LC/MS を用いたテフルベンズロン等 7 物質の分析○ 福沢栄太 ，宮崎光代，河野洋一，野村孝一，小松一裕　財団法人　日本食品分析センター

【はじめに】　 PRTR 第 2 種指定化学物質であるテフルベンズロン、フェナリモル、ヘキサコナゾール、プロクロラズ、シクロナイト、ビフェントリン、チフェンスルフロンメチルについて環境試料 ( 大気 ) を用い、 LC/MS及び LC/MS/MS ポジティブ / ネガティブ同時測定での検討を行った。

テフルベンズロン フェナリモルヘキサコナゾール

チフェンスルフロンメチル シクロナイト プロクロラズ

Cl

F

F

F

F

NHCONHCO

Cl

Cl C

OH

N

N

Cl

Cl

C

Cl(CH2)3CH3

OH

CH2

NN

N

N

(CH2)2CH3

C

N

N

OCH2CH2O Cl

Cl

ClN N

N

NO2

NO2 NO2

SO2NHCONHN

NN

OCH3

CH3

S

CO2CH3

ビフェントリン

CH3

CH3CH2

(Z)-(1R)-cis-

(Z)-(1S)-cis-

C CH

CH3 CH3

CF3C

H H

OO

CH2Cl

C CHCH3CH3CF3

C

H H

O

O

Cl

【方法】・分析方法　アセトン 10mL で洗浄、窒素気流下で乾燥させた固相カートリッジを捕集管とし、一定流量（ 0.7L/min ）で 24 時間大気試料を採取する。採取した捕集管をバックフラッシュによりアセトン 10mL で目的物質を溶出し、 10mL 容メスフラスコに受け、 10mL に定容しろ過したものを試料液とし 、 LC/MS-SIM 法または、 LC/MS/MS-SRM 法で定量した。

・装置　 HPLC は Waters 社製 Alliance2795 、質量分析装置は Waters 社製 Quattro Premier XE を用いた。 ・測定条件　テフルベンズロン及びシクロナイトは ESI ポジティブモード、他の5 物質については、 ESI ネガティブモードにより測定した ( 表 -1) 。また、カラムは OSD 系を用い、シクロナイトが、ぎ酸付加のプリカーサーイオンとして検出されたため、ぎ酸系溶出条件で行った ( 表 -2) 。

＊テフルベンズロン、プロクロラズ、ヘキサコナゾール及びビフェントリンは高濃度標準溶液測定後にキャリーオーバーが認められた。また、試料測定後、対象物質以外の夾雑物質がキャリーオーバーすることが認められた。付着箇所はシリンジニードル部であったため、以下のニードル洗浄を注入毎に行った。なお、条件は (Waters 社製 Alliance 2795) 特有のものである。

ニードル洗浄条件Wash Solvent ： 1%Formic Acid/MethanolPurge Solvent ： Ultra Pure WaterWash Frequency ： InjectFlush Time(s) ： 6 Wash Time(s) ： 15 Wash Cycles ： 5 Secondary Wash Volume(μL) ： 600 Wash Sequence ： Wash-Purge

-1　表 イオン化法及びモニターイオン

定量 確認 プリカーサー プロダクトV（） eV（ ） イオン イオン イオン イオン

テフルベンズロン ESI（－） 25 25 379 381 379 196フェナリモル ESI（＋） 40 25 331 333 331 268ヘキサコナゾール ESI（＋） 35 30 316 314 314 70プロクロラズ ESI（＋） 20 25 378 376 376 70シクロナイト ESI（－） 10 8 267 - 267 45ビフェントリン ESI（＋） 15 15 440 442 440 181チフェンスルフロンメチル ESI（＋） 25 15 388 389 388 167

物質名SIM SRM

イオン化方法

コーン電圧

コリジョンエネルギー

10uL

1　kV ESI 　 　 2.5　kV ESI［ （）］ ［ （－）］110℃ 400℃50L/hr 1000L/hr 0.2mL/hrデソルベーション流量 コリジョンガス流量

