Lekciju saraksts

Nukleīnskābju un proteīnu sekvenču līdzības pamatprincipi

Dažādas salīdzināšanas metodes, to priekšrocības un pielietošanas nosacījumi

Lekciju saraksts

2011. gada 27. oktobris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 2

N.p.k. Datums Lekcijas temats

1. 15.09.2011Ievadlekcija. Prasības kursa apgūšanai un literatūras avoti. Bioinformātikas jēdziens. Kas ir bioinformātika un kāpēc tā biologiem vajadzīga? Bioloģija, statistika, informācijas tehnoloģijas un programmēšana kā bioinformātikas pamatelementi

2. 22.09.2011 Bioloģiskās informācijas veidi un apjoms. Genomu organizācija. Modernās genomu analīzes metodes3. 29.09.2011 Genomu evolūcija. Salīdzinošā genomika 4. 06.10.2011 Bioloģiskās informācijas datubāzes. Informācijas meklēšanas un iegūšanas sistēmas 5. 13.10.2011 Dažādu bioloģiskās informācijas datubāžu izmantošanas piemēri

6. 20.10.2011 Nukleīnskābju un proteīnu sekvenču līdzības pamatprincipi. Nukleīnskābju un proteīnu sekvenču pāru salīdzināšana. BLAST veidi

7. 27.10.2011 Nukleīnskābju un proteīnu daudzkārtējās salīdzināšanas metodes, to priekšrocības un pielietošanas nosacījumi. Datorprogrammas nukleīnskābju un proteīnu sekvenču daudzkārtējai salīdzināšanai

8. 03.11.2011 Seminārs un uzdevumu pārbaude par tēmām, kas saistītas ar informācijas meklēšanu datu bāzēs un sekvenču homoloģijas meklēšanu

9. 10.11.2011 Filoģenētika. Klāsteru un kladistiskās metodes filoģenētisko koku rekonstruēšanā 10. 17.11.2011 Datorprogrammas nukleīnskābju un proteīnu sekvenču filoģenētiskajai analīzei

11. 24.11.2011 Makromolekulu telpiskā struktūra un tās paredzēšana. DNS topoloģija. Proteīnu struktūras paredzēšana, modelēšana un pielietojums farmakoloģijā

12. 01.12.2011 Genoma ekspresijas analīze. Transkriptomika. DNS čipi genomu polimorfisma analīzē. Gēnu ekspresijas ģenētika 13. 08.12.2011 Proteomika un sistēmu bioloģija. Tīklveida struktūras kā bioloģisko sistēmu dabiska sastāvdaļa.

14. 15.12.2011Seminārs un uzdevumu pārbaude par tēmām, kas saistītas ar filoģenētisko analīzi un proteīnu sekundārās struktūras paredzēšanu. Bioinformātikas perspektīvas. Bioinformātika kā priekšnosacījums modernās bioloģijas apgūšanai

15. 22.12.2011 Eksāmens

Aminoskābju nomaiņas

• Dažādu aminoskābju nomaiņas notiek ar dažādu varbūtību. Tam ir divējādi iemesli: 1. aminoskābēm ir dažādas fizikāli – ķīmiskās īpašības, kas ietekmē to funkciju (piemēram, Ala -> Val nomaiņa ir varbūtīgāka nekā Ala -> Asp) 2. Kodona nomaiņai par citu aminoskābi kodējošu kodonu var būt nepieciešams atšķirīgs mutāciju skaits


Ile ATT ATC ATA

Leu TTA TTG CTT CTC CTA CTG

His CAT CAC

Aminoskābju nomaiņu matricas

• Marija Deihofa sastādīja pirmo aminoskābju nomaiņas matricu, kas bija balstīta un eksperimentāli noteiktu proteīnu grupu salīdzinājumu

• Dayhoff, M. O., Schwartz, R. M., and Orcutt, B. C. (1979) In: Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, M. O. Ed, pp. 345-352


Daihofas matrica


Sekvenču atšķirības mērvienības

• PAM – Percent Accepted Mutation • Piemēram, 1 PAM nozīmē, ka starp divām sekvencēm pastāv

1% atšķirību • 1 PAM matrica tiek veidota no sekvencēm, kas ir 99%

identiskas• Atšķirīgākām sekvencēm veido citas, atbilstošākas matricas,

jo pastāv iespēja, ka katrā pozīcijā notikušas vairākas nomaiņas

• PAM250 matrica ir domāta ļoti atšķirīgām sekvencēm (~20% identitāte)


BLOSUM matricas

• S. Henikovs izveidoja BLOSUM matricas, kas bija balstītas uz daudz lielāku daudzumu proteīnu sekvenču

