Upload
phungmien
View
229
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
i
Lembar Pengesahan
OPTIMASI METODE PURIFIKASI DARI EKSTRAK DAUN SIRIH
HIJAU (Piper betle Linn) YANG MEMILIKI AKTIVITAS ANTIBAKTERI
TERHADAP BAKTERI Propionibacterium Acnes
Skripsi
Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi (S.Farm) di
Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Udayana
Oleh
Wayan Agus Wijaya
NIM. 1308505026
Menyetujui:
Pembimbing I Pembimbing II
N. L. P Vidya Paramita, S.Farm., M.Sc., Apt. Ni Made Pitri Susanti, S.Farm., M. Si., Apt.
NIP. 198401032008122004 NIP. 198302132006042002
Mengesahkan:
Ketua Jurusan Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Ni Made Pitri Susanti, S.Farm., M.Si., Apt.
NIP. 19830213200604200
ii
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, karena
atas berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
“Optimasi Metode Purifikasi Dari Ekstrak Daun Sirih Hijau (Piper betle
Linn) Yang Memiliki Aktivitas Antibakteri Terhadap Bakteri
Propionibacterium acnes” tepat pada waktunya.
Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan, saran dan bimbingan
dari berbagai pihak. Maka dari itu, pada kesempatan ini penulis ingin
mengucapkan terima kasih kepada:
1. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M. Si., selaku Dekan Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
2. Ni Made Pitri Susanti, S.Farm., M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
3. N. L. P. Vidya Paramita, S.Farm., M.Sc., Apt., selaku dosen pembimbing I
yang dengan penuh perhatian telah memberikan motivasi, semangat,
bimbingan dan saran dengan sabar selama penulis mengikuti pendidikan di
Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Udayana, khususnya dalam penyusunan skripsi ini.
4. Ni Made Pitri Susanti, S.Farm., M.Sc., Apt., selaku dosen pembimbing II
yang dengan penuh perhatian telah memberikan motivasi, semangat,
bimbingan dan saran selama penulis mengikuti pendidikan di Jurusan
Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Udayana, khususnya dalam penyusunan skripsi ini.
iii
5. Seluruh dosen dan staf pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas MIPA
Universitas Udayana yang telah memberikan bantuan kepada penulis
selama penyusunan skripsi ini.
6. Orang tua kandung yang sangat saya cintai dan hormati, Mamin shen dan
Ida Ayu Rintis yang telah mengasuh dan membesarkan penulis,
membimbing dan memberi motivasi dalam penyusunan skripsi ini.
7. Adik kandung saya, Nyoman Kanda Satyawan yang selalu memberi
motivasi dan dukungan.
8. Sahabat terkasih saya, Nita Pratiwi yang selalu memberi semangat dan
motivasi dalam pengerjaan skripsi ini.
9. Seluruh rekan mahasiswa Jurusan Farmasi angkatan 2013 Tredecim
Paracelcius khususnya teman teman Bebangkaan 13 Angga, Cok arys,
Arya wiraguna, Gungde, Lova, Rio, Prima, Krisna, Wisnu, Rama, wijaya,
Wisesa dan Wiracana.
Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna.
Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat
membangun sehingga di masa yang akan datang dapat menjadi lebih baik. Penulis
berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang
memerlukan.