Waters　 Quattro　Premier　XEキャピラリー電圧イオン源温度 デソルベーション温度コーンガス流量

- 2　 　 LC/MS MS/MS表 及び 測定条件Waters　Alliance2795カラム溶離液

0min A　:　B　=　90　:　100→8min A　:　90→5　 　B　:　10→95　 liner　gradient8→17min A　:　B=5　:　9517→25min A　:　B=90　:　10

流速 0.2mL/min ｶﾗﾑ温度 40℃ 注入量

A 0.02　% 20　mM 1 1； ぎ酸水溶液： ぎ酸アンモニウム水溶液＝ ：B 0.02% 20　mM 1 1； ぎ酸メタノール溶液： ぎ酸アンモニウムメタノール溶液＝ ：

Sun　Fire　C18 2.1　mm×150mm×3.5μ m)（

捕集 溶出 濾過Sep-pak PS-Air 10mL 0.2μ m

1m3(0.7L/min× 24hr) アセトン Positive及びNegative-ESI

LC/MS-SIMLC/MS/MS-SRM大気試料

図 -1 　分析フローSRM 　 0.2 ng/mLm/z=267→45

・装置検出下限 (IDL) 、分析法検出下限 (MDL) 　　測定対象物質中、テフルベンズロンが最もイオン強度が取りにくく、ヘキサコナゾール、プロクロラズ、ビフェントリンは比較的イオン強度が得やすかった（図 -3-1 及び 2 ）。 IDL を表 -3に、 MDL を表 -4 に示す。 SIM と SRM を比較すると同程度の S/Nで検出できる濃度差はおよそ 2～ 200倍程度であった。全般的に SIM に比べて SRM は選択性が高く、ノイズレベルが低くなるため SRM での S/Nが向上している。特にポジティブモードでは、カラムや溶媒等の影響からベースラインが高く、 SIM と SRM の S/Nの違いが大きかった。一方、ネガティブモードのシクロナイトにおいては、 SIM 測定においてもベースラインが低いために、 SIM と SRM の S/Nに大きな差は見られなかった。 (図 -4-1及び 2) 。 （装置検出下限は S/N = 10 を目安に設定した。）

・添加回収率試験　固相カートリッジに標準物質を添加し、大気試料 (東京都多摩市 )1m3

採取し【分析方法】の操作に従い、添加回収実験を行った。また、無添加の場合についても行った。結果を表 -5-1 及び 2 に示す。 50～ 500ng添加での回収率は全て良好であったが、フェナリモル、プロクロラズ、ビフェントリンでは低濃度での添加回収率は 6～ 7割程度であった。なお、無添加ではすべて MDL 以下であった。

・安定性の検討試料採取時、対象物質の固相カートリッジにおける安定性を比較するために、遮光、非遮光での添加回収率の結果を表 -6 に示す。固相カートリッジに標準物質を添加し、遮光下では固相カートリッジをアルミ箔で覆い、非遮光下ではそのままで 24 時間大気試料を捕集した。　 24 時間採取での遮光、非遮光条件下の回収率にはほぼ差が認められなかった。

-4　 (MDL)表 分析法検出下限

SIM SRM SIM SRM SIM SRM SIM SRMテフルベンズロン 10 1 25 3.3 80 34 5.0 7.6フェナリモル 2 0.2 4.6 0.3 18 21 7.1 3.9ヘキサコナゾール 2 0.02 4.4 0.044 32 17 6.4 5.5プロクロラズ 1 0.04 1.3 0.062 20 11 3.5 4.1シクロナイト 1 0.4 0.85 0.68 35 31 2.4 4.4ビフェントリン 1 0.04 2.0 0.042 58 52 5.4 2.7チフェンスルフロンメチル 1 0.1 2.5 0.063 33 59 7.6 1.6