• BLOSUM62 matrica derīga sekvencēm, kas ir vismaz par 62% identiskas

• Vairumā gadījumu sekvenču salīdzināšanas programmu standarta (default) parametri ir adekvāti

• BLOSUM62 ir standarta matrica BLASTP meklēšanā 2011. gada 27. oktobris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas

katedra 7

Divu sekvenču salīdzinājums

• Kad izveidota salīdzinājumu novērtēšanas sistēma, iespējams meklēt optimālu salīdzinājumu – tādu, kas dod vislielāko punktu skaitu

• Ir situācijas, kad pastāv vairāki optimālie salīdzinājumi • Globāls salīdzinājums – tiek salīdzinātas divas pilna garuma

sekvences • Lokāls salīdzinājums – salīdzina vienas sekvences segmentu ar

otras sekvences segmentu • Globāls salīdzinājums var būt ārkārtīgi laikietilpīgs (ja sekvenču

garums ir n un m, tad matricas izmērs ir n x m)


Nīdlmana – Vunša algoritms

• N-W algoritms veic divu sekvenču globālu salīdzinājumu

• Needlman and Wunsch (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology 48: 443 – 453


Nīdlmana – Vunša algoritms

• Izmanto gadījumos, kad jāsalīdzina divas līdzīga garuma sekvences, kas ir savstarpēji pietiekami līdzīgas visā to garumā

• Salīdzinājuma rezultātā atrod labāko (optimālo) salīdzinājumu visā sekvenču garumā


Smita – Vatermana algoritms

• S-W algoritms veic divu sekvenču lokālu salīdzinājumu

• Smith TF, Waterman MS (1981) Identification of Common Molecular Subsequences. Journal of Molecular Biology 147: 195-197


Smita – Vatermana algoritms

• Izmanto atšķirīgu sekvenču salīdzinājumam, kuras varētu saturēt līdzīgus rajonus, vai līdzīgus sekvences motīvus kopējā sekvences kontekstā

• Atrod lokālus sekvenču rajonus, kas līdzīgi viens otram un veido optimālu salīdzinājumu konservatīvajiem domēniem


Algoritmu salīdzinājums (demonstrējums)

• Homo sapiens PAX6 un Drosophila eyeless salīdzinājums (P26367 un O18381)

• Homo sapiens distrofīna izoformu salīdzinājums (NP_004013 un NP_004014)



BLAST

• Basic Local Alignment Search Tool • Līdzīgi kā globālajā sekvenču salīdzinājumā tiek

izmantots dotplots, taču salīdzināšana notiek nevis ar pilna garuma sekvenci, bet gan tās noteikta garuma fragmentiem

• Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410

• Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402


BLAST

• BLAST sadala query sekvenci noteikta garuma vārdos ar garumu k, un tad atrod visas precīzās sakritības datu bāzē

• Katras sakritības gadījumā tā tiek pagarināta uz abām pusēm

• Paplašinātās sakritības (salīdzinājumi) tiek savienoti pieļaujot nesakritības un pārtraukumus, bet tikai noteiktā dotplota diagonāles diapazonā



BLAST mehānisms

• Visam pamatā – dotplots • BLAST sadala meklēšanā izmantoto sekvenci noteikta

garuma vārdos (piemēram, k = 4), tad atrod visas sekvences datu bāzē, kuras satur precīzi tādus vārdus

• BLAST cenšas pagarināt katru no sakrītošajiem vārdiem uz abām pusēm, nepieļaujot atšķirības un pārtraukumus (mismatch, gap)

• Pēc tam pagarinātie rajoni tiek apvienoti, pieļaujot atšķirības un pārtraukumus


NCBI BLAST

2011. gada 27. oktobris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra 19http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi

BLASTN

• BLASTN – nukleotīdu secība pret nukleotīdu datu bāzi Vairāki BLASTN algoritmi: BLASTN – tradicionālais algoritms nukleotīdu secībām. Lēns Megablast – ļoti līdzīgām nukleotīdu secībām (>95% identitātes). Ļoti ātrs Pārtrauktais megablast – līdzīgām nukleotīdu secībām


BLASTP

• BLASTP – aminoskābju secība pret proteīnu datu bāzi Vairāki BLASTP algoritmi: BLASTP – tradicionālais algoritms aminoskābju secībām PSI-BLAST (position specific iterated) – BLASTP variants, kurā pirmajā meklēšanā tiek izveidots daudzkārtējs sekvenču salīdzinājums, ko tālāk atkārtoti izmanto, lai meklētu datu bāzē PHI-BLAST – (pattern hit initiated) – BLASTP variants, kas meklē proteīnu motīvus proteīnu datu bāzē


