Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Sergi Maicas PrietoDepartamento de Microbiología y EcologíaUniversitat de València
Lección 4.1. Introducción al Módulo 4
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 4. Organismos modelo en biología
molecular
¿Qué es un modelo experimental?
En biología, la práctica experimental está organizada alrededor de MODELOS Y
SISTEMAS EXPERIMENTALES para probar HIPÓTESIS DE TRABAJO.
Muchas de las disciplinas se han desarrollado gracias a modelos experimentales.
La genética clásica se ha desarrollado mediante la experimentación con plantas y
Drosophila melanogaster.
La biología del desarrollo usando Drosophila, el nematodo Caenorhabditis
elegans y el pez cebra (Danio rerio).
La microbiología molecular usando la bacteria Escherichia coli y bacteriófagos
(virus).
La neurociencia estudiando axones gigantes de calamar y Mus musculus.
La inmunología usando Mus musculus.
La biología molecular de plantas usando Arabidopsis thaliana.
La biología celular usando la levadura Saccharomyces cerevisiae.
MODELOS FACILES DE OBTENER, MANTENER, REPRODUCIBILIDAD DE
RESULTADOS
Objetivos del módulo
¿Cuáles son los modelos experimentales más importantes?
¿Cuáles son sus características?
¿Qué se sabe de ellos?
¿Cuáles son los recursos disponibles?
Biología molecular. Bases y aplicaciones
• 4.2. Virus
• 4.3. Bacterias (Escherichia coli)
• 4.4. Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)
• 4.5. Nematodos (Heligmosomoides polygyrus)
• 4.6. Plantas (Arabidopsis thaliana)
F. Xavier López LabradorLaboratori de Virologia, Àrea de Genòmica i SalutUMIs Infecció-SP / Genómica-SPCentre Superior Investigació Salut Pública (FISABIO-Salut Pública)
Lección 4.2. Virus
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 4. Organismos modelo en biología
molecular
¿Qué son los virus?
• Del latín virus (del griego:ἰός «toxina» o «veneno»)
• Agentes infecciosos acelulares
• Submicroscópicos (20-450 nm.), (¡ 450-1000 !)
• No crecen ni se dividen (se multiplican)
• No codifican rutas enzimáticas
• Se componen de ácidos nucleicos, proteínas, y
algunos también de lípidos.
• Virión: cápside (con/sin envuelta), ácido nucléico
• ¿Son organismos vivos?
• Parásitos intracelulares estrictos.
• Dos estados: extracelular e intracelular
• Efecto citopático
• ¿Cuál es su lugar en el árbol de la vida?
• El cuarto dominioFoundations of Virology, rev. 2014Frederick A. Murphy, University of Texas Medical Branch
Poliovirus Coronavirus
HerpesvirusEbolavirus
Variolavirus Rabdovirus
Los virus como modelo de evolución
Tipo de infección
Componente Usos Ejemplos
Heteróloga Organismo completo
Atenuación viralPatogénesis modelos
animales
Virus mixoma / conejos
Heteróloga Célula completa Atenuación viralCultivo virus
Vacuna SabinGripe / células perro
Heteróloga Una proteína celular
Genética hospedadorEscape viral
Células humanas transgénicas / SIV
Autóloga Organismo completo
Evolución virusEscape inmunitarioEscape antivirales
Genética poblaciones
SIV en macacosVIH en pacientes
Autóloga Célula completa Evolución virusFitness / mutantesEscape antivirales
Genética poblaciones
HIV en linfocitosPoliovirus
VHC en células de hepatoma
Autóloga Una proteína celular
Genética hospedadorEscape viral
Células humanas siRNA/ VHC
Los virus como modelo de enfermedad
• Los bacteriófagos como modelos de infecciones
agudas, persistentes y latentes (Twort, d’Herelle,
Lwoff, Wollman, Jacob).
• Respuesta inmunológica: experimentos de Doherty
y Zinkernagel (LCMV): restricción del CMH
• Respuesta inmune celular: linfocitos T y la
inmunopatogénesis de la infección.
• Respuesta inmune innata: animales KO, siRNA.
• Modelos de infección viral: aguda, latente y
persistente, oncogénica. Control inmunológico.
• Los virus como modelo en Inmunología: ratón,
hurón, marmota, chimpancé, macaco, humanos.