CV　 %（）ng/mL（ ） (ng/ 　m3)

MDL 17 3＊分析法検出下限（ ）は、｢化学物質環境実態調査の手引き｣（平成 年 月）に従った。

物質名注入液濃度 MDL S/N

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F4:MRM of 1 channel,ES-378.9 > 1963.766e+003

060507_010 Smooth(Mn,2x2)teflubenzuron

13.15478.62

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F4:SIR of 2 channels,ES-378.9

1.863e+004

0605021_024 Smooth(Mn,2x2)teflubenzuron(378.9)

13.172463.17

10.04

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F4:SIR of 2 channels,ES-381

1.216e+004

0605021_024 Smooth(Mn,2x2)teflubenzuron(381)

13.141655.69

11.13

SIM5ng/mL m/z=379( 定量 )

SIM5ng/mLm/z=381( 確認 )

SRM0.5ng/mLm/z=379→196

図 -3-1 　テフルベンズロン　　（標準溶液）のクロマトグラム

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:SIR of 6 channels,ES+378

1.940e+004

0605021_024 Smooth(Mn,2x2)prochloraz(378)

12.422196.61

10.7711.88

12.84 13.7113.21

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:SIR of 6 channels,ES+376

1.814e+004

0605021_024 Smooth(Mn,2x2)prochloraz(376)

12.421845.60

11.0710.28

13.77

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:MRM of 3 channels,ES+376 > 69.7

2.518e+003

060507_010 Smooth(Mn,2x2)prochloraz

12.40301.71

12.0910.14 11.4712.69 13.6713.17

SIM0.5ng/mL m/z=376( 確認 )

SRM0.02ng/mL m/z=376→70

SIM0.5ng/mL m/z=378( 定量 )

図 -3-2 　プロクロラズ　　（標準溶液）のクロマトグラム

濃度差SIM 　 ×10 　　 SRM 　 ×25

min2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

%

0

100

F2:SIR of 2 channels,ES-266.9

1.750e+004

0605021_024 Smooth(Mn,2x2)cyclonite(266.9)

8.671925.48

8.200.01 9.989.47

SIM 　 0.5 ng/mLm/z=267

min2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

%

0

100

F2:MRM of 1 channel,ES-266.9 > 45.61.404e+003

060507_010 Smooth(Mn,2x2)cyclonite

8.67128.03

6.731.731.23 5.723.607.11

8.23 10.959.39

図 -4-1 　シクロナイト　 SIM 測定　　　（標準溶液）のクロマトグラム

図 -4-2 　シクロナイト　 SRM 測定　　　（標準溶液）のクロマトグラム

濃度差　 ×2.5S/N　 SIM ： 10 　　 SRM ： 14

-5-1　 (SIM )表 添加回収実験結果 測定試料量 添加量 測定回数 検出濃度 回収率 変動係数（㎥） ng（ ） （回） ng/（ ㎥） （％） （％）

テフルベンズロン 1 500 5 588 118 4.7フェナリモル 1 100 5 107 107 2.8ヘキサコナゾール 1 100 5 106 106 4.1プロクロラズ 1 50 5 47 94 3.9シクロナイト 1 50 5 50 99 3.0ビフェントリン 1 50 5 49 98 4.6チフェンスルフロンメチル 1 50 5 48 96 2.2

物質名

-5-2　 (SRM )表 添加回収実験結果 測定試料量 添加量 測定回数 検出濃度 回収率 変動係数（㎥） ng（ ） （回） ng/（ ㎥） （％） （％）

テフルベンズロン 1 50 5 51 101 6.4フェナリモル 1 10 5 7.0 70 7.3ヘキサコナゾール 1 1 5 0.8 84 5.4プロクロラズ 1 2 5 1.3 66 9.6シクロナイト 1 20 5 17 86 8.9ビフェントリン 1 2 5 1.5 75 7.7チフェンスルフロンメチル 1 5 5 4.8 96 3.5