BLASTX

• BLASTX – translēta nukleotīdu secība pret proteīnu datu bāzi

• Tiek plaši pielietots genomu anotācijā, ja pastāv hipotēze, ka dotais DNS rajons kodē proteīnu, bet nav zināms nolasīšanas rāmis un kodējošā rajona robežas

• Ļoti noderīga programma EST sekvenču analīze, kas satur daudz kļūdu, piemēram, nolasīšanas rāmi nobīdošas insercijas vai delēcijas


TBLASTN

• TBLASTN – aminoskābju secība pret translētu nukleotīdu datu bāzi

• Izmanto, lai nukleotīdu datu bāzē meklētu sekvences, kas potenciāli varētu kodēt aminoskābju sekvences, kas homologas kādam proteīnam

• Nukleotīdu datu bāzē ir liels daudzums neanotētu secību, galvenokārt EST un GSS


TBLASTX

• TBLASTX – translēta nukleotīdu secība pret translētu nukleotīdu datu bāzi

• Ļoti laikietilpīga metode. Īpaši piemērota jaunu gēnu meklēšanai, jo salīdzina translētas nukleotīdu secības


BLAST rezultātu interpretācija


BLAST rezultātu nozīmība – Score

• Punktu skaitu (score) iegūst novērtējot cik nukleotīdu vai aminoskābju salīdzinājumā sakrīt un piešķirot tiem papildus svaru balstoties uz (BLOSUM62) matricu Papildus jānovērtē arī cik punktu varētu iegūt nejaušības dēļ – izmanto visu meklēšanas rezultātu kopumu, no kuriem vairums ir pret nejaušām secībām Ja oriģinālā sekvence iegūst tikpat punktus, cik nejaušās secības, tad sekvenču līdzība ir nejauša

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.html


BLAST rezultātu nozīmība – E-value

• E vērtība (E value) ir varbūtība, ka novērotā homoloģija meklējot konkrētajā datu bāzē varētu parādīties nejaušības dēļ E > 1 novērotā homoloģija nejaušības dēļ E < 0.02 iespējams, ka sekvences ir homologas

• Punktu skaits un E vērtība ir matemātiski saistīti


Sekvenču salīdzinājumu parametri

• BLAST meklēšanas rezultāts – divu sekvenču salīdzinājums ar standarta parametriem inserciju/delēciju gadījumā nesanāk tāds kā gribētos

• Var mēģināt koriģēt Gap opening un Gap extension soda punktus


Specializētie BLAST veidi

• PSI – BLAST – proteīnu homoloģijas meklēšana

• Konservatīvo domēnu meklēšana (CDS) • Konservatīvas domēnu arhitektūras

meklēšana (CDART) • Vektoru sekvenču meklēšana (VECSCREEN) • Divu sekvenču salīdzināšana izmantojot BLAST

(BL2SEQ) 2011. gada 27. oktobris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas

katedra 29

PSI-BLAST

• BLASTP meklēšana ir samērā ātra un labi darbojas, ja proteīnu homoloģija ir augsta (radniecīgu sugu, dzimtu vai pat kārtu organismu proteīni)

• Ko darīt, ja nepieciešams atrast radniecīgas sekvences ļoti attālās taksonomiskās vienībās, piemēram, proteīnus, kuru aminoskābju secības atšķiras par vairāk nekā 70%?


Cisteīna proteāžu salīdzinājums


Papaīns, aktinidīns, himopapaīns

Papaīns, aktinidīns, himopapaīns + Cys proteāze no Entamoeba histolitica , katepsīns 1 no Aedes egypti un katepsīns S no H. sapiens

Tas pats, kas otrajā salīdzinājumā + Cys proteināze no Giardia lamblia un katepsīns b no Aedes egypti

PSI – BLAST un daudzkārtēja sekvenču salīdzināšana

• Position-Sensitive Iterated BLAST • Vairāku aminoskābju secību salīdzinājums parāda sekvenču

motīvus, kas saglabājušies evolūcijas gaitā • PSI – BLAST sāk ar BLASTP, identificējot visas sekvences, kas

homologas izejas sekvencei • Izveido daudzkārtēju sekvenču salīdzinājumu un no tā iegūst

profilu • Atkārto meklēšanu proteīnu datu bāzē izmantojot profilu • Atkārto meklēšanu, kamēr vairs netiek iegūti jauni rezultāti



