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Septièmes Journées Scientifiques du Réseau Français de
Métabolomique et Fluxomique
10-12 Juin 2013
Université de Picardie Jules Verne
UFR des Sciences
Le Comité d'Organisation
Comité Local UPJV
Rebecca Dauwe, Véronique Dulin, Redouan Elboutachfaiti, Ophélie Fliniaux, Jean-Xavier Fontaine,
Eric Gontier, Nathalie Julian, Jean Claude Laberche, Michelle Lequart, François Mesnard,
Roland Molinié, Paulo Marcello, Thi Khieu Oanh Nguyen, Gabrielle Oria, Corinne Pau-Roblot,
Emmanuel Petit, Maryse Poiret, Anthony Quéro, Séverine Schiltz
Comité National INRA Bordeaux
Catherine Deborde, Muriel Gauthier, Alain Girard, Florence Lartigaut, Marie-Lou Lombard,
Dominique Rolin
Le Comité Scientifique
Comité Local
Rebecca Dauwe, Ophélie Fliniaux, Jean-Xavier Fontaine,
Eric Gontier, François Mesnard, Roland Molinié, Emmanuel Petit BIOPI UPJV - Amiens
Isabelle Gosselin, Albrecht Roscher, Catherine Sarazin,
Brigitte Thomasset GEC-CNRS, UTC-UPJV - Compiègne-Amiens
Eric Grand, José Kovensky LG-CNRS UPJV - Amiens
Paulo Marcello ICAP UPJV - Amiens
Christophe Clément SFR Condorcet et URVVC, URCA - Reims
David Gagneul, Simon Hawkins, Jean-Louis Hilbert SADV USTL - Lille
Conseil d'Administration du RFMF
Serge Akoka CEISAM, Nantes Fabien Jourdan UMR Toxalim - Toulouse
Alain Bouchereau Corsaire Biogenouest & UMR
Igepp, Le Rheu Christophe Junot DSV/iBiTec-S/SPI CEA Saclay
Frédérique Courant Laberca, Nantes Marie-Lou Lombard UMR1332 BFP - Bordeaux
Catherine Deborde
Dominique Rolin PF Métabolome Bordeaux &
UMR1332 BFP - Bordeaux Jean-Charles Martin Biomet NORT - Marseille
Eric Gontier BIOPI UPJV - Amiens Estelle Pujos-Guillot PFEM Clermont-Ferrand
2
Partenaires des Septièmes Journées Scientifiques
Institut national de la recherche
agronomique
147 rue de l'Université
F-75338 Paris Cedex 07
Site web: http://www.inra.fr/
Département Biologie et Amélioration des
Plantes
Université de Picardie Jules Verne
Chemin du Thil
F-80000 Amiens
Site web: http://www.u-picardie.fr/
SFR Condorcet - Agro-Sciences,
Environnement et Développement Durable
FR CNRS n° 3417
GIS IBiSA
Site web: http://www.ibisa.net/
Conseil Régional de Picardie
11 Mail Albert 1er
F-80026 Amiens Cedex 1
Site web: http://www.picardie.fr/
3
Amiens Métropole
BP 2720
F-80027 Amiens Cedex
Site web : http://www.amiens.fr/
Bruker BioSpin S.A.
34, rue de l'industrie - BP 10002
F-67166 Wissembourg cedex
Site web : http://www.bruker.fr
ST
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D +
Sém
ina
ire
AGILENT TECHNOLOGIES
33 rue du Dr Georges Levy
Parc/Club du moulin à vent
69693 Vénissieux
Site web : http://www.agilent.com
ST
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D +
Sém
ina
ire
Thermo Fisher Scientific
16 avenue du Québec - Silic 765
Villebon-sur-Yvette
F-91963 Courtaboeuf cedex
Site web : http://www.thermoscientific.com/
ST
AN
D +
Sém
ina
ire
Waters
5 rue Jacques Monod
F-78280 Guyancourt
Site web : http://www.waters.com/
ST
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4
AB SCIEX
Parc Technopolis - Bâtiment Sigma
3 avenue du Canada
F-91940 Les Ulis
Site web : http://www.absciex.com/
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Sém
ina
ire
Advanced Chemistry Development
(ACD/Labs)
3 quai Kléber, Tour Sébastopol,
F-67000 Strasbourg
Site web: http://www.acdlabs.com/home/
ST
AN
D +
Sém
ina
ire
LECO France
ZAC Les Doucettes
22 avenue des Morillons
BP 70074
F-95144 Garges-Les-Gonesse cedex
Site web: http://www.lecofrance.com/
ST
AN
D
Euriso-Top
Parc des Algorithmes ,Bâtiment Homère
Route de l'Orme
F-91194 Saint Aubin
Site web: http://www.eurisotop.com/
ST
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SIGMA PLUS
6 rue Collange
F-92300 Levallois-Perret
Site web: http://www.sigmaplus.fr
ST
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Séminaires industriels des 7èmes JS RFMF
Séminaire Bruker - Mardi 11 juin Amphi Ehresmann 12h45-13h15
Bruker : outils et développements récents pour les applications en métabolomique
M. Assemat et Mme Jourdain, Bruker France
Séminaire WATERS - Mardi 11 juin Amphi Ehresmann 13h20-13h50
Development of a Metabolomic/Lipidomic Platform Based on a Hybrid Quadrupole Time-Of-
Flight (QTof) Ion-Mobility Mass Spectrometer.
José Portela, MS Sales Specialist, Waters Corporation, Saint-Quentin-en-Yvelines cedex
(France), [email protected]
Metabolomics/Lipidomics represents a paradigm shift in metabolic research, away from approaches
that focus on a limited number of enzymatic reactions or single pathways, to approaches that
attempt to capture the complexity of metabolic networks. Additionally, the high-throughput nature
of metabolomics makes it ideal to perform biomarker screens for diseases or follow drug efficacy.
Mass spectrometry is highly discriminatory for a large range of pathological processes which makes
it the principal tool for metabolomics studies.
Recent technological advances in high resolution mass spectrometry and informatics, which
combine chromatogram and ion-mobilty alignment (HDMSETM), possesses clear analytical
advantages and are specifically designed to address the new challenges of very complex samples in
metabolomic/lipidomic.
This acquisition and processing strategy provides a 100% duty-cycle accurate mass analysis of all
detectable parent and product ion informations in a complex mixture. The exact mass information
obtained provides an information rich dataset with more definitive descriptors of the molecules.
We will illustrate the utility of both the hardware (Synapt G2-S HDMSTM
) and software
(TransomicsTM
) developed for metabolomics/lipidomic work-flow analysis in this talk with real
application examples.
6
Séminaire Agilent Technologies - Mardi 11 juin Amphi Parmentier 12h45-13h15
Les Solutions Agilent technologies en Métabolomique
Luc ARNAUD
Agilent metabolomics solutions are designed to address two major approaches:
Discovery Metabolomics involves acquisition of data in an untargeted mode, in which all
metabolites are detected to determine those that are significantly different between
experimental and control conditions.
Agilent has developed sophisticated tools for untargeted or "targeted" data mining, and these
metabolites are annotated and identified using Agilent's custom metabolite databases and
spectral libraries. The identified metabolites are then mapped onto biological pathways.
Quantitative Metabolomics is hypothesis driven. It may be used to confirm results from a
previous discovery based metabolomic profiling experiment or based on results from a
genomics and/or proteomics study. Typically a large number of samples is needed to
validate a few targets and has the advantage of absolute quantitation using analytical
standards.
Due to the diverse requirements of the systems studied, the chemical diversity of metabolites, and
their wide variation in abundance, metabolomics research usually requires multiple techniques –
GCMS, LCMS, CEMS, NMR.
Séminaire Thermo Scientific - Mardi 11 juin Amphi Parmentier 13h20-13h50
Nouvelle génération de spectromètres de masse ultra performants pour les analyses métabolomiques globales et ciblées.
Claire Dauly, Thermo Scientific, France
7
Séminaire ABSCIEX - Mercredi 12 juin Amphi Ehresmann 12h45-13h15
Targeted and Untargeted Metabolomics - Using TripleTOF® 5600+ System Technology
Baljit Ubhi
AB SCIEX UK Limited, Warrington, UK
The metabolome is difficult to characterize; there is a wide dynamic range of concentrations of
metabolites, which are chemically and structurally diverse with various polarities and sizes.
Creating a single analytical method for all these components is challenging. With global profiling
techniques, the aim is to detect and quantify as many metabolites as possible. Once features of
interest are identified they need to be quantified. Information dependent acquisition (IDA)
provides useful MS/MS information, based on the user selected criteria to prioritize candidates for
fragmentation. Both the TripleTOF® 4600 and TripleTOF® 5600+ systems are capable of delivering
high resolution, quantitative, accurate mass data with high acquisition rates, enabling MS and
MS/MS information to be acquired in a single acquisition. Speed is crucial to the workflow,
enabling MS/MS information to be collected for as many features as possible, providing a
quant/qual workflow on one system!
Séminaire ACD/Labs - Mercredi 12 juin Amphi Parmentier 12h45-13h15
Création d’une base de données de référence RMN et MS sur la base de données expérimentales.
Yves Lorrain, ACD-Labs, France
8
Réseau Français de Métabolomique et Fluxomique 7
èmes Journées Scientifiques - 10 au 12 juin 2013
Université de Picardie Jules Verne, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu, Amiens
Programme
Lundi 10 juin 2013
10h00 –12h00 Atelier « Initiation au traitement de données de métabolomique obtenues par RMN»
Animateurs : Roland Molinié, Jean-Xavier Fontaine. Salle informatique.
13h00 –14h00 Accueil des participants – Buffet
14h00 – 14h10 Allocution de Bienvenue – Amphi Baudelocque
Mohammed Benlahssen, Directeur de l'UFR des Sciences, Université de Picardie Jules Verne
14h10 – 14h20 Allocution de Bienvenue.
Michel Brazier, Président de l'Université de Picardie Jules Verne
14h20 - 14h30 Introduction aux Journées.
Eric Gontier, représentant le Comité local d’organisation des 7 JS RFMF, et Dominique Rolin président du RFMF.
14h30 –15h15 Conférence Plénière invitée 1 Chairwoman : Frédérique Courant, Nantes, France
14h30 –15h15 Analyzing metabolomics data: univariate, multivariate or simplivariate?
Age Smilde, Amsterdam, Pays-Bas O1
15h20 –15h40 Session «Développements technologiques en bioinformatique / traitements statistiques» Chairman : François Mesnard, Amiens, France
15h20 –15h35 Vers une automatisation de l’analyse des données et de l’identification
de métabolites candidats biomarqueurs dans le cadre des études métabolomiques. Sylvain Chéreau, Nantes, France O2
9
15h40 Session Flash 1 (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)
Chairman : François Mesnard, Amiens, France
15h40 Analyse métabolomique des composés participant à la symbiose
Frankia-Alnus. Anne-Emmanuelle Hay-de Bettignies, Villeurbanne, France. F1-P1
15h45 Complementarity of NMR and MS methods in metabolome analysis of
dairy cows’ urine. Hamid Boudra, Saint-Genès-Champanelle, France. F2-P2
15h50 Bruker : outils et développements récents pour les applications en
métabolomique Olivier Assemat et Sabine Jourdain, Bruker, France F3
15h55 –16h35 Session «Développements technologiques en bioinformatique /
traitements statistiques» 1 Chairman : François Mesnard, Amiens, France
15h55 –16h10 ERVA: a novel method of binning, allowing chemical information to be
highlighted, from 1H-NMR metabolomics data. Daniel Jacob, Villenave d'Ornon, France O3
16h15 –16h30 A toolbox using the R environment to explore NMR metabolomic data
sets. Stéphane Balayssac, Toulouse, France O4
16h35 –17h05 PAUSE - Echanges informels
17h05 –17h25 Session «Développements technologiques en bioinformatique / traitements statistiques» 2 Chairman : Fabien Jourdan, Toulouse, France
17h05 –17h20 Vers une Galaxy Métabolomique ?
Pierre Péricard, Roscoff, Estelle Pujos, Saint-Genès Champanelle, France O5
17h25 Session Flash 2 (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)
Chairman : Fabien Jourdan, Toulouse, France
17h25 Evaluation des conséquences métaboliques de deux régimes
alimentaires chez la truite arc-en-ciel par une approche métabolomique. Blandine Madji Hounoum, Saint Pée-sur-Nivelle, France F4-P4
17h30 Caractérisation du réseau métabolique de la micro-algue
Chlamydomonas reinhardtii en conditions photo-autotrophe par métabolomique et analyse des flux en marquage instationnaire. Edern Cahoreau, Toulouse, France F5-P5
10
17h35 Les Solutions Agilent technologies en Métabolomique. Luc Arnaud, Les Ullis, France F6
17h40 – 18h20 Session «Développements méthodologiques en métabolomique, fluxomique, lipidomique, adductomique» Chairman : Serge Akoka, Nantes, France
17h40 – 17h55 Spatially-encoded 2D NMR strategies for fast quantitative
metabolomics. Illa Téa, Nantes, France O6
18h00 – 18h15 Caractérisation rapide du xénométabolome par spectrométrie de masse à très haute résolution combinée à un filtre de défaut de masse. Estelle Rathahao-Paris, Paris, France O7
18h20 Session Flash 3 (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)
Chairman : Serge Akoka, Nantes, France
18h20 NMR-based metabolomics profiling for identification of bevacizumab
effect on U87 cells. Philippe Savarin, Paris, France F7-P7
18h25 Création d’une base de données de référence RMN et MS sur la base
de données expérimentales. Yves Lorrain, ACD-Labs, Strasbourg, France F8
18h30 – 19h10 Session «Développements méthodologiques en métabolomique,
fluxomique, lipidomique, adductomique» (2) Chairwoman : Estelle Pujos, Clermont- Ferrand, France
18h30 – 18h45 Le développement de méthode d’empreintes métabolomiques à haut
débit et à ultra haute résolution pour le phénotypage métabolique et l’identification structurale de biomarqueurs. Baiyi Xue, Paris, France O8
18h50 – 19h05 Evaluation of a metabolic profiling strategy using liquid
chromatography LTQ Orbitrap mass spectrometry for the metabolic characterization of Isatis tinctoria L. leaf extracts. Rebecca Dauwe, Amiens, France O9
19h30 Cocktail d'accueil
Cocktail d'accueil au Logis du Roy, Passage du Logis du Roy, Amiens
19h30 – 20h30 : Réunion du Conseil d’Administration du RFMF (réservée aux membres du Conseil d’Administration)
11
Mardi 11 juin 2013
8h30 Session « Applications de la métabolomique/fluxomique Environnement & Microbiologie » 1
Session parallèle A – Amphi Baudelocque
8h30 –9h50 Session « Environnement»
Chairman : Christophe Clément, Reims, France
8h30 – 8h45 Analyse métabolomique des miels par spectrométrie de masse:
caractérisation chimique et détection de polluants. Jérôme Cotton, Gif-sur-Yvette, France. O10
8h50 – 9h05 Analyse métabolomique de la symbiose entre le puceron
Acyrthosiphon pisum et la bactérie Buchnera aphidicola Marjolaine Rey, Lyon, France O11
9h10 – 9h25 Développement d’une méthode d’extraction et d’analyse du
métabolome de coraux scléractiniaires. Fahoullia Mohamadi, Perpignan, France O12
9h30 – 9h45 Application of both targeted and untargeted metabolomics approaches
to assess potential biological effects of simulated sonar signals on bottlenose dolphins. Gregory Genta-Jouve, Birmingham, Royaume-Uni O13
Session parallèle B – Amphi Parmentier
8h30 –9h50 Session « Microbiologie»
Chairwoman : Catherine Sarazin, Amiens, France
8h30 – 8h45 Rôle de la régulation post-transcriptionnelle dans le contrôle du
métabolisme carboné. Jean-Charles Portais, Toulouse, France. O14
8h50 – 9h05 Metabolomic study of the metabolites induction dynamics during
fungal co-culture. Samuel Bertrand, Lausanne, Suisse. O15
9h10 – 9h25 Towards the development of metabolomics for marine micro-
organisms compounds discovery. Yann Guitton, Nantes, France O16
9h30 – 9h45 Identification par spectrométrie de masse à haute résolution d’un nouveau métabolite chez la bactérie du sol aérobie stricte Acinetobacter baylyi ADP1. Lucille Stuani, Evry, France O17
12
9h50 Session Flash 4 - Amphi Baudelocque (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)
Chairman : Christophe Clément, Reims, France
9h50 Characterization of proanthocyanidins, adaptation and development of
methodology applied to polyphenols in cranberry. David Renaud, Rennes, France F9-P9
9h55 Développement de techniques de préconcentration pour faciliter
l’identification de biomarqueurs lors d’analyses métabolomiques. Nicolas Dalle, France F10-P10
10h00 Development of a Metabolomic/Lipidomic Platform Based on a Hybrid
Quadrupole Time-Of-Flight (QTof) Ion-Mobility Mass Spectrometer. José Portela, Waters, Saint-Quentin-en-Yvelines, France F11
10h05 -10h35 PAUSE - Echanges informels 10h35 –11h15 Session « Fluxomique» Amphi Baudelocque
Chairwoman : Brigitte Thomasset, Compiègne, France
10h35 – 10h55 Understanding fatty acid synthesis in developing linseed embryos using metabolic flux analysis. Sébastien Acket, Compiègne, France O18
11h00 – 11h15 13 C-based metabolic flux analysis as a tool to unravel mechanisms
involved in oil accumulation in maize embryos. Mohamed Koubaa, Columbus, USA O19
11h20 Session Flash 5 - Amphi Baudelocque (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)
Chairwoman : Brigitte Thomasset, Compiègne, France
11h20 Signal processing and data analysis for non-targeted detection of
unknown contaminants in food. Natacha Lenuzza, Gif-sur-Yvette, France F12-P12
11h25 Nouveaux outils pour l’implémentation et l’utilisation de la RMN 2D
ultrarapide. Patrick Giraudeau, Nantes, France F13-P13
11h30 Nouvelle génération de spectromètres de masse ultra performants
pour les analyses métabolomiques globales et ciblées. Claire Dauly, Thermo Scientific, France F14
13
11h35 Session « Applications de la métabolomique/fluxomique Agroressources & Santé » 1
Session parallèle A – Amphi Baudelocque
11h35 –11h55 Session « Agroressources»
Chairman : Jean Louis Hilbert, Lille, France
11h35 – 11h50 Du raisin au vin de Champagne : Impact de la pourriture grise sur le métabolome. Clara Cilindre, Reims, France O20
Session parallèle B – Amphi Parmentier
11h35 –11h55 Session « Santé»
Chairwoman : Frédérique Courant, Nantes, France
11h35 – 11h50 Extension du profilage urinaire des stéroïdes par une approche stéroïdomique pour le dépistage anti-dopage. Julien Boccard, Lausanne, Suisse. O21
12h00 –14h00 BUFFET - REPAS
12h45 –13h50 Sessions Industrielles en parallèle 1
Session parallèle A – Amphi Ehresmann Chairman Roland Molinié, Amiens, France
12h45 – 13h15 Bruker : outils et développements récents pour les applications
en métabolomique Olivier Assemat et Sabine Jourdain, Bruker, Wissembourg, France. F3
13h20 – 13h50 Development of a Metabolomic/Lipidomic Platform Based on a Hybrid Quadrupole Time-Of-Flight (QTof) Ion-Mobility Mass Spectrometer. José Portela, Waters, Saint-Quentin-en-Yvelines, France. F11
14
Session parallèle B – Amphi Parmentier Chairman Jean Xavier Fontaine, Amiens, France
12h45 – 13h15 Les Solutions Agilent technologies en Métabolomique.
Luc Arnaud, Agilent technologies, Les Ullis, France. F6
13h20 – 13h50 Nouvelle génération de spectromètres de masse ultra performants pour les analyses métabolomiques globales et ciblées. Claire Dauly, Thermo Scientific, France. F14
14h00 –14h50 Conférence Plénière invitée 2 - Amphi Baudelocque Chairman : Alain Bouchereau, Rennes, France
14h00 – 14h50 Plant Metabolomics: Challenges and Solutions 2013
Joachim Kopka, Golm, Allemagne O22
14h50 Session Flash 6 - Amphi Baudelocque (Présentations de 5 minutes (2-3 diapos) faites par les participants sur la base de leur poster.)
Chairman : Alain Bouchereau, Rennes, France
14h50 Data processing optimization through batch normalization and
orthogonal variation inspection: Application to a cohort study to define a reference urine human metabolome. Julie Foucquier, Gif-sur-Yvette, France F15-P15
14h55 Targeted and Untargeted Metabolomics - Using TripleTOF® 5600+
System Technology Henri Nicar, ABSCIEX, France F16
15h00 Session « Applications de la métabolomique/fluxomique Agroressources & Santé » 1
Session parallèle A – Amphi Baudelocque
15h00 – 16h20 Session « Agroressources»
Chairman : Eric Gontier, Amiens, France
15h00 – 15h15 Improving the understanding of the stimulating effect of Agrobacterium rhizogenes on the tropane alkaloid biosynthesis pathway in Datura innoxia Mill. using metabolite correlation networks. Kieu Oanh Nguyen, Amiens, France O23
15h20 – 15h35 Profilage métabolique du pathosystème Lactuca sativa / Bremia lactucacea après application de stimulateurs de défenses des plantes. Floriant Bellvert, Villeurbanne, France O24
15
15h40 – 15h55 Phénotypage métabolique de pommes de terre génétiquement résistantes à différents parasites majeurs. Chloé Volant, Le Rheu, France O25
16h00 – 16h15 Acclimatation du lin (Linum usitatissimum) au stress hydrique par la réorganisation du métabolome induite par l’acide β-amino butyrique (BABA). Anthony Quéro, Amiens, France O26
Session parallèle B – Amphi Parmentier
15h00 –16h40 Session « Santé»
Chairman Jean Charles Martin, Marseille, France
15h00 – 15h15 Liquid chromatography-mass spectrometry based analysis of the cerebrospinal fluid metabolome for the study of inborn errors of metabolism. Christophe Junot, Saclay, France O27
15h20 – 15h35 Untargeted metabolomics approach for the analysis of cerebrospinal fluid (CSF) in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients using LC-HRMS method. Hélène Blasco, Tours, France O28
15h40 – 15h55 Pharmaco-metabonomic investigation of acetaminophen toxicity on rat primary hepatocytes in microfluidic biochips. Claire Lopez, Villeurbanne, France O29
16h00 – 16h15 Characterization and localization of d18:2 sphingadienine based sulfatides in rat cerebellum using 2D offline LC-HRMS and MALDI imaging in lipidomics. Benoît Colsch, Gif-Sur-Yvette, France O30
16h20 – 16h35 Variations spectrales et IRM devant une masse cérébrale nécrotique. Jean-Marc Constans, Amiens, France O31
16h40 - 17h10 PAUSE - Echanges informels
17h10 – 18h30 Session « POSTERS » et Echanges Informels
18h30 – 19h30 Assemblée Générale du Réseau Français de Métabolomique et Fluxomique (ouverte à tous les membres du RFMF). Amphi Baudelocque
19h30 Départ en Bus vers le Pré Porus pour le dîner de gala.
16
Mercredi 12 juin 2013
8h45 Session «Etudiants Masters Nantes» Amphi Baudelocque
Chairman : Dominique Rolin, Villenave d’Ornon, France
8h45 – 8h50 Présentation du Master 2 A3M (Analyse, Molécules, Matériaux, Médicaments). Renaud Boisseau, Nantes, France EM1
8h50 – 9h00 L'apport de la métabolomique pour la toxicologie.
Jérémy Marchand, Nantes, France EM2
9h00 – 9h10 L'apport de la métabolomique pour l'étude de l'obésité.
Estelle N'Tsiba, Nantes, France EM3
9h15 –10h20 Session «Nutrition» Amphi Baudelocque Chairwoman : Estelle Pujos-Guillot, Saint-Genès Champanelle, France
9h15 – 9h30 Existe-t-il un profil métabolique associé à la sensation de faim ?
Mohamed N. Triba, Bobigny, France O32
9h35 – 9h50 Metabolomics reveals differentiated metabolic adjustments of normal
and overweight subjects submitted to overfeeding. Blandine Comte, Saint-Genès-Champanelle, France O33
9h55 – 10h10 Effet de l’exercice à la vitesse lipox sur le métabolome hépatique de
souris obèses. Laurence Le Moyec, Evry, France O34
10h15 -10h40 PAUSE - Echanges informels
10h40 –11h50 Session «Initiatives nationale & internationale en métabolomique» - Amphi Baudelocque Chairman : Dominique Rolin, Villenave d’Ornon, France
10h40 – 10h55 MetaboHUB : a National Infrastructure dedicated to metabolomics and
fluxomics. Dominique Rolin, Villenave d’Ornon, France O35
11h00 – 11h45 MetaboLights: towards a new COSMOS of metabolomics data
management. Kenneth Haug et Reza Salek, Cambridge, Royaume-Uni O36
17
11h50 – 12h00 Clôture des Journées Eric Gontier, représentant le Comité local d’organisation des 7 JS RFMF, et Dominique Rolin président du RFMF.
12h00 – 14h00 BUFFET
12h45 – 13h15 Sessions Industrielles en parallèle 2
Session parallèle A – Amphi Ehresmann
12h45 – 13h15 Targeted and Untargeted Metabolomics - Using TripleTOF® 5600+ System Technology Baljit Ubhi, ABSCIEX, UK.
Session parallèle B – Amphi Parmentier
12h45 – 13h15 Création d’une base de données de référence RMN et MS sur la base de données expérimentales. Yves Lorrain, ACD-Labs, Strasbourg, France.
14h00 – 17h00 Atelier 2«Exploitation des données acquises par Spectrométrie de Masse.» Amphi Baudelocque Frédérique Courant, Nantes ; Christophe Junot, Saclay ; Jean-Charles Martin, Marseille ; Estelle Pujos-Guillot, Saint-Genès- Champanelle, France.
14h00 – 16h00 Atelier 3«Techniques d’acquisition et de suppression de solvant en RMN 1D» Amphi Parmentier Serge Akoka, Illa Téa, Patrick Giraudeau, Nantes, France.
14h00 – 16h00 Atelier 4« How to submit data to MetaboLights» Salle Informatique Kenneth Haug et Reza Salek, Cambridge, Royaume-Uni
18
Résumés
Communications Orales
19
O1- Conférencier Invité
Analyzing metabolomics data: univariate, multivariate or simplivariate?
Age Smilde
Biosystems Data Analysis
Swammerdam Institute for Life Sciences,
University of Amsterdam, the Netherlands
20
O2
Vers une automatisation de l’analyse des données et de l’identification de
métabolites candidats biomarqueurs dans le cadre des études métabolomiques.
Sylvain Chéreau1, Anne-Lise Royer
1,2, Frédérique Courant
1, Clémentine Le
Boucher1,2,3
, Sophie Jeanson2,3
, Anne Thierry2,3
, Gaud Dervilly-Pinel1, Jean-Philippe
Antignac1, Fabrice Monteau
1, Bruno Le Bizec
1.
1 LABoratoire d’Étude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA) USC INRA 1329, Oniris,
LUNAM Université, BP 50707, 44307 Nantes Cedex 3, France
2 INRA, UMR1253 Science et Technologie du Lait et de l’Œuf, F-35042 Rennes, France
3 Agrocampus Ouest, UMR1253 Science et Technologie du Lait et de l’Œuf, F-35042 Rennes, France
Par nature, une étude métabolomique génère des volumes de données très importants. En fonction
de l’ampleur de l’étude (nombre d’échantillons) et des conditions d’analyse, l’acquisition des
profils métaboliques correspondants peut s’étendre sur de longues périodes, allant parfois jusqu’à
plusieurs mois. En amont de l’étape de retraitement des données brutes, la caractérisation et la
maîtrise de la qualité analytique des profils métaboliques est alors primordiale pour éviter tout
biais dans l’exploitation ultérieure des données. Dans ce sens, plusieurs solutions sont
communément utilisées par la communauté scientifique : l’ajout d’étalons internes et/ou externes,
l’acquisition de profils sur des échantillons dits « contrôles qualité »… Outre les avantages qu’elles
procurent, ces stratégies complexifient toutefois l’information disponible et par conséquent la mise
en évidence de l’information utile peut se révéler fastidieuse. Passées ces étapes de retraitement de
l’information, l’identification structurale des candidats biomarqueurs révélés reste ensuite une
étape très laborieuse, toutefois nécessaire pour comprendre les perturbations biologiques observées.
Face à ces différentes problématiques, un outil d’évaluation de la qualité analytique des données à
été développé au LABERCA, sous forme d’une macro Excel. Cet outil permet de mieux visualiser
l’homogénéité des profils métaboliques à comparer et, le cas échéant, de corriger automatiquement
les dérives analytiques observées. De plus, en vue de fluidifier l’annotation des empreintes
métaboliques acquises, une banque de données spectrales [1], comptant à ce jour plus de 200
composés caractérisés, a été développée sa consultation intégrée à la macro Excel permet d’annoter
automatiquement le tableau de données généré suite au retraitement des données brutes par XCMS.
Les principaux avantages de cette stratégie haut-débit seront présentés et illustrés au travers
d’applications telles que la mise en évidence de marqueurs d’une administration frauduleuse de
promoteurs de croissance en élevage [2] ou l’identification de marqueurs de croissance bactérienne
au cours de l’affinage du fromage [3].
Références bibliographiques [1] F. Courant et al., Implementation of a semi-automated strategy for the annotation of metabolomic fingerprints generated by liquid
chromatography-high resolution mass spectrometry from biological samples. Analyst. 2012, 137, 4958-4967.
[2] G. Dervilly-Pinel et al., Metabolomics in food analysis: application to the control of forbidden substances. Drug. Test Analysis
2012, Suppl 1:59-69.
[3] C. Le Boucher et al., First mass spectrometry metabolic fingerprinting of bacterial metabolism in a model cheese. Food
Chemistry. Accepted.
Mots-clés : Macro Excel, banque de données, retraitement de données métabolomiques
21
O3
ERVA: a novel method of binning, allowing chemical information to be
highlighted, from 1H-NMR metabolomics data.
Daniel Jacob 1,2
, Catherine Deborde 1,2
and Annick Moing 1,2
1 INRA, UMR1332 Fruit Biology and Pathology, Centre INRA de Bordeaux, F-33140 Villenave d'Ornon, France
2 Metabolome Facility of Bordeaux Functional Genomics Center, IBVM, Centre INRA de Bordeaux, F-33140 Villenave
d'Ornon, France
The spectra processing is crucial in metabolomics approaches, especially for proton NMR
metabolomic profiling, each step might impact on the following. Among the different steps, data
reduction (binning or bucketing) strongly impacts subsequent statistical data analysis and potential
biomarker discovery. Based on a recently published work 1 , here we propose an improving method
of data reduction, called ERVA which stands for Extraction of Relevant Variables for Analysis.
This new method provides buckets i) rid of any non-significant signal, and ii) closer to the chemical
fingerprints of metabolites. Moreover, taking advantage of the concentration variability of each
compound from a complex mixture, chemical information can be highlighted by linking the buckets
into clusters based on significant correlations, thus bringing a helpful support for compound
identification. This new method is applied as a proof of concept, to a tomato 1 H-NMR dataset to
test its ability to recover the fruit extract compositions.
Référence bibliographique
[1] Daniel Jacob, Catherine Deborde, Annick Moing, (2013) An efficient spectra processing method for metabolite
identification from 1H-NMR metabolomics data, Analytical and Bioanalytical Chemistry , doi: 10.1007/s00216-
013-6852-y
Mots-clés : 1H-NMR spectroscopy, spectra processing, metabolite identification, metabolomics
22
O4
A toolbox using the R environment to explore NMR metabolomic data sets
Stéphane Balayssac 1, Sébastien Déjean
2, Julie Lalande
1, Véronique Gilard
1,
Myriam Malet-Martino 1
1 Groupe de RMN Biomédicale, Laboratoire SPCMIB (UMR CNRS 5068),
2 Institut de Mathématiques de Toulouse, UMR 5219
Université de Toulouse, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse cedex, France
Several packages or toolboxes to explore NMR metabolomic data sets exist as for example
metabonomic [1] and MUMA [2] R packages, as well as several in-house codes developed in
Matlab. However, programming knowledge is required with R and Mathlab softwares, which limit
their access for inexperienced users.
The purpose of the present work was to develop in the free R software [3] statistical and
graphical techniques to analyze NMR data. Concretely, very basic knowledge in R is required. The
user just has to source one of the R script files corresponding to the analysis he wants to perform.
Once the script sourced, data are imported from three common xls files. The first one contains the
quantitative and qualitative variables, the second one the specific attribution of the variable and the
last one the high resolution spectrum. Then the user can customize his analysis by answering to
some very simple questions asked by the program like “Do you want different colours? yes/no” or
“Insert the order to display boxplots”. Output files including numerical and graphical results are
produced and stored in one main directory with sub-directories to facilitate the localization of data.
This toolbox includes univariate, bivariate and multivariate statistical analyses. Univariate
approaches propose a set of graphical and numerical tools to provide information for each variable
of the data set. Bivariate approaches lead to various representations (STOCSY-like representation,
statistical correlation network, specific image) of the correlation matrix to explore highly correlated
metabolites. Then, multivariate methods provide a global overview of the data set either in an
unsupervised (PCA) or a supervised (PLS-DA) framework. Sparse versions of these methods,
implemented in the mixOmics package [4], enable selecting the most relevant variables to focus on.
All these tools are accompanied with interactive facilities to make easier the biological
interpretation of the results. For example, interactive facility is available for network handling
where the user can click on the network to move and re-organize the nodes.
The potential of our toolbox is illustrated by a series of graphical representation resulting
from 1 H NMR metabolomic studies (Alzheimer’s disease, melanoma, …) or chemometric analyses.
Références bibliographiques [1] J.L. Izquierdo-García, et al. BMC Bioinformatics 2009; 10: 363.
[2] E. Gaude, et al. (2012) http://cran.r-project.org/web/packages/muma/
[3] R Development Core Team. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org, 2012.
[4] K.A. Lê Cao et al. Bioinformatics, 2009; 25: 2855-2856,
Mots-clés : NMR, Statistical analysis, R software
23
O5
Vers une "Galaxy" Métabolomique ?
la plateforme Galaxy et l’univers des analyses métabolomiques
Pierre Péricard
1, Gildas Le Corguille
1, Urszula Czewinska
1, Marion Landi
2, Franck
Giacomoni 2, Christophe Duperier
2, Jean-François Martin
2, Sophie Goulitquer
1, Christophe
Caron 1, Estelle Pujos-Guillot
2
1 ABiMS, FR2424 CNRS-UPMC, Station Biologique, Place Georges Teissier, 29680, Roscoff, France
2 PFEM, UMR1019 INRA, Centre Clermont-Ferrand-Theix, 63122, Saint Genes Champanelle, France
Contact : [email protected]
Face à l'utilisation croissante de la métabolomique par les scientifiques dans la génération
d’empreintes, les massistes, statisticiens et bio-informaticiens ont dû imaginer de nouvelles
stratégies d’analyses [1]. Des efforts importants ont été consentis par la communauté pour lever les
verrous techniques et méthodologiques rencontrés et particulièrement dans les champs de la
bioinformatique et de la chimiométrie. Ainsi, lors de la dernière décennie, la production
d’algorithmes et d’outils par les laboratoires scientifiques, les compagnies privées et les
constructeurs d’appareils s’est accélérée. Or, la majorité de ces solutions informatiques sont des
logiciels de type client lourd, ou de simples scripts à exécuter avec des fonctionnalités spécifiques et
des performances parfois limitées même si des solutions « full web », plus ergonomiques telles que
XCMS Online [2] ou MetaboAnalyst [3], sont aujourd’hui proposées. Présentée comme une
solution alternative et basée sur un mode collaboratif, nous avons développé une « boîte à outils »
(BAO) intégrant des modules de traitement et d’annotations de données métabolomiques, facile à
compléter quelle que soit l'origine (laboratoire) et la nature (langage) des scripts et des
développements. Cette BAO est accessible par une simple interface web pour les différentes
communautés : biologistes, experts massistes, statisticiens et bio-informaticiens.