物質名

-6　表 遮光及び非遮光条件下での回収率遮光 非遮光

添加量 回収率 回収率ng（ ） （％） （％）

テフルベンズロン 50 101 106フェナリモル 10 70 68ヘキサコナゾール 1 84 79プロクロラズ 2 66 63シクロナイト 20 86 82ビフェントリン 2 75 80チフェンスルフロンメチル 5 96 94

物質名

-3　 (IDL)表 装置検出下限

SIM SRM SIM SRM SIM SRM SIM SRMテフルベンズロン 5 0.5 0.55 0.062 12 12 2.9 3.2フェナリモル 1 0.1 0.081 0.015 11 12 2.1 4.0ヘキサコナゾール 1 0.01 0.16 0.0014 12 5.9 4.3 3.7プロクロラズ 0.5 0.02 0.14 0.0029 13 10 7.3 3.6シクロナイト 0.5 0.2 0.053 0.027 10 14 2.8 3.5ビフェントリン 0.5 0.02 0.1 0.0016 11 14 5.3 2.0チフェンスルフロンメチル 0.5 0.05 0.12 0.0062 4.2 6.3 6.1 3.1

CV　 %（）注入液濃度ng/mL（ ）

IDL 17 3＊装置検出下限（ ）は、｢化学物質環境実態調査の手引き｣（平成 年 月）に従った。

物質名IDL

（ng/mL） S/N

【結果および考察】・検量線　 SIM 測定用で 0.5～ 200ng/mL 、 SRM 測定用で 0.01～ 10ng/mL の標準液を作成した。各物質とも 20倍の濃度範囲において R2=0.9994以上の良好な直線性が得られた。

Compound name: hexaconazoleCorrelation coefficient: r = 0.999991, r^2 = 0.999982Calibration curve: 22961.3 * x + -17.219Response type: External Std, AreaCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

Conc0.000 0.050 0.100 0.150 0.200

Re

sp

on

se

0

1000

2000

3000

4000

Compound name: teflubenzuronCorrelation coefficient: r = 0.999971, r^2 = 0.999941Calibration curve: 861.089 * x + 63.6048Response type: External Std, AreaCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

Conc0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

Re

sp

on

se

0

2000

4000

6000

Compound name: teflubenzuron(378.9)Correlation coefficient: r = 0.999989, r^2 = 0.999978Calibration curve: 388.927 * x + 514.586Response type: External Std, AreaCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

Conc0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Re

sp

on

se

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

y　=　388.927　x+514.586

R2　=　0.9999

（ SIM 測定）　　　　　 5～ 200ng/mL

（ SRM 測定）　　　　0.5～ 10ng/mL

y　=　861.089　x+63.6048

R2　=　0.9999

図 -2-1 　検量線の一例（テフルベンズロン）

Compound name: hexaconazole (316)Correlation coefficient: r = 0.999985, r^2 = 0.999970Calibration curve: 8583.86 * x + -5759.56Response type: External Std, AreaCurve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

Conc0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

Re

sp

on

se

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

（ SIM 測定）　　 1～ 20ng/mL

（ SRM 測定）　 0.01～ 0.2ng/mL

y　=　8583.86　x－ 5759.56

R2　=　0.9999

y　=　22961.3　x－ 17.219

R2　=　0.9999

図 -2-2 　検量線の一例（ヘキサコナゾール）

【まとめ】　今回、テフルベンズロン等 7 物質の分析について、 LC/MS 及び LC/MS/MS を用いた分析を行った。

　本法により、大気試料中テフルベンズロンを SRM 測定で 10ng/m3 、SIM 測定で数十 ng/ m3 、フェナリモルを SRM 測定で 1ng/ m3 、 SIM測定で十数 ng/ m3 、ヘキサコナゾールを SRM 測定で 0.2ng/m3 、 SIM 測定で 4ng/m3 、プロクロラズを SRM 測定で 0.2ng/m3 、 SIM 測定で 3ng/m3 、シクロナイトを SRM 測定で 2ng/m3 、 SIM 測定で 3ng/m3 、ビフェントリンを SRM 測定で 0.2ng/m3 、 SIM 測定で 6ng/m3 、チフェンスルフロンメチルを SRM 測定で 0.2ng/m3 、 SIM 測定で 7ng/m3 で定量が可能である。

