール基に起因するロット間のばらつきが抑えられ、分析の再現性が良く

なります。特に低濃度でエンドキャッピングの差は顕著に現れ、定量性に影響します。

1

2

1

212

12

1

212

1

2

3

1

2

31

2

3

1

2

3

12

3

12

3

0

50000

100000

150000

200000

L-column2 ODSBrand D-1

Brand E-1

Brand F-2

* Inj.vol ： 10μL

ヒノキチオールの定量性

0 2 4 6 8 　　　　　　　　　　　 Time（min）

Lot.No.C

Lot.No.B

Lot.No.A

充填剤ロット

Lot.No.A

Lot.No.B

Lot.No.C※USPテーリングファクター

Rt

6.227

6.294

6.274

N

14483

12519

13752

T.F.※

1.104

1.201

1.099

［Analytical conditions］Column：L-column2 ODS 4.6×150 mm（5μm, 12 nm）Mobile phase：CH3CN/20 mM H3PO4（40/60）Flow rate：1 mL/min　Temp：40℃Sample：1. Urasil　2. Hinokitiol（10 mg/L）Inj.vol.：1μL

0 0.5 1 1.5 2 （mL/L）

Brand D-1,E-1,F-2

0.1 ～ 0.2mg/L　N.D.

ヒノキチオール

0 2 4 6 8 10　　　　　　 Time（min）

0 2 4 6 8 10　　　　　　 Time（min）

0 2 4 6 8 10　　　　　　 Time（min）

0 2 4 6 8 10　　　　　　 Time（min）

0 2 4 6 8 10　　　　　　 Time（min）

0 2 4 6 8 10　　　　　　 Time（min）

■ 塩基性化合物（塩基性医薬品）

1. プロプラノール

2. ベナゼプリル

3. マプロチリン

0 10 20　　　　　　 Time（min）

0 10 20　　　　　　 Time（min）

0 10 20　　　　　　 Time（min）

0 10 20　　　　　　 Time（min）

0 10 20　　　　　　 Time（min）

0 10 20　　　　　　 Time（min）

■ 酸性化合物（ぎ酸、酢酸）

1. ぎ酸

2. 酢酸

1 2 3 4　　　　　Time（min）

1 2 3 4　　　　　Time（min）

1 2 3 4　　　　　Time（min）

1 2 3 4　　　　　Time（min）

1 2 3 4　　　　　Time（min）

1 2 3 4　　　　　Time（min）

※USPテーリングファクター

※USPテーリングファクター

※USPテーリングファクター

Sample：1.Naringin 100 mg/L2.Hesperidin 200 mg/L3.Naringenin 100 mg/L4.Hesperetin 100 mg/L

in CH3CN/H2O（40/60）

Application

リーフレット内容に関してのお問合せは、最寄の代理店又は東京事業所クロマト技術部までご連絡ください

2007/12　2010/04改　2012/04改

http://www.cerij.or.jp

　　　　　東京事業所 クロマト技術部　　　　　　　　　　　　e-mail chromato@ceri.jp

TEL 0480-37-2601 FAX 0480-37-2521〒345-0043 埼玉県北葛飾郡杉戸町下高野1600番地

GC用カラム及び

HPLC用カラムの

設計・開発、製造及び供給

ISO9001

Sample：1. ダイジン 10 mg/L2. グリシジン 10 mg/L3. ゲニシチン 10 mg/L4. ダイゼイン 30 mg/L5. グリシテイン 50 mg/L6. ゲニステイン 30 mg/L

in CH3CN/H2O（40/60）

1 2

3

45

6

2

32 4

15

1

2

3

7

11

Sample：（標品）1. チアミン 　　50 mg/L2. アセトアミノフェン 　　50 mg/L3. カフェイン 　　50 mg/L4. サリチルアミド 　　50 mg/L5. グリチルリチン 　　25 mg/L6. ヘスペリジン 　　50 mg/L7. エテンザミド 　　50 mg/L8. ヨウ化イソプロパミド 　　50 mg/L9. イブプロフェン 　　50 mg/L10. クロルフェニラミン 　　50 mg/L11. デキストロメトルファン 　　50 mg/L12. イソプロピルアンチピリン　50 mg/L13. ジフェンドヒドラミン 　　50 mg/L14. ギンゲロール 　　50 mg/L15. ノスカピン 　　50 mg/L16.クレマスチン 　　50 mg/L

1

2

3 4

5

6

1614

15

1312

7

8

9

10

11

3

豆乳粉末抽出液

解熱薬

風邪薬B

風邪薬A

1

2

3

4 5 6

市販風邪薬には鎮咳剤、解熱鎮痛剤、抗アレ

ルギー剤、生薬成分など様々な成分が含まれ

ています。

今回は4.6×250 mmを流量を2 mL/minにする

ことで風邪薬成分16種を25分で分析すること

ができました。移動相にアセトニトリルを用い

ることでカラム圧力も20 MPa以下に抑えられ、

ピーク形状も分離状態も良好な結果が得られ

ます。

市販風邪薬の分析（Application No.L2031）

0 5 10 15 20 25　　　　　　　　　　　　　 Time（min）

［Analytical conditions］Column：L-column2 ODS 4.6×250 mm（5μm, 12 nm）Mobile phase：A）CH3CN　B）25 mM Phosphate buffer pH7.0 　　　A/B, 2/98→65/35（0→25 min）Flow rate：2 mL/min　Temp：40℃　Detection：220 nmInj.ｖol.：5μL

標品

大豆イソフラボンの分析（Application No.L2028）

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45　　　　　　　　　　　　　 Time（min）

［Analytical conditions］Column：L-column2 ODS 4.6×150 mm（5μm, 12 nm）Mobile phase：A）CH3OH　B）20 mM H3PO4

　　　A/B, 25/75→40/60→40/60（0→30→50 min）Flow rate：1 mL/min　Temp：40℃Inj.ｖol.：5μL

標品

1

2

3

4

ポリフェノール類（かんきつ類薄皮成分）の分析（Application No.L2029）

［Analytical conditions］Column：L-column2 ODS 4.6×150 mm（5μm, 12 nm）Mobile phase：A）CH3OH　B）20 mM H3PO4

　　　A/B, 20/80→40/60（0→20 min）Flow rate：1 mL/min　Temp：40℃　Detection：285 nmInj.ｖol.：5μL

0 5 10 15 20　　　　　　　　　　　　　 Time（min）