Un des moteurs de « workflows » les plus utilisés en bioinformatique, la plateforme web
d’analyses Galaxy [4,5,6] ( http://galaxyproject.org/ ), a été choisi pour développer notre suite
d’applications. Cette première version « métabolomique » de Galaxy a pour objectif d’établir une
preuve de concept de ses capacités d’intégration d’outils tels que XCMS [7]. Nous avons aussi
démontré son adaptabilité à des stratégies d’analyses particulières et valider la qualité intrinsèque de
son interface utilisateur. Dans le cadre d’une collaboration entre les plateformes INRA/PFEM et
CNRS/ABiMS-METABOMER, nous avons ainsi pu construire sous Galaxy un premier
environnement extensible d’analyses. Cette chaîne modulaire inclut des composants connus comme
les fonctions d’XCMS mais aussi une suite d’outils statistiques complémentaires de type ACP,
outils de clustering [8] et de normalisation de données [9]. Chaque composant peut être utilisé de
manière indépendante ou comme faisant partie intégrante d’un « workflow » complet et
préconfiguré. La parallélisation des traitements a aussi été implémentée avec le portage des
fonctions calculatoires sur serveur de calculs. Cette implémentation met également à disposition un
grand nombre des paramètres proposés par le package d’analyses R. Des experts peuvent ainsi
configurer des chaînes de traitement en utilisant les options avancées et les partager à l’ensemble
des utilisateurs de la plateforme pour une utilisation en routine.
La plateforme Galaxy propose nativement une méthodologie d’intégration d’outils issus de
sources multiples et dispose d’un gestionnaire de workflows intuitif, de fonctionnalités avancées
telles que des historiques assurant la traçabilité et la capacité à reproduire des analyses. Enfin,
Galaxy propose un environnement pour le partage des données, des résultats, des outils via le
« toolshed » ou des workflows d’analyses. Cet environnement web unifié facilite la réalisation de
traitements in silico par des non bio-informaticiens.
24
Avec la mise en place de telles infrastructures, notre projet s'inscrit dans un contexte
d’adaptation de nos méthodes de traitement et de changement d’échelle des capacités de traitement
des laboratoires. La dynamique de cette collaboration nous a permis de dépasser notre objectif
initial, à savoir la validation de la plateforme Galaxy. Nous envisageons ainsi notamment de
développer les aspects « annotation » avec des composants d’interrogation de banques de données.
Nos premiers résultats nous ont également permis d’obtenir des financements pour les deux
prochaines années auprès des conseils régionaux d’Auvergne et de Bretagne. Enfin, cette
collaboration s’intègre totalement aux Infrastructures de Recherche financées dans le contexte des
Investissements d’Avenir. Elle contribue notamment à développer de fortes synergies entre
METABOHUB et EMBRC-France, visant à développer des composants interopérables et de haut-
niveau pour la métabolique à haut-débit. Ces développements s’intègrent également dans une
perspective de structuration nationale de la bio-informatique, en liens étroits avec l’Institut Français
de Bio-informatique.
Références bibliographiques :
[1] W. Dunn, Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant
metabolomes. Physical Biology, 5:011001, 2008.
[2] R. Tautenhahn, G.J. Patti, D. Rinehart and G. Siuzdak, XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted
Metabolomic Data. Analytical Chemistry, 84(11):5035-5039, 2012.
[3] J. Xia, N. Psychogios, N. Young and D.S. Wishart, MetaboAnalyst: a web server for metabolomic data analysis and
interpretation. Nucleic Acids Res, 37(Web Server issue):W652-60, 2009.
[4] J. Goecks, A. Nekrutenko, J. Taylor and The Galaxy Team, Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible,
reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol, 11(8):R86, 2010.
[5] D. Blankenberg, G. Von Kuster, N. Coraor, G. Ananda, R. Lazarus, M. Mangan, A. Nekrutenko and J. Taylor, Galaxy: a web-
based genome analysis tool for experimentalists. Current Protocols in Molecular Biology, 89:19.10.1-19.10.21, 2010.
[6] B. Giardine, C. Riemer, R.C. Hardison, R. Burhans, L. Elnitski, P. Shah, Y. Zhang, D. Blankenberg, I. Albert, J. Taylor, W.
Miller, W.J. Kent and A. Nekrutenko, Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Research,
15(10):1451-5, 2005.
[7] C.A. Smith, E.J. Want, G.C. Tong, R. Abagyan, and G. Siuzdak, XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite
profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry, 78(3):779-787, 2006.
[8] A.J. Saldanha, Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics, 20(17):3246-3248, 2004.
[9] F.M. Van Der Kloet, I. Bobeldijk, E.R. Verheij, R.H. Jellema, Analytical error reduction using single point calibration for
accurate and precise metabolomic phenotyping. J Proteome Res, 8(11):5132-41, 2009.
Mots-clés : metabolomics, workflows, galaxy, xcms
25
O6
Spatially-encoded 2D NMR strategies for fast quantitative metabolomics.
Illa Tea, Adrien Le Guennec, Estelle Martineau,
Meerakhan Pathan, Benoît Charrier, Serge Akoka, Patrick Giraudeau
Université de Nantes, CNRS, CEISAM UMR 6230, Nantes, France
Two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance (2D NMR) forms a powerful tool for the targeted
analysis of metabolic samples, thanks to its capacity to simultaneously identify and quantify major
metabolites in biological samples. However, its use for quantitative purposes is far from being
trivial, not only because of the associated experiment time, but also due to its subsequent high
sensitivity to hardware instabilities. The latter highly affect the analytical performance of 2D
experiments (repeatability, linearity), thus affecting the accuracy and precision of quantitative
analysis. Recent papers described the development and optimization of 2D NMR experiments for
quantitative analysis of metabolic samples.1 Reducing the experiment duration appears as
indispensable to reach a high quantitative performance. In this context, we recently focused our
attention on the development of fast quantitative 2D NMR approaches applied to the measurement
of major metabolites in breast cancer cell line extracts, allowing the discrimination between
different cancer cell lines.2
On the other hand, the NMR community has developed a number of approaches departing from the
classical parametric incrementation scheme of 2D NMR, in order to drastically reduce the duration
of 2D NMR experiments. In particular, the last 10 years have witnessed large efforts geared at
developing the so-called “ultrafast 2D NMR” methodology, capable of providing a complete 2D
correlation in a single scan, i.e. in a fraction of a second.3 Based on this approach, we developed a
quantitative “multi-scan single shot” (M3S) strategy, 4
capable of measuring absolute metabolite
concentrations in complex mixtures with a high precision in a reasonable time. The analytical
performance of this methodology was compared to the one of conventional 2D NMR. 2D COSY
spectra were obtained in 10 minutes on model metabolic mixtures, with a precision in the 1-4%
range (versus 5-18% for the conventional approach). 5 This much higher precision is due to the
excellent immunity of the M3S approach towards hardware instabilities. The M3S approach also
shows a better linearity than its conventional counterpart. It ensures that accurate quantitative
results can be obtained provided that a calibration procedure is carried out. The M3S COSY
approach was then applied to measure the absolute metabolite concentration in three breast cancer
cell line extracts, relying on a standard addition protocol. M3S COSY spectra of such extracts were
recorded in 20 minutes and gave access to the absolute concentration of 14 major metabolites,
showing significant differences between cell lines. 5 The concentrations measured are coherent with
the biological processes in cancer cells and are in good adequacy with metabolic studies performed
in our group by Isotopic Ratio Mass Spectrometry (IRMS). 6
Références bibliographiques 1. Chylla, R.A.; Hu, K.; Ellinger, J.J.; Markley, J.L. Anal. Chem. 2011, 83, 4871-4880.
2. Martineau, E.; Tea, I., Akoka; S.; Giraudeau, P. NMR Biomed. 2012, 25, 985-992.
3. Frydman, L.; Scherf, T.; Lupulescu, A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 15858-15862.
4. Pathan, M.; Akoka, S.; Tea, I.; Charrier, B.; Giraudeau, P. Analyst 2011, 136, 3157-3163.
5. Le Guennec, A.; Tea, I.; Antheaume, I. ; Martineau, E.; Charrier, B.; Pathan, M.; Akoka, S.; Giraudeau, P. Anal. Chem. 2012, in
press, doi: 10.1021/ac3033504
6. Tea, I.; Martineau, E.; Giraudeau, P.; Akoka, S.; Barillé-Nion, S. Patent WO 2012/123886, 2012
7. http://www.sciences.univ-nantes.fr
26
O7
Caractérisation rapide du xénométabolome par spectrométrie de masse à
très haute résolution combinée à un filtre de défaut de masse
Estelle Rathahao-Paris
1 , Alain Paris
2
1 INRA, AgroParisTech, UMR 1145 Ingénierie Procédés Aliments, 75231 Paris, France
2 INRA- AgroParisTech, Unité Met@risk, 75231 Paris Cedex 05, France
L’approche métabolomique comprend également la caractérisation possible du xénométabolome
puisque des métabolites des xénobiotiques sont également détectés dans l’organisme à un moment
donné sous forme d’empreintes spécifiques. Compte tenu de la possibilité de présence d’un grand
nombre d’ions correspondant aux xénométabolites et de la présence d’ions d’interférence présents
dans la matrice biologique, il est nécessaire de disposer d’un outil performant permettant la
détection rapide et simultanée des métabolites de différents xénobiotiques pour la caractérisation
rapide du xénométabolome et ainsi la mise en évidence, dans des surveillances épidémiologiques,
de l’état d’exposition réel des populations au risque chimique, notamment l’exposition combinée de
plusieurs xénobiotiques tels que les pesticides, les résidus de médicaments ou les polluants de
l’environnement.
La spectrométrie de masse à très haute résolution combinée à un outil de traitement de données
fondé sur le calcul des défauts de masse permettrait d’extraire des ions d’intérêt, même ceux de
faible abondance [1,2]. Ce type d’approche a été appliqué à l’étude du métabolisme de la
vinclozoline, un fongicide fréquemment utilisé en agriculture et reconnue comme étant un
perturbateur endocrinien ayant des propriétés androgéniques.
Dans ce travail, l’analyse directe de l’urine de rat traité avec la vinclozoline a été réalisée en mode
d’introduction directe combinée à la spectrométrie de masse à très haute résolution (LTQ-Orbitrap).
L’application d’un filtre de défaut de masse a permis de réduire un nombre considérables de
variables, facilitant ainsi la détection et l’identification des métabolites de la vinclozoline ayant
conservé le motif dichlorophényl possédant un massif isotopique caractéristique de la présence de
deux atomes de chlore. La composition élémentaire de chaque métabolite a pu être obtenue à partir
de la mesure précise du rapport m/z des ions caractéristiques. Les expériences de spectrométrie de
masse en tandem ont été également réalisées sur les ions présentant une distribution de massifs
isotopiques diagnostiques de la présence de deux atomes de chlore. La mesure précise des rapports
m/z des ions fragments a permis de fournir la composition élémentaire de chaque ion fragment et
des informations structurales non ambiguës.
Les résultats obtenus sur cette étude semblent très prometteurs en termes d’analyse des
xénométabolites à haut débit.
Références bibliographiques : 1. Zhang, H. Zhang, D. and Ray. K. (2003). A software filter to remove interference ions from drug metabolites in
accurate mass liquid chromatography/mass spectrometric analyses. Journal of Mass Spectrometry 38, 1110-1112.
2. Zhang, H., Zhang, D., Ray, K., and Zhu, M. (2009). Mass defect filter technique and its applications to drug
metabolite identification by high-resolution mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 44, 999–1016.
Mots-clés : xénométabolome, spectrométrie de masse à très haute résolution, filtre de défaut de
masse
27
O8
Le développement de méthode d’empreintes métabolomiques à haut débit et
à ultra haute résolution pour le phénotypage métabolique et l’identification
structurale de biomarqueurs
B. Xue
1 ; S. Alves
2 ; J-C. Tabet
2 ; R. Cole
2 ; A. Paris
3 ; C. Junot
4 ; E. Paris
1
1 INRA, AgroParisTech, Équipe IAQA, UMR 1145 Ingénierie Procédés Aliments, 75231 Paris
Cedex 05 2
UPMC, Laboratoire CSOB, Institut Parisien Chimie Moléculaire, 75252 Paris Cedex 05 3
INRA, AgroParisTech, Mét@risk , 75231 Paris Cedex 05 4
CEA, LEMM, 91191 Gif sur Yvette Cedex
Les études menées en métabolomique utilisent généralement la spectrométrie de masse couplée à un
système de séparation chromatographique [1,2]. La production des données à haut débit avec ce
type d’approche est donc difficile puisque seulement 50 à 100 échantillons peuvent être analysés au
maximum par jour, selon les conditions chromatographiques utilisées. Pour pouvoir réaliser le
phénotypage métabolique sur une cohorte de taille importante et à des coûts raisonnables, il est
nécessaire de disposer d’une méthodologie robuste permettant de produire à haut débit des
empreintes métabolomiques pleinement informatives et exploitables au plan statistique.
L’introduction directe des échantillons, sans avoir recours à une séparation chromatographique
préalable, semble être une bonne alternative.
Dans ce travail, la nouvelle méthodologie développée consiste à remplacer la chromatographie
liquide (LC) par une introduction directe (DI) en mode injection en flux continu (FIA, flow
injection analysis) pour coupler à un spectromètre de masse (MS) FT-ICR (Fourier Transform-Ion
Cyclotron Resonance). Cet instrument possède des performances remarquables sans commune
mesure avec celle des autres types de spectromètre de masse. Ainsi, grâce à son pouvoir résolutif
ultra élevé (résolution en masse > 100 000 FWHM), il permet la séparation des ions isobares et en
conséquence la détection simultanée d’un grand nombre de composés à partir de l’analyse de
mélanges complexes.
Dans cet exposé, seront présentés les résultats préliminaires obtenus sur des échantillons urinaires.
Des composés standards de référence, de poids moléculaires couvrant la gamme de rapports m/z des
spectres de masse étudiés, ont été utilisés afin de déterminer les meilleures conditions d’analyses et
évaluer les performances de la détection dans des matrices complexes telles que l’urine.
L’introduction des composés de référence dans ces biofluides a permis de mettre en évidence, pour
des échantillons faiblement dilués, l’existence des effets de matrice. Un facteur de dilution a pu être
déterminé pour limiter ces effets de matrice et avoir la meilleure réponse en terme de signal de
détection. Une bonne linéarité a pu être observée dans la gamme de concentrations choisies. Les
premiers résultats obtenus ont permis d’évaluer le nombre de métabolites urinaires détectés en
mode introduction directe couplé à l’instrument FT-ICR en comparaison avec les résultats obtenus
sur les mêmes échantillons par couplage UPLC-LTQ-Orbitrap.
Références bibliographiques : 1. Bedair, M., Sumner L.W. Current and emerging mass-spectrometry technologies for metabolomics, Trends in
Analytical Chemistry 2008 , 27, 238-250.
2. Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier J.-F. Applications of liquid chromatography coupled to mass
spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review. Clinical Biochemistry 2011 ,
44, 119–135.
Mots-clés : phénotypage métabolique, haut débit, spectrométrie de masse à très haute résolution
28
O9
Evaluation of a metabolic profiling strategy using liquid chromatography
LTQ Orbitrap mass spectrometry for the metabolic characterization of Isatis
tinctoria L. leaf extracts
Kieu Oanh Nguyen 1 , Kris Morreel
2 , Paulo Marcello
3 , Eric Gontier
1 , Rebecca Dauwe
1
1 Université de Picardie Jules Verne, BIOPI, UFR des Sciences, Ilot des poulies, 33 rue Saint Leu,
80039 Amiens cedex, France 2 VIB - Department of Plant Systems Biology, Ghent University - Technologiepark 927, 9052 Ghent,
Belgium 3
Université de Picardie Jules Verne, ICAP- Plateforme d'Ingénierie Cellulaire et Analyse des
Protéines, 1-3, rue des Louvels, 80037 Amiens cedex, France
Efficient compound annotation is a problem that remains not satisfactorily solved in
untargeted LC-MS-based metabolomics research. Here we present a strategy for metabolite
profiling of plant extracts using an LC-LTQ-Orbitrap MS. As a model plant, we used Isatis
tinctoria L., an ancient indigo dye and a medicinal plant of which the leaf extracts have been
intensively investigated from a pharmacological viewpoint. Complex mass spectra of leaf extracts
consist of molecular ions as well as fragments and adducts. We reduced the data complexity by
selecting the [M-H]- ions from the dataset in an automated way. The highly accurate Orbitrap MS
masses were used to determine the number of sulfur ions and to derive a ranked list of chemical
sum formulae. Furthermore, exact mass differences between different [M-H]- ions in combination
with a correlation analysis and an analysis of the relative retention times could reveal networks of
biochemically closely related compounds in the complex dataset. Based on the MS2 spectra
obtained in parallel via the linear ion trap, selections of [M-H]- ions that showed characteristic
fragments and/or neutral losses in their MS2 spectrum, were made in an automated way. The
structures of selected ions were finally proposed based on MSn experiments obtained in the linear
ion trap. Using this strategy, we performed a broad metabolic characterization of the polar
constituents of fresh leaves of I. tinctoria individuals, in parallel with the metabolic characterization
of the pharmacologically active lipophilic extracts from comparable leaves of the same individuals
after a drying process. The proposed method is able to provide reductions in data complexity and
identification of biochemically related metabolites. We finally used the obtained metabolite profiles
to establish a predictive relationship between the metabolic composition of the fresh I. tinctoria
leaves and the production of pharmacologically active compounds during the drying process.
Mots-clés : high resolution mass spectrometry, structural annotation
29
O10
Analyse métabolomique des miels par spectrométrie de masse:
caractérisation chimique et détection de polluants.
Cotton Jérôme, Sabarly Victor, Oursel Stéphanie, Marie Mylène, Broudin Simon, Leroux
Fanny, Desoubzdanne Denis, Corman Bruno, Junot Christophe.
Traditionnellement, la spectrométrie de masse à analyseurs de type triple quadripôlaire
fonctionnant en mode MRM est utilisée pour la détermination et le dosage de contaminants
chimiques dans les matrices alimentaires 1,2
. Dans cette étude, une approche métabolomique 3 par
couplage de la chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse à ultra haute résolution (LC-
ESI-FTMS) a été développée pour la recherche de contaminants chimiques potentiels (56
pesticides et 35 antibiotiques) dans le miel. La valeur ajoutée de ce travail réside dans l’acquisition
d’une seule empreinte chimique pour (1) la détermination de polluants dans le miel avec une bonne
spécificité (masse exacte, temps de rétention et massif isotopique) et (2) l’utilisation de l’ensemble
des signaux générés durant l’analyse pour réaliser un profilage métabolique à l’aide de méthodes
statistiques. Pour cela, une extraction liquide-liquide en cinq étapes a tout d’abord été réalisée pour
extraire le maximum de métabolites possibles à partir du miel. Les résultats montrent que 74 miels
sur 76 sont pollués par une molécule au moins et que trois pesticides sont retrouvés dans la majorité
d’entre eux (carbendazim, amitraz et chlorfenvinphos). Enfin, des analyses statistiques ont été
réalisées (ACP et modèle prédictif) et ont permis de discriminer les miels selon leurs origines
florales.
Cette étude démontre que les analyses métabolomiques globales et sans a priori permettent
d'obtenir dans le cadre d'une seule acquisition des données pertinentes dans des domaines aussi
variés que la recherche de polluants, la recherche d'adultérations et la chimie des substances
naturelles.
Références bibliographiques : 1. Bohm D.A ; Stachel C.S ; Gowik P. Validation of a multi-residue method for the determination of several
antibiotic groups in honey by LC-MS/MS. Anal Bioanal Chem, 403 (2012) 2943–2953.
2. Herrmanna A ; Roséna J ; Janssonb D ; Hellenäs K.E. Evaluation of a generic multi-analyte method for
detection of 100 representative compounds correlated to emergency events in 19 food types by ultrahigh-
pressure liquid chromatography–tandem mass spectrometry. J Chrom A, 1235 (2012) 115–124.
3. Werner E ; Croixmarie V ; Umbdenstock T ; Ezan E ; Chaminade P ; Tabet J.C ; Junot C. Mass
Spectrometry-Based Metabolomics: Accelerating the Characterization of Discriminating Signals by
Combining Statistical Correlations and Ultrahigh Resolution. Anal Chem, 80 (2008) 4918–4932.
Mots-clés : miel, LC/MS, spectrométrie de masse à haute résolution, métabolomique, statistiques,
environnement, polluants
30
O11
Analyse métabolomique de la symbiose entre le puceron Acyrthosiphon pisum et
la bactérie Buchnera aphidicola
Marjolaine Rey 1 , Floriant Bellvert
2 , Gabrielle Duport
1 , Patrice Baa-Puyoulet
1 , Federica
Calevro 1 , Stefano Colella
1 , Hubert Charles
1 , Gilles Comte
2 , Gérard Febvay
1
1 UMR203BF2I Biologie Fonctionnelle Insectes et Interactions, INRA,INSA Lyon, Université De Lyon,20 avenueAlbert
Einstein,F‐69621 Villeurbanne cedex
2 UMR5557 Ecologie Microbienne, Centre d’Etudes des Substances Naturelles, CNRS, Université Lyon 1, Université
de Lyon, 43 Boulevard du 11 novembre 1918,F‐69622 Villeurbanne cedex
En colonisant de nombreuses légumineuses d’intérêt agronomique (pois, fève, lentille,
luzerne), le puceron du pois Acyrthosiphon pisum est un ravageur notable des cultures en régions
tempérées. Les dégâts qu’il occasionne sont liés d’une part à la ponction de sève phloémienne qui
affaiblit la plante, et d’autre part à sa capacité à transmettre de très nombreux virus végétaux
phytopathogènes.
La sève phloémienne dont se nourrissent les pucerons est un milieu riche en sucres et en
certains acides aminés transporteurs d’azote, et particulièrement carencé en vitamines et acides
aminés essentiels (non synthétisables par les animaux). L’adaptation du puceron à cette source
alimentaire déséquilibrée et variable repose sur l’établissement d’une symbiose obligatoire avec une
bactérie intracellulaire : Buchnera aphidicola . En effet, les études physiologiques conduites dans
les années antérieures ont démontré le rôle nutritionnel de B. aphidicola dans la fourniture au
puceron des acides aminés essentiels déficients dans la sève phloémienne des plantes (Liadouze et
al. , 1995 ; 1996). Dans ce travail, nous étudions l’impact de la présence de la bactérie sur le
métabolisme global du puceron.
Dans cette perspective, nous avons comparé le métabolome de pucerons symbiotiques
témoins, élevés 8 jours sur plants de fève (Vicia fabae), à celui de pucerons aposymbiotiques. Dans
ces derniers, la bactérie a été éliminée par un traitement antibiotique de 2 jours sur milieu artificiel,
avant de transférer les pucerons sur plantes, où ils seront élevés pendant 6 jours. Des pucerons
contrôles ont été élevés 2 jours sur milieu artificiel sans antibiotique, puis transférés sur plantes
pendant 6 jours.
Pour analyser le métabolome de la manière la plus exhaustive, chaque échantillon a été extrait
successivement avec 4 solvants de polarité croissante (hexane, acétate d’éthyle, méthanol et eau)
conduisant à une extraction totale de 37 % à 51% de la masse de matière sèche de puceron. Sur des
combinaisons de ces extraits, deux approches distinctes ont été conduites : (i) une approche ciblée
de type profilage métabolique de plusieurs classes de métabolites : (acides aminés par
HPLC/fluorimétrie, et sucres, acides organiques, acides gras par GC/MS) ; (ii) une approche non
ciblée de type empreinte métabolique par UHPLC/DAD/QTOF. Ces deux types d’approche nous
permettent ainsi d’appréhender aussi bien le métabolisme primaire que le métabolisme secondaire
du puceron.
L’ensemble des données provenant des différentes techniques chromatographiques ont été
normalisées puis compilées au sein d’une même matrice.
L’analyse en composantes principales de cette matrice (328 composés caractérisés) sépare les
pucerons symbiotiques (témoins et contrôles) des pucerons aposymbiotiques (axe 1 / 28%), et
montre aussi l’impact des 2 jours de culture sur milieu artificiel des pucerons symbiotiques (axe 3 /
14%). Cette analyse descriptive met ainsi en évidence des composés discriminants entre les trois
conditions biologiques.
31
L’analyse statistique (ANOVA) montre que plus de 40% des métabolites détectés ou
identifiés sont significativement discriminants entre les différentes conditions biologiques, dont
19% sont des métabolites primaires et 23% des secondaires.
Cette analyse métabolomique globale révèle l’impact important de la bactérie sur le
métabolisme du puceron, tant sur les composés liés directement à la croissance et la reproduction
(métabolisme primaire) que sur les composés du métabolisme secondaire. Cette influence se
caractérise, selon les composés analysés, par une accumulation ou une déficience significative dans
les pucerons aposymbiotiques par rapport aux symbiotiques.
Références bibliographiques Liadouze I, Febvay G, Guillaud J, Bonnot G. 1995. Effect of diet on the free amino acid pools of symbiotic and
aposymbiotic pea aphids, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Physiol. 41 : 33-40.
Liadouze I, Febvay G, Guillaud J, Bonnot G. 1996. Metabolic fate of energetic amino acids in the aposymbiotic pea
aphid Acyrthosiphon pisum (Harris) (Homoptera: Aphididae). Symbiosis 21: 115-127.
Mots-clés : Métabolomique, Acyrthosiphon pisum, symbiose
32
O12
Développement d’une méthode d’extraction et d’analyse du métabolome de
coraux scléractiniaires.
Fahoullia Mohamadi, Isabelle Bonard, Cédric Bertrand et Bernard Banaigs
Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l'Environnement - EA 4215
Centre de Phytopharmacie, 52 av. Paul Alduy
66860 Perpignan Cedex
Le blanchissement des coraux fait suite à un dérèglement symbiotique causé par des perturbations
environnementales. Il se produit alors une rupture de la symbiose corallienne [symbiodinium-polype]. Le
métabolome est la dernière étape des voies métaboliques, ainsi tous les dérèglements environnementaux
susceptibles d’entrainer des modifications physiologiques des coraux, sont observables à ce niveau. Le
métabolome est par conséquent caractéristique d’un état physiologique. Afin de mieux appréhender le
phénomène de blanchissement, une approche globale de l’étude du métabolome de l’holobionte a été
entreprise. Elle consiste à réaliser des empreintes métaboliques en caractérisant un maximum de
métabolites afin d’identifier les diverses voies métaboliques perturbées suite au blanchissement des coraux.
Pour ce faire, une méthode d’extraction bi-phasique du métabolome corallien a été développée, et des
empreintes chimiques des extraits polaires et apolaires sont réalisées sur trois systèmes : en RMN, en HPLC-
MS-DAD et en GC-MS. La méthodologie mise au point permet le suivi d’une large gamme de métabolites
polaires et apolaires.
- L’extraction est réalisée par un mélange de solvants composés d’eau, de méthanol et de dichlorométhane
(H 2 0/MeOH/DCM). Un partage liquide-liquide permet de séparer les molécules polaires des molécules
apolaires et moyennement polaires/apolaire. Ces deux extraits sont analysés respectivement sur une colonne
polaire (Hilic), et sur une colonne apolaire (C6-phenyl) en HPLC-MS-DAD.
- Une fraction de l’extrait apolaire est transméthylée puis dérivatisée avant une analyse en GCMS sur une
colonne moyennement polaire (SPB-50) permettant le partage simultané des acides gras et des stérols.
-Parallèlement, des empreintes chimiques des phases polaires et apolaires sont réalisées en RMN du proton,
dans du D 2 O et dans du CdCl 3 respectivement.
Cette approche métabolomique couvre ainsi une large gamme de métabolites. Son développement s’est
appuyé sur des métabolites cibles caractéristiques et spécifiques des coraux scléractiniaires. Les efforts ont
été concentrés sur les métabolites dits secondaires (molécules spécifiques d’une espèce ayant des rôles
écologiques important, et par conséquent susceptibles de varier en fonction des conditions
environnementales) ainsi que sur les lipides, plus précisément les stérols caractéristiques des clades des
zooxanthelles, et les acides gras aussi spécifiques d’une espèce. Les métabolites susceptibles de varier lors
du phénomène de blanchissement des coraux ont également été ciblés, tels que les mycosporines like
aminoacids (MAAs), des petites molécules polaires photoprotectices synthétisées par les zooxanthelles.
Les méthodes d’extractions et d’analyses ont été optimisées et validées sur deux espèces de coraux
scléractiniaires Pocillopora damicornis et Stylophora pistillata, nos modèles d’études. La méthodologie
développée permet ainsi l’analyse en série de nombreux échantillons, elle est fiable, reproductible et
sensible.
Références bibliographiques : Baker A.C. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 2008, Vol 80 : 435-471.
Hughes T. Science, 2003, Vol 301 : 929-933.
Braid.A.H. et al, Trends in Ecology and Evolution, 2008, Vol 24 :16-20.
Wu H. et al, Analytical Biochemistry, 2008, Vol 372 : 204-212.
Mots-clés : métabolomique, corail, blanchissement, empreintes chimiques, biomarqueurs, stress
33
O13
Application of both targeted and untargeted metabolomics approaches to assess
potential biological effects of simulated sonar signals on bottlenose dolphins.
Grégory Genta-Jouve 1, Dorian S. Houser
2, Angela E. Taylor
3, Wiebke Artl
3,
Mark R. Viant 1
1 Environmental Metabolomics Research Laboratory, School od Biosciences, University of Birmingham, Birmingham, UK
2 National Marine Mammal Foundation, San Diego, CA, USA
3 Centre for Endocrinology, Diabetes and Metabolism, School of Clinical and Experimental Medicine Institute of Biomedical
Research, Rm225, University of Birmingham, UK
.
The effects of underwater noise associated with naval activities have retained the attention of the
scientific community throughout the last decade. Multiple studies have reported the impact of such
sounds on marine mammals. In a search for a deeper mechanistic understanding of the effects of
underwater noise on marine mammals, and to explore potential biomarkers of the stress response,
we have employed a metabolomics approach to characterise the stress response of bottlenose
dolphins induced by simulated sonar signals.
Two approaches were used. A targeted approach focused on a single class of metabolites often
reported to be good indicators of stress in mammals. An untargeted approach investigated new
biomarkers of stress in dolphin serum. During the first part of the study, we developed a highly
sensitive UHPLC-QQQ method to quantify six steroids of interest (i.e. cortisone, cortisol,
corticosterone, 11-deoxycortisol, testosterone and progesterone). Each compound was identified
using both retention time and multiple reactions monitoring (MRM). The untargeted approach was
run on a UHPLC system coupled to a FT-ICR mass spectrometer in order to acquire very high
resolution mass spectra.
While the targeted approach did not yield significant results, the untargeted approach led to more
interesting findings. PLS-DA analysis of the different class of samples pre, test and post (i.e. before
the sound exposure, immediately following the sound exposure, and one week after the sound
exposure) yielded a robust model to discriminate dolphin samples before and after exposure to the
simulated sonar signal. Univariate statistical analyses of the data suggested that several tens of
compounds were involved in the stress response.
Identification of these biomarkers will improve our ability to identify and understand biologically
significant effects of sound exposure on marine organisms and especially marine mammals. This
should improve the effectiveness and efficiency of efforts to minimize the risks of anthropogenic
noise.
Mots-clés : bottlenose dolphins - simulated sonar signals - metabolomics - LC-FT-ICR
34
O14
Role de la régulation post-transcriptionnelle dans le contrôle du métabolisme
carboné
Olga Revelles 1,2,3,$
, Pierre Millard 1,2,3,$
, Jean-Philippe Nougayrède 4,5,6,7
, Ulrich Dobrindt 8 ,
Eric Oswald 4,5,6,7
, Fabien Létisse 1,2,3
, Jean-Charles Portais 1,2,3
.
$Premiers auteurs à contributions égales.
1 Université de Toulouse; INSA, UPS, INP, LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse,
2 INRA, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse,
3 CNRS, UMR5504, F-31400 Toulouse, France ;
4 INRA USC1360, 5 Inserm U1043,
6 CNRS UMR5282,
7 Université de Toulouse, UPS, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan (CPTP), F-31400 Toulouse, France,
8 Institute for Hygiene, University of Münster, 48149 Münster, Germany.
Le métabolisme est l’objet d’une intense régulation dont les composantes métaboliques et
transcriptionnelles sont largement étudiées. En revanche, le rôle de la régulation post-
transcriptionnelle dans le contrôle du métabolisme carboné a été très peu caractérisé. La
connaissance de ces mécanismes est pourtant essentielle pour relier l’expression du génome au
comportement métabolique final. Dans ce travail, nous avons analysé le rôle du principal système
de régulation post-transcriptionnelle chez la bactérie Escherichia coli, le système Csr (pour Carbon
Storage Regulator), dans la nutrition carbonée et le contrôle du métabolisme central de la bactérie.
Pour cela nous avons analysé les capacités de croissance de mutants affectés pour les différents
composants du système Csr (deux protéines CsrA 51 et CsrD, et deux petits ARN non codants
CsrB and CsrC) pour des sources de carbone représentatives de la principale niche écologique d’E.
coli (intestin). Puis nous avons analysé en détail l’impact de ces mutations sur le métabolome et le
fluxome de la bactérie. Nos résultats montrent que la protéine CsrA, qui est le constituant clé du
système Csr, est un déterminant important de l’’utilisation de ces sources de carbone
physiologiques. L’analyse fonctionnelle du métabolisme des mutants sur glucose et gluconate met
en évidence une réorganisation importante du métabolisme carboné central, indiquant un rôle
significatif du système Csr dans le contrôle du métabolisme carboné et énergétique (ATP et rédox).
De plus, la nature et l’importance de ces réorganisations dépendent de la source de carbone.
L’ensemble de ces résultats suggère un rôle significatif du système Csr dans l’adaptation
métabolique aux conditions de vie que rencontre E. coli dans l’intestin.
Mots-clés : métabolisme carboné, métabolome, fluxome, régulation post-transcriptionnelle
35
O15
Metabolomic study of the metabolites induction dynamics during fungal co-
culture
Samuel Bertrand 1, Antonio Azzollini
1, Olivier Schumpp
2, Nadine Bohni
1, Michel Monod
3,
Katia Gindro 2, Jean-Luc Wolfender
1.