Bukit Jimbaran, juli 2017
Penulis
iv
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i
LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. ii
KATA PENGANTAR ..................................................................................... iii
DAFTAR ISI .................................................................................................... v
DAFTAR TABEL ............................................................................................ ix
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... x
DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xi
DAFTAR ISTILAH ......................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xiv
ABSTRAK ....................................................................................................... xv
BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................... 1
1.1 Latar Belakang.................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah .............................................................. 4
1.3 Tujuan ................................................................................. 4
1.4 Manfaat ............................................................................... 4
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 5
2.1. Sirih Hijau (Piper betle L.) ....................................................... 5
2.1.1. Klasifikasi ..................................................................... 5
2.1.2. Deskripsi ....................................................................... 5
2.1.3. Kandungan Kimia ......................................................... 7
v
2.1.4. Bioaktivitas Daun Sirih Hijau ....................................... 7
2.2. Ekstrak ...................................................................................... 8
2.2.1. Definisi Ekstrak ............................................................. 8
2.2.2. Metode Ekstraksi ........................................................... 8
2.2.3. Purifikasi ........................................................................ 10
2.3. Acne Vulgaris ........................................................................... 11
2.4. Propionibacterium acnes .......................................................... 12
2.5. Minyak Atsiri ............................................................................ 13
2.6. Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Difusi Disk ............ 14
BAB III. METODE PENELITIAN ................................................................ 16
3.1. Rancangan Penelitian ............................................................... 16
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian................................................... 16
3.3. Objek Penelitian ....................................................................... 16
3.4. Bahan Penelitian ....................................................................... 17
3.4.1. Bahan Ekstraksi dan Purifikasi ....................................... 17
3.4.2. Bahan Uji Skrining Fitokimia ........................................ 17
3.4.3. Bahan Uji Antibakteri ..................................................... 17
3.5. Alat Penelitian ......................................................................... 18
3.6. Batasan Operasional Penelitian ............................................... 18
3.7. Variabel Penelitian .................................................................. 19
3.7.1. Variabel Bebas ............................................................. 19
3.7.2. Variabel Terikat ............................................................ 19
vi
3.7.3. Variabel Terkontrol ...................................................... 19
3.8. Prosedur Penelitian ................................................................... 19
3.8.1. Determinasi Tumbuhan ................................................ 19
3.8.2. Pengambilan dan Preparasi Sampel .............................. 20
3.8.3. Pembuatan Ekstrak dan Purifikasi Ekstrak Sirih Hijau 20
3.8.4. Penetapan Kadari Air Dengan Destilasi Toulena ......... 22
3.8.5. Uji Skrining Fitokimia dengan KLT............................. 22
3.8.6. Uji Aktivitas Fraksi uji dengan Metode Difusi Disk ... 24
3.9. Uji KLT Bioautografi kontak ................................................... 25
3.10. Analisis Data .......................................................................... 26
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 28
4.1. Determinasi Tanaman ............................................................... 28
4.2. Preparasi Sampel ..................................................................... 28
4.3. Penetapan Kadar Air Dengan Destilasi .................................... 30
4.4. Pembuatan Ekstrak dan Purifikasi Ekstrak Etanol Daun Sirih
Hijau (Piper betle L.). .............................................................. 31
4.5. Uji Konfirmasi Bakteri ............................................................. 33
4.6. Skrining Fitokimia Dengan KLT .............................................. 35
4.7. Uji Aktivitas Antibakteri .......................................................... 44
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 51
5.1. Kesimpulan ............................................................................... 51
5.2. Saran ......................................................................................... 51
vii
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 53
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1. Klasifikasi daya hambat pertumbuhan bakteri .............................. 15
Tabel 3.1. Jenis pereaksi pendeteksi dan hasil positif setelah dideteksi ........ 23
Tabel 3.2. Sampel, konsentrasi dan jenis bakteri uji aktivitas antibakteri ..... 25
Tabel 3.3. Klasifikasi zona hambatan ............................................................ 26
Tabel 4.1. Hasil Uji Konfirmasi isolat bakteri P. acnes ................................. 34
Tabel 4.2. Hasil identifikasi FH dan FEA I dengan pereaksi pendeteksi
dan perbandingan dengan pustaka................................................ 36
Tabel 4.3. Hasil identifikasi FK, FEA II, FD dan FEA III dengan
pereaksi pendeteksi dan perbandingan dengan pustaka................ 40
Tabel 4.4. Hasil pengujian aktivitas antibakteri ............................................. 45
ix
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1. Tanaman sirih (Piper betle L.) .................................................... 5
Gambar 4.1. Hasil Skrining KLT FH dan FEA I ............................................. 35
Gambar 4.2. Hasil Skrining KLT FK, FEA II, FD dan FEA III ...................... 39
Gambar 4.3. Hasil uji KLT bioautografi FH dan FD ..................................... 50
x
DAFTAR SINGKATAN
ANOVA : Analysis of variance
CFU : Colony Forming Unit
KLT : Kromatografi Lapis Tipis
LSD : Least Significant Differences
MHA : Mueller Hinton Agar
CLSI : Clinical and Laboratory Standart Institute
UV : Ultra Violet
xii
DAFTAR ISTILAH
Inokulasi : Kegiatan pemindahan mikroorganisme dari
sumber asalnya ke media baru dengan
ketelitian yang sangat tinggi dan aseptis.
