Les BMR :Comment éviter les erreurs au laboratoire - entérobactéries

-hyperproductrices de céphalosporinase,- productrices de BLSE

- les acinetobacters, - les pyocyaniques

Dr O. BELLONDr O. BELLONHôpital dHôpital d’’AixAix--enen--ProvenceProvence

Connaître•• Les Les bactériesbactéries

–– IdentificationIdentification•• CorrecteCorrecte•• Jusqu’à l’espèceJusqu’à l’espèce

•• Leur Leur résistancerésistance•• Les Les mécanismesmécanismes de résistancede résistance

–– Leur fréquenceLeur fréquence–– Leur expressivitéLeur expressivité

•• Les Les milieux utilisésmilieux utilisés

Reconnaître•• Savoir n’est pas Savoir n’est pas

toujours suffisanttoujours suffisant–– MilieuxMilieux–– MéthodesMéthodes–– AntibiotiquesAntibiotiques

•• RecommandationsRecommandations–– En France CAEn France CA--SFMSFM

PRINCIPALES NOUVEAUTES DU COMMUNIQUE 2006

• Contrôle de qualité :– Des précisions ont été apportées concernant la souche

de Providencia stuartii CIP 107808• Antibiotiques à étudier :

– Addition de la fosfomycine dans la liste standard des entérobactéries

– Modification de la liste des pénèmes à tester chez les entérobactéries et P. aeruginosa

• Harmonisation des valeurs critiques européennes :

• Addition du Communiqué 2006 du groupe de travail : « Antibiogramme vétérinaire »

HARMONISATION EUROPEENNE

• en 2002 à la création de l’EUCAST (European Committeeon Antimicrobial Susceptibility Testing)

– s’accorder sur l’expression des concentrations critiques : celle qui a toujours prévalu en France a été retenue,

– établir des « cut-off values » séparant pour chaque couple espèce-antibiotique, la population des souches sauvages de celles porteuses d’un ou plusieurs mécanismes de résistance acquise ;

– établir des concentrations critiques pour la catégorisation clinique, d’une part en rédigeant en accord avec l’EMEA (European Agencyfor the Evaluation of Medicinal Products) une procédure

• Dans le Communiqué Annuel sont indiquées en gras :– les concentrations critiques proposées par l’EUCAST et

approuvées par le CA-SFM

pour éviter les erreurs

•• Pour toutes les bactériesPour toutes les bactéries–– Appliquer les recommandationsAppliquer les recommandations–– EncoreEncore–– toujourstoujours

•• Pour certaines bactériesPour certaines bactéries–– SavoirSavoir–– Chercher : on ne trouve que ce que l’on cherche……Chercher : on ne trouve que ce que l’on cherche……

Identification•• Réactifs non périmésRéactifs non périmés•• Contrôle des lectures (visuelles et automates Contrôle des lectures (visuelles et automates

aussi….)aussi….)•• Utilisations d’experts…Utilisations d’experts…•• Vérifier la concordance avec l’antibiogrammeVérifier la concordance avec l’antibiogramme•• Ne pas se contenter Ne pas se contenter

–– du genredu genre–– d’une approximation (milieux chromogènes)d’une approximation (milieux chromogènes)–– D’une « D’une « identification acceptableidentification acceptable »»

•• Tout le monde le sait mais l’applique tTout le monde le sait mais l’applique t--on tous on tous les jours??les jours??

Les résistances•• NaturellesNaturelles

–– Pyocyanique rPyocyanique réésistant sistant àà la la pyostacinepyostacine–– EntEntéérobactrobactééries rries réésistantes sistantes àà la la vancomycinevancomycine–– SerratiaSerratia rréésistante sistante àà la la colimycinecolimycine–– EtcEtc………………………………………………

•• AcquisesAcquises–– MutationMutation–– Transfert de gTransfert de gèènesnes–– EtcEtc……………………..

•• Association des phAssociation des phéénomnomèènes nes –– Difficiles Difficiles àà ddéépisterpister–– impasse thimpasse théérapeutiquerapeutique–– Diagnostic important pour lDiagnostic important pour l’é’épidpidéémiologie et la prmiologie et la préévention de vention de

la dissla dissééminationmination

L’antibiogramme

•• Antibiotique en milieu Antibiotique en milieu géloségélosé

•• automatiséautomatisé

Conditions Techniques• DE DILUTION ET DE DIFFUSION EN MILIEU GELOSE

– Enterobacteriaceae, bacilles à Gram négatif non fermentaires Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonasmaltophilia, Burkholderia cepacia

• - Inoculum– A partir d’une culture de 18-24 h sur milieu gélosé non sélectif,– préparer une suspension en bouillon Mueller-Hinton ou en solution

saline (0,9 % NaCl) équivalente au standard McFarland 0,5 (~ 108 UFC/ml).