　また、環境試料 ( 大気 ) を用いた分析法で、 SIM 測定と比較して SRM 測定時の選択性の高さによる S/Nの向上が改めて確認できた。なお、測定モード（ポジティブ，ネガティブ）の違いとして、ポジティブモードでベースラインが高い傾向があり、ネガティブモードでは低い傾向も改めてうかがえた。ポジティブモードでは、大気中の対象外物質も検出する割合が高かった。

　ネガティブモードで測定したシクロナイトにおいては、 SIM 測定でも SRM 測定でもほぼ同等の S/Nが得られ、シングルマス（ LC/MS ）でも同等の測定が出来る場合も確認できた。

　今回得られた知見は少ないが、今後対象とする環境試料媒体及び測定対象物質を広げ、環境試料における測定モードの違いによる影響を検討したい。

【謝辞】　本検討は、環境省総合環境政策局環境保健部環境安全課から財団法人日本食品分析センターに委託された、「平成 17年度　化学物質環境実態調査における分析法開発調査 (LC/MS)」の一環として行ったものである。

・実試料分析例　実試料 (東京都多摩市 ) の測定では、テフルベンズロン、フェナリモル、ビフェントリンのクロマトグラム上に対象外物質のピークが認められたが、 MDL 以下であった。　また、ポジティブモードでの実試料の測定においては全体的なベースラインの上昇が認められた。さらにフェナリモル、ヘキサコナゾール、ビフェントリンでは対象外物質のピークが観察され、実試料の分析の際に低濃度レベルまでこのような物質を測定するには、 SIM 測定よりも選択性の高い SRM 測定の方が望ましいと考えられた (図 -5-1～ 4) 。　一方、ネガティブモードの実試料におけるシクロナイトの測定では、SIM 、 SRM ともピークは認められず、 SIM 測定において溶離液中のメタノール濃度の上昇とともに若干ベースラインの上昇が認められた程度であった。 (図 -6 ）

　

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:MRM of 3 channels,ES+314 > 69.7

1.903e+003

060507_019 Smooth(Mn,2x2)13.39

13.0712.45

11.5110.78 14.16

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:SIR of 6 channels,ES+316

1.244e+005

060507_038 Smooth(Mn,2x2)

13.9712.56

13.49

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:SIR of 6 channels,ES+314

1.392e+005

060507_038 Smooth(Mn,2x2)13.32

12.7812.25

13.94

実試料SIMm/z=316( 定量 )

実試料SIMm/z=314( 確認)

実試料SRMm/z=314→70

図 -5-1 　フェナリモルのクロマトグラム　　　　 （環境大気）

図 -5-2 　ヘキサコナゾールのクロマトグラム　　　　 （環境大気）

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:SIR of 6 channels,ES+333

3.735e+004

060507_038 Smooth(Mn,2x2)12.7812.33

13.2313.86

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:SIR of 6 channels,ES+331

8.020e+004

060507_038 Smooth(Mn,2x2)13.23

12.33

10.77

12.70

13.88

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:MRM of 3 channels,ES+331 > 268

1.561e+003

060507_019 Smooth(Mn,2x2)13.22

12.69

12.16fenarimol

11.9136.62

10.0111.67

13.87

13.60

実試料SIMm/z=331( 定量)

実試料SIMm/z=333( 確認)