Intermediate : Merupakan kategori yang menjelaskan
bahwa isolat sebagai agen antimikroba pada
konsentrasi hambat minimal yang mendekati
darah dan tingkat jaringan dimana dari rata
rata respon dari isolat memiliki daya hambat
lebih kecil dibandingkan dengan kategori
susceptible.
Like dissolve like : Prinsip kelarutan dimana suatu zat cenderung
akan terlarut pada pelarut yang memiliki
kepolaran yang sama.
Resistant : Merupakan kategori yang menyatakan bahwa
isolat mikroorganisme tidak dapat dihambat
oleh agen antibakteri dengan konsentrasi
tertentu.
Sebum : Zat berminyak terdiri dari lemak, keratin,
dan bahan selular yang diproduksi oleh
kelenjar sebasea kulit.
xiii
Streak for single colony : Metode untuk memisahkan mikroorganisme
menjadi koloni tunggal dengan cara
menggoreskan isolat pada media agar.
Susceptible : Merupakan kategori yang menyatakan bahwa
isolat mikroorganisme dapat dihambat oleh
agen antibakteri dengan konsentrasi tertentu
secara maksimal.
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran.1. Komposisi larutan ....................................................................... 60
Lampiran.2. Perhitungan Pembuatan Fase Gerak ........................................... 61
Lampiran.3. Hasil Determinasi Tanaman Sirih Hijau ..................................... 62
Lampiran.4. Uji Konfirmasi Bakteri P. acnes ................................................. 64
Lampiran.5. Hasil Pengamatan KLT .............................................................. 66
Lampiran.6. Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (Media MHA) ............ 71
Lampiran.7. Tabel Hasil Penetapan Kadar Air ............................................... 72
Lampiran.8. Hasil uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi ................... 73
xv
ABSTRAK
Propionibacterium acnes merupakan bakteri utama penyebab jerawat,
dimana dilaporkan dalam suatu penelitian bahwa persentase ditemukannya bakteri
P. acnes pada lesi jerawat sebesar 78,8%. Daun sirih hijau telah banyak
dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antibakteri Kemampuan antibakteri daun
sirih hijau disebabkan karena adanya senyawa golongan fenol yang terdiri dari
kavikol, hydroxychavicol, chavibetol, estragol, eugenol, carvacrol dan golongan
senyawa seskuiterpen. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode optimum
yang menghasilkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri P. acnes dari ke-enam
fraksi uji yaitu FH, FEA I, FEA II, FEA III, FK dan FD.
Metode purifikasi yang digunakan untuk mendapatkan ke-6 fraksi tersebut
adalah LLE dengan penggunaan pelarut polar etanol-air yang tidak bercampur
dengan pelarut heksan, kloroform dan dietileter. Ke-6 fraksi uji tersebut
selanjutnya di uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi disk dan dilanjutkan
dengan metode tambahan yaitu KLT bioautografi kontak. Analisis data secara
dilakukan secara deskriptif terhadap nilai diameter zona hambat dengan
mengkategorikannya berdasarkan CLSI dan terhadap hasil skrining fitokimia
serta KLT-Bioautografi. Analisis statistik dilakukan terhadap data diameter zona
hambat menggunakan ANOVA-one way.
Hasil penelitian ini diperoleh hanya dua fraksi yaitu fraksi n-heksan dan
fraksi dietileter yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri bakteri P. acnes
dengan nilai diameter zona hambat sebesar 8 mm dan 9 mm. Metode purifikasi
ekstrak daun sirih hijau yaitu gabungan metode maserasi dan LLE yang
dilakukan belum optimal dilihat dari ke-6 fraksi yaitu fraksi etanol-air (FEA I),
fraksi etanol-air (FEA II), fraksi etanol-air (FEA III), fraksi kloroform, fraksi
dietil eter dan fraksi n-heksan yang belum mampu menghambat pertumbuhan
bakteri P. acnes dimana ke-6 fraksi tersebut termasuk dalam kategori resistant.