1 School of Pharmaceutical Sciences, EPGL, University of Geneva, University of Lausanne, quai Ernest-
Ansermet 30, CH-1211 Geneva, Switzerland; 2 Mycology group, Agroscope Changins ACW, Route de Duillier, CH-1260 Nyon, Switzerland;
3 Departement of Dermatology and Venereology, Laboratory of Mycology, CHUV, CH-1011 Lausanne,
Switzerland
In their environments (such as soil, rhizospheres, plants, mucosal membranes and guts), fungi
are part of a microbial community where they constantly are in interaction. These interactions
activate silent genes that are not normally active under classical growth condition in laboratories.
These genes are particularly related to metabolite production such as pheromones, defence
molecules and metabolites of symbiotic associations [1]. This induction phenomenon was recently
illustrated to be a general consequence of fungal co-culture with a large panel of fungal interaction
tested [2, 3]. To explore in details the resulting fungal metabolome modifications, the design of the
experiment need to be devised to meet high analytical and biological reproducibility.
In order to tackle this issue a high throughput UHPLC-TOF-MS based metabolomic approach
has been developed for the screening of miniaturized 12-wellplates solid fungal co-cultures,
mimicking standard petri dishes growth conditions. The strategy provided reproducibility in
accordance to metabolomic standards [4]. It highlighted the induction of many metabolites. And the
time series used enabled to assess typical metabolites induction dynamic patterns during the
interaction between Aspergillus clavatus and Fusarium sp.
Acknowledgements: This work was supported by Swiss National Science Foundation Sinergia
Grant CRSII3_127187 (to J.-L. W., K. G. and M. M.)
Références bibliographiques : [1] K. Scherlach, C. Hertweck, Org. Biomol. Chem., 7 (2009) 1753-1760.
[2] S. Bertrand, O. Schumpp, N. Bohni, A. Bujard, A. Azzollini, M. Monod, K. Gindro, J.-L. Wolfender, J.
Chromatogr., A, (2013) DOI: 10.1016/j.chroma.2013.1001.1098.
[3] G. Glauser, K. Gindro, J. Fringeli, J.-P. De Joffrey, S. Rudaz, J.-L. Wolfender, J. Agric. Food Chem., 57
(2009) 1127-1134.
[4] E.J. Want, I.D. Wilson, H. Gika, G. Theodoridis, R.S. Plumb, J. Shockcor, E. Holmes, J.K. Nicholson,
Nat. Protoc., 5 (2010) 1005-1018.
Mots-clés : Aspergillus clavatus, Fungal Interactions, Fusarium, Solid Media Co-Culture, UHPLC-
TOF-MS Metabolomics
36
O16
Towards the development of metabolomics for marine micro-organisms
compounds discovery.
Yann Guitton
1,3 , Elodie Blanchet
1,2 , Marieke Vansteelandt
1 , Catherine Roullier
1,
Marie Geiger 1,3
, Ronan Le Bot 2 , Yves François Pouchus
1 and Olivier Grovel
1
1 Faculty of Pharmacy, University of Nantes, F-44035 Nantes, France;
2 ATLANTHERA, 1 rue Gaston Veil,
F - 44000 Nantes, France;
3 IFREMER, F-44311, Nantes, France
The significance of natural resources in the discovery of new bioactive compounds is still of
interest. The increasing research on microorganisms, especially from marine environments has
provided numerous structurally different secondary metabolites and original scaffolds, with relevant
activities for drug discovery. Metabolomics tools provide an efficient way of describing and
selecting interesting species but also help to target potential new drugs. In the course of our ongoing
research on bioactive fungal metabolites, a new species of the Penicillium genus was investigated,
as it led to the isolation of ligerin, a chlorinated sesquiterpene which exhibited a specific
antiproliferative activity against osteosarcoma cell lines and in vivo antitumor activity. Four marine-
derived strains of this species were then studied in order to describe their metabolome. While they
belong to the same new species, they exhibit clear morphotypic differences linked with the
biological activities of their culture extracts. Thorough investigations of their metabolic fingerprints
have been conducted by LC-HRMS/MS and the comparison of theses fingerprints was done
automatically using a combination of the well-known R packages XCMS & CAMERA and in-
house R scripts. The application of metabolomics to marine microorganisms studies needed the
development of an in-house workflow which enhances classical XCMS outputs. It allowed us to
point out new biomarkers differentiating two sub-types inside the investigated species and also to
identify some natural structural analogs of ligerin using an LC-MS/MS-based strategy: a
fragmentation modelization was established by thoroughly studying the fragmentation patterns of
both ligerin and purified or synthetized derivatives such as fumagillin, fumagillol and TNP470. The
use of this model allowed the detection and structural identification of several minor compounds
related to ligerin. This study shows the interest of LC-HRMS/MS analyses of the metabolome of
marine-derived fungi for the rapid identification and then the targeted purification of original
bioactive secondary metabolites in a chemical series.
Mots-clés : Metabolomic, Marine micro-organisms, natural products, secondary metabolites,LC-
HRMS/MS, R tools.
37
O17
Identification par spectrométrie de masse à haute résolution d’un nouveau
métabolite chez la bactérie du sol aérobie stricte Acinetobacter baylyi ADP1.
Lucille Stuani 123
, Christophe Lechaplais 123
, Ekaterina Darii 123
, Marcel Salanoubat 123
,
Alain Perret 123
1 CEA, DSV, IG, Genoscope, 2 rue Gaston Crémieux, Evry F-91057, France,
2 CNRS-UMR 8030, Evry F-91057, France
3 UEVE, Université d’Evry, Evry F-91057, France
Nous essayons de compléter l’inventaire des activités métaboliques chez la bactérie du sol
Acinetobacter baylyi ADP1 par différentes approches (génomique comparative, phénotypage de
croissance à haut débit, RNAseq…). Nous souhaitons notamment découvrir de nouvelles activités
enzymatiques par des approches métabolomiques.
Nous avons suivi l’adaptation du métabolisme de la bactérie à l’utilisation d’une source de
carbone alternative par spectrométrie de masse à haute résolution (LC LTQ/Orbitrap). L’étude
comparée des métabolomes de cellules se développant sur succinate (source de carbone de
référence) ou sur quinate (source alternative) a permis de mettre en évidence les différents
intermédiaires de cette voie catabolique bien caractérisée (au niveau génétique et biochimique).
Des études similaires effectuées sur des souches de Pseudomonas ont montré que les
principales variations de la composition en métabolites des cellules concernent surtout les
intermédiaires de dégradation des sources de carbone utilisées [1-2]. Cependant, chez ADP1, nous
n’avons pas observé de tel ‘core metabolome’ : dans notre étude, environ 40% des métabolites
détectés chez ADP1 présentent des abondances significativement différentes selon la source de
carbone. De plus, certains métabolites, non identifiés, sont présents uniquement sur quinate.
Nous nous sommes particulièrement intéressés à l’un de ces ions donnant un signal intense
dans les deux modes d’ionisation. L’interrogation des bases de données à partir de sa masse précise
n’a pas permis de proposer d’identité en accord avec la fragmentation observée.
Les fragmentations successives avec détection à haute résolution dans l’Orbitrap nous
permettent de penser que ce composé est très probablement une tyrosine modifiée contenant une
méthylamine en position beta. A notre connaissance, ce métabolite n’a encore jamais été décrit. La
démarche expérimentale conduisant à l’élucidation de cette structure et les mécanismes envisagés
seront abordés.
Ce travail confirme que la spectrométrie de masse à haute résolution peut être un outil de
choix pour l’élucidation de structure de nouveaux métabolites.
Références bibliographiques : [1] van der Werf MJ. et al. Mol. BioSyst., 2008, 4, 315
[2] Frimmersdorf E. et al. Environ. Microbiol., 2010,12, 1734
Mots-clés : métabolomique microbienne, LC-MS, élucidation structurale
38
O18
Understanding fatty acid synthesis in developing linseed embryos using
metabolic flux analysis
.
Sébastien ACKET 1, Mohamed KOUBAA
2, Albrecht ROSCHER
3, Brigitte THOMASSET
1
1 Université de Technologie de Compiègne, BP 20529, 60205 Compiègne Cedex, France
2 Department of Molecular Genetics, The Ohio State University, 1060 Carmack Rd, 053 Rightmire Hall,
43210 Columbus, OH, USA 3 Université de Picardie Jules Verne, 33 rue Saint Leu, 80039 Amiens Cedex, France
In oilseeds, lipids can be accumulated to relatively high levels, up to 50% of dry weight.
However, the mechanisms controlling oil storage are widely unknown and only few pathways were
revealed (e.g. in Brassica napus embryos [1]). This work specifically addresses major knowledge
gaps in biological mechanisms controlling oil accumulation in linseed ( Linum usitatissimum L.)
embryos. In order to understand fatty acid synthesis and oil accumulation in linseed embryos, 13
C
Metabolic Flux Analysis (13
C-MFA) was used as a tool to calculate carbon fluxes. Developing
linseed embryos aged 15 days after pollination were dissected under aseptic conditions and
incubated for 7 days in a medium containing [U- 13
C]glucose. After incubation, biomass and free
metabolites (free amino acids and organic acids) were extracted and the 13
C labeling was quantified
using GC-MS. The model of central metabolic pathways for developing linseed embryos was built
according to literature, and 13C-FLUX software [2] was used for quantifying the flux values. Our
results show first that, similarly to Brassica napus embryos [1], precursors for fatty acid synthesis
in linseed embryos are mainly generated from the plastid and the major precursors supporting fatty
acid synthesis are glucose 6-phosphate imported from the cytosol and pyruvate. Second, the malic
enzyme is not involved in the generation of plastidial acetyl-CoA unlike its contribution in cytosolic
acetyl-CoA in developing Brassica napus embryos [1]. Third, plastid envelope transporters between
the cytosol and the plastid rapidly exchange hexose phosphates and triose phosphates. All of these
results represent a key point in understanding fatty acid synthesis and oil accumulation in oilseed
plants.
Références bibliographiques : [1] J. Schwender, J.B. Ohlrogge, Y. Shachar-Hill, A flux model of glycolysis and the oxidative
pentosephosphate pathway in developing Brassica napus embryos, J. Biol. Chem. 278 (2003) 29442–
29453.
[2] W. Wiechert, 13C metabolic flux analysis, Metab. Eng. 3 (2001) 195–206.
Mots-clés : Metabolic Flux Analysis, developing flax embryos, lipids, fatty acids
39
O19
13
C-based metabolic flux analysis as a tool to unravel mechanisms involved in oil
accumulation in maize embryos
Mohamed Koubaa, Jean-Christophe Cocuron, Rebecca Kimmelfield, Ana Paula Alonso
The Ohio State University, Department of Molecular Genetics, Columbus, OH 43210, USA
To meet the growing demands of plant bioproducts for food, industrial applications and
biofuels, it is imperative to improve crop production. The aim of this study is to unravel the
mechanisms involved in biomass accumulation in maize ( Zea mays L.) embryos and gain insight
into the identification of possible targets for genetic modifications. It has been shown, by using the
powerful tool for metabolic engineering; 13
C-Metabolic Flux Analysis (13
C-MFA), that the
plastidic NADP-dependant malic enzyme is supplying 1/3 of the carbon and reductant for fatty acid
synthesis, in developing maize embryos accumulating 34% triacylglycerol (TAG; w/w) [1].
However, no study has been conducted to unravel the mechanisms of oil accumulation in high oil
storage maize lines. The present study consists of the development and comparison of carbon flux
maps between moderate oil (34% TAG, w/w) [1] and high oil (48% TAG, w/w) storage lines using 13
C-MFA. Our results, obtained for the high oil storage line, not only point out and confirm the key
role for plastidic NADP-dependant malic enzyme in supplying carbon and reductant for fatty acid
synthesis in developing maize embryos, but also demonstrate that the flux through this enzyme is
limited by its quantity. Those results are accompanied by enzyme activities performed in developed
maize embryos as well as a metabolomic comparison between the two studied lines demonstrating a
strong synergy between kinetic, metabolomic and fluxomic data.
Référence bibliographique : [1] A.P. Alonso, V.L. Dale, Y. Shachar-Hill, Understanding fatty acid synthesis in developing maize
embryos using metabolic flux analysis, Metab. Eng. 12 (2010) 488–497.
Mots-clés : Zea mays, Metabolic Flux Analysis, Metabolomics, Maize embryo, Fatty acid
synthesis, NADP-dependent malic enzyme
40
O20
Du raisin au vin de Champagne : Impact de la pourriture grise sur le
métabolome.
Young-Shick Hong 1, Jean-Marc Nuzillard
2, Agathe Martinez
2, Gérard Liger-Belair
1,3,
Philippe Jeandet 1, Norbert Hertkorn
4, Philippe Schmitt-Kopplin
4, Clara Cilindre
1,3
1 Laboratoire d’Oenologie et Chimie Appliquée, URVVC UPRES EA 4707, Université de Reims Champagne Ardenne,
BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France. 2 Institut de Chimie Moléculaire de Reims, Université de Reims Champagne-Ardenne, UMR CNRS 7312, Université de
Reims Champagne Ardenne, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France 3 Equipe Effervescence Champagne et Applications, GSMA UMR CNRS 7331, Université de Reims Champagne
Ardenne, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France. 4 Helmholtz-Zentrum Muenchen-German Research Center for Environmental Health, Institute for Ecological
Chemistry, Neuherberg, Allemagne.
En Champagne, l’un des principaux facteurs pouvant nuire à la qualité du raisin et du vin est la présence de
pourriture grise, conséquence de l’infection des raisins par le champignon Botrytis cinerea. En effet, les
conditions climatiques de cette région septentrionale sont souvent favorables au développement de B.
cinerea sur les baies, malgré l’application de traitements phytosanitaires. Cette contamination fongique a
pour effet de réduire le rendement de la récolte et a des répercussions négatives sur la qualité du vin. Elle
provoque notamment une forte altération des propriétés moussantes et du contenu en protéines des vins de
Champagne (Cilindre et al., 2007 et 2008). Afin de mieux comprendre la relation entre le degré d’infection
des raisins et la qualité des vins de Champagne, nous avons mené une recherche approfondie par RMN, sur
l’influence de l’infection des raisins par B. cinerea sur le profil métabolique du raisin et du vin. En effet, une
approche métabolomique par RMN permet notamment une meilleure compréhension globale sur la
physiologie de la vigne (Ali et al., 2009 et 2011) et sur les processus fermentaires du vin (Son et al., 2009).
Des échantillons de raisins, moûts et vins présentant différents degrés de pourriture grise ont été préparés.
L’ensemble des données obtenues ont ensuite été analysées par une étude statistique multivariée afin
d’évaluer l’influence de l’infection par B. cinerea sur le profil métabolique global.
Les résultats obtenus sur les raisins sains et botrytisés révèlent que deux voies métaboliques, l’une associée
aux mécanismes de défense de la plante et l’autre liée à la croissance du champignon sont simultanément
impliquées et provoquent des perturbations métaboliques dans les grappes de raisins botrytisées (Hong et al.,
2012).
Sur les vins élaborés à partir de raisins sains et botrytis, les métabolites les plus discriminants montrent
clairement que l’infection par B. cinerea conduit à un ralentissement de la fermentation alcoolique. En effet,
ces composés sont des produits de la fermentation. D’autre part, des teneurs élevées de plusieurs
oligosaccharides dans les vins botrytisés indiquent également une activité fermentaire des levures plus faible
(Hong et al., 2011).
Nos résultats mettent en évidence par une approche métabolomique globale l’incidence (au niveau
métabolique) d’une infection par B. cinerea sur les raisins et vins de Champagne.
Références bibliographiques : Cilindre C. et al. J.Proteome Res., 2008 , 7, 1199-1208.
Cilindre C. et al. Food Chem., 2007 , 103, 139-149.
Ali K. et al. J. Agric. Food Chem., 2009 , 57, 9599-9606.
Ali K. et al. Food Chem., 2011 , 124, 1760-1769.
Son H.S. et al. Anal. Chem., 2009 , 81, 1137-1145.
Hong Y.S et al. J. Agric. Food Chem. 2011 , 59, 7237-7245.
Hong Y.S et al. J. Exp. Bot., 2012 , 63, 5773-5785.
Mots-clés : Champagne, Botrytis cinerea, raisin, vin, métabolome, RMN
41
O21
Extension du profilage urinaire des stéroïdes par une approche stéroïdomique
pour le dépistage anti-dopage
J. Boccard 1, F. Badoud
2, S.S Ouertani
3,4, M. Hanafi
3,4, G. Mazerolles
5, N. Baume
2,
S. Rudaz 1, M. Saugy
2
1 School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva, University of Lausanne, Geneva, Switzerland
2 Swiss Laboratory for Doping Analyses, University Center of Legal Medicine, Lausanne, Switzerland
3 ONIRIS, Unité de Sensométrie et de Chimiométrie, Nantes, France
4 Université Nantes Angers Le Mans, France
5 INRA-UMR, 1083 SPO, INRA, Montpellier, France
Le profil stéroïdien est utilisé dans le cadre de la lutte anti-dopage pour déceler la prise
exogène de testostérone, ses précurseurs et ses métabolites, destinés à améliorer les performances
des athlètes. Cette approche qui repose sur le suivi de stéroïdes endogènes est toutefois limitée par
l’utilisation d’un nombre restreint de biomarqueurs. Un profil élargi pourrait donc permettre
d’améliorer la fenêtre de détection et d’augmenter la sensibilité des tests anti-dopage. Une méthode
analytique associant la chromatographie liquide à ultra haute pression (UHPLC) et la spectrométrie
de masse à temps de vol (TOF-MS) a été développée pour l’analyse des stéroïdes endogènes dans
l’urine. Cette méthode est appliquée aux échantillons issus d’une étude clinique visant à détecter les
modifications métaboliques engendrées par la prise orale de pilules de testostérone. Des
prélèvements d’urine sont effectués pour chacun des volontaires à différents temps après la prise.
L’ensemble de données obtenu présente donc une structure à trois entrées (volontaires x stéroïdes x
temps), dont il est nécessaire de tenir compte lors des traitements statistiques. L’analyse de données
proposée permet la construction de modèles décrivant la cinétique des modifications métaboliques
observées chez les volontaires et l’évaluation d’un profil élargi par rapport au profil stéroïdien
traditionnel pour le dépistage.
Les résultats obtenus illustrent l’apport des méthodes de modélisation multivoie pour
l’analyse de données issues d’études cliniques (structure à trois entrées) et l’évaluation d’une
fenêtre de détection. Cette approche stéroïdomique a permis la mise en évidence de nouveaux
biomarqueurs stéroïdiens associés à la prise orale de testostérone qui constituent des éléments
pertinents dans le cadre de la lutte anti-dopage et de l’établissement du passeport biologique de
l’athlète.
Références bibliographiques : [1] Baume N. et al. Effect of multiple oral doses of androgenic anabolic steroids on endurance performance
and serum indices of physical stress in healthy male subjects. Eur.J.Appl.Physiol. 98, 329-340, 2006.
[2] Andersson, C. A. et al. The N-way Toolbox for MATLAB. Chemometr.Intell.Lab. 52, 1-4, 2000.
[3] Boccard J. et al. A steroidomic approach for biomarkers discovery in doping control. Forensic Sci. Int.
213, 85–94, 2011.
Mots-clés : UHPLC-QTOF-MS, lutte anti-dopage, stéroïdomique, modélisation multivoie, biomarqueurs
42
O22 - Conférencier Invité
Plant Metabolomics: Challenges and Solutions 2013
Joachim Kopka
Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology (MPIMP), Applied Metabolome Analysis;
Department Prof. Dr. L. Willmitzer, Am Mühlenberg 1, Potsdam-Golm, 14476, Germany;
Phone + 49 (0) 331-567-8262; [email protected]
The “Challenges and Solutions” 2013 talk will give a personal view on the development of plant
metabolomics from 1998 until today.
The current challenges of plant metabolomics and metabolic phenotyping will be discussed with
specific reference to the metabolomic challenges that were expressed in 2003-2006.
The talk will try to highlight instances where metabolomic challenges meet with solutions.
43
O23
Improving the understanding of the stimulating effect of Agrobacterium
rhizogenes on the tropane alkaloid biosynthesis pathway in Datura innoxia Mill.
using metabolite correlation networks
Kieu Oanh Nguyen 1 , Arnaud Lanoue
2 , Eric Gontier
1 , Rebecca Dauwe
1
1 Université de Picardie Jules Verne, BIOPI, UFR des Sciences, Ilot des poulies, 33 rue Saint Leu, 80039
Amiens cedex, France 2 Université François-Rabelais Tours, Plant Biotechnology and Biomolecules, Faculté des Sciences
Pharmaceutiques, 31 Avenue Monge, 37200 Tours, France
Scopolamine and hyoscyamine are two medically important tropane alkaloids that are synthesized
in the roots of Datura innoxia Mill.. Although the biosynthesis pathway has amply been studied
using isotopic markers, major questions persist up to today, such as concerning the role of hygrine
as a precursor. On the other hand, it is well known that transformation of D. innoxia with
Agrobacterium rhizogenes induces a strong increase in the production of scopolamine and
hyoscyamine. It remains unknown, however, if just the mere fact of an increase in the amount of
young root cells is at the origin of this increased production, or if specific biosynthetic steps are
stimulated.
Here, we quantified a large number of precursors and derivatives of scopolamine and hyoscyamine
in the roots of a large number of transformed and untransformed Datura innoxia individuals. These
metabolites were quantified and structurally identified using a combination of GC-MS and UPLC-
MS. Correlation networks of the metabolites strongly suggested certain architectural aspects of the
hyoscyamine-scopolamine biosynthesis pathways and identified rate limiting steps. Biosynthetic
steps that were specifically up-regulated in the A. rhizogenes transformed individuals were clearly
revealed. Our results suggest thus that metabolite correlation networks form a promising tool for the
unraveling of different biosynthetic pathways.
Mots-clés : Metabolite, Datura innoxia Mill., Agrobacterium rhizogenes, biosynthesis
44
O24
PROFILAGE METABOLIQUE DU PATHOSYSTEME LACTUCA SATIVA
/BREMIA LACTUCEA APRES APPLICATION DE STIMULATEURS DE
DEFENSES DES PLANTES
1 Floriant Bellvert,
1 Jihane Hamzaoui,
1 Fabien Repiquet,
1 Guillaume Meiffren,
2 Jérôme
Guerrand, 3 Brigitte Maisonneuve,
4 Marie-Lisa Brachet,
1 Gilles Comte.
1 CESN, UMR 5557, CNRS Université Claude Bernard Lyon1, Villeurbanne F-69622 France
2 Vegenov, Penn Ar Prat, 29250 Saint Pol de Léon France
3 INRA, UR1052, Domaine Saint Maurice, CS 60094, 84143 Montfavet Cedex, France 4 CTIFL, Centre de Balandran, 751 Chemin de Balandran 30127 Bellegarde France
La réduction de l’utilisation des pesticides est une composante essentielle de pratiques agricoles
durables et doit être en conformité avec la compétitivité de notre agriculture. Parmi les alternatives
de protection des cultures, les Stimulateurs de Défenses des Plantes (SDP) mettant en jeu les
défenses naturelles des plantes représentent un champ d’investigation important (Fahri Y., 2011).
Dans ce contexte le projet DefiLeg a pour objectif de développer des SDP d’origine naturelle pour
les cultures légumière en s’appuyant notamment sur des approches de types métabolomiques pour
le suivi de l’activation des défenses des plantes afin de mieux appréhender le fonctionnement des
SDP.
Cette étude a pour objectif de caractériser qualitativement et quantitativement le contenu en
métabolites secondaires qui jouent un rôle important dans les mécanismes de défenses des plantes
(Dixon et al., 2002), du pathosystème Lactuca sativa cv sensai / Bremia lactucea en présence de
SDP. Pour cela, nous avons réalisé le profilage métabolique des extraits méthanoliques de feuilles
de laitue par UHPLC/DAD/QTOF.
La première phase expérimentale a été réalisée en condition in vitro avec 9 SDP et 5 temps de
prélèvements encadrant l’inoculation du pathogène. 180 composés présentant une signature
spectrale UV et MS ont été analysés dans les extraits methanoliques. La famille chimique la plus
représentée est celle des phénylpropanoïdes dont un grand nombre d’acides cinnamiques conjugués
comme l’acide cafeoylmalique ou l’acide chicorique. Aucune modification sur le contenu en
métabolites n’est observée lors de la seule application des SDP. Par contre, 4 jours après inoculation
du pathogène, un profil métabolique différentiel est observé entre la condition témoin et certains
SDP. Ces modifications sont corrélées à l’efficacité des SDP sur l’état phytosanitaire de la laitue.
Nous avons ensuite suivi le profil métabolique des feuilles de laitue traitées avec les 2 SDP
sélectionnés pour leur efficacité en condition in vitro dans (i) des expérimentations en plein champs
sur deux stations expérimentales et sur deux années (2011 et 2012) et (ii) une expérimentation de
criblage des ressources génétiques de la laitue.
Références bibliographiques : Fahri Yigit. Acibenzolar-S-methyl induces lettuce resistance against Xanthomonas campestris pv. vitians (2011).
African Journal of Biotechnology. 10(47) : 9606-9612.
Dixon R. et al. The phenylpropanoid pathway and plant defence—a genomics perspective (2002). Molecular Plant
Pathology 3 : 371-39.
Mots-clés : Profilage métabolique, Metabolisme secondaire, Eliciteurs,
45
O25
Phénotypage métabolique de pommes de terre génétiquement résistantes à
différents parasites majeurs
Chloé Volant 1,2
, Nathalie Marnet 3, Jean-Eric Chauvin
4, Aymeric Goyer
1,5
1 INRA, UMR 1349 IGEPP, F-35653 Le Rheu, France
2 Université d’Orléans, F-45067 Orléans, France
3 INRA, UR117, F-35653 Le Rheu, France
4 INRA, UMR 1349 IGEPP, F-29260 Ploudaniel, France
5 Oregon State University, Department of Botany and Plant Pathology, Hermiston, OR 97838
La pomme de terre est la 3ème
production alimentaire mondiale. Il existe sur cette culture plus
de 60 pathosystèmes qui peuvent avoir une incidence économique, actuellement la priorité de la
recherche va à la mise en place de moyens de lutte adaptés pour limiter le recours aux produits
phytosanitaires. Dans le contexte du plan Ecophyto 2018, la lutte génétique connait un regain
d’intérêt, en particulier pour ce qui est des parasites majeurs (Phytophthora infestans, Globodera
pallida, Pectobacterium sp., Potato Virus Y). Les gènes et QTL de résistance identifiés par notre
équipe chez des espèces sauvages apparentées à la pomme de terre ont été transférés par
croisements sexués récurrents dans l’espèce cultivée. Il est important de déterminer si la résistance
est corrélée à la présence de composés biochimiques dans les tubercules qui pourraient avoir un
impact (positif ou négatif) sur la qualité, la valeur nutritionnelle, les effets santé et/ou la sécurité
alimentaire du produit consommé. Dans ce but, nous avons entrepris le phénotypage métabolique de
47 variétés de pommes de terre. Le choix de ces variétés est basé sur les niveaux de résistance aux
quatre parasites mentionnés ci-dessus. Dans un premier temps, nous travaillons sur la mise au point
de deux méthodes de dosage par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
(MSn) et à un détecteur UV multi-longueurs d’ondes (UPLC-PDA, UPLC-PDA-MS) : une méthode
pour l’analyse et la quantification à la fois de différents composés phénoliques et des
glycoalcaloïdes majeurs de la pomme de terre; et une autre méthode pour l’analyse de plusieurs
vitamines hydrosolubles du groupe B. Ces méthodes ainsi que celles déjà mises en place sur la
plate-forme de métabolomique P2M2 sont ensuite utilisées dans la caractérisation des profils
métaboliques des variétés de pommes de terre, soit sur des tubercules, soit sur des produits
transformés. Les métabolites ciblés sont les suivants : composés phénoliques et glycoalcaloïdes,
acides aminés, sucres réducteurs, vitamines hydrosolubles (C, B1, B2, B3, B5, B6 et B9) et
acrylamide (pour les produits transformés). Ces familles de composés ont été choisies pour leur
importance dans des mécanismes de résistance aux maladies et/ou dans la qualité nutritionnelle. Des
analyses statistiques seront ensuite effectuées de façon à tenter de mettre en évidence des
corrélations significatives entre le niveau de résistance du matériel, son origine génétique et sa
teneur en certains composés.
Mots-clés : Solanum, phénotypage, métabolomique, marqueurs biochimiques
46
O26
Acclimatation du lin (Linum usitatissimum) au stress hydrique par la
réorganisation du métabolome induite par l’acide β-amino butyrique (BABA).
Anthony Quéro
1 , Ophélie Fliniaux
1 , Redouan Elboutachfaiti
1 , Xavier Guillot
2 , Corinne
Pau-Roblot 1 , François Mesnard
1 et Josiane Courtois
1 .
1 Laboratoire de BIOlogie des Plantes & Innovations UPJV, IUT / GB, Avenue des Facultés, Le Bailly, 80025 Amiens
Cedex, France. Email : [email protected] 2 Laboulet Semences, 1 rue Carnot, 80270 Airaines, France
Le lin (Linum usitatissimum) est traditionnellement cultivé dans les régions humides et tempérées (telle
que la Picardie) pour la qualité de ses fibres ou de ses graines riches en composés valorisables par leurs
activités pharmacologiques (acide α-linolénique, lignanes) [1]. Le lin est une culture respectueuse de
l’environnement qui nécessite peu de produits phytosanitaires et qui est peu exigeante en apport d’azote ou
de potasse. Malgré ces avantages, la production de cette plante est tombée en désuétude en France. Alors
qu’en 1850, le lin était cultivé sur plus d’un million d’hectares, aujourd’hui la surface allouée à la production
de cette linacée est limitée à quelques milliers d’hectares. Le lin est considéré comme pas assez rentable, trop
dure à récolter et trop peu productive (www.cetiom.fr).
Pour réhabiliter cette culture traditionnelle et dans un souci d’élargir la biodiversité en adéquation avec
la politique environnementale actuelle, un effort doit être fourni pour améliorer la compétitivité de cette
espèce. Cet effort doit s’effectuer par un gain au niveau de la productivité de cette culture en limitant
notamment les pertes de rendement attribuées au manque de disponibilité en eau dans le milieu extérieur.
Dans cette démarche d’amélioration de la tolérance au stress hydrique chez le lin oléagineux, les travaux
de cette étude ont fait intervenir un traitement par l’acide β-amino butyrique (BABA). Le BABA est un acide
aminé non protéinogène très peu représenté dans la nature dont l’efficacité à induire une amélioration de la
tolérance au stress hydrique a déjà été démontrée chez Arabidopsis thaliana [2], le pommier (Malus pumila)
[3] et le blé (Triticum aestivum) [4].
Les travaux conduits sur le lin oléagineux ont mis en évidence que les plantes préalablement traitées par
le BABA possèdent une teneur en eau plus importante en situation de stress hydrique que les plantes non
traitées. Cette amélioration de la tolérance s’accompagne par une légère diminution du potentiel osmotique
(PO) des feuilles. Cette déviation du PO n’est pas due à une accumulation nette de solutés mais est attribuée
à une modification du statut hydrique. Les résultats ont également souligné une forte réorganisation du
métabolome qui se traduit par une accumulation de solutés organiques et une diminution de la teneur en
solutés minéraux. La comparaison de la réponse métabolomique obtenue en condition de choc osmotique ou
après un traitement BABA a aussi permis d’établir qu’un chevauchement important existe entre ces deux
réponses.
L’ensemble de ces résultats montre que le BABA induit un stress hydrique léger chez le lin et suggère
que le BABA conduit à une acclimatation de la plante qui se traduit par une réorganisation du métabolome et
par une diminution du potentiel osmotique. Ces travaux offrent un regard nouveau sur les raisons
explicatives de l’amélioration de la tolérance au stress hydrique induite par le BABA chez les végétaux.
Références bibliographiques : [1] Touré A et Xueming X, CRFSFS, 2010, vol.9, pp. 261-269
[2] Jakab et al. , Plant Physiol, 2005, vol.139, pp. 267-274
[3] Macarisin et al., Plant Cell Environ, 2009, vol.32, pp. 1612-1631
[4] Du et al., J Exp Bot, 2012, vol. 63, pp. 4849-4860
Mots-clés : Linum usitatissimum, stress hydrique, BABA, metabolome, GC-MS
47
O27
Liquid chromatography-mass spectrometry based analysis of the cerebrospinal
fluid metabolome for the study of inborn errors of metabolism.
Amador M 1 , Lamari F
1,5 , Colsch B
2 , Mochel F
1,3 , Seguin F
4 , Sedel F
1 , Junot C
2
1 Neurometabolic Unit, Pitié-Salpêtrière Hospital, AP-HP & University Pierre and Marie Curie,
Paris, France. 2 CEA/DSV/iBiTec-S/SPI, Bâtiment 136, CEA/Saclay, 91191 Gif-sur-Yvette cedex,
France. 3 INSERM UMR S975, Brain and Spine Institute and Department of Genetics.
4 INSERM
U1082, University of Poitiers, Hôpital La Milêtrie, Poitiers, France. 5 Department of Metabolic
Biochemistry- Pitié-Salpêtrière Hospital, AP-HP
Introduction Many complex neurological disorders remain of unknown etiology despite extensive biochemical
and genetic work-up. These “unexplained encephalopathies” may be caused by inborn errors of
metabolism (IEM). Diagnosis of IEMs can usually be accomplished by the biochemical analysis of
biofluids (blood and urine in most cases) to highlight the consequences of an enzymatic or a
transport protein defect. However, biochemical analyses available at clinical chemistry laboratories
are restricted to well-known metabolites, and many metabolic pathways remain unexplored. By
enabling the concomitant detection of a wide range of metabolites in biological fluids in a single
analysis, metabolomics appears to be a relevant tool for the diagnosis of IEMs[1-3]. Regarding
disorders with predominant nervous system dysfunction, the cerebrospinal fluid (CSF) is the body
fluid more likely to be altered because of its proximity with neuronal and glial cells. In the present
pilot study, we aimed at evaluating liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS)-
based CSF metabolomics for the study and characterization of IEMs involving the nervous system.
Material and methods Patients. For this study, 79 CSF samples were selected from a biobank collected from adult patients
seen in the neurometabolic unit of the Pitié-Salpêtrière Hospital. CSF sample collection was
realized after written informed consent, in accordance with french ethical rules. Selected CSF
samples were classified into 4 categories: (i) 7 Negative controls without progressive neurological
disease, (ii) 12 patients with well-defined neurometabolic disorders, (iii) 60 patients having
unexplained encephalopathies, and (iv) 15 patients with various neurodegenerative diseases.
LC/MS based metabolomics. Hundred µl of CSF samples were deproteinized in microcentrifuge
tubes by adding 300 µl of methanol. Samples were vortexed and centrifugated. Supernatants were
evaporated to dryness under nitrogen and resuspended in 100 µl of water containing 0.1% of formic
acid. Five µl of a solution of internal standards were added to all samples. In addition, a quality
control CSF sample was injected every 10 samples in order to evaluate the analytical error at the
level of each metabolite. Samples were analyzed by ultra performance liquid chromatography
coupled to an ESI-LTQ-Orbitrap operated in positive and negative modes. Data processing and
treatment were performed as previously described [4].