• Antivirales: potencia, especificidad, resistencias
• Vacunas: efectividad a corto, medio y largo plazoFoster ES, et al. Emerg Infect Dis 2006
Lymphocytic choriomeningitis virus
Rolf Zinkernagel & Peter Doherty
Nobel Prize in Physiology, Medicine 1996
Mus musculus
Los virus como modelos de terapia
• Fagoterapia: ¿el fin de los antibióticos?
• Vacunas “clásicas”:
• viruela, poliomielitis, sarampión, gripe
• Virus defectivos y VLPs
• Virus pseudotipos
• Terapia génica: los virus como vectores de genes:
• completos, truncados, antisentido, siRNA…
• Protección del ácido nucleico
• Liberación dirigida a la célula diana
• AdV (caso Gelsinger), AAV
• Oncoretrovirus, lentivirus (ADA/SCID)
• Vacunas contra el cáncer
• Virus oncolíticos (VSV, Vaccinia)
Félix d'Hérelle
Jonas Salk Albert Sabin
Edward Jenner
Maurice Hilleman Anderson, Culver, Blaese
Los virus como modelo biotecnológico
• Bacteriofagos: clonaje y expresión génicas.
• Vacunas subunidad: hepatitis B (rHBsAg)
• Virus defectivos y VLPs (virus-like particles): papilomavirus
• Virus con reordenaciones genéticas: rotavirus
• Vacunas de “nueva generación” (vectores recombinantes)
• Dengue, West Nile, Encefalitis Japonesa
(YFV17D204-DENV, WNV ó JEV)
• Ébola zaire (VSV-EBOVGP, AdV3-EBOVGP)
• Modelos de expresión de proteinas. Bacteriofagos.
• Modelos de control de plagas:
• Baculovirus, NPV (orugas)
• O. rhinoceros virus (escarabajo)
• Myxoma, Calicivirus (conejos)Fr
ont.
Mic
robi
olht
tps:
//doi
.org
/10.
3389
/fmic
b.20
16.0
0429
BMC Microbiology. 11: 213. PMC 3224144
Jan
Chr
istia
n ht
tp://
flick
r.com
/pho
tos/
1754
7754
@N
03
Ikeh
iker
at t
he E
nglis
h la
ngua
ge W
ikip
edia
Links:Los virus como modelo en Biología (Esteban Domingo y Margarita Salas)
http://publicacions.iec.cat/repository/pdf/00000177/00000080.pdf
http://www.rac.es/ficheros/doc/00424.pdf
De los experimentos de Doherty y Zinkernagel a las vacunas contra el cáncer:
http://www.uzh.ch/en/about/portrait/nobelprize/zinkernagel.htmlhttp://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1996/
Historia de las vacunas:
https://www.historyofvaccines.org/
Vacunas recombinantes basadas en el vector del YFV:https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Yellow_Fever_Vaccine
Control de conejos mediante liberación de virus:http://dpipwe.tas.gov.au/invasive-species/invasive-animals/invasive-mammals/european-rabbits/release-of-rabbit-calicivirus-disease
Referencias bibliográficas y enlaces
Sergi Maicas PrietoDepartamento de Microbiología y EcologíaUniversitat de València
Lección 4.3. Escherichia coli
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 4. Organismos modelo en biología
molecular
Biología y bioquímica
• Bacteria Gram negativa
• Anaerobia facultativa
• No esporulada
• Células bacilares
• Aproximadamente 2 μm de largo y 0.5 μm de diámetro
• Volumen celular 0.6 – 0.7 (μm)3
• Puede vivir sobre una gran cantidad de sustratos
• Temperatura de crecimiento óptima de 37°C
• Las cepas con flagelos (peritricos) son móviles
• Pueden transferir DNA mediante conjugación, transducción o transformación,
posibilitando la transferencia génica horizontal
Ventajas
• Procariota (unicelular, sin núcleo)
• Cultivo fácil y barato
• Posibilidad de almacenamiento por congelación
• Tiempo de generación de 30 minutos
• Puede usarse como almacén de DNA foráneo
• Puede usarse como sistema de expresión de DNA foráneo
• Disponible una gran cantidad de mutantes
• Genoma secuenciado (en varias cepas)
• K12 y derivadas (DH1, DH5α, DH10B) y las comerciales (XL1 Blue, JM109, TOP10)
• B y derivadas (serie BL21)
• C
• W
Modelo estructural en bacterias Gram -
• Pared celular bacteriana • Flagelo
• Componentes de señalización (Familia
proteínas Che, movimiento flagelar)
Fisiología de la división bacteriana
Anillo-FtsZ
FtsBFtsLFtsQFtsIFtsN
FtsA
ZipA
FtsKFtsW
Divisoma
FtsZ
Modelo a nivel genético
• Conjugación • Transducción
• Bacteriófagos (T4)
Modelo evolutivo
Estudio en curso en la evolución experimental dirigido por Richard Lenski que sigue los
cambios genéticos en 12 poblaciones inicialmente idénticas de la bacteria Escherichia coli
desde el 24 de febrero de 1988.