Kata Kunci: sirih hijau, optimasi metode, difusi disk, Propionibacterium acnes.
xvi
ABSTRACT
Propionibacterium acnes is the main cause of acne bacteria, which is
reported in a study that the percentage of P. acnes bacteria found in acne lesions
was 78.8% (Sylvia, 2010). Green betel leaf has been reported to have antibacterial
activity. The antibacterial ability of green betel leaves is caused by the phenol
group compound consisting of kavikol, hydroxychavicol, chavibetol, estragol,
eugenol, carvacrol and sesquiterpen compound class. The aim of this research is
to find out the optimum method that produces antibacterial activity against P.
acnes bacteria from six test fractions ie FH, FEA I, FEA II, FEA III, FK and FD.
The purification method used to obtain the six fractions is LLE with the
use of water-soluble ethanol solvent with hexane, chloroform and diethylether
solvents. The six fractions of the test are then tested for antibacterial activity by
the disk diffusion method and followed by additional method of contact TLC
bioautography. The data analysis was done descriptively to the value of drag zone
diameter by categorizing it based on CLSI and on the results of the phytochemical
scores and TLC-Bioautography. Statistical analysis was performed on the drag
zone diameter data using ANOVA-one way.
The results of this study obtained only two fractions of the fraction of n-
hexane and diethylether fraction capable of inhibiting the growth of bacterial
bacteria P. acnes with the value of inhibit zone diameter of 8 mm and 9 mm. The
purification method of green betel leaf extract that is combination of maseration
and LLE method is not optimal yet from 6 fractions ie ethanol-water fraction
(FEA I), ethanol-water fraction (FEA II), ethanol-water fraction (FEA III)
Chloroform fraction, diethyl ether fraction and n-hexane fraction that have not
been able to inhibit the growth of P. acnes bacteria where the 6 factions are
included in the resistant category.
Key word: Piper betle, optimization methods,disk diffusion, Propionibacterium
acnes.
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Propionibacterium acnes merupakan bakteri utama penyebab jerawat,
dimana dilaporkan dalam suatu penelitian bahwa persentase ditemukannya bakteri
P. acnes pada lesi jerawat sebesar 78,8% (Sylvia, 2010). Daun sirih hijau telah
banyak dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Berdasarkan penelitian
Putri (2010), ekstrak etanol daun sirih hijau memiliki aktivitas antibakteri
terhadap bakteri P. acnes dengan nilai Kadar Hambat Minimum (KHM) sebesar
0,25%. Menurut Kursia et al., (2016) bahwa pada konsentrasi 5% ekstrak
etilasetat daun sirih hijau menghasilkan daya hambat 15 mm terhadap bakteri
Staphylococcus Epidermidis yang merupakan salah satu bakteri penyebab jerawat.
Salah satu komponen penting dalam daun sirih hijau adalah minyak atsiri.
Kemampuan antibakteri daun sirih hijau disebabkan karena adanya senyawa
golongan fenol yang terdiri dari kavikol, hydroxychavicol, chavibetol, estragol,
eugenol, carvacrol dan golongan senyawa seskuiterpen. Senyawa fenol dengan
inti katekol dalam daun sirih (Piper betle L.) adalah allylpyrocatechol dan
hydroxychavicol. (Moeljanto dan Mulyon, 2003). Hasil uji bioautografi ekstrak
terpurifikasi daun sirih hijau dengan menggunakan fase diam silika gel GF254 dan
fase gerak n-heksan: etilasetat (7,2: 2,8) v/v diperoleh satu spot dengan nilai Rf
3.7 dimana dari nilai Rf 3.7 itu diketahui senyawa aktif yang berperan sebagai
2
antibakteri terhadap P. acnes yaitu golongan senyawa fenol dan terpenoid
(Paramita et al., 2016). Berdasarkan penelitian Jesonbabu et al., (2011), dikatakan
bahwa hydroxychavicol berperan sebagai antibakteri. Hydroxychavicol mampu
menghambat pertumbuhan bakteri dengan MIC 200 μg/mL untuk Staphylococcus
aureus dan Staphylococcus pyogenes dan 400 μg/ml untuk E. coli, Salmonella
typhi dan Shigella dysentriea (Jesonbabu et al., 2011).