Results The developed LC/MS and processing methods led to the identification of 104 metabolites in the
CSF. Statistical analyses indicated that physiological factors such as gender and age have no impact
on CSF metabotypes in the context of our study. CSF analysis revealed a specific abnormal
fingerprint in 4 out of 12 patients with confirmed metabolic diseases, emphasizing that the
48
possibility to measure metabolites not previously analyzed may be of help to depict underlying
pathophysiological mechanisms. For the others 8 patients, LC/MS analysis of the CSF was normal.
This can be explained by incomplete coverage of the whole metabolome. Furthermore, 22 of the 60
patients with unexplained encephalopathies presented at least one or more metabolites in an
abnormally high concentration. Among these 22 patients, our LC/MS study enabled the grouping of
3 patients, given the high number of common abnormalities detected in their fingerprints.
Interestingly, two of these patients have already been grouped from a previous NMR study in which
a significant elevation of free sialic acid was detected exclusively in their CSF [5].
In conclusion, The CSF profile of abnormal metabolites might provide new insights into the
pathogenic mechanisms of known diseases. In patients with unexplained encephalopathies, the
precise delineation of individual biochemical phenotypes makes LC/MS based metabolomics of
CSF a promising complementary tool to high throughput genetic approaches.
Références bibliographiques : [1] B.A.Binzak, R.A.Wevers, S.H.Moolenaar, Y.M.Lee, W.L.Hwu, J.Poggi-Bach, U.F.Engelke, H.M.Hoard,
J.G.Vockley and J.Vockley, Am J Hum. Genet., 68 (2001) 839.
[2] M.Oostendorp, U.F.Engelke, M.A.Willemsen and R.A.Wevers, Clin. Chem, 52 (2006) 1395.
[3] S.H.Moolenaar, G.Gohlich-Ratmann, U.F.Engelke, M.Spraul, E.Humpfer, P.Dvortsak, T.Voit, G.F.Hoffmann,
C.Brautigam, A.B.van Kuilenburg, G.A.van, P.Vreken and R.A.Wevers, Magn Reson. Med, 46 (2001) 1014.
[4] D.Darghouth, B.Koehl, G.Madalinski, J.F.Heilier, P.Bovee, Y.Xu, M.F.Olivier, P.Bartolucci, M.Benkerrou,
S.Pissard, Y.Colin, F.Galacteros, G.Bosman, C.Junot and P.H.Romeo, Blood, 117 (2011) e57-e66.
[5] F.Mochel, F.Sedel, A.Vanderver, U.F.Engelke, J.Barritault, B.Z.Yang, B.Kulkarni, D.R.Adams, F.Clot,
J.H.Ding, C.R.Kaneski, F.W.Verheijen, B.W.Smits, F.Seguin, A.Brice, M.T.Vanier, M.Huizing, R.Schiffmann, A.Durr
and R.A.Wevers, Brain, 132 (2009) 801.
Mots-clés : Chromatographie liquide, spectrométrie de masse, haute résolution, liquide céphalorachidien,
biomarqueurs, erreurs innées du métabolisme
49
O28
Untargeted metabolomics approach for the analysis of cerebrospinal fluid (CSF)
in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients using LC-HRMS method
Hélène Blasco 1,2,3
, Philippe Corcia1,2,7
, Pierre-François Pradat5, Cinzia Bocca
2,4, Charlotte
Veyrat-Durebex1,2,3
, Sylvie Mavel1,2
, Lydie Nadal-Desbarats1,2,3,4
, Caroline Moreau6, David
Devos6, Christian R Andres
1,2,3, Patrick Emond
1,2,3,4
1- Inserm U930, CNRS 2448, Tours, France
2- Université François-Rabelais, Tours, France
3-CHRU de Tours, Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Tours, France
4- PPF, Université François-Rabelais, Tours, France
5-APHP, Fédération des Maladies du Système Nerveux, Centre Référent Maladie Rare SLA, Hôpital de la Pitié-
Salpêtrière, Paris, France
6-CHRU de Lille, Service de Neurologie, Lille, France
7- Centre SLA, Service de Neurologie, CHRU Tours, France
Background
Diagnosis of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) remains currently clinical owing to
identification of few biological markers. This mainly explains the delay of 9-12 months between
first symptoms and diagnosis (1). Metabolomics is a promising approach providing metabolic
profile of biological fluids. This method has been rarely used to explore neurological diseases (2,3,4
).
Among the high-throughput analytical platforms used in metabolomics, liquid chromatography
coupled to high-resolution mass spectrometry (LC-HRMS) appears the most powerful to obtain a
high sensitivity and mass accuracy (5). However it has never been used to perform metabolomics on
cerebrospinal fluid (CSF) in ALS.
Objectives
To devise a reliable methodology to compare CSF of ALS and non ALS patients using untargeted
metabolomics by LC-HRMS in order to (i) ascertain a metabolic signature of ALS patients and (ii)
identify metabolites for a potential use as diagnostic biomarkers or for pathogenesis understanding.
Methods
CSF samples were collected from ALS patients at the time of diagnosis and from controls. We
developed a method to analyze CSF components by UPLC coupled with a Q-Exactive Mass
Spectrometer using an electrospray ionization. We performed multivariate data analysis (OPLS-
DA) using R 2 and Q
2 values as representative of the model quality. We focused on discriminating
metabolites involved in our models and relevant compounds previously identified by other
metabolomics studies using univariate statistical analysis.
Results
66 CSF samples from ALS patients and 128 from patients with other neurological diseases were
analyzed. CSF metabolome analysis by LC-HRMS of ALS patients could predict a correct status in
more than 80% of cases. Among the features highlighted in these OPLS-DA models, 5 were found
highly differently expressed between both groups (p<0.004). These relevant compounds are
characterized by MS 2 and are currently under identification.
Conclusions: We developed a robust procedure to analyse a large cohort of CSF samples using LC-
HRMS method. Accordingly, a specific metabolic CSF profile has been highlighted in ALS
patients, suggesting the great interest to use these emerging technologies in diagnosis.
50
Références bibliographiques : 1- Rocchetti, I.; Taruscio, D.; Pierannunzio, D., Modeling delay to diagnosis for Amiotrophic lateral sclerosis: under
reporting and incidence estimates. BMC Neurol 2012, 12, (1), 160.
2-Quinones, M. P.; Kaddurah-Daouk, R., Metabolomics tools for identifying biomarkers for neuropsychiatric diseases.
Neurobiol Dis 2009, 35, (2), 165-76.
3-Blasco, H.; Corcia, P.; Moreau, C.; Veau, S.; Fournier, C.; Vourc'h, P.; Emond, P.; Gordon, P.; Pradat, P. F.; Praline,
J.; Devos, D.; Nadal-Desbarats, L.; Andres, C. R., 1H-NMR-based metabolomic profiling of CSF in early
amyotrophic lateral sclerosis. PLoS One 2010, 5, (10), e13223.
4-Wuolikainen, A.; Moritz, T.; Marklund, S. L.; Antti, H.; Andersen, P. M., Disease-related changes in the
cerebrospinal fluid metabolome in amyotrophic lateral sclerosis detected by GC/TOFMS. PLoS One 2011, 6, (4),
e17947.
5-Wang, X.; Sun, H.; Zhang, A.; Wang, P.; Han, Y., Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass
spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. J Sep Sci 2011, 34, (24), 3451-9.
Mots-clés : amyotrophic lateral sclerosis, cerebrospinal fluid, biomarkers, LC-HRMS, metabolomics
51
O29
Pharmaco-metabonomic investigation of acetaminophen toxicity on rat primary
hepatocytes in microfluidic biochips.
.
Claire Lopez 1 , Mathilde Bayet-Robert
1 , Marc-Emmanuel Dumas
2 , Jean-Matthieu Prot
3 ,
Alexandre Péry 4 , Céline Brochot
4 , Eric Leclerc
3 , and Bénédicte Elena-Herrmann
1
1 Université de Lyon, Centre de RMN à Très Hauts Champs, CNRS/ENS Lyon/ UCB Lyon 1, 5 rue de la
Doua, 69100 Villeurbanne, France. 2 Biomolecular Medicine, Department of Surgery and Cancer, Faculty of Medicine, Imperial College
London, Sir Alexander Fleming Building, London SW7 2AZ, United Kingdom. 3 Université de Technologie de Compiègne (UTC), Laboratoire de biomécanique et bioingénierie, CNRS
UMR 7338, BP 20529, rue Personne de Roberval, 60205 Compiègne Cedex, France. 4 Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques (INERIS), Parc Technologique Alata, BP2,
60550 Verneuil en Halatte, France.
Microfluidic bioartificial organs enable the spatial and temporal control of cell growth and
biochemistry as well as the combination of organ-specific metabolic functions in endogenous and
xenobiotic metabolism 1. These properties are particularly relevant to testing the metabolic dose-
response and building extrapolation models in both pharmaceutical and environmental toxicity
screening. Thus, various microfluidic bioartificial organs have been proposed to reproduce human
organs.
Here we present a microfluidic bioartificial organ system combined with 1 H NMR-based
metabolomic study to characterize an analgesic drug (N acetyl-para-aminophenol or APAP)
toxicity. The objective of this systematic approach, based on innovative in vitro and in vivo
methodologies to predict toxicity of substances, is to characterize culture media for biochip
systems. This work is the continuity of a previous investigation carried out previously on hepatoma
cell line 2 . APAP is a model molecule to validate in vitro biochips systems in toxicology
approaches. We analyze using 1 H high-field NMR (800 MHz) the metabolomic profiles of rat
primary hepatocytes cultivated inside microfluidic systems (perfused dynamic system) with or
without acetaminophen. Differences between controls and samples exposed to APAP were observed
using supervised analysis. Acetaminophen met abolites such as its glucuronide conjuguate are
identified on the corresponding metabolic fingerprint, as well as a range of amino-acids. A better
differentiation between control and APAP is shown for long perfusion times (>24h). Results
obtained on rat primary hepatocytes are also compared with in vivo study on rat biofluids.
Références bibliographiques : 1. Baudoin R, Griscom L, Monge M, Legallais C, Leclerc, E. Biotechnol. Prog. 23, 1245 (2007).
2. Prot JM, Andrei Bunescu A, Elena-Herrmann B, Aninat C, Snouber LC, Griscom L, Razan F,
Bois FY, Legallais C, Brochot C, Corlu A, Dumas ME, Leclerc E, Toxicology and Applied
Pharmacology 259, 270 (2012).
Mots-clés : metabonomic, biochips, acetaminophen, toxicity, primary hepatocytes
52
O30
Characterization and localization of d18:2 sphingadienine based sulfatides in rat
cerebellum using 2D offline LC-HRMS and MALDI imaging in lipidomics.
Samia Boudah 1 ; Benoit Colsch
1 ; Christophe Junot
1 ; Amina S. Woods
2 .
1. Laboratoire d’Etude du Métabolisme des Médicaments-SPI-IbiTec-S-CEA- France.
2. Structural Biology Unit, Cellular Neurobiology Section, NIDA IRP, NIH, Baltimore, MD, USA
Introduction: Sulfatides are a subclass of sphingolipids involved in several biological processes such as signal
transduction and cell recognition. In mammalian brain, sulfatides are present in cerebellar and
cerebral white matter areas. They are implicated in several neurological diseases such as
metachromatic leukodystrophy, or Alzheimer’s disease. Sphingosine (d18:1) represents the most
abundant sphingoïd base, as compared to sphingadienine (d18:2). Due to the high structural
diversity of sulfatide species, high resolution mass spectrometry is a powerful tool to detect low
abundance species. In this study, we have developed a 2D offline method based on a pre-separation
of sulfatide species before LC-HRMS analysis to characterize numerous sulfatide species. MALDI
imaging was used in parallel to localize these species in rat cerebellum.
Methods: For the imaging, a MALDI-LTQ mass spectrometer was used, while LC-HRMS was conducted on
an ESI-Orbitrap mass spectrometer. Brain tissue was obtained from male Sprague-Dawley rats and
was cut into thin sections (18 mm thickness) using a cryostat. Brain sections were collected onto a
MALDI sample target and the matrix of saturated 2, 6-dihydroxyacetphenone / 125 mM ammonium
sulfate and 0.5% HFBA were sprayed on the tissue section with an airbrush. Brain lipid extracts
were obtained using a Folch modified partition from adjacent rat tissue sections (± 2-3mg). The
lower phase containing sulfatide species underwent further separation using LCNH2 columns. The
resulting fractions were dried and dissolved in methanol prior to LC-HRMS or shotgun analysis.
Preliminary data: In this study, a lipidomic analysis of cerebellum tissue section extracts was conducted. The sulfatide
fraction were isolated from LC-NH2 column and analyzed by direct infusion and LC/HRMS then
compared to the total lipid extract (TLE). More than 30 sulfatide isoforms were identified according
to their exact mass, retention time and MS n
experiments. We demonstrated structural differences
not only on the fatty acid chain according to their length, presence of double bounds and
hydroxylations, but also on the sphingoïd base moiety. We have identified and characterized
different sphingoïd bases in rat cerebellum including sphingosine (d18:1) and sphingadienine
(d18:2). Direct infusion of LC-NH2 sulfatide fraction was more effective compared to TLE’s as
sulfatide species identification was not hampered by the presence of other isobaric species and ion
suppression. As an example, during shotgun experiments of TLE, the presence of the 13C isotope of
glycerophosphatidylinositol (GPI 38a:4) ( m/z 886.5527) makes the characterization of sulfatide (Su
d18:2/C24:1) ( m/z 886.6078) species difficult. Moreover, reverse phase chromatography coupled
with a high resolution instrument (RPLC-HRMS) brought an additional separation dimension in
support of the high mass accuracy. Using RPLC-HRMS methodology, low level sulfatide species
containing sphingadienine and sphinganine which are often undetected and/or uncharacterized by
MS n experiments were clearly separated and identified. Finally, MALDI imaging of all these
species was performed in rat cerebellum and show specific localization according to the nature of
53
the sphingoïd bases and the presence of hydroxylations in fatty acid chains. In addition, sulfatides
containing sphingadienine were mapped for the first time in mammalian brain and compared to the
major sulfatide species containing sphingosine. If the biosynthesis mechanisms of ceramides
containing sphingadienine remain unclear, the presence of this low level sphingoïd base already
shown to be present in ceramide, galactosylceramide and sulfatide species will lead to future
research on their cellular functions.
Mots-clés : Lipidomics, structural characterization, brain, imaging mass spectrometry, 2D offline
LC-MS
54
O31
Variations spectrales et IRM devant une masse cérébrale nécrotique
B Loiseau1, S Collet
1, JS Guillamo
1, F Kauffmann
1, C Sarrazin
2, F Mesnard
2, S Bouchoux
2, R
Benchimol2, S Valable
1, H. Vasseur
2, M Gaffez
2, M Kamsu
1, C Levy
1, E Emery
1, A Fichten
2,
M Lefranc2, J Peltier
2, A Coutte
2, R Verdon
1, E Lechapt-Zalcman
1, M Bauvois
2,
P Courtheoux1, H Deramond
2, D Legars
2, JM Constans
1,2
(1) CAEN - FRANCE, (2) AMIENS (CHU et BioFLOWIMAGE) - FRANCE
Objectifs Déterminer si les paramètres IRM et Spectroscopie par Résonance Magnétique (SRM) de 40
patients avec une masse cérébrale nécrotique (avec rehaussement périphérique après injection de
produit de contraste (gadolinium)) et non encore traitée permettent de discriminer les abcès, des
métastases et des tumeurs cérébrales gliales de haut grade glioblastomes (GBM).
Matériels et méthodes 40 patients tous biopsiés : 12 avec abcès, 11 avec métastases et 15 avec GBM furent étudiés avec
des séquences d’imagerie IRM (Sagittal T1, axial T2, FLAIR, T2*, diffusion, perfusion et 3D T1
après gadolinium) et de la SRM : 1H, simple volume PRESS (multiple TE à 1.5T et 3T (GEMS)).
Pour quelques cas le liquide de nécrose, le matériel biopsique ou le liquide cérébrospinal (LCS) a
été ou sera analysé in vitro par RMN in vitro, HRMAS ou CPMAS. Traitements des données
spectrales (par SRM): logiciels SA/GE (du constructeur GE), JMRUI et SCI-MRS-Lab (développé
au LMNO et CHU de Caen) calculant amplitudes, aires, ratios (Cho/Cr, CH2/Cr (de phospholipides
de nécrose) et NAA/Cr) et concentrations de métabolites. Analyse statistique des données
spectroscopiques et des données de diffusion et de perfusion et d’IRM standard par analyse en
composante principale et analyse discriminante.
Résultats Le coefficient apparent de diffusion (ADC) et les profils spectroscopiques aident à différencier dans
tous les cas les abcès des autres tumeurs nécrotiques. Les ratios Cho/Cr et CH2/Cr aident à
différencier les métastases des GBM : seuls 2 GBM sont mal classés.
Conclusion L’IRM, la diffusion, la SRM et la perfusion permettent très souvent (38/40) une classification non-
invasive des masses cérébrales nécrotiques.
Références bibliographiques : Patel TR, McHugh BJ, Bi WL, Minja FJ, Knisely JP, Chiang VL. Am J Neuroradiol. 32:1885-1892.
Chang SC, Lai PH, Chen WL, Weng HH, Ho JT, Wang JS, Chang CY, Pan HB, Yang CF, 2002. Clinical Imaging 26,
227–236.
Dorenbeck U, Butz B, Schlaier J, Bretschneider T, Schuierer G, Feuerbach S, 2003. Journal of Neuroimaging 13, 330–
338
Pal D, Bhattacharyya A, Husain M, Prasad KN, Pandey CM, Gupta RK. AJNR Am J Neuroradiol. 2010 31:360-6.
Arvinda HR, Kesavadas C, Sarma PS, Thomas B, Radhakrishnan VV, Gupta AK, Kapilamoorthy TR, Nair S, 2009. J
Neurooncol 94, 87–96.
Catalaa I, Henry R, Dillon WP, Graves EE, McKnight TR, Lu Y, Vigneron DB, Nelson SJ. 2006.NMR in Biomedicine
19, 463–475.
Bulik M, Jancalek R, Vanicek J, Skoch A, Mechl M, 2013. Clinical Neurology and Neurosurgery 115, 146–153.
Chaichana KL, Kosztowski T, Niranjan A, Olivi A, Weingart JD, Laterra J, Brem H, Quinones-Hinojosa A, 2010. J.
Neurosurg. 113, 286–292.
55
de Certaines JD, Le Moyec L, Seguin F, Eliat A, Constans JM. Current Organic Chemistry 2007 11:529-46
Fliniaux O et al. J Biomol NMR (2011, 51 : 457-465)
Dou W, Dong A, Chi P, Li S, Constans JM. IEEE Engineering in Medicine & Biology Society 2011 May:1-4
Constans JM, Collet S, Guillamo JS, Hossu G, Lacombe S, Gauduel Y, Houée Levin C, Dou W, Ruan S, Barré L,
Rioult F, Derlon JM, Lechapt-Zalcmann E, Valable S, Chapon F, Courtheoux P, Fong V, Kauffmann F. Journal of
Physics : Conference Series (JPCS) 2011;26:1-17
Mots-clés : IRM, diffusion, SRM, perfusion, masses cérébrales nécrotiques
56
O32
Existe-t’-il un profil métabolique associé à la sensation de faim ?
Mohamed N Triba1, Laurence Le Moyec
1, Elodie Etienne
1, Claire Gaudichon
2, Nadezda
Khodorova2, Daniel Tomé
2, Alain Paris
3.
1: METEVBO : UMR 7244-Université Paris 13-Sorbonne Paris-Cité et U902 Université d’Evry Val d’Essonne.
2:UMR 914, AgroParisTech.
3:U1012 Mét@risk, INRA, AgroParisTech.
A ce jour il n’existe pas de marqueur fiable de la satiété, qu’il soit métabolique ou hormonal. Pourtant, un tel
marqueur serait un outil primordial pour les nutritionnistes. Il permettrait d’optimiser les régimes
alimentaires en contrôlant la sensation de faim. Le but de notre étude est de déterminer 1) s’il existe un profil
métabolomique dépendant du délai qui existe entre la dernière prise alimentaire et le moment où la sensation
de faim est ressentie et 2) si ce profil est fonction de la composition qualitative du dernier repas.
Matériel et Méthodes
Nous avons analysé les plasmas de 7 sujets volontaires participant à une étude d’intervention nutritionnelle
Pour chaque sujet, l’étude durait 2 jours. Durant ces deux jours, ils consommaient soit un encas à base d’œuf,
soit un encas à base de fromage blanc. L’attribution du type d’encas consommé le premier jour était
déterminée par tirage au sort. Les deux encas étaient de même valeur énergétique et de même composition en
termes de macronutriments. Des prélèvements sanguins ont été effectués au moment de l’administration de
l’encas (P0) puis régulièrement (toutes les 20 à 30 min) jusqu’à la demande d’un repas (DR). Pour
l’ensemble des sujets le nombre de prélèvements entre P0 et DR variait de 3 à 8. Les prélèvements analysés
par RMN pour tous les sujets étaient les prélèvements P0 et DR ainsi que les seuls prélèvements
intermédiaires effectués 40 minutes après P0 et une heure avant DR. Avant l’analyse RMN, chaque
prélèvement (100 µl) a été dilué par 400 µl de PBS/D2O puis soumis à une expérience à 500 MHz de type
CPMG avec suppression du signal de H2O. L’analyse statistique multivariée (PCA et OPLS) a été effectuée à
l’aide d’un script écrit en langage Matlab.
Résultats.
Un premier modèle OPLS prenant en compte les deux types d’encas a été construit pour discriminer les
prélèvements P0 et DR. Les acides aminés branchés sont les métabolites les plus discriminants de ce premier
modèle. Un autre modèle prenant en compte uniquement les encas à base d’œuf met en évidence des
variations des lipides tandis qu’en prenant en compte uniquement les encas à base de fromage blanc l’OPLS
réalisée entre P0 et DR indique des variations des teneurs en acides aminés mais pas celles en lipides.
A chaque prélèvement, nous avons associé un indice I=T/T DR compris entre 0 (pour P0) et 1 (pour DR) et
exprimant de manière relative le moment du prélèvement (T) par rapport à la durée de la satiété (T DR ). La
projection des prélèvements intermédiaires sur le modèle OPLS discriminant P0 et DR indique une très forte
corrélation entre l’indice I et la variable prédictive du modèle.
L’utilisation des méthodes exploitant l’appariement des échantillons issus d’un même individu accroît de
façon significative les performances des différents modèles.
Conclusions.
Cette étude démontre la possibilité de déterminer par RMN un métabotype caractérisant la sensation de faim
et que ce dernier peut être spécifique du type d’encas. En fonction du temps relatif de la satiété (indice I), le
métabotype évolue d’un état métabolique correspondant à P0 vers un état correspondant à DR. Ce
métabotype pourrait être un outil potentiellement prédictif de l’état d’évolution de la satiété.
Mots-clés : Métabolomique, RMN, Nutrition
57
O33
Metabolomics reveals differentiated metabolic adjustments of normal and
overweight Subjects submitted to overfeeding.
B. Comte 1,2
, B. Morio 1,2
, JF. Martin 1,2,3
, A. Paris 4 , C. Junot
5 , Bernard Lyan
1,2,3 , Yves
Boirie 1,2
H. Vidal 6,7
, M. Laville 6,7
, E. Pujos-Guillot 1,2,3
, J.L. Sébédio 1,2
.
(1)-INRA, UMR 1019, UNH, CRNH Auvergne, F-63000 Clermont-Ferrand, France; (2)-Clermont Université,
Université d'Auvergne, Unité de Nutrition Humaine, BP 10448, F-63000 Clermont-Ferrand, France; (3)-INRA, UMR
1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, UNH, F-63000 Clermont-Ferrand, France; (4)- INRA Met@risk,
AgroParisTech, F-75231 Paris cedex 05; (5)- CEA-LEMM, F-91191 Gif sur Yvette cedex; (6)- Institut National de la
Santé et de la Recherche Médicale Unit 1060, CarMeN Laboratory and Centre Européen Nutrition Santé, Lyon 1
University, F-69600 Oullins, France; (7)-Centre de Recherche en Nutrition Humaine (CRNH) Rhône-Alpes, Centre
Hospitalier Lyon-Sud, F-69310 Pierre Bénite, France.
Shifts in dietary pattern, food composition and processing as well as a modification in physical activity
are linked to nutritional transitions have led to an energy imbalance with an increasing prevalence of
overweight and obesity. Obesity is associated with increased risk of metabolic syndrome which is a complex
disease involving dysregulation of several metabolic pathways. The purpose of the present work was to
compare metabolic trajectories followed by free living non-obese overweight and lean subjects during a
moderate weight gain induced by a lipid-enriched supplementation of the diet. Metabolomics allowed us
determining early changes in metabolic signatures with indicators of metabolic alterations.
Thirty eight male adult subjects, 19 normal weight (BMI: 20-24.9 kg.m 2 ; NW) and 19 overweight
(BMI: 25-29.9 kg.m 2 ; OW) were recruited and submitted for 56 days to an overfeeding protocol consisting
in adding an excess of 3,300 kJ/d to their usual diet. Conventional anthropometric and metabolic parameters
were measured over time. Plasma and urine samples were collected at different time points for an untargeted
metabolomic approach. Deproteinized plasma and diluted urine samples were analyzed using UPLC-QToF-
Micro mass spectrometer. Univariate (ANOVA) and multivariate (OSC-PLS) models were used to explore
the kinetic differences between OW and NW subjects. Metabolite identifications were performed using
public databases and complementary analyses on a LTQ Orbitrap Velos high resolution mass spectrometer.
For most of the anthropometric, biochemical, metabolic parameters and for some plasma metabolomic
data, the phenotypes were discriminated at any time of the kinetic. On the whole, plasma metabolite
signatures evolve similarly in NW and OW subjects. In comparison with the NW, lower abundances of
plasma highly unsaturated lysophospholipids (LPs) were observed in OW while increased levels of saturated
LPs occurred with the intervention in both groups. Urinary metabolomic profiles clearly evidenced different
metabolic trajectories between groups, generally characterized in OW by an increase over time of short- and
medium-chain acylcarnitines and bile acids. Changes in metabolic signatures occurred at different time
points for the NW and OW volunteers. Therefore, the comprehensive metabolic profiling provided by
metabolomics revealed a differential response to the nutritional intervention in urine metabolomes of NW
and OW, indicating dissimilar metabolic flexibility. Changes with weight status of plasma and urine
metabolites, mostly related to modifications in fatty acid β-oxidation and metabolism, and inflammation
indicate a greater metabolic flexibility in NW subjects.
In conclusion, this study demonstrates that untargeted metabolomics allows detecting subtle metabolic
changes in linked to differences in metabolic flexibility that were not evidenced by a classical approach.
Mots-clés : metabolic trajectory, metabolomics, overweight, human nutritional intervention
58
O34
Effet de l’exercice à la vitesse lipox sur le métabolome hépatique de souris
obèses.
Laurence Le Moyec, Florian Messier, Mohamed Triba, Laurence Mille-Hamard, Véronique
Billat.
METEVBO : INSERM U902, Université d’Evry Val d’Essonne, UMR 7244, Université Paris 13-Sorbonne
Paris Cité.
L’un des moyens de lutter contre l’obésité est la pratique d’une activité physique à condition
d’être correctement dosée. Pour optimiser l’efficacité pour diminuer la masse graisseuse, il a été
proposé une activité physique d’intensité modérée correspondant à l’utilisation maximale des
lipides comme source d’énergie : lipox. Sur des souris obèses, nous avons recherché les effets
hépatiques d’un entrainement à leur vitesse lipox.
Les souris utilisées sont des souris ob/ob, n’exprimant pas la leptine, qui développent un
syndrome métabolique comparées à des souris « lean ». Pour chaque type de souris, les
performances ont été mesurées (vitesse critique et vitesse lipox) et la moitié de chaque groupe a été
soumis a un entrainement de 5 semaines à raison de 5 jours par semaines. Après cette période
d’entrainement, les souris sont sacrifiées et un échantillon de foie et d’urine ont été congelés.
Les foies ont été analysés par HR-MAS, à 500 MHz par une séquence CPMG et les urines en
sonde liquide avec une séquence noesy-1D. Les analyses statistiques multivariées ont été réalisées
par un script écrit sous Matlab.La comparaison des données obtenues sur les souris lean et obèses
non entrainées confirment le syndrome métabolique tant au niveau hépatique (stéatose) qu’au
niveau urinaire (diabète).
Les effets de l’exercice à Vlipox sont mis en évidence par le calcul d’un modèle OPLS pour les
souris obèses contrôles et entrainées. Pour les souris lean, un tel modèle ne peut pas être calculé.
Cette meilleure efficacité sur les souris obèses est confirmée par les variations de masse corporelle.
Chez les souris obèses, les effets hépatiques sont principalement des effets sur le métabolisme des
glucides avec une accumulation de glycogène chez les souris entrainées.
Ainsi cet entrainement à vitesse modérée s’est avéré efficace pour moduler les voies
métaboliques hépatiques de ces souris obèses en améliorant le stockage des glucides plutôt qu’en
diminuant l’accumulation des lipides.
Mots-clés : foie obésité RMN
59
O35
MetaboHUB : a National Infrastructure dedicated to metabolomics and
fluxomics
Rolin D, Agasse A, Bertrand-Michel J, Cole R, Colsch B, Colombié S, Deborde C, Debrauwer
L, Ferrara M, Fouillen L, Jacob D, Jourdan F, Jousse C, Junot C, Moing A, Portais JC,
Pujos-Guillot E, Thévenot E.
MetaboHUB, Bordeaux, Clermont-Ferrand, Paris-Saclay, Toulouse, France
In view of the critical role that metabolomics is already playing in the development of the knowledge-
based bio-economy, there is an urgent need to promote the development of this discipline in France in a
coordinated manner and with substantial resources. The MetaboHUB project aims at creating a national
infrastructure that will place France among the European leaders for advanced research services in
metabolomics and fluxomics. This infrastructure is an integration of four IBiSA platforms in the fields of
nutrition and health, agriculture, environment and biotechnologies. It will provide analytical and
computational expertise, tools and services to academic research teams and industrial partners.
In this lecture, the MetaboHUB Infrastructure will be presented as a National Platform which addresses
major life science trends and challenges listed in the French National Strategy for Research and Innovation
priorities. MetaboHUB focuses on developing tools which are not available yet, but are crucial to obtain
biologically relevant answers. MetaboHUB outputs will provide custom solutions for (i) relevant biomarkers
discovery and validation for personalized nutrition and medicine, and diagnosis of diseases with major socio-
economic impact such as obesity, cancer, cardiovascular, neurological pathologies and infectious diseases
(ii) the identification of stress indicators and biomarkers for plant and animal breeding programs and
agricultural practices, and (iii) the development of new tools to optimize microbial metabolic engineering
and create new synthesis pathway with industrial applications and (iv) dedicated bioinformatics and
biostatistics software modules for data processing, analysis annotation, and integration with other ‘omics’
technologies, biological networks reconstruction and disease modelling within a systems biology framework.
The first 4 years will focus on harmonizing, implementing and up-grading the four existing platforms
with common metabolomics and fluxomics tools (Bordeaux, Paris and surroundings, Toulouse and
Clermont-Ferrand). The following years will be dedicated to the rise in activity of the infrastructure that will
provide full services to biotech companies and national research projects (e.g. for the analysis of large patient
cohorts). The five main scientific and technological objectives are (i) to provide high-throughput,
quantitative technologies for biochemical phenotyping of large sets of samples (human epidemiological
cohorts, large sets of transgenic or non-genetically modified plants) with state of the art analytical
technologies and computational algorithms, and dedicated bioinformatics workflows, (ii) to identify
metabolites in human biofluids, and plant, microorganisms and animal cell extracts, through the
implementation and maintenance of centralized and open spectral repositories for metabolome annotations,
(iii) to develop large-scale flux profiling and sub-cellular fluxomics through integration of analytical data
from multiple analytical devices, and (iv) to provide access to high-impact services to the national scientific
community and industrial actors and, (v) to attract a new generation of scientists and users through the
promotion of metabolomics in education and the organization of training courses.
Tools and expertise will be made available to the metabolomics community through a dedicated
website, trainings, and partnerships within large set projects.
Mots-clés : Investissement d'Avenir, Infrastructure Nationale, Metabolomique, Fluxomique,
Bioinformatique
60
O36 - Conférenciers Invités
MetaboLights: towards a new COSMOS of metabolomics data management.
Kenneth Haug et Reza Salek
EMBL - European Bioinformatics Institute. Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, CB10 1SD, UK
61
Communications Flashs
F1-P1
Analyse métabolomique des composés participant à la symbiose Frankia-Alnus
Anne-Emmanuelle Hay 1, Antoine Buonomo
1, Laetitia Cotin
2, Thi Van Anh Huynh
1, Maria
Fernandez 2
et Aude Herrera-Belaroussi 2
1 CESN, Ecologie Microbienne, UMR 5557, ISPB, 43, Bvd du 11 novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cedex
2 Ecologie Microbienne, UMR 5557, 43, Bvd du 11 novembre 1918, 69622 Villeurbanne Cedex
L’association entre Alnus spp et l’actinobactérie Frankia s’inscrit dans le cadre des symbioses
actinorhiziennes. Au cours de cette interaction plante-bactérie, Frankia induit chez sa plante-hôte la
formation d’un nouvel organe au niveau racinaire, le nodule, au sein duquel ont lieu des échanges
trophiques entre les deux partenaires. La bactérie fournit à l’hôte de l’azote réduit, grâce à sa
capacité à fixer l’azote atmosphérique, et bénéficie en retour des composés carbonés issus de la
photosynthèse de la plante. Les actinobactéries sont notamment connues pour leur résistance en
conditions environnementales défavorables (sécheresse, toxicité due à des métaux lourds,
antibiotiques…), souvent en lien avec leur capacité à sporuler. Toutes les souches de Frankia sont
capables de sporuler en culture pure. En revanche, seules certaines souches, dites Sp +, conservent
cette capacité en symbiose, à l’intérieur même des cellules végétales dans le nodule (sporulation in-
planta) [1,2]. Des différences génétiques sont déjà observées entre les souches Sp+ et les souches
Sp-.
Notre objectif est ici de mettre en évidence d’éventuelles molécules-signatures associées à la
présence ou à l'absence de spores du symbiote dans le nodule. Pour cette étude, à partir de 48
échantillons biologiques, nous avons réalisé une analyse exploratoire globale des métabolites
synthétisés dans les nodules ou les racines d' Alnus Glutinosa , prélevés sur des sites Sp+ ou Sp-
(N+ : extrait nodulaire d’un arbre Sp+, N- : extrait nodulaire d’un arbre Sp-, R+ : extrait racinaire
d’un arbre Sp+, R- : extrait racinaire d’un arbre Sp-). Les extraits polaires (MeOH/Eau) ont été
analysés par UHPLC/UV-DAD/ESI-QTOF afin de comparer les empreintes en métabolites
secondaires. Le contenu en sucres et acides organiques a également été analysé pour ces extraits,
par GC/MS-QQQ après dérivatisation. Les premiers résultats d'ACP obtenus montrent bien qu'il
existe des métabolites secondaires discriminants entre les extraits N+ et N-. Cette différence est
moins spécifique dans le cas des extraits racinaires. Ce qui peut s’expliquer par le fait que la
composition est modifiée au sein même de la symbiose.