La población tiene 67899 generaciones en septiembre de 2017.
Desde el inicio del experimento, Lenski y sus colegas han informado de una amplia gama de
cambios genéticos, algunas adaptaciones evolutivas se han producido en las 12 poblaciones,
mientras que otros sólo han aparecido en una o en algunas poblaciones.
Una cepa de E. coli que fue capaz demetabolizar aeróbicamente el citrato
Indicio de especiación
Modelo ómico
GENOMA
TRANSCRIPTOMA
PROTEOMA
METABOLOMA
DNA
mRNA
Proteína
Metabolito
Interacción proteína-proteína
Activación Inhibición
Modelo de secuenciación Control de calidad de las proteínas
Producción de metabolitos
• 30% proteínas terapéuticas producidas en E. coli
• Se dispone de:
• Vectores de expresión
• Cepas productoras
• Tecnología de plegamiento
• Tecnología de fermentación
• 151 fármacos aprobados por FDA y/o AEM
Patogénesis microbiana
Modelo de colonización Biología sintética
Técnicas con una sola célula(single-cell techniques)
• Biopelículas
CRISPR - Cas 9
http://www.lgcstandards-atcc.org/
http://www.cbs.knaw.nl/About/nccb.aspx
http://www.dsmz.de/
http://bccm.belspo.be/about/lmg.php
The Coli Genetic Stock Center CGSC, at Yale
http://cgsc.biology.yale.edu/ Shiga Toxin-producing E. coli (STEC)
Referencias bibliográficas y enlaces
Libros
Molecular genetics of bacteria. Dale, J.W. y S.F. Park. 5ª ed. Wiley-Blackwell. 2010.
Systems biology and biotechnology of Escherichia coli. Lee, S.Y. 1ª ed. Springer. 2009
Bacterial pathogenesis: A molecular approach. Wilson, B.A. et al. 3ª ed. ASM Press. 2011
Artículos
Vollmer W, Bertsche U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in
Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2008. 778: 1714-34.
Berg HC. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 2003. 72:19-54.
Enlaces
http://www.genome.wisc.edu/
http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes
http://myxo.css.msu.edu/ecoli/
Emilia Matallana Redondo Instituto de Biología Integrativa de Sistemas Universitat de València
Lección 4.4. Saccharomyces cerevisiae
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 4. Organismos modelo en biología
molecular
La levadura Saccharomyces cerevisiae
• Usado con fines alimentarios desde la más remota
antigüedad
• Organismo GRAS “generally recognized as safe”
• Louis Pasteur, 1857
• Microorganismo eucariota
Las ventajas del modelo eucariótico Saccharomyces cerevisiae
• Unicelularidad: ciclo de vida haplodiploide, mantenimiento
estable de formas haploide y diploide, con reproducción
asexual por gemación.
• Facilidad de cultivo, escasos requerimientos nutricionales,
tiempo de generación corto (aprox. 100 min).
• Primer genoma eucariótico secuenciado (1997, última revisión 2011), pequeño (12 Mpb,
16 cromosomas, aprox. 6200 genes), el más ampliamente caracterizado estructural y
funcionalmente
http://www.yeastgenome.org/
Las ventajas del modelo eucariótico Saccharomyces cerevisiae
• Multitud de herramientas genéticas y genómicas
http://syntheticyeast.org
Las ventajas del modelo eucariótico Saccharomyces cerevisiae
• Disponibilidad de mutantes individuales de todos sus genes, fenotípicamente
caracterizados
http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/deletions3.html
http://www.yeastgenome.org/help/function-help/phenotypes
Las ventajas del modelo eucariótico Saccharomyces cerevisiae
• Disponibilidad de bases de datos procedentes tanto de análisis de genes y proteínas
individuales como de estudios globales
http://www.uniprot.org/
La historia de Saccharomyces cerevisiae como modelo eucariótico
Antonio Marcilla DíazDepartamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica y Parasitología; Unidad Mixta de Endocrinología, Nutrición y Dietética Clínica, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, Universitat de València
Lección 4.5. Heligmosomoides polygyrus
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 4. Organismos modelo en biología
molecular
Introducción
• Heligmosomoides polygyrus es un nematodo parásito
natural de roedores.