– Cette suspension peut également être préparée à partir d’une culture en bouillon Mueller-Hinton obtenue après incubation à 37° C au bain-marie agité pendant 3 à 5 h, et dont la densité est ajustée au standard McFarland 0,5.

Conditions Techniques• Milieu

– Gélose Mueller-Hinton• Ensemencement

– méthode de dilution :• diluer la suspension inoculum au 1/10 et déposer 1 à 2 µl, soit ~

104 UFC par spot.– méthode de diffusion :

• diluer la suspension inoculum au 1/100 (~ 106 UFC/ml) et ensemencer

– par écouvillonnage – ou par inondation

• Lecture– Après 18-24 h d’incubation à 35-37° C.

•• Tester Tester TOUSTOUS les les antibiotiques de antibiotiques de la liste standard la liste standard

•• Tester Tester si possiblessi possiblesTOUSTOUS les les antibiotiques de la antibiotiques de la liste complémentaire liste complémentaire en cas de résistancesen cas de résistances

•• Meilleur diagnostic Meilleur diagnostic des mécanismes de des mécanismes de résistance résistance –– d’où meilleur d’où meilleur

traitementtraitement–– D’où diminution de la D’où diminution de la

durée de possible durée de possible disséminationdissémination

•• Il existe une liste pour chaque germeIl existe une liste pour chaque germe

•• Utiliser les bonnes Utiliser les bonnes concentrations critiquesconcentrations critiques

•• LireLire les règles de la lecture interprétativeles règles de la lecture interprétative……..et ……..et les les appliquerappliquer–– changer le résultat APRES vérification de changer le résultat APRES vérification de

l’identification…….l’identification…….

Céphalosporinases inductibles• « Interpréter I un résultat S

– à céfotaxime – et/ou à ceftriaxone – et/ou à ceftazidime – et/ou à aztréonam

si le résultat est I ou R à l’une des molécules citées chez une entérobactérie naturellement productrice d'une céphalosporinase inductible »

BLSE• « La mise en évidence d’une synergie entre un

inhibiteur de bêta-lactamase et les céphalosporines de 3ème génération et/ou l’aztréonam permet la détection de mécanismes de résistance non décelables par les tests usuels. »

• « En pratique, on réalise le test de synergie en disposant les disques des bêta-lactamines à étudier à 30 mm (centre à centre) d’un disque d’amoxicilline + acide clavulanique (AMC). »– Une synergie entre AMC et la ceftazidime et/ou

l’aztréonam (indicateurs les plus sensibles) et/ou le céfotaxime et/ou la ceftriaxone permet la détection d’une ß-lactamase à spectre étendu (BLSE).

BLSE

« En cas de synergie,interpréter I tout

résultat obtenu S pour céfotaxime, ceftriaxone, ceftizoxime, ceftazidime, céfépime, cefpirome, céfixime et pour l’aztréonam. »

amcamc

ctxctxcazcaz

crocro

atmatm

• « La détection de BLSE chez les souches également hyperproductrices de céphalosporinase (Enterobacter, par exemple) est facilitée par la recherche d’une synergie entre AMC et céfépime ou cefpirome »

amcamc

cpocpo

tcctcc

fepfep

ctxctx

amcamc

Alternatives

normalnormal

Avec Avec cloxacillinecloxacilline250 à 500 mg/l250 à 500 mg/l

Alternatives

•• Disques avec Disques avec antibiotique antibiotique seul et associé seul et associé avec de l’acide avec de l’acide clavulaniqueclavulanique

cazcaz

ctxctx

cpocpo

Klebsiella oxytoca• « Chez K. oxytoca, un test de

synergie positif avec l’aztréonam et/ou la ceftriaxone, mais négatif avec la ceftazidime dont l’activité est conservée, évoque une hyperproduction de la bêta-lactamase naturelle chromosomique. Interpréter I les seuls résultats S associés à une synergie. »

Klebsiella oxytoca

•• Présence de Présence de synergie mais synergie mais pas de BLSEpas de BLSE

Klebsiella oxytocasans et avec cloxacilline

Klebsiella oxytoca

•• ProblèmesProblèmes–– Fausses images positives dans Fausses images positives dans

les souches les souches hyperproductriceshyperproductricessans BLSEsans BLSE

–– Souche ayant vraiment une Souche ayant vraiment une BLSE :BLSE :

•• présence d’une synergieprésence d’une synergie•• Rechercher l’AAC6’ (mais pas Rechercher l’AAC6’ (mais pas

toujours présente)toujours présente)–– Souche Souche hyperproductricehyperproductrice avec avec

BLSEBLSE•• Pas d’image de synergie mais Pas d’image de synergie mais

BLSE présente….BLSE présente….