Afin d'observer une éventuelle différence en fonction de l'hôte, nous avons réalisé le même travail
sur Alnus viridis. Les résultats sont en cours de traitement.
Références bibliographiques : 1- VandenBosch K, Torrey JG (1985) Development of endophytic Frankia sporangia in field- and
laboratory-grown nodules of Comptonia peregrina and Myrica gale. Amer. J. Bot. 72:99-108.
2- Van Dijk C (1978) Spore formation and endophyte diversity in root nodules of Alnus glutinosa
(L.) Vill. New Phytol. 81:601-615.
Mots-clés : Alnus, Frankia, symbiose, UHPLC, GC, sucres, métabolites secondaires
62
F2-P2
Complementarity of NMR and MS methods in metabolome analysis of dairy
cows’ urine
H. Boudraa, C. Thibaudeau
a, M. Traikia
c, JF. Martin
b, C. Bonnet
a, M. Lagree
c, C. Jousse
c,
E. Pujos-Guillotb & DP. Morgavi
a
a INRA, UMRH1213 Herbivores, F-63122 Saint-Genès-Champanelle, France
b INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, Nutrition Humaine, F-63122 Saint Genès Champanelle,
France c ICCF, UMR 6296, Plateforme d'Exploration du Métabolisme, Université Blaise Pascal, 24 avenue des Landais, F-
63171 Aubière, France.
Metabolites produced by organisms have diverse chemical structures and properties. Due to this
complexity efforts to survey the entire metabolome rely on the implementation of multiplatform
approaches. In our study, a hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with mass
spectrometry and 1 H NMR spectroscopy (LC-MS/NMR) methods were developed to
simultaneously measure metabolic profiles in dairy cows’ urine. Urine samples were collected from
dairy cows fed two different levels of N with starch or fibre as the main energy source in a 4×4
Latin square design. The objective of this study was to develop and refine non-invasive markers of
rumen N efficiency.
For both NMR and MS data, PLS-DA models showed a clear separation of the four diets. Nine
urinary differential metabolites with a high VIP (variable important plot) were identified and
confirmed by 2D NMR. For LC-MS, several discriminant ions were observed and are currently
analysed for identification. However, only three metabolites found by NMR, i.e. hippuric acid,
phenylacetylglycine and allatoin were also found as markers using the MS method.
These results show that these two analytical techniques are complementary and when used
simultaneously offer a better coverage of the metabolome.
Mots-clés : LC-MS, NMR, nitrogen digestion, dairy cow, urine
63
F3
Bruker : outils et développements récents pour les applications en
métabolomique
Olivier Assemat et Sabine Jourdain
Bruker, 34 rue de l'Industrie, BP 10002, 67166 Wissembourg
64
F4-P4
Evaluation des conséquences métaboliques de deux régimes alimentaires chez la
truite arc-en-ciel par une approche métabolomique.
Blandine Madji Hounoum 1,2
, Catherine Deborde 2,3
, Mickaël Maucourt 2,4
, Annick Moing 2,3
,
Laurence Larroquet 1, Geneviève Corraze
1, Françoise Médale
1, Benoît Fauconneau
1
1 INRA, UR1067 NuMéA Nutrition, Métabolisme et Aquaculture, Pôle d’Hydrobiologie INRA, F- 64310 Saint Pée-sur-
Nivelle, France 2 Plateforme Métabolome Bordeaux du Centre de Génomique Fonctionnelle, IBVM, Centre INRA de Bordeaux, F-
33140 Villenave d'Ornon, France 3 INRA, UMR1332 Biologie du Fruit et Pathologie, Centre INRA de Bordeaux, F-33140 Villenave d'Ornon, France
4 Univ. Bordeaux, UMR1332 Biologie du Fruit et Pathologie, Centre INRA de Bordeaux, F-33140 Villenave d'Ornon,
France
L'aquaculture se développe pour répondre à l’augmentation de la demande en produits aquatiques
liées aux évolutions des pratiques alimentaires humaines. Cet essor de l'élevage aquacole engendre
une forte demande en huile et farine de poisson, produits à partir de la pêche et sources
traditionnelles de protéines et de lipides des aliments pour poissons. Or les volumes d'huile et farine
de poissons sont stables depuis plus de 20 ans pour protéger les ressources naturelles marines. Le
développement durable de l’aquaculture n’est concevable qu’en recherchant d’autres matières
premières protéiques et lipidiques que celles d’origine halieutique tout en étant compatibles avec les
besoins des poissons et la qualité des produits. De nombreux travaux menés dans le cadre de
plusieurs programmes européens ont permis d'augmenter la substitution des matières premières
d’origine marine par des matières premières d’origine végétale chez de nombreuses espèces de
poisson. Cette évolution doit impérativement se poursuivre pour affranchir l'aquaculture des
produits de la pêche. Les effets à long terme de la substitution totale sur les différentes fonctions
physiologiques et à certains stades critiques du développement restent à préciser. L'approche
métabolomique parait pertinente pour caractériser les changements globaux induits par
l'alimentation cependant elle n'a été que très rarement utilisée chez les poissons.
L’objectif de cette première étude, réalisée sur le modèle truite arc-en-ciel, vise (i) à caractériser des
aliments expérimentaux (matières premières d’origine marine vs d’origine végétale) par
spectrométrie de RMN du proton (RMN- 1 H) et (ii) à approfondir la connaissance des effets de ces
aliments sur le métabolisme du poisson par une approche métabolomique par RMN- 1 H sur fluide
biologique (plasma) et sur tissus (foie et muscle). Les résultats préliminaires de l’analyse du plasma
de truites nourries avec un régime à base de matières premières d’origine marine ou d’origine
végétale mettent en évidence des spécificités métaboliques selon la nature de l’aliment. Ils
démontrent qu’une approche métabolomique par RMN peut fournir des informations sur les
modifications induites par les matières premières alternatives et contribuer au développement de
nouvelles stratégies d'alimentation en aquaculture.
Remerciements: Les auteurs remercient vivement l’importante contribution de l’équipe technique
de l’unité NuMéA.
Financement : Projet européen ARRAINA Advanced Research Initiatives for Nutrition &
Aquaculture (FP7-KBBE-2011-5 N° 288925).
Mots-clés : Nutrition, Truite, Plasma, Métabolomique, RMN
65
F5-P5
Caractérisation du réseau métabolique de la micro-algue Chlamydomonas
reinhardtii en conditions photo-autotrophe par métabolomique et analyse des
flux en marquage instationnaire
Edern Cahoreau 1,2,3
, Arnaud Martzolff 4, Serguei Sokol
1,2,3, Guillaume Cogne
4, Lindsay
Peyriga 1,2,3
, Stéphane Massou 1,2,3
, Jean-Charles Portais 1,2,3
1 Université de Toulouse; INSA, UPS, INP, LISBP, 135 Avenue de Rangueil, F-31077 Toulouse, 2INRA,
UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, F-31400 Toulouse, 3 CNRS, UMR5504, F-
31400 Toulouse, France ; 4 LUNAM Université, Université de Nantes, CNRS, GEPEA, UMR 6144, Bât.
CRTT, 37 bd de l’Université, BP 406, F-44602 Saint-Nazaire Cedex, France
La capacité des micro-algues à convertir la lumière et le CO 2 en réserves énergétiques en font des
cibles potentielles pour la production de biocarburants. Cependant leur exploitation se heurte à des
verrous biologiques qui limitent le rendement de la conversion de l’énergie lumineuse et le stockage
énergétique. Pour exploiter les capacités métaboliques de ces organismes, une meilleure
compréhension de la photosynthèse et plus largement du métabolisme photoautotrophe est
nécessaire. Dans le cadre du projet ANR ALGOMICS (programme Bioénergies), nous avons étudié
le métabolisme de la microalgue modèle C. reinhardtii, en conditions photoautrophes par des
approches de métabolomique et de fluxomique 13
C. Cela a nécessité le développement d’une
approche de fluxomique en marquage instationnaire adaptée à l’analyse d’un métabolisme dans
lequel le CO 2 constitue la seule entrée de carbone. Cela a conduit à la mise en place d’une stratégie
analytique complète (échantillonnage, séparation des métabolites, méthodes d’analyse isotopique
par RMN et spectrométrie de masse). La mesure des flux intracellulaires dans ces conditions a
également nécessité le développement d’outils mathématiques modélisant la cinétique de
propagation du marquage et permettant ainsi de calculer les flux et les concentrations de
métabolites. Ce travail a permis en premier d’identifier la topologie fonctionnelle du réseau
métabolique actif en conditions photoautotrophes, montrant en particulier une compartimentation
complexe et une coordination du métabolisme chloroplastique et cytosolique pour couvrir
l’ensemble des besoins anaboliques et cataboliques des micro-algues. Nos résultats montrent
également un rôle principalement anabolique du métabolisme mitochondrial. La mise en place de
cette approche de fluxomique par marquage instationnaire nous a enfin permis d’établir la première
carte de flux réalisée d’un organisme eucaryote en condition photoautotrophe.
Mots-clés : Analyse de Flux, marquage 13C, photoautotrophie, microalgues
66
F6
Les Solutions Agilent technologies en Métabolomique
Luc Arnaud
Agilent Technologies France, Parc Technopolis ZA Courtaboeuf, 3 av du Canada, 91978 Les Ullis
cedex, France
Agilent metabolomics solutions are designed to address two major approaches:
Discovery Metabolomics involves acquisition of data in an untargeted mode, in which all
metabolites are detected to determine those that are significantly different between
experimental and control conditions.
Agilent has developed sophisticated tools for untargeted or "targeted" data mining, and these
metabolites are annotated and identified using Agilent's custom metabolite databases and spectral
libraries. The identified metabolites are then mapped onto biological pathways.
Quantitative Metabolomics is hypothesis driven. It may be used to confirm results from a
previous discovery based metabolomic profiling experiment or based on results from a
genomics and/or proteomics study. Typically a large number of samples is needed to
validate a few targets and has the advantage of absolute quantitation using analytical
standards.
Due to the diverse requirements of the systems studied, the chemical diversity of metabolites, and
their wide variation in abundance, metabolomics research usually requires multiple techniques –
GCMS, LCMS, CEMS, NMR.
67
F7-P7
NMR-based metabolomics profiling for identification of bevacizumab effect on
U87 cells
Tanja Mesti 1, Philippe Savarin
2, Mohamed N. Triba
2, Janja Ocvirk
3, Claire Banissi
1,
Antoine F Carpentier 4
University Paris 5, Laboratoire de recherche biochirurgicale. Hopital Européen Georges
Pompidou, Paris, France 1,
Université Paris 13, Sorbonne Paris Cité, CSPBAT, UMR 7244, CNRS, Bobigny, France 2 ,
Institute of Oncology Ljubljana, Slovenia 3 ,
Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Avicenne, Bobigny, France, 4
Background: Bevacizumab (Bev) is a monoclonal antibody targeting VEGF, which induces a high
rate of radiological response in malignant gliomas. However, concerns exist about increased tumor
cell invasiveness induced by Bev, possibly related to reduced blood supply and hypoxia. A direct
effect of Bev on tumor cells can also be advocated because glioma cells both secrete VEGF and
express low level of VEGF receptors, suggesting an autocrine loop.
We thus investigated the direct impact of Bev on U87 glioma cells metabolism recording 1D proton
spectra by High Resolution Magic Angle Spinning Spectroscopy (HR-MAS), to determine whether
Bev induces metabolic modifications that could make the cells either more invasive or resistant to
further treatments.
Material and methods: U87 cells were seeded into 25 cm 2 -Petri dishes in 5mL of culture medium
supplemented or not with a clinically relevant concentration of Bev (0,1 mg/ml). Cell proliferation
was assessed with the MTT cell proliferation assay (Sigma Aldrich, France). VEGFR expression
was checked with FACS flow cytometry (BD™ LSR II flow cytometer).VEGF secretion into the
medium was assessed with an ELISA kit for human VEGF (R&D Systems Abingdon, UK). For
HR-MAS experiments, after a 24-hour incubation, the cells were washed twice, scraped into PBS
with D 2 O and kept frozen at -80°C until analysis in a Bruker 500 MHz spectrometer. Finally,
OPLS analysis was run to determine metabolites that discriminate the different conditions.
Results: U87 cells secreted VEGF into the media (median conc. of 30 ng/ml), that can be
neutralized with Bev concentrations above 1µg/ml. U87 cells express low level of VEGFR2, but no
detectable VEGFR1. Proliferation of U87 cells was not affected by Bev. Using NMR spectra,
biomarkers which discriminate controls from Bev-treated cells were determined. The strongest
correlation obtained in the OPLS analysis concerned one metabolite located in the sugar region,
whose concentration was increased in Bev-treated samples. After assignment, this metabolite was
identified as trehalose which is actually an excipient contained in Bev. A second OPLS-model was
obtained after suppression of the sugar region, showing additional increases in choline and
glutamate in Bev-treated cells.
Mots-clés : NMR Cells VEGF
68
F8
Création d’une base de données de référence RMN et MS sur la base de données
expérimentales.
Yves Lorrain
ACD/Labs
69
F9-P9
Characterization of proanthocyanidins, adaptation and development of
methodology applied to polyphenols in cranberry.
David RENAUD1, Sylvain GUYOT
1, Philippe SANONER
2 et Hélène SOTIN
1
1 INRA, UR117 Recherches Cidricoles et Biotransformation Des Fruits Et Légumes, F-35653 Le Rheu
2 DIANA FOOD, Research & Development - Health & Nutrition Manager, F-35011 Rennes
Polyphenols are well known secondary metabolites. They are largely responsible for organoleptic
qualities, such as color, bitterness and astringency. In addition, polyphenols may have positive nutritional
effects. Polyphenols are also known for their health benefits. Indeed, the role of polyphenols as natural
antioxidants has drawn increasing interest in the prevention and treatment of cancer, inflammatory diseases,
cardiovascular and urinary tract infections [1].
In recent years, studies have been done on many matrices (apples, pomace, peel, dates, grapes, ciders,
wines, etc.) [1,2]. Cranberry (Vaccinium macrocarpon) remains unexplored; although it is increasingly
present in the European diet, mainly in the form of juice, dried fruit, jam and ingredients.
The aim of this work is to develop a method for the analysis of proanthocyanidins in cranberry and its
derivatives.
Polyphenols profiling was performed by high performance liquid chromatography (HPLC) in tandem
with mass spectrometry ion trap (MS) and UV detector. Extraction in water/methanol/formic acid (49/49/1
v/v/v) enabled the identification of proanthocyanidins in cranberry, including procyanidins A type. The four
products of acid-catalysis in presence of excess phloroglucinol (m/z 289; 413; 575 and 699) provided an
estimate of the total amount of proanthocyanidins, composition and degree of polymerization (mDP) and the
nature of the constituent units [3].
Quantification is a problem because the ions of m/z 289 and m/z 699, corresponding to epicatechin and
phloroglucinol adduct of procyanidin A2, gives an overlap with UV anthocyanins. Two hypotheses are then
explored:
1. Selective extraction to remove anthocyanins.
2. Quantification by mass spectrometry by comparison with standards.
The development of this method goes through different stages:
- Sample preparation:
o Extraction
o Purification
- Optimization of analytical parameters:
o LC (gradient, etc ...)
o MS (ionization mode, etc ...)
o UV light (wavelength, etc ...)
- Analysis by LC-UV-MS
- Complete Method Validation
- Implementation on an industrial scale
Références bibliographiques : - [1] H.HAMMOUDA et al. Ital. J. Food Sci., vol 23-2011: 404-414
- [2] A.RRODRIGUEZ-MATEOS et al. J. Agric.Food Chem 60-2012: 5772-5778
- [3] J.KENNEDY et al. J. Agric.Food Chem 49-2001: 1740-1746
Mots-clés : Polyphenols, LC-MS
70
F10-P10
Développement de techniques de préconcentration pour faciliter l’identification
de biomarqueurs lors d’analyses métabolomiques
Nicolas Dalle, Bernard Lyan, Estelle Pujos-Guillot
INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, UNH, F-63000 Clermont-Ferrand, France
Parmi les nombreuses problématiques liées aux analyses métabolomiques, l’une d’entre elles
concerne la présence, dans les échantillons, de nombreux métabolites dont la concentration est très
faible. Cela entraîne des difficultés dans leur identification par spectrométrie de masse (MS) ou
RMN puisqu’il est nécessaire d’avoir une quantité suffisante de composé pour envisager des études
structurales. Pour remédier à cette problématique, la préconcentration des métabolites est une
solution efficace, avec l’existence de différentes techniques pour la préparation des échantillons.
Quatre d’entre elles sont régulièrement citées dans la littérature, ce sont la Solid Phase Extraction
(SPE) [1], la Supported Liquid Extraction (SLE) [
2], la Solid Phase MicroExtraction (SPME) [
3,4] et
la Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) [5,6
]. Ces méthodes sont toutes basées sur les phénomènes
d’adsorption (SPE et SPME) ou d’absorption (SBSE et SLE) des métabolites sur des matrices, qui
vont interagir selon les polarités ou les charges de ces molécules.
Cependant pour la plupart de ces techniques, la matrice adsorbante ou absorbante proposée est le
plus souvent spécifique d’une famille de métabolites, alors qu’il est plus intéressant, dans le cadre
d’une approche métabolomique globale, de ne pas faire de sélection lors de l’étape de
préconcentration pour obtenir un grand nombre de molécules avec des polarités et des charges très
différentes. L’objectif sera donc de trouver des matrices pouvant extraire et concentrer des
métabolites de propriétés physico-chimiques variées. Pour optimiser l’efficacité de la concentration
des métabolites d’intérêts par ces méthodes, l’utilisation de la collecte de fractions pourra permettre
de séparer les métabolites selon leurs temps de rétention et ainsi les regrouper selon leurs polarités.
Les différentes techniques ont été testées avec des matrices adsorbantes et absorbantes diverses
sur des solutions de standards comprenant des acides aminés, des acides gras et organiques, des
phospholipides, des hormones, des carnitines, des amines, des nucléosides, des peptides et d’autres
molécules à différentes concentrations et dont la gamme de log P varie de -3,52 à 7,23. Ces
techniques ont ensuite été expérimentées sur des échantillons biologiques complexes, comme du
plasma et/ou de l’urine, pour valider leur efficacité. Les analyses des échantillons ont été réalisées à
l’aide d’une chaîne uHPLC Dionex Ultimate3000 couplée au spectromètre de masse haute
résolution LTQ-Orbitrap Velos (Thermoscientific).
L’efficacité de chaque technique est déterminée par comparaison des intensités des signaux
détectés en masse avant et après les extractions réalisées. Les différentes techniques sont en cours
de validation.
Références bibliographiques : [1] Álvarez Sánchez et al. Journal of Chromatography A, 1207, 46-54 (2008).
[2] Gong et al. Talanta, 91, 77-82 (2012).
[3] Bojko et al. Analytica Chimica Acta, 750, 132-151 (2012).
[4] Vuckovic D, Pawliszyn J. Anal. Chem., 83, 1944-1954 (2011).
[5] Baltussen et al. J. Microcolumn Separations, 11(10), 737-747 (1999).
[6] Xu et al. Journal of Chromatography A, 1278, 8-15 (2013).
71
F11
Development of a Metabolomic/Lipidomic Platform Based on a Hybrid
Quadrupole Time-Of-Flight (QTof) Ion-Mobility Mass Spectrometer.
José Portela
Waters Corporation, Saint-Quentin-en-Yvelines cedex, France
Metabolomics/Lipidomics represents a paradigm shift in metabolic research, away from
approaches that focus on a limited number of enzymatic reactions or single pathways, to approaches
that attempt to capture the complexity of metabolic networks. Additionally, the high-throughput
nature of metabolomics makes it ideal to perform biomarker screens for diseases or follow drug
efficacy. Mass spectrometry is highly discriminatory for a large range of pathological processes
which makes it the principal tool for metabolomics studies.
Recent technological advances in high resolution mass spectrometry and informatics, which
combine chromatogram and ion-mobilty alignment (HDMSETM), possesses clear analytical
advantages and are specifically designed to address the new challenges of very complex samples in
metabolomic/lipidomic.
This acquisition and processing strategy provides a 100% duty-cycle accurate mass analysis of
all detectable parent and product ion informations in a complex mixture. The exact mass
information obtained provides an information rich dataset with more definitive descriptors of the
molecules.
We will illustrate the utility of both the hardware (Synapt G2-S HDMSTM
) and software
(TransomicsTM
) developed for metabolomics/lipidomic work-flow analysis in this talk with real
application examples.
72
F12-P12
Signal processing and data analysis for non-targeted detection of unknown
contaminants in food
Natacha Lenuzza1, Julie Foucquier
1, Jérome Cotton
2, Victor Sabarly
2, Christophe Junot
3,
Bruno Corman2, Etienne Thévenot
1
1 CEA, LIST, Laboratory of Tools for Data Analysis, Gif-sur-Yvette, France
2 Profilomic, CEA-Saclay, Gif-sur-Yvette, France
3 CEA, DSV, iBiTecS, Pharmacology and Immunoanalysis Unit, Gif-sur-Yvette, France
In the food industry, contaminations of raw materials propagate exponentially to all end-products, sometimes
with devastating health and economic consequences. The AgriFood GPS consortium
(http://agrifoodgps.sharepoint.com) aims to develop innovative services to detect chemical and
microbiological contamination and fraud based on untargeted metabolomic approaches. The AgriFood GPS
project is partly financed by OSEO, a French public sector institution that provides support for innovation.
Current targeted screening of chemical contaminants (pesticides, drug residuals, and adulterations) relies on
MS/MS methods that are specific to single molecules. Development of non-targeted metabolomics by liquid-
chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-MS) could provide a means of
simultaneously identifying all molecules of interest, and even detect the presence of unknown, potentially
hazardous molecules [1]. However signal processing and data analysis of LC-MS data to detect unknown,
trace contaminants remain a challenging task that is poorly addressed.
Despite its strengths, classical pre-processing of data using the XCMS package for R software [2] is not
optimal for food contaminant detection: parameters required to maximize the number of detected compounds
and to detect trace contaminants lead to high dimensional peaklists (~ tens of thousands of variables) with
many false positives and non-robust intensities among replicates. In this study, we propose an optimized
filter approach to remove such noisy variables that could mask the identification of putative contaminant
signals from the peak list.
We used a metabolomics dataset containing 156 wines samples (52 wines from different regions, 3 replicates
per wines) in which contaminants were previously identified by targeted screening. We performed a robust
thresholding of the XCMS peaktable ( i.e. selection of the variables whose intensities in all the replicates are
superior to a threshold determined by cross-validation using the known contaminants). The quality of the
positive variables was then evaluated using chromatogram-based criteria (maximum, entropy [3], CODA
[4]), leading to a sensitivity of 89% and a specificity of 95% for the detection of 16 known contaminants.
Further work will consist in generalizing our approach by using a dedicated dataset (water spiked with a pool
of contaminants in various concentrations, with several technical replicates) in order: 1) to optimize the
number of replicates for robust thresholding, 2) to precisely evaluate the number of false warnings, and 3) to
assess complementary peak quality metrics.
Références bibliographiques : [1] García-Reyes et al. (2007). Comprehensive screening of target, non-target and unknown pesticides in food by LC-
TOF-MS. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 26:828-841.
[2] Smith et al. (2006). XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak
Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry, 78:779-787.
[3] Krishnan et al (2012). Instrument and process independent binning and baseline correction methods for liquid
chromatography-high resolution-mass spectrometry deconvolution, Analytical Chimica Acta, 740:12-19.
[4] Windig et al (1996). A noise and background reduction method for component detection in liquid
chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry, 68:3602-3603.
Mots-clés : Food; Liquid chromatography; Mass spectrometry; Non-target analysis; Unknown analysis; Data
processing
73
F13-P13
Nouveaux outils pour l’implémentation et l’utilisation de la RMN 2D
ultrarapide
Patrick Giraudeau, Benoît Charrier, Meerakhan Pathan, Illa Tea, Serge Akoka
Université de Nantes, CNRS, CEISAM UMR 6230, Nantes, France
La RMN 2D ultrarapide a littéralement révolutionné la spectroscopie bidimensionnelle en
permettant l’obtention de spectres 2D en une fraction de seconde. 1 Au cours des dernières années,
nous avons fortement amélioré les performances analytiques de cette méthodologie. 2 Cela nous a
permis de l’appliquer à un grand nombre de problématiques, allant de l’étude de réactions rapides 3
au couplage HPLC-RMN. 4 Nous avons récemment démontré l’intérêt d’approches 2D et 3D basées
sur la RMN ultrarapide pour l’analyse quantitative, dans le domaine de la métabolomique 5 et de la
fluxomique. 6
En dépit de ses performances remarquables, la RMN ultrarapide reste sous-utilisée : à ce jour,
moins d’une dizaine d’équipes ont fait mention de son utilisation. Cela est principalement dû aux
paramètres et séquences d’impulsions spécifiques qui gouvernent les acquisitions correspondantes,
rendant difficile leur implémentation et leur utilisation en routine. Afin de rendre la RMN
ultrarapide accessible aux non-spécialistes, nous avons développé une interface web offrant tous les
outils nécessaires à sa mise en œuvre. 7 Elle comprend un protocole d’implémentation, ainsi qu’une
interface conviviale permettant de traduire les paramètres conventionnels (largeurs spectrales,
offsets) en paramètres ultrarapides spécifiques (gradients, impulsions sélectives).
Références bibliographiques :
[1] Frydman, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99 : 15858-15862.
[2] Giraudeau, P., Akoka, S., J. Magn. Reson., 2010, 205 : 171-176.
[3] Queiroz, L.H.K. et al. Magn. Reson. Chem, 2012, 50 : 496-501
[4] Queiroz, L.H.K. et al. Analyst, 2012, 137 : 2357-2361
[5] Le Guennec, A. et al. , Anal. Chem., 2012, 84 : 10831-10837.
[6] Giraudeau, P. et al. , Anal. Chem., 2011, 83 : 3112-3119.
[7] Pathan, M. et al. , Magn. Reson. Chem, 2013, 51 : 168-175
Mots-clés : RMN, développements méthodologiques, RMN 2D ultrarapide
74
F14
Nouvelle génération de spectromètres de masse ultra performants pour les
analyses métabolomiques globales et ciblées.
Claire Dauly
Thermo Fisher Scientific, 16 Avenue du Québec - SILIC 765
91963 COURTABOEUF CEDEX
75
F15-P15
Data processing optimization through batch normalization and orthogonal
variation inspection: Application to a cohort study to define a reference urine
human metabolome
Julie Foucquier1*
, Aurélie Roux2*
, Natacha Lenuzza1, Ying Xu
2,
Christohe Junot2, Etienne Thévenot
1
1 CEA, LIST, Laboratory of Tools for Data Analysis, Gif-sur-Yvette, France.
2 CEA, DSV, iBiTecS, Pharmacology and Immunoanalysis Unit, Gif-sur-Yvette, France
*Equally contributed to this work
In metabolomic studies involving large cohorts of patient samples by liquid chromatography
coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS), various systematic biases (sample
preparation, acquisition conditions, instrumental drift) often hamper the discovery of true
biomarkers. Several normalization methods relying on regression with pooled quality control (QC)
samples have been proposed recently (Dunn et al., 2011). In addition, new modeling approaches
such as orthogonal projection to latent structures (O-PLS) offer the opportunity to separately study
the systematic variation and the contribution to the factor of interest (Pinto et al., 2012).
Here we combine both strategies to analyze urine samples from a 227 healthy volunteer cohort
(Roux et al., 2012) in order to define a human reference metabolome. By using nonlinear regression
with periodic QC samples followed by O-PLS modeling of age, gender and body mass index (BMI)
responses, we were able to 1) correct intensity drift over injection order, 2) detect outliers, 3)
integrate three different batches, and 4) identify a set of metabolites associated with the covariates:
these metabolites will be useful as a control in biomarker studies to avoid confounding effects of
age, gender, and BMI.
All algorithms have been implemented within an in-house R package so that they can be readily
integrated within existing workflows. All numerical and graphical results obtained with the PCA,
PLS and OPLS methods included in the package have been cross-validated with the SIMCA-P
software (Version 11).
Références bibliographiques : Dunn et al. (2011). Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas
chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols, 6 :1060-
1083.
Pinto et al. (2012). Advantages of orthogonal inspection in chemometrics. Journal of Chemometrics, 26:
231-235.
Roux et al. (2012). Annotation of the Human Adult Urinary Metabolome and Metabolite Identification
Using Ultra High Performance Liquid Chromatography Coupled to a Linear Quadrupole Ion Trap-
Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry, 84: 6429-6437.
Mots-clés : normalization, OPLS-DA, data processing, chemometrics
76
F16
Targeted and Untargeted Metabolomics - Using TripleTOF® 5600
+ System
Technology
Henri Nicar
AB SCIEX, 3 avenue du Canada, Parc Technopolis – Bâtiment Sigma, 91940 LES ULIS France
The metabolome is difficult to characterize; there is a wide dynamic range of concentrations of
metabolites, which are chemically and structurally diverse with various polarities and sizes.
Creating a single analytical method for all these components is challenging. With global profiling
techniques, the aim is to detect and quantify as many metabolites as possible. Once features of
interest are identified they need to be quantified. Information dependent acquisition (IDA) provides
useful MS/MS information, based on the user selected criteria to prioritize candidates for
fragmentation. Both the TripleTOF® 4600 and TripleTOF® 5600+ systems are capable of
delivering high resolution, quantitative, accurate mass data with high acquisition rates, enabling MS
and MS/MS information to be acquired in a single acquisition. Speed is crucial to the workflow,
enabling MS/MS information to be collected for as many features as possible, providing a
quant/qual workflow on one system!
77
Communications Posters
P17
Analysis of the interactions between seedcoat and embryo metabolites using
NMR metabolomics in flaxseed (Linum usitatissimum)
Miart F., Pageau K., A. Ramsay, Fontaine JX., Bouton S., Fournet F., Van Wuytswinkel O.,
Thomasset Bb
& Mesnard F.
aEA3900 BIOPI Biologie des Plantes et Innovation, UFR des Sciences, 33 rue Saint Leu, F-80039 Amiens
France bCNRS UMR6022 Génie Enzymatique et Cellulaire, Université de Technologie de Compiègne, BP 20529, F-
60205 Compiègne Cedex France
Interest for flaxseed (Linum usitatissimum) is actually growing because of its high content in
valuable metabolites (mucilage, lignan and omega3 fatty acids). Whereas the formers accumulate in
the seedcoat, the later accumulate in the embryo. Fatty acid biosynthesis pathway has been largely
characterized in the model species Arabidopsis thaliana [1] and a relation was demonstrated
between genes involved in mucilage biosynthesis and the fatty acid content in embryo [2]. In
addition, in flax, it was suggested a relation between lignans and oil rate using a 1H-NMR
metabolomic approach [3]. In order to get information about the inter-regulation of these three
pathways in flax, phenotypic screenings of the mucilage proportion on recombinant inbreed lines
from the crossing between Oliver (a winter “oil” flax) and Viking (a spring “fiber” flax) was
performed. Ten stable lines with different proportions in mucilage, lignan and omega-3 contents
were selected. The epidermal cells of the seed coat of these lines is being analysed by histochemical
techniques and the carbohydrate composition of their mucilage is being chemically characterized.
Références bibliographiques
[1] R. Naran et al. (2008) Plant Physiol. 148, 132-141.
[2] L. Shi et al. (2012) Plant J. 69, 37-46.
[3] A Ramsay, these de l’Université de Picardie Jules Verne, 2011
Mots-clés : NMR, flax, seed coat, mucilage, embryo fatty acids, lignans
78
P18
Addressing the Bottlenecks in Compound Identification from High Resolution
Accurate Mass Spectrometry Data
Eva Duchoslav, Lyle Burton, André Schreiber, Suma Ramagiri and Ron Bonner
AB SCIEX, 71 Four Valley Drive, Concord, ON, L4K 4V8 Canada
Tools for compound identification from accurate mass spectrometry data have been advanced by
assigning ion type (i.e. protonated, sodiated or ammoniated) , grouping together complementary
data for one molecule, looking up possible chemical entities in local and public compound
repositories and an option to expand local repositories with putative identification results.
Performance of the new research grade Formula Finder tool has been assessed on samples covering
a variety of applications.
Mots-clés : mass spectrometry, ion type, compound identification,
79
P19
Effects of brown seaweed extracts on plant growth Metabolomic characterisation of brown seaweed extracts used as phytostimulants and
transcriptomic and metabolomic analyses of physiological responses in Arabidopsis thaliana
Céline CONAN 1 , Anne GUIBOILEAU
2 , Sophie GOULITQUER
1 , Gaëlle CORREC
1 ,
Jean-Marie JOUBERT 2 , Philippe POTIN
1 .
1 UMR 7139, Marine Plants and Biomolecules, CNRS-Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Station
Biologique, 29680, Roscoff - France. 2 Goëmar Company, Parc Technopolitain Atalante St-Malo - CS 41908 St-Jouan des Guérets, 35419, Saint
Malo cedex - France.
Ascophyllum nodosum (L.) Le Jolis. and other seaweeds are manufactured commercially by the
Goëmar company for use on agricultural crops in the form of liquid concentrate. Indeed, seaweed
extracts have been used to improve plant growth and food production.
Some of their modes of action have been elucidated by the Goëmar laboratory. However, the
bioactive ingredients have not been identified using classical methods of bioassay-guided
fractionation, and their mechanisms of action remain poorly understood.
The aim of this thesis project is, at first, to determine, using a metabolomic profiling, what are the
bioactive compounds responsible for the plant growth. Then, the physiological effects of these
seaweed extracts will be studied in the model plant Arabidopsis thaliana through transcriptomic and
metabolomic approaches. The metabolomic study will allow us to define which metabolite
pathways are activated or repressed by these seaweed extracts, while the transcriptomic approach
will allow gene regulation to be deciphered.
This integration of approaches will lead to the identification of new target genes, enzymes and
metabolites which will be used to develop a new bioassay-guided fractionation of Goëmar extracts
and thus to valorize new seaweed by-products.
Mots-clés : seaweed extracts, Ascophyllum nodosum, metabolomic, transcriptomic.
80
P20
Comparaison d’empreintes phytochimiques de différents organes de la variété
de rose ‘Jardin de Granville’.
Ludivine Riffault a&b
, Emilie Destandau a , Laure Pasquier
b , Patrice André
b , Claire Elfakir
a .
a Université d’Orléans, Institut de Chimie Organique et Analytique UMR 7311, rue de Chartres 45067
Orléans cedex2, France. b LVMH recherche, département Innovation Actifs, 185 avenue de Verdun, 45800 Saint-Jean-de-Braye,
France.
La variété Rosa hybrida cv. ‘Jardin de Granville’ a été sélectionnée à la fois pour sa beauté et
sa résistance aux maladies, par les parfums Christian Dior pour être intégrée dans certaines
formulations cosmétiques. Afin de caractériser le contenu phytochimique de cette plante,
responsable de son caractère unique, différentes parties de la plante sont étudiées. La famille des
polyphénols est ciblée en particulier, du fait des nombreuses études disponibles dans la littérature et
de la très large gamme d’activités biologiques de ces composés (activité antioxydante, implication
dans la coloration de la plante, molécules de défense contre les pathogènes…).