• Produce infecciones crónicas en diferentes cepas de
ratones: buen modelo de helmintiasis intestinales.
• Su presencia origina un potente efecto
inmunomodulador (enfermedades autoinmunes,
alergias y respuestas frente a diversos antígenos).
• Gran parte de sus efectos debido a productos de
excreción/secreción (PES).
• Organismo modelo en estudios de parasitología,
inmunología, farmacología y toxicología.
Ciclo biológico de H. polygyrus
Fuente: http://hpoly.blogspot.com.es/
• Ciclo de vida directo (sin hospedadores
intermediarios).
• Adultos en intestino de roedores, tras la
ingestión de larvas infestantes L3 del
medio.
• L3 invaden mucosa intestinal en 24h y tras
4 días mudan a L4 en la submucosa.
• Tras 2 días mas se enquistan en la capa
muscular del intestino, donde origina los
individuos adultos.
• Tras 14 días post-infestación los adultos
se aparean en el lumen intestinal,
producen huevos que son eliminados por
heces al medio externo, donde se da
maduración de larvas L1 a L3.
Patología
Fuente: http://hpoly.blogspot.com.es/
• Tras la infestación se generan respuestas
inmunitarias innata y específica para evitar
establecimiento en intestino.
• Aumenta producción de moco en intestino
• Quistes de larvas en pared intestinal
• Se activan macrófagos por citoquinas Th2 que
aumentan motilidad intestinal e inducen fibrosis
y cicatrización.
• El parásito es capaz de evadir la respuesta
inmunitaria
Fuente: http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/
Fuente: http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/
L3 se enquista y muda L4 y adultos en 7 días
Granuloma en el sitio de infección
Día 7
Día 14
L3 penetran pared duodeno
Adultos tras día 8
Huevos desde día 10
Adultos día 14, cultivados 21 días sin suero
E/S
L3 vía oral
Cultivo en el laboratorio
http://maizelslab.org/wp-content/uploads/2016/09/HES-Protocol-22June11.pdf
Protocolos de cultivo y obtención de productos de excreción/secreción (E/S):https://www.jove.com/video/52412/cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode
Genoma, transcriptoma y secretoma
Genoma secuenciado en 2014: 560 Mpbhttp://www.nematodes.org/genomes/heligmosomoides_polygyrus/http://parasite.wormbase.org/Heligmosomoides_polygyrus_prjeb1203/Info/Index/
Transcriptoma en proceso:http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/
Secretoma:http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/
Estudios de inmunomodulación
Fuente: Joel Bowrron
Fuente: http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-polygyrus/Parásitos E/S
Recientes estudios con vesículas extracelulares (VEs) de H. polygyrus
Buck et al., (2014), Nature Communications 5, 5488:
• VEs contienen miRNA, tRNA e YRNA
• Se detectan VEs en animales infestados
• Administración de VEs reducen síntomas de
alergia en modelo experimental múrido
Coakley et al., (2017), Cell Reports 19, 1545-1557:
• VEs inhiben activación de macrófagos por vía Th1 y
Th2
• Vacunación con VEs genera fuerte producción de
anticuerpos y protege frente a infestación en modelo
• VEs actúan sobre la vía de IL33 y sobre activación
de macrófagos para evitar la expulsión de parásitos
Links:
Grupo de Rick Maizels en Glasgow (UK): http://maizelslab.org/organisms/heligmosomoides-
polygyrus/
Blog de PCS: http://hpoly.blogspot.com.es/
Videos:
Angela Debenedetti: https://www.youtube.com/watch?v=9wETbKzWikY
Cultivo de Heligmosomoides polygyrus y obtencion E/S:
https://www.jove.com/video/52412/cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-
immunomodulatory-nematode
Acción de células B: https://www.youtube.com/watch?v=E4koFMP2njw
Apareamiento de adultos: https://www.youtube.com/watch?v=y9AXzc48WDA
Publicación PLoS Pathogens Hewitson: https://www.youtube.com/watch?v=0y84NaXw-S0
Referencias bibliográficas y enlaces
Roc Ros PalauERI Biotecnología y Biomedicina; Departamento Biología VegetalUniversitat de València
Lección 4.6. Arabidopsis thaliana
Biología molecular. Bases y aplicacionesMódulo 4. Organismos modelo en biología
molecular
Arabidopsis thaliana
• Características morfológicas y moleculares
¿Quién es?
• Recursos biológicos disponibles
¿De qué recursos se dispone?