Kluyvera•• Image de synergie mais Image de synergie mais

pas de BLSEpas de BLSE

•• Actuellement on pense Actuellement on pense que les BLSE que les BLSE dériveraient de cette dériveraient de cette enzyme chromosomique enzyme chromosomique présente naturellement présente naturellement chez ce genrechez ce genre

Proteus• « Chez P. vulgaris, P.

penneri et C. diversus, un test de synergie positif avec le céfotaxime et/ou l'aztréonam évoque une hyperproduction de la bêta-lactamasenaturellechromosomique et beaucoup plus rarement la présence d'une BLSE plasmidique. »

pvulpvul

ppenppen

Défaut d’expression de la BLSE dans certaines espèces

– « Chez P. mirabilis, P. vulgaris, P. penneri, M. morganii, P. stuartii et P. rettgeri, les BLSE s’expriment à bas niveau.

– Dans ce cas, le test de synergie est optimisé en disposant les disques à une distance de 40-45 mmau lieu de 30 mm. »

Défaut d’expression de la BLSE dans certaines espèces

– Alternatives• Biologie moléculaire• Conjugaison avec un colibacille récepteur, les BLSE

s’exprimant mieux dans cette espèces.

Proteus mirabilis

pmirpmirEcolEcol--TCTC

amcamc

BLSE et AAC’

• « Etant donné l’épidémiologie actuelle, quand une entérobactérie est R à la tobramycine, la nétilmicine et l’amikacine, mais S à la gentamicine, il est conseillé de rechercher la présence d’une BLSE associée, surtout chez les espèces où ce type d’enzyme est faiblement exprimé (Proteusspp., Providencia spp.). »

• Attention – certaines bactéries possèdent une AAC’ naturelle– Actuellement on note une augmentation des souches qui n’ont pas

d’AAC6’ associée……..– Problème des milieux utilisés pour rechercher les germes porteurs

de BLSE et basés sur la présence de cette enzyme (milieux à l’amikacine ou à la tobramicine)

Fausses images chez les non entérobactéries

•• XanthomonasXanthomonas•• RadiobacterRadiobacter•• AgrobacterAgrobacter•• StenonotrophomonasStenonotrophomonas

Les BMR•• EfficacitEfficacitéé face face àà la rla réésistance des bactsistance des bactééries = Association ries = Association

des compdes compéétencestences–– ClinicienClinicien

•• PrPrééllèèveve•• Traite efficacementTraite efficacement

–– MicrobiologisteMicrobiologiste•• DDéétectetecte•• Suivi de lSuivi de l’é’évolution de lvolution de l’é’épidpidéémiologiemiologie

–– SoignantsSoignants•• Appliquent les rAppliquent les rèègles dgles d’’hygihygièène de basene de base•• Isolent si nIsolent si néécessairecessaire

–– EOHEOH•• Aide Aide àà la mise en place dla mise en place d’’une politique efficace (faisable et une politique efficace (faisable et

appliquappliquéée)e)–– MaladeMalade

•• IntIntéégrgréé au soinau soin

La lecture interprétative de l'antibiogramme

• « fondée sur la connaissance– des phénotypes de résistance conduit dans certains cas

à transformer un résultat initialement catégorisé S en résultat I ou R en raison d'un risque d'échec thérapeutique

– De plus, pour quelques couples bactérie-antibiotique, malgré une catégorisation « sensible », le risque accru de sélection in vivo de mutants résistants justifie un commentaire particulier destiné au clinicien.

• Ceci requiert au préalable l'identification correcte de la souche

• bactérienne et une méthode d'antibiogramme standardisée. »

La lecture interprétative de l'antibiogramme

• L’identification de la bactérie• L'identification formelle du (ou des)

mécanisme(s) de résistance impliqué(s) • impose la mise en place de techniques

spécifiques.• Les règles de lecture interprétative espèces ou

pour certains groupes bactériens,

Contrôle De Qualité Interne

• Un contrôle de qualité interne doit être organisé pour s’assurer de la validité des résultats obtenus. Les souches de référence recommandées sont les suivantes :– Escherichia coli CIP 7624 (ATCC 25922),– Pseudomonas aeruginosa CIP 76110 (ATCC 27853),– Staphylococcus aureus CIP 7625 (ATCC 25923),– Providencia stuartii CIP 107808,– Streptococcus pneumoniae CIP 104485

Conclusion•• La bonne méthode est celle que l’on connaît et La bonne méthode est celle que l’on connaît et

que l’on pratique régulièrement avec des que l’on pratique régulièrement avec des contrôles réguliers et une participation à des contrôles réguliers et une participation à des réseaux…………..réseaux…………..

•• Se tenir au courantSe tenir au courant–– http://http://wwwwww..invsinvs..santesante..frfr/presse/2004/le_point_sur/inf_a_baumannii_110204/ac/presse/2004/le_point_sur/inf_a_baumannii_110204/ac

ineto_phenotype_2004.pdfineto_phenotype_2004.pdf