Ainsi, des extractions microondes à des stades de développement successifs de la plante ont été
réalisées. Au total 16 organes ont été sélectionnés pour cette étude : les bois de taille d’hiver, les
jeunes pousses de printemps, les boutons précoces, les boutons juste avant éclosion, les fleurs (1ère
floraison de printemps), quatre parties de la fleur analysées séparément (pétales, étamines, sépales
et réceptacles), les feuilles, les bois de taille d’été, les jeunes pousses d’été, les boutons juste avant
éclosion, les fleurs (2ème
floraison en fin d’été), les fruits et les racines. Le contenu moléculaire des
extraits a ensuite été évalué par des techniques chromatographiques complémentaires : HPTLC,
HPLC-DAD et UHPLC-ESI-HRMS. En combinant toutes les informations recueillies (spectres
d’absorbance, masses exactes, propositions de formules brutes) et grâce à la comparaison à certains
molécules de référence, plusieurs composés phénoliques dérivés de gallotanins, d’ellagitanins, et de
flavonoides quercétine et kaempférol ont été caractérisés.
Un traitement statistique d’ACP, de CAH et d’ANOVA a été réalisé sur les empreintes des
différents organes obtenues par UHPLC-UV à 270 nm. Une nette séparation entre organes
végétatifs et reproducteurs est alors observable. Ainsi, des composés tels que certains dérivés de
kaempérol sont représentatifs de la partie reproductrice de la plante alors que des tanins, dérivés de
catéchine notamment, caractérisent davantage la partie végétative.
Mots-clés : UHPLC-HRMS, polyphénols
81
P21
La RMN 3D hybride, une nouvelle stratégie pour la mesure des enrichissements
isotopiques 13C en fluxomique
Renaud Boisseau 1 , Benoît Charrier
1 , Stéphane Massou
2 , Jean-Charles Portais
2 , Serge
Akoka 1 et Patrick Giraudeau
1
1 Université de Nantes, CNRS, CEISAM UMR 6230, Nantes, France
2 Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, UMR 5504 CNRS & UMR
792 INRA, INSA, Toulouse, France
L’analyse du flux métabolique est rendue possible par l’utilisation du marquage au 13
C, qui permet
l’observation de métabolites marqués sites spécifiques. L’une des techniques phares pour mesurer
les enrichissements isotopiques est la RMN 2D 1 H homonucléaire.
1 Cependant, l’inconvénient
majeur de cette technique réside dans une longue durée d’acquisition (de quelques minutes à
quelques heures) ce qui affecte la précision des mesures quantitatives et limite son utilisation en
routine. Nous avons récemment développé une approche alternative basée sur la RMN 2D ultra-
rapide 2 , présentant d’excellentes performances analytiques. Cette stratégie a permis de réduire
considérablement la durée d’acquisition. 3 Toutefois la RMN 2D, qu’elle soit ultra-rapide ou
conventionnelle, est limitée par la persistance de recouvrements dans les mélanges complexes, qui
empêchent la mesure des enrichissements isotopiques.
Pour contourner ce problème, nous proposons de basculer les couplages 1 H-
13 C dans une
troisième dimension. L’acquisition d’un spectre de RMN 3D conventionnel nécessiterait une durée
d’expérience rédhibitoire, c’est pourquoi nous avons développé des séquences de RMN 3D hybride 4 combinant approches classiques et codage spatial pour obtenir un spectre 3D en quelques minutes
seulement. Les performances analytiques de ces séquences 3D hybrides sont évaluées sur une série
d’échantillons de glucose enrichi au 13
C avec un taux d’enrichissement connu (5 à 90%). Nos
séquences optimisées sont caractérisées par une justesse et une précision proche du %, ainsi que par
une excellente linéarité.
Références bibliographiques :
1. S. Massou et al. Phytochemistry 2007, 68, 2330
2. L. Frydman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 15858
3. M. Pathan et al., J. Magn. Reson. 2012, 214, 335 ; P. Giraudeau et al, Anal. Chem. 2011 ,
83, 3112
4. P. Giraudeau et al., ChemPhysChem , 2012, 13, 3098-3101
Mots-clés : fluxomique, RMN 3D, RMN ultrarapide
82
P22
Variation des profils urinaires au cours du temps pour des patients traités soit
avec la ciclosporine ou le tacrolimus.
Binta Diémé, Patrick Emond, Hélène Blasco, Yvon Lebranchu, Matthias Buchler, Jean
Michel Halimi et Chantal le Guellec.
EA4245, Université François Rabelais, Tours, France
Contexte : La détection d’une éventuelle dysfonction du greffon chez le patient transplanté rénal repose
actuellement sur la mesure de la clairance de la créatinine ou la biopsie rénale, chacune présentant des
limites. L’objectif de notre travail était d’évaluer la capacité de l’approche métabolomique urinaire à refléter
des changements fonctionnels rénaux qui pourraient, à terme, servir de base au développement de
biomarqueurs spécifiques et précoces de la dysfonction du greffon.
Méthodes : Dans cette étude, des urines de 48 patients transplantés rénaux traités par tacrolimus ou
ciclosporine (deux inhibiteurs de la calcineurine, CNI) ont été recueillies à 7 jours (J7), 3 mois (M3) et 12
mois (M12) après la greffe. Nous avons cherché s’il existait des variations du profil métabolique urinaire au
cours du temps et/ou en fonction du type de CNI utilisé, puis avons recherché des différences de profil
métabolique selon l’état fonctionnel du greffon et ceci à des stades très précoce (J7) et plus tardif (M3). Pour
celà, nous avons comparé au sein du sous-groupe de patients traités par tacrolimus ceux qui avaient une
bonne reprise de fonction du greffon définie par une créatinémie à J7 < 250 µmol/L et ceux ayant une
créatinémie >250 µmol/L. A M3, la comparaison a porté sur les patients ayant une clairance de la créatinine
> ou < 60 mL/min. Une analyse par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse (GC/MS) a été
réalisée. Les données générées ont été analysées grâce à des logiciels d’analyse statistique multivariée
(SIMCA et R).
Résultats : Les résultats ont montré une séparation des profils métaboliques urinaires entre J7, M3 et M12,
et ceci pour les 2 CNI étudiés. Nous avons également montré que le profil métabolique à un temps donné
était différent selon l’inhibiteur de calcineurine utilisé. Enfin, il existait une signature métabolique permettant
de différencier les patients ayant eu une reprise immédiate de fonction du greffon de ceux chez qui la reprise
était retardée ou lente (figure).
Les métabolites qui permettent cette séparation étaient principalement des sucres (pentoses et hexoses), le
citrate, le lactate, l’acide hippurique et l’inositol.
Conclusion : Cette étude nous a permis de vérifier la faisabilité de l’approche métabolomique et son intérêt
potentiel pour le suivi des patients greffés. Elle a permis pour la première fois de décrire des variations
urinaires qui se produisent au cours du temps chez des patients transplantés rénaux et, au moins à J7 chez les
patients traités par tacrolimus, de relier un profil métabolique particulier à l’état fonctionnel du greffon,
ouvrant la voie à l’identification de nouveaux biomarqueurs.
Mots-clés : GC/MS (gas chromatography coupled to mass spectrometry) , fonction rénale, inhibiteurs de la
calcineurine.
83
P23
Etude de l’impact d’une exposition maternelle à un mélange de
polychlorobiphényles (PCB) chez la souris, sur le métabolisme de la descendance
par une approche métabonomique par RMN
Benedict Yanibada 1 , Marie Tremblay-Franco
1 , Roselyne Gautier
1 , Laurent Debrauwer
1 ,
Rachid Soulimani 2 et Cécile Canlet
1
1- INRA, UMR 1331 Toxalim, 180 Chemin de Tournefeuille BP 93173, 31027 Toulouse Cedex 3
2- Université de Lorraine, Neurotoxicologie Alimentaire et Bioactivité, MRCA/UR AFPA/INRA, BP
4102, 57040 Metz, France
L’augmentation des activités anthropiques a conduit à l’utilisation et au rejet de nombreux
produits chimiques dans l’environnement. L’exposition des écosystèmes à ces polluants peut
affecter la santé humaine et animale via la chaîne alimentaire. De récentes études épidémiologiques
ont révélé une augmentation des maladies neurologiques et mentales chez les enfants. Les polluants
environnementaux sont fortement suspectés d’induire des pathologies lorsque l’exposition a lieu à
un âge précoce de la vie (période de développement). Aussi, il est important d’étudier les
mécanismes d’action de ces contaminants par des approches globales : analyses transcriptomiques
et métabolomiques.
L’objectif des travaux présentés est d’étudier chez la souris l’impact d’une exposition
maternelle in utero et au cours de la lactation à un mélange de 6 Non-Dioxin-Like
PolyChloroBiphenyls (6 NDL-PCB) sur le métabolisme plasmatique et au niveau du cerveau en
utilisant une approche globale : la métabonomique par RMN du proton.
Les souris gestantes ont été exposées aux PCB soit par gavage par un mélange de 6 NDL-PCB
constitué des composés purs (3 faibles doses), soit à partir d’une matrice alimentaire contaminée
(anguilles). Les 6 NDL-PCB ont été dosés dans les anguilles de façon à administrer des doses de
PCB comparables en utilisant les deux matrices (composés purs et poissons). Le plasma et le
cerveau ont été récupérés chez les souriceaux mâles et femelles âgés de 14 jours. Deux parties du
cerveau ont été analysées : le cortex et le cervelet. Les analyses des échantillons de plasma, des
extraits aqueux de cervelet et de cortex ont été réalisées par RMN du proton à la fréquence de 600
MHz.
Les analyses PLS-DA obtenues à partir des spectres RMN de plasma, du cortex et du cervelet
des souris âgées de 14 jours traitées ou non avec le mélange des 6 NDL-PCB montrent clairement
des empreintes métaboliques différentes suivant le traitement et le sexe.
En conclusion, une exposition aux PCB à des doses auxquelles aucune toxicité n’est rapportée
(< dose sans effet), peut être caractérisée par une empreinte métabolique spécifique témoignant des
effets de l’exposition.
Mots-clés : polychlorobiphényles, exposition in utéro et période de lactation, analyse RMN
84
P24
Comparison of lipid synthesis and carbohydrate metabolism in developing
linseed and rapeseed embryos : A fluxomic study.
Sébastien ACKET 1, Abdelghani IDRISSI TAGHKI
1, Mohamed KOUBAA
2, Albrecht ROSCHER
3,
Brigitte THOMASSET1
1 Université de Technologie de Compiègne, CNRS-FRE 3580, BP 20529, 60205 Compiègne Cedex, France.
2 Department of Molecular Genetics, The Ohio State University, 1060 Carmack Rd, 053 Rightmire Hall,
43210 Columbus, OH, USA. 3 Université de Picardie Jules Verne, CNRS-FRE 3580, 33 rue Saint Leu, 80039 Amiens Cedex, France.
Oilseed plants accumulate high levels of oil (up to 50% of the dry weight in the form of
triacylglycerols: TAGs) in their seeds with potential applications in food and industrial domains. In
fact, developing embryos efficiently convert synthesized sugars into storage reserves (TAG, starch,
proteins…), but depending on precursor availability and enzyme kinetics, this conversion differs
between plant tissues and leads to different biomass patterns. Thus, oilseed embryos have an initial
phase of starch accumulation, before the accumulation of storage oil. Starch levels decline later
during development as rates of accumulation of storage oil and protein increase [1]. However,
linseed (Linum usitatissimum) and rapeseed (Brassica napus) embryos synthesize different amount
of starch during the same developmental stage [2]. In linseed, the starch accumulation is very low
when compared to the rapeseed starch accumulation [1].
In order to understand the differences observed in lipid accumulation between rapeseed and
linseed and to gain insights into the identification of mechanisms involved in biomass accumulation
for these two oilseed plants, we have studied the biomass accumulation using 13
C Metabolic Flux
analysis to calculate carbon fluxes [3]. Developing linseed (Linum usitatissimum) and/or rapeseed
(Brassica napus) embryos aged 15 days after pollination were dissected under aseptic conditions
and incubated for 7 days in a medium containing [U- 13
C]glucose. After incubation, biomass and
free metabolites (free amino acids and organic acids) were extracted and the 13
C labeling was
quantified using GC-MS. The model of central metabolic pathways for developing linseed and
rapeseed embryos was built according to literature.
Our results show first that, in rapeseed and linseed embryos, precursors for fatty acid synthesis
in embryos are mainly generated from the plastid and the major precursor supporting fatty acid
synthesis is glucose 6-phosphate imported from the cytosol. In our studies, we have also reported
that the rates of sucrose turnover are different between the two studied plant species.
Références bibliographiques : [1] Idrissi Taghki A. (2009) Etude de type métabolisme intégré entre embryons de colza
transgéniques ou non. Thèse de l’Université de Technologie de Compiègne.
[2] Troufflard S., Roscher A., Thomasset B., Barbotin J.N., S. Rawsthorne S. et Portais J.C. (2007)
In vivo 13
C-NMR determines metabolic fluxes and steady state in linseed embryos.
Phytochemistry, 68 , 2341-2350.
[2] Wiechert W. (2001) 13C metabolic flux analysis, Metab. Eng ., 3 , 195–206.
Mots-clés : rapeseed, linseed, lipids, sugar metabolism, fluxomic
85
P25
Influence of Diurnal factor on compositional changes of tomato fruit and leaf
Camille Bénard 1 , Stéphane Bernillon
2* , Sonia Osorio-Algar
4 , Mickaël Maucourt
3* , Benoît
Biais 2 , Emilie Labadie-Lemière
2 , Patricia Ballias
2* , Catherine Deborde
2* , Daniel Jacob,
Cécile Cabasson 3*
, Michel Génard 1 , Alisdair Fernie
4 , Dominique Rolin
3* , Hélène Gautier
1 , Yves Gibon
2* , Annick Moing
2*
1 INRA UR 1115 Plantes et Systèmes de culture Horticoles, Domaine St Paul, Site Agroparc, 84914 Avignon, France
2 INRA UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
3 Université de Bordeaux, UMR 1332, Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave
d’Ornon, France
* Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av
Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
4 Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, 14476 Potsdam-Golm, Germany
The Fruit Integrative Modelling project is an Eranet EraSysBio+ project which aims at
describing and modelling the influence of environmental factors on tomato fruit central metabolism
during its development. In this project, high-throughput biochemical phenotyping, MS and NMR
spectrometry have been used to characterise fruit and leaf metabolites and estimate their levels for
tomato plants (Solanum lycopersicum cv Moneymaker) cultivated in a greenhouse. Within this
frame, one experiment focussed on the effect of harvest time on tissue composition throughout a
day and night cycle. First, expanding fruits, and the mature leaves close to the harvested fruit
cluster, were harvested on two different representative days. Analyses of pericarp tissue and foliar
limb were performed on water/methanol/chloroform extracts using GC/EI-ToF-MS after
derivatization, methanol/water extracts using LC/ESI-QToF-MS and ethanol/water extracts for
robotized biochemical phenotyping and 1 H-NMR quantitative profiling. Metabolite data were
processed using univariate, multivariate and clustering analyses. For source leaves, metabolite
changes were related to well-known physiological processes. For green fruits, several metabolites
were shown to change throughout the day. The second step of this study was the combined data
analysis of the compositional changes of mature leaves close to the harvested fruit cluster with that
of the fruit pericarp.
Mots-clés : Tomato, fruit, leaf, light, metabolism, NMR, MS, metabolomic
86
P26
Analyse métabolomique sur l’hémolymphe d’abeille, contraintes de l’étude et
évaluation d’un stress biotique (nosémose).
Régis Fontbonne1,2, Céline Dalle1-4, Marie Lagrée3, Mounir Traïkia3,4, Michaël Roussel1,2, Cyril
Jousse3,4, et Frédéric Delbac1,2
[1]
Clermont Université, Université Blaise Pascal, Laboratoire Microorganismes : Génome et
Environnement , BP 10448, F-63000 Clermont-Ferrand (France) [2]
CNRS, UMR 6023, LMGE, F-63177 Aubière [3]
Plateforme d’exploration du métabolisme, Université Blaise Pascal, BP 80026, F-63171 Aubière [4]
Clermont Université, Université Blaise Pascal, Institut de Chimie de Clermont-Ferrand, BP
10448, F-63000 Clermont-Ferrand (France)
Courriel : [email protected]
L’objectif de ce travail est d’évaluer les conséquences physiologiques d’une infection par Nosema
ceranae sur l’abeille européenne Apis mellifera [1,2]. Cette microsporidie colonise l’épithélium
intestinal et engendre un stress énergétique associé à la fois à une baisse de l’immunité et à une
altération de la production de phéromones [3,4]. L’hémolymphe est le liquide circulant qui assure
alimentation, défense et communication à l’échelle de l’organisme. La découverte du métabolome
de ce tissu commence à peine [5,6,7] et peut nous apporter une première information concernant les
perturbations métaboliques engendrées par l’infection.
Sur un des deux lots d’abeilles émergentes issues du rucher expérimental du LMGE (Clermont-
Ferrand), une infection manuelle est réalisée en proposant à chaque abeille 5μl d’eau sucrée
contenant 125000 spores de N. ceranae. L’hémolymphe est récoltée 2 et 10 jours post-infection et
analysée à l’aide du Metabolic Profiler [8,9] (PFEM, Clermont-Ferrand), par spectroscopie de
résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 500MHz) puis par chromatographie liquide
(UPLC) couplée à un spectromètre de masse à temps de vol (ESI-μToF). Les protocoles analytiques
ont été adaptés au regard des quantités d’hémolymphe disponible, 10 à 15 µL par abeille. Le
traitement des données (bucketing/ binning), l’analyse statistique en composantes principales (ACP
& PLS) et l’interrogation des banques de données, ont permis d’identifier des métabolites
discriminant significativement les lots d’individus.
Cette expérience s’inscrit en préliminaire de plus vastes études, étant donnée l’importance
écologique (biodiversité), agronomique (rendement agricole) et économique (apiculture) de cet
insecte social.
Références bilbiographiques : 1. Higes et al., J Invertebr Pathol, 2006, 92: 93-95
2. Martin-Hernandez et al., Appl Environ Microbiol, 2007, 73: 6331-6338
3. Goblirsch et al., PLoS ONE, 2013, 8: e58165.
4. Dussaubat et al., Journal of Invertebrate Pathology, 2013, 113: 42-51
5. Hammer et al., Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 2012, 7: 292-302
6. Poyton et al., Environ Sci Technol, 2011, 45: 3710–3717
7. Aliferis et al., Journal of Insect Physiology, 2012, 58: 1349-1359
8. Godjohann, J Chomatogr A, 2007, 1156: 87-93
9. Sun et al., J Chromatogr B, 2008, 871: 328–340
Mots-clés : Abeille, pathogène, métabolomique, hémolymphe, environnement.
87
P27
MeHaloCoA project (MarinE HALOgenated COmpounds Analysis)
Yann Guitton 1,3
, Elodie Blanchet 1,2
, Marieke Vansteelandt 1, Catherine Roullier
1, Marie
Geiger 1,3
, Thibaut Robiou du Pont 1, Yves François Pouchus
1, Olivier Grovel
1
1 University of Nantes, Faculty of Pharmacy, F-44035 Nantes, France;
2 ATLANTHERA, 1 rue Gaston Veil,
F - 44000 Nantes, France;
3 IFREMER, F-44311, Nantes, France
Numerous halogenated natural compounds have been described from all natural sources. They are
considered as biologically important and could play an interesting role as lead compounds for drug
discovery [1]
. Despite the abundance of chlorine in the marine environment, only nine compounds
from marine-derived Penicillium strains have been described [2]
to possess a chlorine atom in their
chemical structure and they all displayed biological acivities such as antifungal activity for
griseofulvin or cytotoxicity for ligerin, a chlorinated sesquiterpene which exhibited a specific
antiproliferative activity against osteosarcoma cell lines and in vivo antitumor activity. In the course
of our ongoing research on bioactive fungal metabolites, we are particularly interested in finding
new halogenated compounds from marine-derived Penicillium. In order to simplify the data
treatment and to fasten discoveries of natural halogenated compounds we have developed several
addons for R XCMS. The first addon is HaloDetect.R which is a script allowing the fast screening
of LC-MS data in order to find putative chlorinated or brominated compounds. The second
MSMSclust.R is based on MS/MS data analysis and classifies compounds based on MS/MS
similarities. The last MStoOPLS.R is an integrated workflow going from raw MS data to OPLS-DA
analysis (with S-Plot generation) and is a combination of XCMS, CAMERA and MUMA packages.
All those R scripts have been developed and validated on chlorinated-compounds containing
samples analyzed on an LC-ESI-IT-ToF apparatus (Shimadzu) belonging to the new
THALASSOMICS metabolomic core facility. All those tools are available upon request and will be
soon integrated in an R package.
Références bibliographiques : 1- Gribble, Gordon W. Naturally Ocurring Organohalogen Compounds, Acc. Chem. Res. 1998, 31, 141-152
2- Vansteelandt, Marieke, Elodie Blanchet, Maxim Egorov, Fabien Petit, Loïc Toupet, Arnaud Bondon,
Fabrice Monteau, et al. “Ligerin, an Antiproliferative Chlorinated Sesquiterpenoid from a Marine-
Derived Penicillium Strain.” J. Nat. Prod. 76, no. 2 (February 22, 2013): 297–301
Mots-clés : Halogeneted compound detection, Marine Fungi, Penicillium, LC-HRMS/MS, R scripts
88
P28
Contrôle de l’administration des anabolisants chez le cheval : développement
d’une approche métabolomique sur l’urine par couplage GC-EI-QTOF
B. Loup1, N. Floch
1, AC. Paris
1, N. Stojiljkovic
1, P. Garcia
1, L. Pascaud
2,
L. Bailly-Chouriberry1, MA. Popot
1 et Y. Bonnaire
1.
1 LCH,
Laboratoire des Courses Hippiques, 15 rue de Paradis, 91370 Verrières-le-Buisson ; [email protected]
2 Agilent Technologies France, Parc Technopolis – ZA Courtaboeuf, 3 avenue du Canada, CS 90263, 91978 Les Ulis
Cedex
Afin de lutter contre les pratiques de dopage aux anabolisants et détecter leur éventuelle
administration, des méthodes analytiques directes sont utilisées en routine dans les laboratoires de
contrôle anti-dopage.
La mise au point de nouvelles méthodes comme la métabolomique peuvent permettre
d’augmenter les temps de dépistages en suivant, non plus la présence de la molécule en elle-même,
mais ses effets. Ainsi, de telles approches constituent un axe de recherche intéressant dans
l’amélioration de la lutte contre le dopage et ont déjà été développées au LCH pour des couplages
LC-HRMS [1][2].
Dans cette étude nous proposons le développement d’une nouvelle méthode innovante d’analyse
métabolomique par couplage GC-HRMS (GC-EI-QTOF, Agilent Technologies) à partir
d’échantillons urinaires provenant d’une administration de stanozolol.
Dans un premier temps, l’injection d’une dizaine de séquences d’échantillons (n=10) nous a
permis de déterminer les conditions expérimentales assurant l’obtention d’une empreinte la plus
riche possible ainsi qu’une bonne reproductibilité. Ces essais nous ont amenés à choisir pour la
préparation d’échantillons une précipitation à l’acétonitrile suivi d’une dérivation MSTFA/ITMS.
L’analyse des données a montré une bonne reproductibilité de la méthode avec notamment des
coefficients de variation (CV) inférieurs à 15% sur les étalons internes. Concernant les analytes,
37% et 44% d’entre eux présentent des CV compris respectivement entre 0-30% et entre 30-70%.
Par ailleurs, le pré-traitement des données a permis d’obtenir des résultats comparables entre le
logiciel Mass Hunter (Agilent Technologies) et XCMS. En effet, après optimisation des paramètres
de XCMS au couplage GC-EI-QTOF, la comparaison des aires des pics extraits selon les deux
méthodes montre une corrélation supérieure à 95%.
La seconde étape de cette étude consiste à analyser les échantillons urinaires de chevaux ayant
(n=5) ou non (n=4) reçu une administration de stanozolol (0,30mg/kg) dans des conditions
contrôlées, selon le protocole et les conditions établies précédemment. Des méthodes d’analyses
factorielles (ACP) seront mises en œuvre dans le but d’explorer et d’interpréter les données.
[1] Boyard-Kieken F et al., J Sep Sci., 2011, Dec;34(24):3493-501.
[2] Kieken F et al., Anal Bioanal Chem., 2009, Aug;394(8):2119-28.
89
P29
Détection des métabolites urinaires par spectrométrie de masse à très haute
résolution : comparaison entre les approches DI /ESI-FTICR et LC/ESI-LTQ-
Orbitrap
B. Xue
1 ; S. Alves
2 ; J-C. Tabet
2 ; R. B. Cole
2 ; A. Paris
3 ; E. Rathahao-Paris
1 ; C. Junot
4
1 INRA, AgroParisTech, Équipe IAQA, UMR 1145 Ingénierie Procédés Aliments, 75231 Paris Cedex 05
2 UPMC, EquipeCSOB, Institut Parisien Chimie Moléculaire, 75252 Paris Cedex 05
3 INRA, AgroParisTech, Mét@risk , 75231 Paris Cedex 05
4 CEA, LEMM, 91191 Gif sur Yvette Cedex
La spectrométrie de masse (MS) couplée à la chromatographie liquide (LC) s’est évélée être un
outil ultra sensible et spécifique pour les études métabolomiques depuis une dizaine d’années 1.
C’est une méthode analytique en deux dimensions puisque les métabolites sont caractérisés par
leurs temps de rétention et par les ions rapports m/z générés par leur ionisation/désorption. Les
principaux défauts de cette approche sont la complexité du traitement automatique des données dus
à des variations de temps de rétention, et les temps d’analyse assez longs. Une technique à haut
débit, telle que l’introduction directe des échantillons dans le spectromètre de masse (DI-MS) est
attractive à des fins d’études métabolomiques à grande échelle en raison de sa rapidité et son faible
coût 2. Cependant, sans l’utilisation du couplage avec la LC, les composés introduits simultanément
dans la source d’ionisation electrospray engendrent des effets de suppression des ions qui limitent la
détection exhaustive de l’ensemble des métabolites dans un échantillon biologique. Le spectre de
masse acquis est beaucoup plus complexe dans le cas de DI-MS, puisque de nombreux d’ions
isobares peuvent se positionner au même rapport m/z nominal. Un instrument d’ultra haute
résolution, tel que l’instrument FT-ICR (Fourier Transform-ion cyclotron resonance), est alors
indispensable pour ce type d’approche directe car il permet de distinguer ces ions isobares au
contraire des appareils faible résolution tel que les filtres quadripolaires et les piège à ions.
L’objectif de notre étude est de développer une méthodologie pour réaliser en une seule analyse la
détection et l’identification d’un nombre maximum de métabolites avec une bonne précision dans la
mesure en masse. Nous nous intéressons, dans un premier temps, à la matrice urinaire. L’urine
présente un grand intérêt pour les études métabolomiques car elle contient une grande diversité de
métabolites aussi bien dans leurs structures que dans leurs concentrations 3 . Le mode d’injection en
flux continu (FIA, «flow injection analysis») couplé à un instrument FT-ICR (7 Tesla) avec un
pouvoir résolutif d’environ 260 000 (à m/z 400) a été utilisé pour l’analyse directe des échantillons
d’urine dilués. Dans cette communication, seront présentés les résultats obtenus en comparaison
avec l’approche classique réalisée par couplage entre la LC et un appareil FT-MS équipé de
l’Orbitrap et possédant un pouvoir résolutif maximum de 100 000 (à m/z 400). Nous évaluerons le
nombre de métabolites détectables et identifiables. Nous examinerons la précision de la mesure en
masse ainsi que celle du rapport d’abondance isotopique relative (RIA, relative isotopic abundance).
Références bibliographiques : 1 : Dettmer K. ; Aronov P.A. ; Hammock B.D. Mass Spectrometry Reviews , 2007 , 26, p51-78.
2 : Werner E. ; Heilier J-F. ; Ducruix C. ; Ezan E. ; Junot C. Journal of Chromatography B , 2008 , 871, p143-163.
3 : Fernáandez-Peralbo M.A. ; Luque de Castro M.D. Trends in Analytical Chemistry , 2012 , 41, p75-85.
Mots-clés : phénotypage métabolique, analyse haut débit, spectrométrie de masse à ultra haute résolution,
échantillons urinaires
90
P30
Impact métabolique de la glycine bétaïne exogène ou produite par transgénèse
chez Arabidopsis thaliana sous traitement salin
Raphaël Lugan
1,2 , Marie-Françoise Niogret
1 , Laurent Leport
1 , Jean-Paul Guégan
3 ,
Ronan Sulpice 4 , Joachim Kopka
5 , Alain Bouchereau
1
1 UMR 1349 IGEPP, INRA-Agrocampus Ouest-Université de Rennes 1, Rennes-Le Rheu
2 Plateforme Métabolomique IBMP, Institut de Botanique, Strasbourg
3 UMR 6226, ENSCR, CNRS-Université de Rennes 1, Rennes
4 MPIMP, Potsdam-Golm, Germany
5 MPIMP, Potsdam-Golm, Germany
La glycine bétaïne (GB), produite et accumulée par différentes espèces animales, végétales et
microbiennes, possède des propriétés avérées d’osmoprotection et de thermoprotection [1]. Chez les
végétaux, ce sont plus particulièrement des espèces halotolérantes ou résistantes à la dessiccation
qui accumulent cette bétaïne [2]. Ses modes et mécanismes d’action restent cependant obscurs et en
dépit de propriétés qualifiées de compatibles rien n’indique que ses fonctions protectrices soient
seulement circonscrites à des activités de chaperoning chimique et qu’elles soient effectives dans
n’importe quel contexte biologique. Par ailleurs, dans le cadre d’actions qui tendraient à valoriser
ces propriétés pour améliorer la performance, en conditions de stress, d’espèces d’intérêt
agronomique non accumulatrices [3], il apparaît essentiel, non seulement d’en démontrer la
fonctionnalité en système hétérologue mais aussi de vérifier son innocuité et sa compatibilité
effectives. Ainsi, une première expérimentation à consisté à appliquer de la GB dans la solution
nutritive de plantes d’Arabidopsis thaliana (écotype Col non accumulateur de GB) cultivées en
hydroponie puis, par profilage métabolique (GC-Tof) des tissus foliaires, à en vérifier l’impact sur
le métabolome après traitement salin. Une seconde expérimentation s’est également traduite par le
phénotypage métabolique de plantes d’Arabidopsis thaliana exprimant par transgénèse le gène
codA d’Arthrobacter globiformis [4] et néoproductrices de GB obtenue par oxydation directe de la
choline. Un traitement salin a également été appliqué à ces plantes transformées. Les deux
situations conduisant à accumuler la GB dans les tissus foliaires se traduisent par des modifications
importantes du métabolome amenant à penser, qu’en absence de toute contrainte saline, la molécule
à caractère « xénobiotique » est inductrice d’un stress chimique et que sa compatibilité en système
hétérologue est toute relative. Les phénotypes métaboliques établis en conditions de traitement salin
suggèrent, en revanche, que les propriétés protectrices de la GB puissent s’exprimer dans ces
conditions [5].
Références bibliographiques : [1] Sakamoto A. and Murata N., 2002, Plant Cell and Environment, 25, 163-171
[2] Ashraf F. and Foolad MR., 2007, Environmental and Experimental Botany, 59, 206-216.
[3] Khan MS. et al., 2009, Plant Biotechnology, 26, 125-134
[4] Sulpice R. et al., 2003, The Plant Journal, 36, 165-176.
[5] Lugan R., 2008, Thèse de Doctorat de l’Université de Rennes 1
Mots-clés : Soluté compatible, stress salin, codA, phénotypage métabolique, marqueurs d’exposition
91
P31
Couplage EPC/RMN/Statistiques pour la caractérisation en mélange d’un
extrait végétal valorisé en Cosmétique
Sylvain Purson
1 , Jane Hubert
1 , Jean-Marc Nuzillard
1 , Romain Reynaud
2 ,
Jean-Hugues Renault
1 : UMR CNRS 7312, Université de Reims Champagne-Ardenne, Moulin de la Housse, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2,
France 2 : Soliance, Route de Bazancourt, 51110 Pomacle, France
La valorisation d’extraits naturels occupe actuellement une place prépondérante dans l’industrie
cosmétique. Mieux connaître le contenu de ces extraits reste un enjeu majeur, non seulement pour
répondre aux contraintes réglementaires grandissantes imposées aux industriels de ce secteur
(REACH…) mais aussi pour déterminer la composition, l’activité biologique et l’innocuité de ces
extraits et ainsi leur conférer davantage de valeur-ajoutée. Les méthodes actuelles de caractérisation
des substances naturelles consistent généralement à isoler les composés de manière individuelle afin
ensuite de procéder à leur identification ; ce qui est long, fastidieux et coûteux.
C’est dans ce cadre qu’une nouvelle approche basée sur la caractérisation de métabolites naturels en
mélange a été développée. Elle repose sur la combinaison originale d’une méthode de
fractionnement par Extraction de Partage Centrifuge (EPC), d’analyse par RMN du 13
C et de
traitement bioinformatique des données générées. L’intérêt majeur de cette approche est qu’elle
permet d’accéder à la composition globale de l’extrait de départ sans purifier systématiquement
chaque composé.
L’exemple choisi est un extrait d’Orobanche rapum, une plante originaire des landes du Massif
central français. Le fractionnement par EPC, basé sur l’utilisation d’un système triphasique de
solvants en mode élution séquentielle (Hamzaoui et al. – 2012) a d’abord fourni des mélanges
sélectifs et simplifiés de molécules en fonction de leur polarité. Les fractions moyennement polaires
obtenues ont ensuite été analysées par RMN du carbone 13
C, la durée de chaque analyse étant fixée
à 10 minutes. Enfin, un algorithme développé localement a permis d’aligner les intensités de
l’ensemble des signaux collectés automatiquement dans chaque fraction selon leurs déplacements
chimiques avec une fenêtre de 0.2 ppm. La Classification Ascendante Hiérarchique du jeu de
données ainsi généré offre une visualisation directe des clusters de déplacements chimiques présents
dans plusieurs fractions successives et correspondants à des squelettes carbonés représentatifs de
métabolites particuliers.
Il en résulte ainsi une analyse globale des résonances détectées dans chaque fraction, conjuguée à
un protocole d’EPC efficace. Cela nous a permis de discriminer des molécules de structure proche
ayant des résonances en commun. L’application de cette nouvelle approche est en cours sur des
extraits plus complexes afin de parfaire sa mise au point.
Références bibliographiques : - H. Wagner et G. Ulrich-Merzenich, « Synergy research: Approaching a new generation of
phytopharmaceuticals », Phytomedicine , vol. 16, n o 2-3, p. 97-110, mars 2009.
- M. Hamzaoui, J.-H. Renault, J.-M. Nuzillard, R. Reynaud, et J. Hubert, « Stepwise Elution of a Three-
phase Solvent System in Centrifugal Partition Extraction: A New Strategy for the Fractionation and
Phytochemical Screening of a Crude Bark Extract », Phytochem Anal , févr. 2013.