• Bases de datos
Impacto de Arabidopsis en la biotecnología y biomedicina
• Posibilidades biotecnológicas: plantas con valor añadido, resistentes a estreses, fitorremediadoras
•Arabidopsis thaliana es una crucífera(Brasicacea) considerada como malahierba
•Conocida vulgarmente como Arabide oArabidopsis (thale cress)
•En los ecosistemas silvestres es unaespecie anual que germina en otoño yflorecen a principio de la primavera
•Las rosetas tienen un diámetro de 2 a 10cm. Cuando la planta madura, produceunos tallos florales que miden entre 20 y40 cm.
Imagen: B and C, Maria Bernal and Peter Huijser; other photographs, InesKubigsteltig and Klaus Hagemann.HTTPS://DOI.ORG/10.7554/ELIFE.06100.002
• Las flores de Arabidopsis miden 2 mm de
longitud y tienen un diámetro de 1 mm.
• Tienen capacidad de autopolinizarse,
aunque también pueden polinizarse
fácilmente con el polen de otra planta.
• Cuando se produce la fertilización y el
ovario se elonga, produce un fruto
alargado llamado silicua que contiene las
semillas.
Distribución geográfica de Arabidopsis
Imagen: Ute Krämer and Klaus Hagemann.HTTPS://DOI.ORG/10.7554/ELIFE.06100.005
• Genoma de pequeño tamaño (1.2 x 108 bases,
aprox. 25000 genes comparado con maíz 2.4 x109
bases, 20 veces más, o trigo 1.6 x 1010, 130 veces
más)
• Fácil cultivo por su pequeño tamaño (placa Petri)
• Ciclo corto (6 semanas de vida)
• Produce muchas semillas para estudios genéticos
En los años 1980s los biólogos moleculares se fijaron
en Arabidopsis por sus características especiales.
En Diciembre de 2000 se publicó la secuencia de su
genoma (5 cromosomas).
• Se han desarrollado métodos de aislamiento y
detección de DNA, RNA, proteínas
• Facilidad para obtener mutantes y para transformar
¿De qué recursos se dispone?Existen bases de datos con información
detallada de Arabidopsis.
•The Arabidopsis Information Resource
http://www.arabidopsis.org/
•En ellas encontramos: colecciones de
semillas y otros stocks (genotecas, BACs,
ESTs, vectores, mutantes disponibles para
los distintos genes).
•Herramientas bioinformáticas
•Información de genes de interés: expresión
espacial y temporal, expresión en distintas
condiciones ambientales, búsqueda de
mutantes (insercionales, micro RNAs,
tilling).
http://signal.salk.edu/
g1g2 WT
Colecciones de mutantes de T-DNA
El estudio de Arabidopsis ha permitido diseñar plantas con:
1. Valor nutricional añadido (proteínas, aminoácidos,
vitaminas) como por ejemplo el arroz dorado,
http://www.goldenrice.org/ Science, 2000, 287 (5451): 303
2. Mayor rendimiento agrícola. Plantas resistentes a estreses biótico (Toxina Bt) y abiótico
(salino), a herbicidas (glifosato) virus, con mayor eficiencia fotosintética. Plant Physiology, 2008,
147:6
3.Plantas para producir medicamentos o productos químicos. Plant Cell Rep 2011, 30, 1367-
1382
Uso de Arabidopsis como modelo de plantas
Enlaces:
https://doi.org/10.7554/elife.06100.002http://www.arabidopsis.org/portals/education/aboutarabidopsis.jsp
https://www.nsf.gov/pubs/2002/bio0202/model.htm
http://www.arabidopsisbook.org/
The Arabidopsis book. (2002). IA Al-Shehbaz SL O’Kane. The American Society of Plant Biologists.
Arabidopsis: A Laboratory Manual. (2002). Detef Weigel and Jane Glazebrook. Cold Spring Harbor
Lab Press.
Arabidopsis: A Practical Approach. (2000). Zoe Wilson ed. Oxford University Press, Oxford, UK.
Arabidopsis: Annual Plant Reviews, Vol.1. (1998). Mary Anderson and Jeremy Roberts, eds. CRC
Press, Boca Raton, FL, USA.
Arabidopsis. (1994).Elliot M. Meyerowitz, Chris R. Somerville, eds. CSHL Press, New York, USA.
Arabidopsis : an Atlas of Morphology and Development. (1993). John L. Bowman ed.Springer-
Verlag, Berlin & New York.
Referencias bibliográficas y enlaces