PSI – BLAST un daudzkārtēja sekvenču salīdzināšana

PSI – BLAST pirmais solis


PSI – BLAST 2 - 4 solis


Konservatīvo domēnu meklēšana

• Conserved domain search - tiek veikts automātiski BLASTP meklēšanas laikā


CD meklēšana ir saistīta ar citām datu bāzēm


Konservatīvas domēnu arhitektūras meklēšana

• Conserved domain architechture – vairums proteīnu sastāv no domēniem Domēns – kompakta struktūrvienība, nereti veic speciālu molekulāru funkciju

• Proteīnu evolūcija notiek domēnu līmenī • CDART atļauj meklēt proteīnus, kuriem ir

līdzīga domēnu arhitektūra


Konservatīvas domēnu arhitektūras meklēšana


VECSCREEN

• DNS sekvenēšana tradicionāli pamatojās uz genoma fragmenta klonēšanu plazmīdu vektorā un inserta sekvenēšanu izmantojot vektora praimeru saitus

• Rezultātā iegūtā sekvence satur nelielu vektora gabaliņu

• Pirms iesniegt savas sekvences GenBank, jāatbrīvojas no vektora sekvencēm un VECSCREEN ir BLAST veids, kas identificē varbūtējos vektora fragmentus


Vektora sekvences EST datu bāzē


BL2SEQ

• BL2SEQ salīdzina divas secības (nukleotīdu vai aminoskābju) izmantojot BLAST algoritmu

• Ļauj noteikt intronu – eksonu sturktūru, vai identificēt insercijas/delēcijas (piemēram, alternatīvo splaisingu)


BL2SEQ piemērs


Miežu gēna RPG1 cDNS (horizontāli) un genomiskās DNS salīdzinājums Eksoni parādās, kā homoloģijas bloki ar 100% identitāti. Atkārtojums gēna struktūrā parādās kā homoloģijas rajons ar 82% identitāti

Tīkla BLAST no lokāla datora


Tīkla BLAST

• Mūsdienās vairs nav tik plaši lietots, jo arī standarta WWW BLAST interfeiss atļauj vienlaicīgi meklēt homologus vairākām nukleotīdu un aminoskābju secībām

• ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/release/LATEST/ • netblast-2.2.25-ia32-win32.exe vai • netblast-2.2.25-x64-win64.exe


Lokālais BLAST un lokālās datubāzes

• NCBI BLAST servera iespējas nav neierobežotas – reizumis meklēšana var ieilgt vai vispār nedot rezultātus. Veikt BLAST homoloģijas meklējumu ar vairākiem simtiem DNS/aminoskābju secību ir ļoti laikietilpīgi, ja to mēģina darīt NCBI mājas lapā

• Ja grib salīdzināt vairākas sekvences vienu ar otru, kuras nav GenBank datu bāzē, var izmantot BL2SEQ, bet tas ļauj veikt tikai 2 sekvenču salīdzinājumu vienlaicīgi

• Iespējams uzstādīt BLAST uz lokālā datora un veidot pašam savas datu bāzes


Lokālais BLAST

• Instalē Windows BLAST programmu • Izveido savas lokālās datu bāzes ar formatdb

komandu • Veic BLAST meklēšanu uz sava datora • ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/release/LATEST

• blast-2.2.25-ia32-win32.exe vai • blast-2.2.25-x64-win64.exe


FASTA – alternatīva BLAST

• BLAST nav vienīgā sekvenču homoloģijas meklēšanas programma

• FASTA (FAST-All) ir nukleotīdu un aminoskābju sekvenču homoloģijas meklēšanas programma, kas tika radīta vēl pirms BLAST

• Pearson WR, Lipman DJ (1988) Improved tools for biological sequence comparison. PNAS, 85: 2444 – 2448

• http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/2011. gada 27. oktobris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas

katedra 48

Vēlreiz vispārīgi par sekvenču salīdzināšanu

• Sekvenču līdzība vēl nenozīmē homoloģiju, t.i., izcelsmi no kopīga senča

• Homoloģija nenozīmē līdzīgu funkciju • Piemēri, mioglobīns un augu hemoglobīns – <25% identiski

aminoskābju atlikumi, bet līdzīga proteīnu struktūra, funkcija un izcelsme

• Cilvēka malāta un laktāta dehidrogenāzes ir homoloģiskas, bet veic atšķirīgu funkciju

• Baktēriju subtilizīns un dzīvnieku himotripsīns nav homologi, bet tiem ir līdzīgi proteāzes aktīvie saiti (Asp, His un Ser) – konverģentās evolūcijas piemērs




Himotripsīna un subtilizīna dot plots


Documents

Lekciju saraksts