実試料SRMm/z=331→268

図 -5-3　プロクロラズのクロマトグラム　　　　 （環境大気）

図 -5-4 　ビフェントリンのクロマトグラム　　　　 （環境大気）

min15.00 16.00 17.00 18.00 19.00

%

0

100

F5:SIR of 2 channels,ES+440

2.571e+004

060507_038 Smooth(Mn,2x2)14.21

bifenthrin(440)14.99865.16

18.29

min15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00

%

0

100

F5:MRM of 1 channel,ES+440 > 180.86.594e+002

060507_019 Smooth(Mn,2x2)bifenthrin

15.0231.95

14.53 15.3016.7116.31 16.84 17.37 17.91 18.56

19.6019.74

min15.00 16.00 17.00 18.00 19.00

%

0

100

F5:SIR of 2 channels,ES+442

1.370e+005

060507_038 Smooth(Mn,2x2)16.72

14.0318.58

実試料SIMm/z=440( 定量)

実試料SIMm/z=442( 確認)

実試料SRMm/z=440→181

min9.00 10.00 11.00

%

0

100

F1:SIR of 3 channels,ES+388

1.759e+004

060507_038 Smooth(Mn,2x2)

10.8710.34

9.749.449.26

8.968.768.578.06

min8.00 9.00 10.00 11.00

%

0

100

F1:SIR of 3 channels,ES+389

1.964e+004

060507_038 Smooth(Mn,2x2)

10.839.659.53

9.078.938.738.498.29

9.95

min9.00 10.00 11.00

%

0

100

F1:MRM of 2 channels,ES+388 > 166.85.616e+002

060507_019 Smooth(Mn,2x2)8.81

8.05

8.36

10.468.99

9.229.52

9.82 9.91

11.05 11.23

実試料SIMm/z=388( 定量)

実試料SIMm/z=389( 確認)

実試料SRMm/z=388→167

図 -5-5 　チフェンスルフロンメチルの　　クロマトグラム （環境大気）

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:SIR of 6 channels,ES+378

1.369e+004

060507_037 Smooth(Mn,2x2)12.90

12.2513.7713.40

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:SIR of 6 channels,ES+376

3.041e+004

060507_038 Smooth(Mn,2x2)13.88

13.60

13.2611.88

11.30

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F3:MRM of 3 channels,ES+376 > 69.7

5.938e+002

060507_019 Smooth(Mn,2x2)12.42

11.8911.5610.8810.01

11.27

13.94

13.7212.61

13.26

実試料SIMm/z=378( 定量 )

実試料SIMm/z=376( 確認 )

実試料SRMm/z=376→70

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F4:SIR of 2 channels,ES-378.9

6.117e+003

060507_038 Smooth(Mn,2x2)

11.0510.60

11.8112.41

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F4:SIR of 2 channels,ES-381

4.526e+003

060507_038 Smooth(Mn,2x2)

12.3211.24

10.38

14.1013.59

min11.00 12.00 13.00 14.00

%

0

100

F4:MRM of 1 channel,ES-378.9 > 1965.908e+002

060507_019 Smooth(Mn,2x2)teflubenzuron

13.1642.41

12.5112.2811.4811.1710.02 14.1113.71

実試料SIMm/z=379( 定量 )

実試料SIMm/z=381( 確認 )

実試料SRMm/z=379→196

図 -6-1 　テフルベンズロンのクロマトグラム　　　　 （環境大気）

min2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

%

0

100

F2:SIR of 2 channels,ES-266.9

2.735e+003

060507_038 Smooth(Mn,2x2)

10.429.64

9.138.738.04

7.837.086.35

2.011.765.37

min2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

%

0

100

F2:MRM of 1 channel,ES-266.9 > 45.62.516e+002

060507_019 Smooth(Mn,2x2)2.440.20 1.86 5.912.82

4.16 5.606.40

7.647.45

9.018.01 10.23

実試料SIMm/z=267( 定量)

実試料SRMm/z=267→45

図 -6-2 　シクロナイトのクロマトグラム　　　　 （環境大気）