Metode yang digunakan untuk memperoleh ekstrak terpurifikasi sirih hijau
adalah gabungan metode maserasi dan Liquid-liquid extraction. Proses maserasi
dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol 96% hingga diperoleh ekstrak
kasar dan dilakukan partisi menggunakan dua macam pelarut yaitu n-heksan dan
akuades (1:2) v/v sehingga diperoleh fraksi heksan dan fraksi etanol-air. Fraksi
etanol-air yang dihasilkan termasuk dalam katagori intermediate (Budiningrum,
2016). Kekurangan dari metode ini adalah pengunaan pelarut yang kurang tepat
dimana polaritas antara pelarut dengan senyawa aktif berbeda sehingga tidak
dapat menarik senyawa aktif yang mempunyai aktivitas antibakteri. Untuk
mendapatkan fraksi dengan kategori suspectible, perlu dilakukan optimasi metode
fraksinasi.
Hasil uji bioautografi minyak atsiri daun sirih hijau (Piper betle L.)
menggunakan fase diam silika Gel GF254 dan fase gerak toluen: etilasetat (93: 7)
v/v menunjukan adanya dua spot yaitu hRf 62 dan hRf 48 yang mengandung
golongan senyawa fenol dan terpenoid (Wintari, 2016) dimana setelah dilakukan
identifikasi dengan GC-MS dan KLT Densitometer didapatkan bahwa senyawa
3
fenol yang aktif sebagai antibakteri terhadap bakteri P. acnes adalah eugenol dan
kavikol (Wirasuta dan Paramita, 2016).
Pada penelitian ini metode purifikasi dilakukan menggunakan pelarut yang
sesuai dengan polaritas dari senyawa aktif, dimana pelarut yang digunakan adalah
kloroform dan dietileter. Menurut Samy and Gopalakrishnakon (2008)
penggunaan pelarut kloroform saat dilakukannya proses ekstraksi dapat
melarutkan golongan senyawa terpenoid, falvonoid dan steroid sedangkan
penggunaan pelarut dietileter dapat melarutkan golongan senyawa alkaloid dan
terpenoid. Jadi pada penelitian ini dilakukan optimasi metode fraksinasi dengan
maserasi serbuk daun sirih hijau menggunakan etanol 96% dan LLE dengan n-
heksan: air (1:1) v/v hingga diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi etanol air. Fraksi
etanol air selanjutnya di LLE dengan masing masing pelarut kloroform dan
dietileter. Fraksi n-heksan (FH), fraksi etanol-air (FEA I), fraksi etanol-air (FEA
II), fraksi etanol-air (FEA III), fraksi klorofrom (FK) dan fraksi dietileter (FD)
diuji aktivitas antibakteri untuk mengetahui metode optimumnya. Metode
optimum adalah metode yang menghasilkan aktivitas antibakteri suspectible.
Kelebihan metode ini dibandingkan dengan metode sebelumnya adalah
penggunaan pelarut yang sesuai dengan polaritas dari senyawa aktif yang
mempunyai aktivitas antibakteri.
4
1.2 Rumusan masalah
Bagaimana metode purifikasi ekstrak daun sirih hijau yang optimum
ditunjukan dengan aktivitas antibakteri yang termasuk dalam katagori suspectible?
1.3 Tujuan
Mengetahui metode optimum saat dilakukannya proses LLE yang
ditunjukan dengan diameter zona hambat yang besar dari fraksi n-heksan (FH),
fraksi etanol-air (FEA I), fraksi etanol-air (FEA II), fraksi etanol-air (FEA III),
fraksi klorofrom (FK) dan fraksi dietileter (FD) dengan menggunakan metode
difusi disk sehingga menghasilkan aktivitas antibakteri yang termasuk dalam
kategori suspectible.
1.4 Manfaat
Melalui penelitian ini akan diperoleh informasi mengenai aktitas
antibakteri yang dihasilkan dari fraksi n-heksan (FH), fraksi etanol-air (FEA I),
fraksi etanol-air (FEA II), fraksi etanol-air (FEA III), fraksi klorofrom (FK) dan
fraksi dietileter (FD) dengan menggunakan metode difusi disk sehingga
menghasilkan aktivitas antibakteri yang termasuk dalam katagori suspectible.