Mots-clés : substances naturelles, Extraction de Partage Centrifuge, RMN 13C, métabolomique
92
P32
Secondary metabolites profiling of the invasive Fallopia japonica: variability
between populations from France and Japan ?
Buonomo A 1 , Meiffren G
1 , Puijalon S
2 , Bellvert F
1 , Rouifed S
2 , Comte G
1 , Piola F
2
1 CESN, UMR 5557, CNRS Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne F-69622 France
2 UMR 5023, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne F-69622 France
Biological invasions are increasingly recognized as important elements in global change and constitute an
important factor in the loss of biodiversity (Vitousek et al , 1996). Most invasive plants are phytochemically
unique in their habitats, and many of the phytoconstituents from these plants have been reported to have
multiple activities, including antiherbivore, antifungal, antimicrobial and allelopathic effects, which provide
the plants with several advantages in their new environments (Cappucino and Arnason, 2006).
Japanese knotweed Fallopia japonica is a well-known East Asian perennial that was introduced to Europe in
the 19 th century as ornamental plant. It rapidly expanded throughout Europe and North America with
functional impacts such as modifying ecosystems by altering nutrient cycles (Dassonville et al ., 2007 & 2011)
and threatening endemic biodiversity by reducing the plant species diversity of invaded sites (Vanderhoeven et
al ., 2005; Gerber et al ., 2008). Allelopathic properties and chemical composition of rhizome extracts from
different species of Fallopia have been reported (Vrchotova and Sera, 2008; Bertrand et al ., 2008; Fan et al .;
2009 & 2010; Murrell et al ., 2011) and could be involved in the invasive capacities of F. japonica .
As the presence of different metabolites might confer ecological advantages to the introduced varieties, the
aim of this work was to find out whether the invasive plants growing in France differed in their secondary
metabolites composition from the native plants growing in Japan. Plants were collected from different areas
in Japan (5 genotypes) and in the Rhône-Alpes region in France (1 genotype). Clonal individuals were
obtained and roots hydro-alcoholic extracts have been performed and analyzed by UHPLC/DAD/ESI-Q-
TOF. Retention time of each peak of the chromatograms was aligned and its relative intensity recorded in a
matrix (24 samples, 174 components) to perform PCA.
Secondary metabolites profiles showed some similarities in the phytochemical composition between French
and Japanese extracts. Main peak of the profiles were phenolic compounds, UV and mass spectra were
characteristic of flavanols, stilbenes, anthraquinones and di-anthrones that were identified for the first time in
F. japonica.
PCA showed an obvious discrimination between the French and Japanese individuals. French plants were
almost identical. Statistical analysis based on Wilcoxon rank-sum test didn’t reveal any significant
differences in the composition of chemical weapons between French and Japanese individuals but the
relative quantity of stilbenes and anthraquinones for which interesting bioactivities have already been
reported (Jayatilake et al., 1993) tended to be higher in French populations.
Références bibliographiques : Bertrand C et al. (2008) Planta Med 74(9):1134-1134.
Cappucino N, Arnason JT (2006) Biol Lett 2:189-193.
Dassonville N, et al. (2007) Ecoscience 14:230-240.
Dassonville N, et al. (2011) Biol Invasions 13:1115-1133.
Fan P, et al. (2009) Biochem Syst Ecol 37:24-34.
Fan P, et al. (2010) Chemoecol 2:223-227.
Gerber E, et al. (2008) Biol Conservation 141:646-654.
Jayatilake GS, et al. (1993) J Nat Prod 56:1805–1810.
Murrell C, et al. (2011). Am J Bot 98:38-43.
Vanderhoeven S, et al. (2005) Plant Soil 275(1/2):169-179.
Vitousek PM, et al. (1996) Am Sci 84:468-478.
Vrchotova N, Sera B (2008) Plant Soil Environ 54(7):301-303.
Mots-clés : Invasion, secondary metabolism, Fallopia, LC-MS
93
P33
Développement d’une méthode LC/ESI/MS/MS pour la détermination
simultanée de 8 vitamines hydrosolubles dans des farines de blé, des pâtons, du
pain et des pains grillés
Nurit Eric
1 , Lyan Bernard
1 , Piquet Agnès
2 , Branlard Gérard
3 , Pujos-Guillot Estelle
1
1 INRA, UMR1019, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, UNH, F-63000 Clermont-Ferrand, France
2 VetagroSup, Campus Agronomique de Clermont, 89 avenue de l’Europe, BP35, F-63370 Lempdes
3 INRA, UMR 1095, Génétique, Diversité et écophysiologie des céréales, site de Crouël, F-63039 Clermont-
Ferrand, France
L’amélioration de l’état nutritionnel de la population constitue, en ce début de XXI e siècle, un
enjeu majeur pour les politiques de santé publique menées en France, en Europe et dans le monde.
Fort de ce constat, il semble donc normal de vouloir s’interroger sur l’impact des procédés de
production et d’intensification des cultures dans l’agriculture. Le blé est la seconde céréale la plus
largement cultivée dans le monde. Elle est également la plus consommée par les hommes après
transformation en pain, pâtes, biscottes, biscuits et beaucoup d’autres produits. Par conséquent le
blé apporte une importante contribution aux besoins nutritionnels quotidiens pour les humains. Il
apparait donc nécessaire au vue des enjeux de développer la caractérisation du métabolome du blé
et de préciser les facteurs génétiques associés à sa valeur nutritionnelle. L’objectif principal de ce
travail a été de développer une méthode de chromatographie liquide suivie d’une analyse en
spectrométrie de masse LC/MS à la fois rapide et à haut débit permettant la détermination
simultanée de 8 vitamines hydrosolubles dans quatre matrices végétales différentes (de la farine de
blé, des pâtons, des pains et des pains grillés). La mise en place d’une méthode d’extraction rapide
permettant la libération totale des vitamines hydrosolubles sous leurs formes libres ainsi qu’une
injection directe de l’extrait d’hydrolyse sans aucune étape de purification ou de concentration a
rendu possible l’analyse des vitamines en un seul « run ». Les résultats ont montré que la méthode
LC-ESI-MS/MS développée est suffisamment sensible et sélective (la linéarité ainsi que la
spécificité de la méthode appréciées par des tests de Fisher et de Student ont été significativement
concluants) pour être appliquée dans la détermination des teneurs naturelles en vitamines dans les
quatre matrices. La fidélité Intra- et Inter-jours de la méthode évaluée par le coefficient de variation
se situe dans un intervalle compris entre 2.21% et 11.35% pour l’ensemble des vitamines. La
méthodologie développée a été appliquée à la mesure de ces métabolites sur des farines de blé de
type T110 ainsi que sur les produits dérivés de la transformation de ces farines (pâtons, pains et
pains grillés).
Références bibliographiques : A Gentili, F Caretti, G D’Ascenzo, S Marchese, D Perret, D Di Corcia, L Mainero Rocca (2008) Rapid
Commun. Mass Spectrom.; 22: 2029–2043.
A Leporati, D Catellania, M Sumana, R Andreolib, P Maninib, WMA Niessenc (2005) Analytica Chimica
Acta, 531, 87–95.
Z Chen, B Chen, S Yao (2006) Analytica Chimica Acta 569, 169–175
F Batifoulier, MA Verny, E Chanliaud, C Rémésy, C Demigné (2006) Europ. J. Agronomy 25, 163–169.
S Ndaw, M Bergaentzlé, D Aoudé-Werner, C Hasselmann (2002) Food Chemistry 71, 129–138
Mots-clés : vitamines hydrosolubles, LC-ESI-MS/MS, Blé, farine T110, Pâton, pain, pains grillés
94
P34
Metabolomics of growth and type B trichothecenes production in Fusarium
graminearum
L. Legoahec 1,
V. Atanasova-Penichon 1 , N. Ponts
1 , C. Deborde
2,3 , M. Maucourt
3,4 , S.
Bernillon 2,3
, A. Moing 2,3
, F. Richard-Forget 1
1 INRA, UR1264-MycSA, CS20032, 33140 Villenave d’Ornon, France;
2 INRA, UMR1332 Fruit Biology, CS20032, 33140 Villenave d’Ornon, France;
3 Metabolome Facility of Bordeaux Functional Genomics Center, IBVM Centre INRA de Bordeaux, CS20032, 33140
Villenave d’Ornon, France; 4 Univ. Bordeaux, UMR1332 Fruit Biology and Pathology, Centre INRA de Bordeaux, CS20032, 33140 Villenave
d’Ornon, France
The plant fungal pathogen Fusarium graminearum can produce type B trichothecenes, a family
of sesquiterpene molecules with toxic properties upon human or animal ingestion. Deoxynivalenol,
or DON, and its acetylated forms belong to this family of secondary metabolites and are frequent
contaminants of cereals worldwide.
The biosynthesis of trichothecenes initiates with the condensation of two molecules of farnesyl
pyrophosphate, at the end of the mevalonate pathway in Fusarium ’s metabolomics chart, and is
under the control of various factors such as the redox parameters of the environment or carbon
source. For example, supplementing liquid submerged cultures of F. graminearum with phenolic
acids was shown to reduce the accumulation of DON and its acetylated forms in the medium. Such
result, however, gives a partial glimpse of the effect of phenolic acids, from the trichothecene
production point of view only.
The present study analyzed F. graminearum ’s metabolome in conditions when DON and its
acetylated forms are produced. Mass spectrometry and nuclear magnetic resonance were used to
identify metabolites produced by the fungus, secreted in the culture medium or not, over the course
of 14 days.
Fifty-two polar and semi-polar metabolites were identified in the culture medium, i.e., the exo-
metabolites, and/or in the mycelium, i.e., the endo-metabolites. Among them are amino acids and
derivatives, sugars, polyketides, and terpenes including trichothecenes. We found that samples
composition varies over time in terms of primary metabolites as well as secondary metabolites. In
the presence of caffeic acid, a phenolic acid that reduces the accumulation of DON and its
acetylated forms in the culture medium, endo- and exo-metabolic profiles are different from the
ones observed in not supplemented cultures. Signature metabolic profiles were identified for both
conditions and are different depending on the exo- or the endo-metabolites are considered.
Mots-clés : metabolomics; secondary metabolite; Fusarium graminearum
95
P35
Metabolomic approach using NMR to study the regulation of energy metabolism
on chicken lines divergently selected for low or high abdominal fat deposition
Lalande Julie
1 , Gondret Florence
2 , Louveau Isabelle
2 , Tea Illa
1 , Duclos Michel
3 ,
Baéza Elisabeth3
1 CNRS, Chimie et Interdisciplinarité: Synthèse, Analyse, Modélisation (CEISAM), UMR 6230, Faculté des Sciences,
Université de Nantes, BP 92208, 2 rue de la Houssinière, F-44322 Nantes Cedex 03, France 2 INRA, UMR1348 Physiologie, Environnement et Génétique pour l'Animal et les Systèmes d'Elevage (PEGASE), F-
35590 Saint-Gilles, France 3 INRA, UR 83 Recherches Avicoles, F-37380 Nouzilly, France
The feed cost represents about 60% of total cost in broiler production. In a context of high prices for
raw materials used in animal feed, it is therefore necessary to optimize feed efficacy and particularly the use
of dietary energy. For monogastric animals, feed energy is mainly provided by cereals presenting high starch
content and oil. The aim of this study was to analyze how broilers can adapt their energy metabolism
according to dietary energy source.
For that purpose, we reared 48 chickens issued from two lines divergently selected on the abdominal fat
content (3.4 and 1.3% relative to body weight for FL and LL lines, respectively) and fed from 3 to 9 weeks
of age with two different diets, HF and LF containing 80 and 20 g of lipids/kg of feed, and 379 and 514 g of
starch/kg of feed, respectively. Both diets were isoproteic (190 g crude proteins/kg of feed) and isoenergetic
(3000 kcal metabolisable energy/kg of feed). At 9 weeks of age, blood samples were collected on heparin
from all chickens, 3 hours after feed distribution in order to analyze plasma metabolites.
A metabolomic approach using the 1D 1 H NMR experiments was recorded on a Bruker Avance 500
spectrometer with a cryoprobe. NOESY 1D NMR sequence including water presaturation was used to obtain
plasma metabolic profiles. After identifying metabolites, a statistical approach was applied on data for
metabolites discrimination. The statistic tests included univariate (ANOVA, BoxPlot) and multivariate
analysis (PCA, PLS-DA) using the free R software and SIMCA P+ (Umetric®), respectively.
The multivariate analysis allowed discriminating the four groups. Among the 38 identified metabolites,
six had the main effects: glutamine, histidine, betaine, lipids, methionine and low density lipoproteins (LDL).
FL chickens had lower plasma levels of glutamine and histidine but higher plasma levels of betaine,
methionine and lipids than LL chickens. These data confirmed the highest ability of FL chickens to
synthesize lipids and to use glucogenic amino acids (AA) for this metabolism thus increasing the plasma
level of lipids for a further deposition in peripheral adipose and muscle tissues and decreasing the plasma
pool of free glutamine and histidine. Chickens fed with HF diet had higher plasma levels of lipids,
glutamine, methionine and betaine and lower plasma level of LDL than chickens fed with LF diet. The
circulating lipids were mainly provided by HF diet and were directly deposited in peripheral adipose and
muscle tissues with a low return towards the liver explaining the low level of plasma LDL. With HF diet,
chickens decreased the hepatic use of glucogenic AA which level then remained high in plasma.
The more interesting was the effect of line and diet on the plasma levels of methyl donors (methionine
and betaine) suggesting the implication of methionine and folate metabolisms in the control of hepatic lipid
synthesis.
This project was supported by the French ANR FatInteger program (ANR-11-BSV7-0004).
Mots-clés : Metabolomics, NMR, chicken, plasma, diet
96
P36
Use of NMR-based metabolomic to study cold stress on Miscanthus
Hyacinthe Le Gall, Jean-Xavier Fontaine, Roland Molinié, Jean-Marc Domon, Jérôme
Pelloux, Catherine Rayon, François Mesnard, Françoise Gillet, Ophélie Fliniaux.
EA 3900-BIOPI, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens, France
Miscanthus is a potential energy crop grass with several advantages in biomass production
(Glowacka, 2011). However, it can be damaged by late frost when shoots emerge too early in the
spring and during the first winter after planting (Farrell et al, 2006). The effects of cold acclimation
on cell wall composition has been described in Domon et al (2013). Herein, the effects of cold
acclimation on metabolome were investigated in different Miscanthus ecotypes.
NMR metabolomic approach was largely used to assess the impact of stress conditions on
plants (Kim et al, 2011). Within this context, a 1H NMR metabolomic study was performed on
frost-sensitive, frost-resistant or intermediate Miscanthus. After 28 days of culture in a growth
chamber (Zub et al, 2012), the different ecotypes were grown under cold acclimation or under
control conditions during 4 and 8 days then aerial parts were harvested, extracted and analysed by 1H NMR. Multivariate data analysis revealed a clear separation between the different ecotypes in
standard culture conditions and between cold acclimation and control conditions for the same
ecotype. The metabolites corresponding to the discrimination were identified using 1D and 2D
NMR spectra.
Références bibliographiques : Glowacka, 2011. A review of the genetic study of the energy crop Miscanthus. Biomass Bioenerg 35, 2445–
2454.
Farrell et al, 2006. Genotypic variation in cold tolerance influences the yield of Miscanthus. An. Appl Biol
149, 337–345.
Domon et al, 2013. Cell wall compositional modifications of Miscanthus ecotypes in response to cold
acclimation. Phytochemistry 85, 51–61.
Kim et al, 2011. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotechnol.
29, 267–275.
Zub et al, 2012. The frost tolerance of Miscanthus at the juvenile stage: differences between clones are
influenced by leaf-stage and acclimation. Eur J Agron 36, 32–40.
Mots-clés : Miscanthus; Cold stress; NMR metabolomic
97
P37
Development of a high-throughput fingerprinting protocol for carotenoids and polyphenols in
tropical root and tuber crops
Ismael MUÑOZa, Vincent LEBOT
b, Laurent LEGENDRE
a
a CNRS, UMR 5557, Ecologie Microbienne, Université Lyon 1, Université de Lyon, F-69622 Villeurbanne,
France b CIRAD UR 75, P.O. Box 946, Port-Vila, Vanuatu
Background
Cassava, taro and the greater yam (tropical root and tuber crops) are major sources of starch in
developing tropical countries around the world. Nevertheless, they are often poor in secondary
metabolites such as carotenoids and polyphenols, representing a good opportunity for
biofortification. The human health benefits of consuming secondary metabolites are broad and are
the subject of an increasing number of epidemiological studies
Aim
With the long-term goal of identifying varieties for the development of plant breeding programmes
and studying the relationship between geographic distribution, genetic and chemical diversity of
tropical root and tuber crops varieties in Vanuatu (South Pacific), this study aimed to develop a
high-throughput fingerprinting protocol for carotenoids and polyphenols in these species
Methodology
Sampling was carried out at the experimental site in VARTC (Vanuatu Agricultural Research and
Technical Centre, Espiritu Santo) from July to September 2012. Germplasm was harvested when
fully mature to limit differences due to ontogeny. A core-sample of 352 accessions from the
VARTC collection was assembled to represent the full range of variation in flesh colour of the
storage organs. Inner tuber samples were excised, frozen and freeze-dried before being shipped to
France for carotenoids and polyphenols extraction and analysis by HPLC/DAD
Results
We developed the extraction and chromatographic protocols to analyse a wide range of phenolic
and carotenoid compounds in these species. Around 60 anthocyanins, flavonoids, phenolic acids
and carotenoids were identified based on retention time and UV-vis spectrum data
Conclusions
Our preliminary results indicate that tropical root and tuber crop varieties of Vanuatu differ
generally in their phenolic and carotenoid profiles or content and these differences can be exploited
to spot potentially useful parental varieties for future breeding programmes.
98
P38
A NMR-based metabolomic study of plant-insect interaction : Solanum
chomatophilum- Macrosiphum euphorbiae
Vincent Le Roux a , Roland Molinié
b , Jean-Xavier Fontaine
b , Philippe Giordanengo
c ,
François Mesnard b .
a EDYSAN EA 4698, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens, France. b EA 3900-BIOPI, Université de Picardie Jules Verne, 80000 Amiens, France.
c Institut Sophia Agrobiotech, CNRS 7254 – INRA 1355, Université de Nice Sophia Antipolis, 06903 Sophia
Antipolis, France.
The wild potato Solanum chomatophilum (Bitter) is an interesting model for crop protection against
aphids such as Macrosiphum euphorbiae (Thomas), as this plant presents a strong antibiosis
defense, which could be due to toxic compounds, but only on mature leaves. Indeed, the young
leaves are susceptible to this aphid [1, 2]. As leaf age, the pre-infestation by aphids is likely to
modify Solanum defense [3]. This would suggest a different content in metabolites as a function of
leaf age. To determine the compounds implied in S. chomatophilum defense in young and mature
leaves previously infested or not by aphids, we used NMR metabolomic [4]. Multivariate data
analysis revealed a clear separation between the different leaves previously infested or not by
aphids. The metabolites corresponding to the discrimination were identified using 1D and 2D NMR
spectra. Trigonelline, GABA, malic acid and phenylalanine were notably discriminant.
Références bibliographiques : [1] Le Roux V. , Dugravot S., Campan E. D. M., Dubois F., Vincent C. & Giordanengo P. (2008) - Wild
Solanum resistance to aphids : antixenosis or antibiosis ? Journal of Economic Entomology 101 : 584-591.
[2] Le Roux V. , Campan E. D. M., Dubois F., Vincent C. & Giordanengo P. (2007) - Screening for
resistance against Myzus persicae (Sulzer) and Macrosiphum euphorbiae (Thomas) among wild species of
Solanum in laboratory. Annals of Applied Biology 151 : 83-88.
[3] Brunissen L. , Cherqui A., Pelletier Y., Vincent C. & Giordanengo P. (2009) – Host-plant mediated
interactions between two aphid species. Entomologia Experimentalis et Applicata 132 : 30-38.
[4] Plischke, A., Y. H. Choi, P. M. Brakefield, P. G. Klinkhamer, and M. Bruinsma. (2012) –
Metabolomic plasticity in GM and non-GM potato leaves in response to aphid herbivory and virus infection.
Journal of agricultural and food chemistry 60: 1488-1493.
Mots-clés : NMR, metabolomic, Solanum chomatophilum, aphids, Macrosiphum euphorbiae
99
P39
NMR METABOLOMICS STUDY OF THE HEPATIC GLUCOSE AND
GLUTAMINE METABOLISM REPROGRAMMATION DURING HCV
INFECTION
Gilles Rautureau 1, Elodie Jobard
1, Pierre Lévy
2, Birke Bartosch
2,3, Bénédicte Elena-
Herrmann 1
1 Centre de RMN à Très Hauts Champs, Institut des Sciences Analytiques, CNRS/ENS Lyon/UCB Lyon 1,
69100 Villeurbanne, France; 2 Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052 CNRS 5286, 69003 Lyon, France;
3 Hospices Civils de Lyon (HCL), 69004 Lyon, France
Gilles Rautureau : [email protected]
Background and aims: Hepatitis C virus (HCV) is known to perturb hepatic glucose and lipid
metabolism with important pathophysiological consequences. Chronic carriers often develop
steatosis, insulin resistance and type 2 diabetes, which resolve with successful antiviral treatment.
The exact circumstances of this metabolic reprogramming still remain vague. Here we show that
HCV infection induces an important reduction of glucose utilization that seems to be in part
compensated by anaplerotic mechanisms following an activation of glutamine metabolism.
Methods: The properties of the hepatitis C virus (HCV) JFH1 isolate have made it possible to
produce and study HCV in an infectious cell culture system. 1 H-NMR-based metabolomic at
600MHz and biological analyses in the context of diverse nutrient situations were performed with
JFH1 infected Huh7.5 cell extracts and supernatants. The metabolic signature was obtained using a
range of univariate and multivariate statistical methods.
Results: NMR-based metabolomic assays showed that HCV infected cells have a reduced glucose
utilization compared to non infected cells. Their lactate production in the absence of glucose is
highly increased in comparison to non infected cells. The alternative source to glucose that drives
the metabolism of HCV-infected cells seems to be glutamine. Indeed, cell proliferation rates of
HCV infected and uninfected cells in conditioned growth media showed that infected cells become
dependent on glutamine and lose their glucose dependence.
Conclusions: Altogether, these data suggest that HCV reprograms the hepatocyte metabolism and
establishes glutamine dependence. This HCV-induced metabolic reprogramming shares some
similarities to that commonly found in many types of tumor cells.
Mots-clés : HCV, RMN, métabolomique
100
P40
NMR metabolomic analysis of Arabidopsis thaliana deficient for pinoresinol
reductases
Romain Roulard, Jean-Xavier Fontaine, Roland Molinié, François Mesnard
Université de Picardie Jules Verne, BIOPI, UFR des Sciences, Ilot des poulies, 33 rue Saint Leu,
80039 Amiens cedex, France
Lignin and lignans are both biosynthesized from the phenylpropanoid pathway and therefore
share the same precursors: the monolignols. Lignin is a complex three-dimensional phenolic
polymer naturally present in the walls of certain specialized cells (xylem, sclerenchyma), where it
plays an important role in plant mechanical support and defense (Huis et al , 2012). Lignans are
dimeric structures containing two monolignols linked together by 8-8’ carbon bonds. The
dimerization of coniferyl alcohol results in the formation of pinoresinol, which is then converted
into lariciresinol and secoisolariciresinol via the action of the pinoresinol-lariciresinol reductases
(PLR; Davin and Lewis, 2003). In Arabidopsis thaliana , the genes coding for these enzymes show
a high level of expression in the xylem vessels (Nakatsubo et al , 2008). This localization
strengthens the hypothesis of a narrow relation between lignin and lignans biosynthesis. The
possibility of a regulation system between lignin and lignan has already been hypothesized when
elicitation experiments performed on flax with Fusarium oxysporum had showed a dramatic
decrease in lignan accumulation and an increase in lignin formation, without lowering the PLR
expression (Hano et al , 2006, Beejmohun et al , 2007). In order to verify this hypothesis,
Arabidopsis thaliana deficients for these enzymes (At1g32100 et At4g13660) were obtained and a
NMR metabolomic analysis was performed on their seeds and compared to wild types. A number of
differences in primary and secondary metabolites accumulation was found.
Références bibliographiques : Beejmohun V, Fliniaux O, Hano C, Pilard S, Grand E, Lesur D, Cailleu D, Lamblin F, Laine E, Kovenski J,
Fliniaux MA, Mesnard F. Coniferin dimerisation in lignan biosynthesis in flax cells. Phytochemistry
(2007), 68, 2744-2752
Davin LB, Lewis NG. An historical perspective on lignan biosynthesis: monolignol, allyphenol and
hydroxycinnamic acid coupling and downstream metabolism. Phytochemistry Review (2003) 7, 257–288
Hano C, Addi M, Bensaddek L, Crônier D, Baltora-Rosset S, Doussot J, Maury S, Mesnard F, Chabbert B,
Hawkins S, Lainé E, Lamblin F. Differential accumulation of monolignol-derived compounds in elicited
flax ( Linum usitatissimum ) cell suspension cultures. Planta (2006), 223, 975-989
Huis R, Morreel K, Fliniaux O, Lucau-Danila A, Fénart S, Grec S, Neutelings G, Chabbert B, Mesnard F,
Boerjan W, Hawkins S. Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation
in flax stems. Plant Physiology (2012), 158, 1-23
Nakatsubo T, Mizutani M, Suzuki S, Hattori T, Umezawa T. Characterization of Arabidopsis thaliana
Pinoresinol Reductase, a New Type of Enzyme Involved in Lignan Biosynthesis Journal of Biol ogical
Chemistry (2008), 283, 15550-15557
Mots-clés : Pinoresinol-lariciresinol reductases, lignans, phenylpropanoids, NMR, Arabidopsis thaliana
101
P41
A systems biology approach for the effect of nitrogen supply on anthocyanin
accumulation in grapevine cell suspensions.
E. Soubeyrand 1*
, S. Colombié 3 , I. Merlin
1 , G. Hilbert
1 , B. Beauvoit
3 , Z.W. Dai
1 , S.
Cluzet 2 , C. Renaud
1 , Y. Gibon
3 , J.M. Mérillon
2 , S. Delrot
1 and E. Gomès
1
1 University of Bordeaux, INRA, ISVV, UMR 1287 EGFV, Bordeaux, France
2 University of Bordeaux, ISVV, EA 3675, GESVAB, Bordeaux, France
3 University of Bordeaux, INRA, UMR 1332 BFP, Bordeaux, France
* Corresponding author: [email protected]
Grapevine berry composition depends on the accumulation of primary (sugar and organic acids) and
secondary metabolites (anthocyanins, flavonols …). Anthocyanin accumulation is influenced by
environmental factors and nutrient supply. High sugar and/or low nitrogen supply stimulate
anthocyanin production in berry skin cells of red grape varieties (Larronde, et al. 1997; Hilbert et
al. 2003). The present work aims to understand the molecular mechanisms involved in the response
of anthocyanin accumulation to changes in nitrogen supply. We applied an integrated approach
combining transcript, enzyme and metabolite profiling, with cell suspensions of cv. Gamay
teinturier cultivated in the presence of two different concentrations on Nitrogen: Low (5 mM of
KNO3 - ) and Control (25 mM of KNO3
- ). Sugar, amino acid and anthocyanin concentrations;
gene expression and enzyme activities were measured and compared. The low nitrogen medium
increased the total anthocyanin content, especially peonidin and petunidin derivatives including
anthocyanin molecules that were not accumulated in high nitrate cultivated cells. Moreover, the low
phenylalanine concentration in low nitrogen-fed cells is in agreement with the increase in
phenylpropanoid catabolic flux, supported by the increase in phenylalanine ammonia-lyase activity.
Gene expression analysis on structural genes involved in anthocyanin synthesis confirmed the
stimulation of the phenylpropanoid pathway. Indeed, transcripts encoding 4 enzymes of the
anthocyanin biosynthetic pathway (phenylalanine ammonia-lyase, chalcone synthase, flavanone-3-
hydroxylase and dihydroflavonol-4-reductase) were higher in nitrogen-limited cell suspensions.
These experimental data will be used for constraint-based modeling, using a Flux Balance Analysis.
For that, a stoichiometric metabolic model including both primary and secondary metabolism will
describe the carbon and the nitrogen flux partitioning in the cells. Assuming a metabolic steady
state at 4 and 6 days of cell culture, and using the metabolite accumulation rates in the biomass, the
fluxes in the network will be calculated. Then, the flux maps could help us to point out the
metabolic changes when nitrogen is supplied to the cells and the model should help to get a
comprehensive view of anthocyanin biosynthetic pathway regulation by nitrogen.
Références bibliographiques : Larronde, F., Krisa, S., Decendit, A., Ch, C., & Deffieux, G. (1998). Regulation of polyphenol production in
Vitis vinifera cell suspension cultures by sugars. Vitis, 946–950.
Hilbert, G., & Gaudillère, J.-P. (2003). Effects of nitrogen supply on must quality and anthocyanin
accumulation in berries of cv . Merlot. Vitis, 42(2), 69–76.
Mots-clés : Nitrogen, Anthocyanin, Flux Balance Analysis
102
P42
Metabolite correlation networks for the study of tropane alkaloid pathway: How
Agrobacterium rhizogenes deregulates the secondary metabolism of Datura
innoxia Mill. plants?
Kieu Oanh Nguyen1, Arnaud Lanoue
2, Eric Gontier
1, Rebecca Dauwe
1
1 Université de Picardie Jules Verne, BIOPI, UFR des Sciences, Ilot des poulies, 33 rue Saint Leu, 80039
Amiens cedex, France 2Université François-Rabelais Tours, Plant Biotechnology and Biomolecules, Faculté des Sciences
Pharmaceutiques, 31 Avenue Monge, 37200 Tours, France
Scopolamine and hyoscyamine are two medically important tropane alkaloids that are
synthesized in the roots of Datura innoxia Mill.. Although the biosynthesis pathway has amply
been studied using isotopic markers, major questions persist up to today, such as concerning the
role of hygrine as a precursor. On the other hand, it is well known that transformation of D. innoxia
with Agrobacterium rhizogenes induces a strong increase in the production of scopolamine and
hyoscyamine. It remains unknown, however, if just the mere fact of an increase in the amount of
young root cells is at the origin of this increased production, or if specific biosynthetic steps are
stimulated.
Here, we quantified a large number of precursors and derivatives of scopolamine and
hyoscyamine in the roots of a large number of transformed and untransformed Datura innoxia
individuals. These metabolites were quantified and structurally identified using a combination of
GC-MS and UPLC-MS. Correlation networks of the metabolites strongly suggested certain
architectural aspects of the hyoscyamine-scopolamine biosynthesis pathways and identified rate
limiting steps. Biosynthetic steps that were specifically up-regulated in the A. rhizogenes
transformed individuals were clearly revealed. Our results suggest thus that metabolite correlation
networks form a promising tool for the unraveling of different biosynthetic pathways.
103
P43
Coordinated methodological developments for plant metabolomics at Bordeaux
Stéphane Bernillon 1*
, Benoît Biais 1 , Catherine Deborde
1* , Lætitia Fouillen
2* , Yvon
Guntz1 , Daniel Jacob
1* , Mickaël Maucourt
3* , Yves Gibon
1* , Éric Pedrot
4* , Tristan
Richard 4*
, Annick Moing 1*
1 INRA, UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
2 CNRS, UMR 5200 Laboratoire de Biogenèse Membranaire, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon,
France
3 Université de Bordeaux, UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave
d’Ornon, France
4 Université de Bordeaux, GESVAB, 71 av Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
* Plateforme Métabolome du Centre de Génomique Fonctionnelle Bordeaux, IBVM, Centre INRA Bordeaux, 71 av
Edouard Bourlaux, 33140 Villenave d’Ornon, France
Bordeaux Metabolome Facility (BMF) is dedicated to plant metabolomics from chemical to data
analyses. Besides routine analyses, this facility has developed methods to improve metabolome and
lipidome coverage, facilitate metabolite identification, and increase throughput from extraction to
data processing. This poster focuses on three on-going method developments:
(1) Lipidomics has been established at BMF in 2010 (a). To improve lipid coverage, a method
involving LC-QTRAP-MS has been developed for quantification and characterization of
triacylglycerols.
(2) Identification is a key point in metabolomics to link biomarkers discovery to biological
information. A pipeline has been developed to identify metabolites by a combination of LC-MS and
LC-NMR (b), as exemplified by metabolite identification in tomato organs.
(3) In order to increase the throughput of 1 H-NMR metabolomic profiling, sample preparation has
been improved through robotization of extraction and titration, eventually revealing the bottleneck
of data processing. Therefore, an automated binning tool for NMR spectra has been developed to
speed up bin design and integration calculations (c). Moreover, chemical information can be
highlighted by bin clustering and use of reference spectra libraries, thus providing a helpful support
for compound identification.
In the near future, these three types of development will allow BMF to achieve new ambitious plant
metabolomics projects.
Fundings: INRA National Commission of Joint Tools (CNOC), IBiSA (Infrastructures in Biology,
Health and Agronomy) and Functional Genomic Center Bordeaux
Références bibliographiques : a- Cacas et al. 2012 Anal Bioanal Chem DOI: 10.1007/s00216-012-6060-1
b- Acevedo et al. 2012 Anal Chim Acta DOI: 10.1016/j.aca.2011.11.060
c- Jacob et al. 2013 Anal Bioanal Chem DOI 10.1007/s00216-013-6852-y
Mots-clés : Développement technologique, RMN, LC-MS, Métabolomique, bioinformatique
104
P44
Approche métabolomique de la résistance de la vigne au mildiou
Clémence Grosab
, Anne Poutaraudab
, Emilce Pradoab
, Christophe Schneiderab
, Sabine Wiedemann-
Merdinogluab
, Raymonde Baltenweck-Guyotb, Philippe Hugueney
ab, Didier Merdinoglu
ab
a INRA, UMR 1131, SVQV, 68000 Colmar, France
b Université de Strasbourg, UMR 1131, SVQV, 68000 Colmar, France
En vue de limiter l’application de produits phytosanitaires sur la vigne, l’équipe de Génétique
et d’Amélioration de la Vigne de Colmar développe des variétés résistantes (1). La création de ces
variétés est réalisée par introgression de différents gènes de résistance provenant d’espèces
asiatiques ou américaines dans des variétés sensibles de l’espèce Vitis vinifera présentant de bonnes
qualités viticoles et vinicoles (2, 3). Dans ce cadre, la connaissance des mécanismes biochimiques
liés à ces gènes est importante. L’interaction entre la vigne et le mildiou (Plasmopara viticola)
provoque chez la plante une cascade de réactions qui conduit à la sensibilité ou à la résistance.
L’objectif de notre étude vise à identifier les molécules intervenant dans le mécanisme d’un facteur
de résistance de la vigne au mildiou provenant de Muscadinia rotundifolia : RPV2.
Sept génotypes ont été étudiés. Cinq issus d’une population correspondant au 4ème retro
croisement de Vitis vinifera (sensible) sur des plantes présentant le facteur de résistance RPV2 issu
de Muscadinia rotundifolia et leur 2 parents. Ainsi ont été analysés 3 genotypes sensibles au
mildiou et 4 génotypes résistant présentant RPV2.
Des feuilles de niveau 6 de chacun de ces génotypes ont été prélevées en serre puis inoculées
avec du mildiou ou placées dans de l’eau (control). Des disques foliaires de 2 cm de diamètre ont
été prélevés à différents temps post traitement : 0h, 12h, 24h, 48h, 72h puis extraits avec du
méthanol à chaud. Ces extraits ont été analysés avec une UHPLC Ultimate 3000 (Dionex) couplée à
un spectromètre de masse Orbitrap Exactive (Thermo). Les analyses ont été effectuées en mode
positif et négatif avec une méthode chromatographique de 30 min (gradient acétonitrile eau).
Les résultats sont en cours d’analyse avec le logiciel SIEVE 1.3 (Thermo) avec une approche
ciblée sur certaines molécules d’intérêt et non ciblée. Plusieurs centaines de « frames » (masse
précise à un temps de rétention donné) ont été extraits de ce jeu de données.
La comparaison des sept génotypes, présentant ou non le facteur de résistance au mildiou
RPV2, à différents temps post infection a déjà permis de mettre en évidence plusieurs familles de
molécules impliquées dans la résistance dont certains stilbènes mais également d’autres molécules
en cours d’identification.
Références bibliographiques : 1. Merdinoglu, D., Merdinoglu-Wiedemann, S., Mestre, P., Prado, E., and Schneider, C. (2009) The
contribution of varietal innovation to the reduction of pesticide inputs in the vineyard: the example of
resistance to mildew and oidium, Progres Agricole et Viticole 126, 244-247.
2. Perazzini, R., Leonardi, D., Ruggeri, S., Alesiani, D., D'Arcangelo, G., and Canini, A. (2008)
Characterization of Phaseolus vulgaris L. Landraces Cultivated in Central Italy, Plant Food Hum Nutr 63,
211-218.
3. Blanc, S., Wiedemann-Merdinoglu, S., Dumas, V., Mestre, P., and Merdinoglu, D. (2012) A reference
genetic map of Muscadinia rotundifolia and identification of Ren5, a new major locus for resistance to
grapevine powdery mildew, TAG. Theoretical And Applied Genetics. Theoretische Und Angewandte
Genetik 125, 1663-1675.
105
P45
Identification de signatures métabolomiques sériques séquentielles de la récidive
après traitement par radiofréquence d’un carcinome hépatocellulaire sur
cirrhose par RMN 1H
C.Goossens1, M.Triba
1, M.Yaziciyan
1, O.Seror
2, P.Savarin
1, P.Nahon
2
1 Université Paris 13, Sorbone Paris Cité, CSPBAT, UMR 7244, CNRS, Bobigny, France
(METEVBO : plateforme Métabolomique Evry-Bobigny) 2 Service d’Hépatologie, Université Paris 13, Hôpital Jean Verdier, Bondy, France
Contexte : Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le plus fréquent des cancers primitifs du foie.
La tumeur s’accroissant très rapidement, le taux de survie ne dépasse pas 5% après cinq ans si la
personne n’a pas été traitée. La cirrhose est considérée comme une condition précancéreuse
prédisposant au développement du CHC. Les causes de cette atteinte hépatique sont essentiellement
les virus de l’hépatite B, C et la consommation excessive d’alcool. Alors que l’ablation par
radiofréquence (RFA) est un des traitements les plus utilisés, la récurrence tumorale est de l’ordre
de 50% suite à ce traitement. A l’heure actuelle, le pronostic de ces patients est particulièrement
délicat à préciser. Les praticiens hospitaliers manquent de marqueurs cliniques et biologiques
fiables pour classifier le CHC. C’est pourquoi, la métabolomique apparaît être une technique de
choix permettant d’identifier et de caractériser de nouveaux biomarqueurs. Elle permet d’identifier
et de quantifier des métabolites dans un fluide biologique.
Objectifs : Identifier un profil métabolomique sérique associé à la récidive du petit CHC traité par
radiofréquence. Déterminer des biomarqueurs susceptibles d’affiner la prédiction de la récidive et le
pronostic de patients traités.
Matériel et méthodes : 19 patients présentant un CHC développé sur foie cirrhotique et éligibles
pour la RFA ont été présélectionnés. Trois sera correspondant aux temps J (jour précédent la RFA),
J+1 (1 jour après la RFA) et J+30 (30 jours après la RFA, plus de traces de nodules visibles) ont été
prélevés. Chaque échantillon de sérum est analysé par RMN 1H à 23°C sur un spectromètre Bruker
500 MHz suivant la séquence d’acquisition CPMG. Le traitement des différents spectres obtenus est
réalisé à l’aide du logiciel NMR Pipe (Delaglio et al, 1997). Les méthodes statistiques multivariées
utilisées sont de type analyse en composantes principales ACP et OPLS.
Résultats préliminaires : L’analyse multivariée supervisée permet de discriminer les échantillons J
des échantillons J+1. Nous avons dans un deuxième temps réalisé une seconde étude statistique sur
les échantillons J+1 et J+30. Les biomarqueurs mis en évidence dans ces deux modèles sont très
similaires. Nous avons ainsi établi une signature métabolique caractérisant l’ablation par
radiofréquence.
Conclusion : Ces résultats sont de bon augure. L’analyse du suivi longitudinal des sera séquentiels
sera effectuée de manière à déterminer des biomarqueurs susceptibles d’affiner la prédiction de la
récidive et le pronostic de patients traités.
106
P46
Development of a work-flow for high performance thin layer chromatography
data processing for untargeted metabolomics
Coralie Audoin
(1,2), Khadidja Romari
(2), Olivier P. Thomas
(1), Grégory Genta-Jouve
(1,3)
(1) Nice Institute of Chemistry UMR 7272 CNRS-PCRE, University of Nice-Sophia Antipolis, Parc Valrose,
06108 Nice, France email: [email protected]
(2) GREENSEA SAS, Promenade du Sergent Jean-Louis Navarro, 34140 Mèze, France
(3) School of Biosciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, United Kingdom
Nowadays, most of the metabolomics studies are performed using NMR or MS techniques [1]. One
technique however seems to have been left apart in this field: the high performance thin layer
chromatography (HPTLC). Although the different practical steps of a HPTLC experiment are now all
automated, this technique is suffering the lack of computational treatment of the data. A large number
of qualitative and quantitative protocols have been developed using HPTLC for the study of plants
extracts [2-4]. While for quantitative analyses UV detection is mainly use, qualitative comparisons of
different samples are often realized by direct visualization of the plates.
In this context we developed the first work-flow dedicated to the analysis of HPTLC data, including
the steps commonly used in metabolomics analyses. This development resulted in the increase of
features detected, and more importantly, in the reduction of the common diffusion drift observed
during HPTLC plate development.
Références bibliographiques : [1] R. Schuhmacher, R. Krska, W. Weckwerth, R. Goodacre, Anal. Bioanal. Chem. (2013) 1–2.
[2] X.-H. Wang, P.-S. Xie, C. W. Lam, Y.-Z. Yan, Q.-X. Yu, J. Pharm. Biomed. Anal. 49 (2009) 1221–1225.
[3] S. Bonny, L. Paquin, D. Carri´e, J. Boustie, S. Tomasi, Analytica Chimica Acta 707 (2011) 69–75.
[4] J. P. Piwowarski, A. K. Kiss, Phytochem. Anal. (2013).
107
Communications Etudiants Master Nantais
EM1
Présentation du Master 2 A3M (Analyse, Molécules, Matériaux, Médicaments)
Renaud BOISSEAU
Laboratoire CEISAM, Groupe EBSI, CNRS-Université de Nantes UMR6230, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes
cedex,
EM2
L'apport de la métabolomique pour la toxicologie.
Jérémy MARCHAND, Marie ALLAIN, Renaud BOISSEAU, Sylvain KENAN, Elise
LEMASSON, Alexis RIPOCHE
Université de Nantes UMR6230, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes cedex
EM3
L'apport de la métabolomique pour l'étude de l'obésité
Estelle N'TSIBA, Dalinda BEN ZINA, Claire BIERLING, Simon GIRAUD, Tiffany
GUITTET, Nicolas GUILLOPE
Université de Nantes UMR6230, 2 rue de la Houssinière, 44322 Nantes cedex
108
Atelier 1
Initiation au traitement de données de métabolomique
obtenues par RMN
Personnes encadrant la formation : Roland Molinié, Jean-Xavier FONTAINE
Public envisagé et les prérequis :
- Public : novice ou initié en programmation
- Prérequis : connaissance du principe de la métabolomique par RMN
Compétences acquises à la sortie de la formation : aperçu de certaines méthodes d’alignement et de
« binning »
Objectif de la formation :
Initiation au traitement de données de métabolomique obtenues par RMN. Exemples
d’utilisation d’algorithmes développés sous Matlab (Mathworks). Travail pratique sur un
jeu de données réalisées dans le cadre du test inter-plateformes du RFMF (metaboring) :
Compétences acquises à la sortie de la formation :
- Alignement des spectres (utilisation de l’algorithme icoshift1)
- « Binning » simple et adapté2
- Traitement statistique simple (ACP, …)
Durée de la formation : 2 heures.
Date : Lundi 10 juin à 10H en salle informatique, sur le lieu des 7 JS RFMF
Format : Travail pratique sur ordinateur (a priori, 2 personnes par ordinateur)
Nb de places max : 30 personnes (2 par ordinateur).
Références bibliographiques :
1 : F. Savorani, G. Tomasi, S.B. Engelsen, icoshift: A versatile tool for the rapid alignment of 1D
NMR spectra, J. Magn. Reson. (2010) 202: 190-202
2 : P. E. Anderson, D. A. Mahle, T. E. Doom, N. V. Reo, N. J. DelRaso, M. L. Raymer. Dynamic
adaptive binning: an improved quantification technique for NMR spectroscopic data.
Metabolomics (2011) 7 : 179-190
109
Atelier 2
Exploitation des données acquises par Spectrométrie de Masse.
Personnes encadrant la formation : Frédérique Courant, Christophe Junot, Jean-Charles Martin,
Estelle Pujos-Guillot
Public envisagé et les prérequis :
- Public : toute personne pratiquant ou désireuse de pratiquer l'analyse métabolomique par
spectrométrie de masse ; adapté aux débutants « éclairés » mais non spécialistes
- Prérequis : Connaissance pratique de la spectrométrie de masse ; notions de traitement des
données par xcms
Objectif de la formation :
● Traitement des données : parfaire ses connaissances sur l’utilisation des scripts xcms et leurs
différentes fonctions / arguments en fonction de la forme des données brutes (GC ou LC, LR ou
HR…),
● Quality Controls : apprendre à utiliser les Quality Controls dans un objectif de diagnostique des
pitfalls et de correction de la dérive analytique,
● Identification des biomarqueurs : acquérir des bases d’élucidation structurale (application des 7
règles d’or pour arriver à une formule brute, spectrométrie de masse multidimensionnelle pour
approcher la formule développée, interrogations de bases de données en ligne, construction de
banque de données interne).
Compétences acquises à la sortie de la formation : meilleure connaissance du pipeline
métabolomique, du traitement des données MS à l’élucidation structurale des candidats
biomarqueurs.
Durée de la formation : 3 heures.
Date et lieu : Mercredi 12 juin à 14h -17h , Amphi Baudelocque, sur le lieu des 7 JS RFMF.
110
Atelier 3
Techniques d’acquisition et de suppression de solvant en RMN 1D.
Personnes encadrant la formation : Serge Akoka, Illa Tea, Patrick Giraudeau.
Public envisagé et les prérequis :
- Public : Toute personne pratiquant ou désireuse de pratiquer l'analyse métabolomique par RMN ;
- Prérequis : Connaissance pratique de la RMN 1D et notions de base en RMN 2D.
Objectif de la formation :
Acquérir ou parfaire les bases théoriques et pratiques de la suppression du signal de l'eau en RMN-
1D à visée quantitative.
Compétences acquises à la sortie de la formation : vision objective des performances analytiques
(justesse, précision, robustesse) des différentes stratégies.
Durée de la formation : 2 heures.
Date et lieu : Mercredi 12 juin à 14h dans l’amphi Parmentier sur le lieu des 7 JS RFMF.
111
Atelier 4
How to submit data to MetaboLights ?
Personnes encadrant la formation : Kenneth Haug et Reza Salek, EBI Cambridge UK.
EMBL - European Bioinformatics Institute. Wellcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge, CB10 1SD, UK
Public envisagé et les prérequis :
o Expérimentateurs qui travaillent sur la gestion des données métabolomiques
o Bioinformaticiens
o Personnes qui souhaitent déposer des données lors d’une publication
Objectif de la formation:
L'objectif est d'acquérir une connaissance de l’architecture de la base MetaboLights et une certaine
autonomie dans le dépôt et la recherche de données métabolomiques.
Overview of MetaboLights: MetaboLights (http://www.ebi.ac.uk/metabolights) is the first general-
purpose, open-access repository for metabolomics studies, their raw experimental data and
associated metadata, maintained by one of the major open-access data providers in molecular
biology. Metabolomic profiling is an important tool for research into biological functioning and into
the systemic perturbations caused by diseases, diet and the environment. The effectiveness of such
methods depends on the availability of public open data across a broad range of experimental
methods and conditions. The MetaboLights repository, powered by the open source ISA
framework, is cross-species and cross-technique. It will cover metabolite structures and their
reference spectra as well as their biological roles, locations, concentrations and raw data from
metabolic experiments. Studies automatically receive a stable unique accession number that can be
used as a publication reference (e.g. MTBLS1). At present, the repository includes 15 submitted
studies, encompassing 93 protocols for 714 assays, and span over 8 different species including
human, Caenorhabditis elegans, Mus musculus and Arabidopsis thaliana. Eight hundred twenty-
seven of the metabolites identified in these studies have been mapped to ChEBI. These studies
cover a variety of techniques, including NMR spectroscopy and mass spectrometry.
Compétences acquises à la sortie de la formation :…..
- Une compréhension générale de l'utilisation de MetaboLights et de l'outil d'édition ISAcreator
- L’autonomie dans le dépôt de données sur MetaboLights
Durée de la formation : 2 heures.
Date et lieu : Mercredi 12 juin à 14h en salle informatique sur le lieu des 7 JS RFMF
Nb de places max : 30 personnes maximum.
Référence bibliographique : Kenneth Haug, Reza M. Salek, Pablo Conesa, Janna Hastings, Paula de Matos, Mark Rijnbeek, Tejasvi
Mahendraker, Mark Williams, Steffen Neumann, Philippe Rocca-Serra, Eamonn Maguire, Alejandra
González-Beltrán, Susanna-Assunta Sansone, Julian L. Griffin and Christoph Steinbeck. MetaboLights-- an
open-access general-purpose repository for metabolomics studies and associated meta-data. Nucl. Acids Res.
(2012) doi: 10.1093/nar/gks1004
112
Liste des Participants
Acket Sébastien
UTC, GEC CNRS-FRE 3580,
BP 20259
60205 Compiègne
Aidoud Nacima
UMR Inserm 1062 / Inra 1260 Nutrition
obésite et risque thrombotique
27 bvd Jean Moulin, Fac Méd La Timone
13005 Marseille
Akoka Serge
CEISAM - Bat9
2 rue de la houssinière,
44322 Nantes cedex
Alves Sandra
Equipe CSOB
Bâtiment F 7ème
étage case 45,
4 Place Jussieu
75252 Paris cedex 05
Arnaud Luc Agilent Technologies France
Parc Technopolis ZA Courtaboeuf
3 av du Canada
91978 Les Ullis cedex
Assemat Olivier BRUKER
34 rue de l'Industrie, BP 10002
67166 Wissembourg
Audoin Coralie
Institut de Chimie de Nice
28 avenue Valrose - Parc Valrose
06100 Nice
Balayssac Stéphane
Groupe de RMN Biomédicale Laboratoire de
Synthèse et Physico-Chimie de Molécules
d'Intérêt Biologique (SPCMIB) UMR CNRS
5068, Université Paul Sabatier
118, Route de Narbonne
31062 Toulouse Cedex 9
Baltenweck-Guyot Raymonde
UMR1131 INRA/UdS - équipe MSV-
Métabolisme secondaire de la Vigne
28 rue de Herrlisheim
68021 Colmar
Bayle Marie-Laure
Pôle Ecotox
1 avenue de la Gare BP 15173 Alixan-
ROVALTAIN
26958 Valence Cedex 9
Bellvert Floriant
Centre d'Etude des Substances Naturelles
CESN
Université Lyon 1 la Doua
Bât. Forel 4ème
étage –
43 bd du 11 Novembre 1918
69100 Villeurbanne
Berardocco Solenne
UMR INRA 1349 IGEPP
Bâtiment A - Numéro 301 - Domaine de la
Motte
35653 Le Rheu cedex
Bertrand Cédric
UPVD - LCBE
58 Avenue Paul Alduy
66860 Perpignan
113
Bertrand Samuel
School of Pharmaceutical Sciences, EPGL,
University of Geneva, University of
Lausanne, quai Ernest-Ansermet 30,
CH-1211 Genève
Suisse
Blasco Hélène
U930
2 BD Tonnelle
37044 Tours
Boccard Julien
Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne
20 Bd d'Yvoy
CH-1211 Genève 4,
Suisse
Boisseau Renaud
CEISAM - Bat9
2 rue de la houssinière,
44322 Nantes cedex
Bonnard Isabelle
UPVD - LCBE
58 Avenue Paul Alduy
66860 Perpignan
Bonnet Claire
INRA, UMRH1213 Herbivores,
63122 Saint-Genès-Champanelle
Bouchemal-Chibani Nadia
CSPBAT - UMR CNRS 7244
UFR SMBH
74 rue Marcel Cachin
93017 Bobigny
Bouchereau Alain
UMR INRA 1349 IGEPP
Bâtiment A - Numéro 301 - Domaine de la
Motte
35653 Le Rheu cedex
Boudra Hamid
INRA, UMRH-DIMA
63122 Saint Genès Champanelle
Broudin Simon
Profilomic
CEA Saclay - Batiment 136
91191 Gif-Sur-Yvette
Buonomo Antoine
CESN
29 cours Emile Zola
69100 Villeurbanne
Cahier Karine
CNRS UMR7139
Station Biologique
29688 Roscoff
Cahoreau Edern
Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes
Biologiques et des Procédés
135 avenue de Rangueil
31077 Toulouse cedex 4
Charles Christian
SIGMA PLUS
6 rue Collange
92300 Levallois-Perret
Chéreau Sylvain
ONIRIS-LABERCA
ONIRIS Chantrerie, Route de Gachet
44307 Nantes
Cilindre Clara
Equipe Effervescence, Champagne et
Applications
GSMA UMR CNRS 7331 - Université de
Reims Champagne Ardenne - Moulin de la
Housse - BP1039
51687 Reims
Clément Christophe
URVVC EA 4707
URCA - UFR SEN - Moulin de la Housse -
Bâtiment 18 - BP 1039
51687 Reims
Colsch Benoît
CEA, DSV/iBiTec-S/SPI/LEMM
Centre CEA-SACLAY
91190 Gif sur Yvette
114
Combourieu Bruno
Pôle Ecotox
1 avenue de la Gare BP 15173 Alixan-
ROVALTAIN
26958 Valence Cedex 9
Comte Blandine
UNH - PhéMABIO
Centre de recherche de Clermont-
Ferrand/Theix
63122 Saint-Genès Champanelle
Conan Céline
UMR7139-Végétaux Marins et Biomolécules
Place Goerges Teissier
29688 Roscoff
Constans Jean-Marc
CHU Amiens et BIOFLOWImage
Radiologie Hôpital Nord
80000 Amiens
Cotton Jérome
Profilomic
31 rue d'Aguesseau
92100 Boulogne Billancourt
Courant Frédérique ONIRIS-LABERCA
ONIRIS Chantrerie, Route de Gachet
44307 Nantes
Dalle Céline Institut de Chimie de Clermont-Ferrand
Laboratoire Microorganismes: Génome et
Environnement,
BP 10448,
63000 Clermont-Ferrand
Dalle Nicolas
INRA, UMR 1019, Plateforme d’Exploration
du Métabolisme, UNH,
63000 Clermont-Ferrand
Dariy Ekaterina
LGBM, Genoscope
2 rue Gaston Crémieux
91000 Evry
Dauly Claire
Thermo Fisher Scientific
16 avenue du Québec - Silic 765 Villebon-
sur-Yvette
91963 Courtaboeuf Cedex
Dauwe Rebecca
BIOPI EA3900 UPJV
UFR des Sciences, Ilot des poulies,
33 rue Saint Leu
80000 Amiens
De Luca Deborah
Biologie humaine et toxicologie
6 avenue du champ de mars
7000 Mons
Belgique
Deborde Catherine
Plate-forme Métabolome &UMR1332
Biologie du Fruit & Pathologie, INRA
Université Bordeaux
71, avenue E. Bourlaux, BP 81
33140 Villenave d'Ornon
Diémé Binta
Equipe 2-Inserm U930
Bâtiment vialle
10 bd Tonnellé
37000 Tours
El Boutachfaiti Redouan
BIOPI EA3900 UPJV
Ilot des poulies, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Emond Patrick
UMR INSERM 930
10 bd Tonnellé BP3223
37032 Tours cedex 1
Ferchaud-Roucher Véronique
Plateforme spectrométrie de masse CRNH,
U915
IRT-UN 8 quai Moncousu BP70721
44007 Nantes
115
Fliniaux Ophelie
BIOPI EA3900 UPJV
Ilot des poulies, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Fontaine Jean-Xavier
EA3900-BIOPI
Rue des Louvels
80000 Amiens
Foucquier Julie
CEA LIST, Laboratory of Tools for Data
Analys
91191 Gif-sur-Yvette
Gagneul David
UMR INRA-USTL 1281 SADV
Université de Lille1, Cité Scientifique
59655 Villeneuve d'Ascq
Gaveau Nathalie
URVVC Université de Reims Champagne-
Ardenne, UFR Sciences Exactes et Naturelles,
Campus Moulin de la Housse, Chemin des
Rouliers,BP 1039
51687 Reims
Genta-Jouve Gregory
Environmental Metabolomics Research
Laboratory - University of Birmingham
71, Lottie Road
B296JY Birmingham
UK
Ginies Christian
BIOMET-INRA1260
27 boulevard Jean Moulin
13385 Marseille
Giraudeau Patrick
CEISAM - Bat9
2 Rue de la Houssinière,
44322 Nantes cedex
Gontier Eric
BIOPI EA3900-UPJV "Biologie des Plantes
et Innovation" Ilot des poulies, UFR de
Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens
Goossens Corentine
Metevbo, CSPBAT-UMR7244, UP13
74, rue Marcel Cachin
93017 Bobigny
Gosselin Isabelle
Génie Enzymatique et Cellulaire
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Goyer Aymeric
UMR IGEPP 1349
bat 301 - A - Domaine de la Motte
35653 Le Rheu
Grand Eric
Laboratoire des Glucides
33 Rue Saint Leu
80039 Amiens
Gros Clémence
Génétique et amélioration de la vigne
28 rue de Herrlisheim
68021 Colmar
Guitton Yann
Mer Molecule Santé
2 rue de la Houssinière - BP92208
44322 Nantes
Halter David
INRA Colmar
28 rue de Herrlisheim
68000 Colmar
Hance Philippe
UMR SADV USTL/INRA 1281
USTL - Avenue Mendeleëv -Bât SN2
59655 Villeneuve d'Ascq
Haug Kenneth
EMBL - European Bioinformatics
Institute. Wellcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge, CB10 1SD,
UK
Hay Anne-Emmanuelle
CESN ISPB UMR5557 Ecologie
Microbienne UCB Lyon 1
Pavillon Netien 2ème
étage - 8 av. Rockefeller
69373 Lyon
116
Hilbert Jean-Louis
UMR SADV USTL/INRA 1281
USTL - Avenue Mendeleëv -Bât SN2
59655 Villeneuve d'Ascq
Hubert Jane
Institut de Chimie Moléculaire Reims
Université de Reims Champagne-Ardenne,
Moulin de la Housse, BP 1039
51687 Reims
Idrissi Abdel
UTC, GEC CNRS-FRE 3580
BP 20259
60205 Compiègne
Jacob Daniel
Plate-forme Métabolome-Fluxome,
&UMR1332 Biologie du Fruit & Pathologie,
INRA Université Bordeaux
71, avenue E. Bourleaux, BP 81
33140 Villenave d'Ornon
Jamali Arash
BIOPI EA3900-UPJV "Biologie des Plantes
et Innovation" Ilot des poulies,
UFR de Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens
Jourdain Sabine
Bruker Daltonique
34 rue de l'industrie
67166 Wissembourg
Jourdan Fabien
Toxalim INRA
180 chemin de Tournefeuille
St-Martin-du-Touch BP 3
31931 Toulouse cedex
Jousse Cyril
ICCF/PFEM
Chimie 4 (1er
étage),
24 avenue des Landais, BP 80026
63171 Aubière
Junot Christophe
CEA
DSV/iBiTec-S/SPI/LEMM
91191 Gif sur Yvette cedex
Kerzaon Isabelle
CESN ISPB UMR5557 Ecologie
Microbienne UCB Lyon 1
Pavillon Netien 2ème
étage
8 av. Rockefeller
69373 Lyon
Kopka Joachim
Max Planck Institute of Molecular Plant
Physiology, Applied Metabolome Analysis;
Department Prof. Dr. L. Willmitzer
Am Mühlenberg 1
14476 Potsdam-Golm
Allemagne
Koubaa Mohamed
The Ohio State University - Department of
Molecular Genetics
1060 Carmack Rd, 053 Rightmire Hall
43229 Columbus, OH
USA
Kovensky José
Laboratoire des Glucides CNRS FRE 3517
33 Rue Saint-Leu
80039 Amiens
Lalande Julie
CEISAM
2 rue de la Houssinière
44322 Nantes Cedex 3
Lanoue Arnaud
EA2106 Biomolecules Biotechnologies
Végétales
31 Av Monge UFR Pharmacie
37200 Tours
Lartigaut Florence
UMR1332 BFP
33140 Villenave d'Ornon
Le Gall Hyacinthe
BIOPI - EA 3900 - UPJV
Ilot des Poulies - UFR des Sciences
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
117
Le Moyec Laurence
Université d'Evry Val d'Essonne
UBIAE INSERM U902
rue du père Jarlan
91025 Evry
Lechaplais Christophe
LGBM, Genoscope
2, rue Gaston Cremieux - CP5706
91057 Evry Cedex
Legendre Laurent
UMR 5557 Ecologie Microbienne
UCBL CNRS
43 Bd du 11 Nov 1918
69622 Villeurbanne
Legoahec Laurie
UMR IGEPP 1349
bat 301 - A - Domaine de la Motte
35653 Le Rheu
Lenuzza Natacha
CEA/DRT/LIST/DM2I/LOAD
CEA Saclay, Digiteo Labs- Bât. 565 - PC192
91191 Gif-sur-Yvette Cedex
Leroux Fanny
Profilomic
CEA Saclay - Batiment 136
91191 Gif-Sur-Yvette
Lombard Marie-Lou
UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie
SFR Biologie Intégrative et Ecologie
INRA, BP 81
33140 Villenave d'Ornon
Lopez Claire
Centre de RMN à Très Hauts Champs
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Lorrain Yves
Advanced Chemistry Development
(ACD/Labs)
3 quai Kléber, Tour Sébastopol,
67000 Strasbourg
Loup Benoit
Laboratoire des Courses Hippiques
15 rue de Paradis
91370 Verrières le Buisson
Madji Hounoum Blandine
UR 1067 NuMeA Nutrition Métabolisme et
Aquaculture
INRA Pôle d'Hydrobiologie
64310 St Pée/Nivelle
Marcelo Paulo
Plateforme ICAP
3 rue des Louvels
80000 Amiens
Marchand Jeremy
Université de Nantes
2 Rue de la Houssinière
44322 Nantes
Martin Jean-Charles
Biomet_NORT
Faculté de médecine de La Timone
27 bd Jean Moulin
13385 Marseille
Maucourt Mickaël
UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie &
Plateforme Métabolome-Fluxome Bordeaux
71 Avenue Edouard Bourlaux
33140 Villenave d'Ornon
Mauger Florence
CEA/IG/CNG/LEE
2 rue Gaston Crémieux
91057 Evry
Mavel Sylvie
INSERM U930, Université François Rabelais
31 av Monge
37200 Tours
Meiffren Guillaume
Plateforme CESN - Lyon
Université Lyon 1 la Doua
Bât. Forel 4ème
étage –
43 bd du 11 Novembre 1918
69100 Villeurbanne
118
Mesnard François
BIOPI
Ilot des poulies, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Miart Fabien
BIOPI EA3900 UPJV
Ilot des poulies, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Michalet Serge
Centre d'Etude des Substances Naturelles
CESN
Université Lyon 1 la Doua
Bât. Forel 4ème
étage –
43 bd du 11 Novembre 1918
69100 Villeurbanne
Mohamadi Fahoullia (Mme)
LCBE- Universite de Perpignan
52 Av Paul Alduy
66000 Perpignan
Molinié Roland
Laboratoire de Phytotechnologie - EA3900 -
BioPI UFR de Pharmacie – UPJV
1, rue des Louvels
80037 Amiens
Muñoz Ismael
CNRS UMR 5557 Ecologie Microbienne
6, rue Raphaël Dubois
69622 Villeurbanne
Nguyen Thi Kieu Oanh (Mme)
BIOPI EA3900 UPJV
Ilot des poulies, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Nicar Henri
ABSCIEX
3 avenue du Canada, Parc Technopolis –
Bâtiment Sigma
91940 Les Ulis
N’Tsiba Estelle
Université de Nantes
2 Rue de la Houssinière
44322 Nantes
Nurit Eric
UNH PFEM
INRA, UMR1019, Plateforme d’Exploration
du Métabolisme, UNH
63000 Clermont-Ferrand
Oria Gabrielle
UPJV
Chemin du Thil
80025 Amiens Cedex 1
Ouguerram Khadija (Mme)
Institut du Thorax UMR_S1087
IRT-UN 8 quai Moncousu BP 70721
44007 Nantes
Paris Alain
Mét@risk - INRA
16, rue Claude Bernard
75231 Paris cedex 05
Péricard Pierre
CNRS - Station Biologique de Roscoff
Place G. Teissier
29680 Roscoff
Perret Alain
LGBM, Genoscope
2, rue Gaston Crémieux CP5706
91057 Evry cedex
Petit Emmanuel
BIOPI EA3900 UPJV
Ilot des poulies, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens cedex
Portais Jean-Charles
LISBP, UMR5504, UMR792 CNRS, INRA,
INSA, INSA Toulouse
31077 Toulouse cedex 4
Portela José
Waters S.A.S.
BP 608
78056 Saint-Quentin en Yvelines Cedex
119
Poutaraud Anne
Génétique et amélioration de la vigne
28 rue de Herrlisheim
68021 Colmar
Pujos-Guillot Estelle
INRA
Plateforme d'Exploration du Métabolisme
UNH INRA
63122 Saint-Genès-Champanelle
Purson Sylvain
ICMR, Université de Reims Champagne-
Ardenne, Moulin de la Housse, BP 1039,
51687 Reims Cedex 2,
Quéro Anthony
Laboratoire de Phytotechnologie - EA3900 -
BioPI UFR de Pharmacie – UPJV
1, rue des Louvels
80037 Amiens
Rathahao-Paris Estelle
Laboratoire de Chimie Analytique
16 rue Claude Bernard
75231 Paris
Rautureau Gilles
CRMN,
5 rue de la Doua
69100 Villeurbanne
Renaud David
IGEPP
UMR IGEPP 1349
bat 301 - A - Domaine de la Motte
35653 Le Rheu
Rey Marjolaine
CESN
69621 Villeurbanne cedex
Riffault Ludivine
Institut de Chimie Organique et Analytique,
Université d'Orléans
rue de Chartres, BP 6759
45067 Orléans cedex 2
Rivet Laurent
Plate-forme Corsaire Biogenouest
Domaire de la Motte - BP 35327
35653 Le Rheu cedex
Rolin Dominique
UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie
71, avenue E. Bourlaux, BP 81
33140 Villenave d'Ornon
Roscher Albrecht
Génie Enzymatique et Cellulaire
33 rue St Leu
80039 Amiens
Roulard Romain
BIOPI EA3900 UPJV
Ilot des poulies, UFR des Sciences,
33 rue Saint Leu
80039 Amiens
Salek Reza
EMBL - European Bioinformatics Institute.
Wellcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge, CB10 1SD,
UK
Sanchez Lisa
Stress Défenses et Reproduction des Plantes
Reims
Sarazin Catherine
Unité de Génie Enzymatique et Cellulaire
33, rue St Leu
80039 Amiens
Savarin Philippe
CSPBAT
74 rue Marcel Cachin
93017 Bobigny
Seeburn Gaëtan
EURISO-TOP
Parc des Algorithmes, Bât Homère,
Route de l'Orme
91194 Saint-Aubin Cedex
Simon Yann
LECO France
120
Smilde Age
Biosystems Data Analysis
Swammerdam Institute for Life Sciences,
University of Amsterdam, the Netherlands
Soubeyrand Eric
MR 1287- EGFV
210 Chemin de Leysotte
33140 Villenave d'ornon
Stuani Lucille
LGBM, Genoscope
2, rue Gaston Cremieux - CP5706
91057 Evry Cedex
Taghi Meryam (Mme)
C-TAC
4 av de l'observatoire
75006 Paris
Tagliatti Vanessa Biologie Humaine et Toxicologie
Chemin du Canon 1A
7000 Mons
Belgique
Tea Illa (Mme)
CEISAM UMR CNRS 6230
2 rue de la Houssinière
44322 Nantes
Thibaudeau Christophe
Université de Picardie Jules Verne - Génie
Enzymatique et Cellulaire
33 rue Saint-Leu
80039 Amiens
Thiombiano Benjamin
BIOPI
1, rue des Louvels
80037 Amiens
Thomasset Brigitte
UTC, GEC CNRS-FRE 3580
BP 20259
60205 Compiègne
Traïkia Mounir
ICCF
Clermont Université, Université Blaise Pascal
63000 Clermont-Ferrand
Triba Mohamed Nawfal
CSPBAT
74 rue Marcel Cachin
93017 Bobigny
Trivelli Xavier
UGSF UMR CNRS 8576 Université Lille1
Université Lille1, Bat. C9, Cité Scientifique
59655 Villeneuve d'Ascq
Ubhi Baljit (Mme)
AB Sciex UK Limited
Phoenix House, Lakeside Drive, Centre Park
WA1 1RX Warrington, Cheshire
UK
Verdu Alexandre
Bruker Daltonique
4, allée Hendrik Lorentz
77447 Marne la Vallée Cedex 02
Volant Chloé
UMR IGEPP 1349
bat 301 - A - Domaine de la Motte
35653 Le Rheu
Werner Erwan
TECHNOLOGIE SERVIER
27 Rue Eugene Vignat
45000 Orléans
Xue Baiyi (Mme)
Laboratoire de Chimie Analytique
16, rue Claude Bernard
75231 Paris
Yanibada Benedict INRA Toxalim
180 chemin de tournefeuille
31300 Toulouse