Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES

Franck HALARY UMR CNRS 5164 (Bordeaux)

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES

• Généralités sur les Cellules Dendritiques :

Historique « Milestones »

Origines/PhénotypesRôles/Fonctions immunologiquesMiscellanées

• Cellules Dendritiques et Thérapie humaine :

• Interactions CD/cytomegalovirus humain

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

• 1796 : 1er essai de vaccination anti-variolique par Jenner.

• 1868 : 1ère observation par Langerhans dans la peau humaine.

• 1973 : Identification chez la souris. Steinman RM et al. J Exp Med. 1973;137:1142-62.

• 1992 : Cultures in vitro. Caux C et al. Nature 1992;360: 258-261 (CSH CD34+ humaines). Inaba, K.et al. J. Exp. Med.1992; 176: 1693-1702 (précurseurs moelle murine).

Sallusto F et al. J. Exp. Med.1994; 179(4):1109-18 (monocytes sanguins humains).

• 1998 : Utilisation en essais thérapeutiques. Nestle, F.O. et al. Nature Med.1998;4:328-332

HISTORIQUE « Milestones » DES DC

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES

• Généralités sur les Cellules Dendritiques :

Historique « Milestones »

Origines/PhénotypesRôles/Fonctions immunologiquesMiscellanées

• Cellules Dendritiques et Thérapie humaine :

• Interactions CD/cytomegalovirus humain

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

MORPHOLOGIE ET ULTRA STRUCTURE DES DC

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ORIGINESLess than 0,1% of all leukocytes

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Vaisseausanguin (HEV) Épithélium

MIP3DC

ImmatureCCR6

Toxines, allergènes, pathogènes

(bactéries, virus, etc.)

Moëlle osseuse

preDC(CD14+, CD11c+,

CD11c-)

CYCLE DES CELLULES DENDRITIQUES

Lymphocytesspécifiques

activés

Eliminationdu pathogène

D ’après Banchereau & Steinman, Nature 1998

Organe lymphoïde secondaire (i.e. ganglion lymphatique, CCL19/MIP3b)

DCMatureCCR7

CCL21/6C-kine

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

PHENOTYPES

CD1a + + -CD2 - + -

CD14 - + -

Langerin + - -

CD11c + + -

HLA-DR + + +CD19, CD56,CD3 (lin)

- - -CD80, CD86,CD40 + + +CD123 - - +DC-SIGN - + -

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

IsoDAPI

CD1aDAPI

LangDAPI

CD44DAPI

Some peripheral DC markers

DC-SIGNDAPI

LP E

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES

• Généralités sur les Cellules Dendritiques :

Historique « Milestones »

Origines/PhénotypesRôles/Fonctions immunologiquesMiscellanées

• Cellules Dendritiques et Thérapie humaine :

• Interactions CD/cytomegalovirus humain

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Activationinflammation

La rencontre cellule dendritique/pathogène :activation/maturation

muqueuse

Celluledendritique

Agentpathogène

Capture

TLR

C-Lectine

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Vaisseausanguin (HEV) épithélium

DCimmature

Toxines, allergènes, pathogènes

(bactéries, virus, etc.)

Organe lymphoïde secondaire (i.e. ganglion lymphatique)

DCmature

Moëlle osseuse

CSHpreDC

ACTIVATION/MATURATION DES DC

Lymphocytesspécifiques

activés

Eliminationdu pathogène

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Stimulus Details

Microbial products Via Toll-like, NOD, RIG-I, Mda5 receptors

Lymphocytes (natural killer, NKT,gammadelta T, alphabeta T) and neutrophils Via CD40, lymphotoxin alphabeta receptors

Cytokines TNF, interferons, TSLP and IL-10

Endogenous ligands Uric acid, histamine, heat shock proteins,high mobility group box protein 1, defensins, ATP

Immune complexes Via activating and inhibitory FcR

From the following article:Taking dendritic cells into medicineRalph M. Steinman & Jacques BanchereauNature 449, 419-426(27 September 2007)

STIMULI D ’ACTIVATION/MATURATION DES DC

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ACTIVATION/MATURATION DES DC

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

acide lipoteichoiquelipopeptides (Pam3CSK4)

peptidoglycan ?Zymozan, CMV ?

dsRNApoly I:C

? LPSViral

ssRNAImiquimod

Bactériesuropathogènes

CpGdéméthylé

Flagelline

Cytokines pro-inflammatoires : TNF, IL1, IL6, IL12, etc.

Activation de NFB

VOIE DES TLR (Toll-Like Receptors)

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

PHENOTYPES DC/ Toll-like Receptor

mDC pDC

MONO

TLR1 ++ +/-++ TLR2 ++ -++ TLR3 ++ --TLR4 - - + TLR5 +/- - + TLR6 +/- +/- +/- TLR7 - + -

TLR9 - ++ - TLR8 - + +/-

TLR10 +/- - +/-

Kadowaki et al., J. Exp. Med., 2001

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

B: B cells, DC: dendritic cells, LC: Langerhans cells, Mo: monocytes, M: macrophages, PMN: polymorphonuclear cells,LDNF: GalNAc1-4(Fuc1-3)GlcNAc, ManLAM: mannosylated lipoarabinomannan, tPA: tissue plasminogen activator,ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif*: mannose receptor, **: intermediately-differentiated M

Récepteurs lectiniques de type C (CLR)

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Récepteurs lectiniques de type C des DC Myéloïdes

Activation des cellules T naïves

Capture des antigènes

Adhésion/migration

Récepteurs solublesaux antigènes

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLES/FONCTIONS IMMUNOLOGIQUES

• Cellule professionnelle présentatrice de l ’antigène (LT naïfs).• 10-100 X de complexes pCMH [autres APC : lymphocyte B,

monocyte et macrophage].

cellule dendritique

lymphocyte T naïfACTIVATION

CD2

LFA-3 pCMH

LFA-1actif

ICAM-1

TCR/CD3

CD4/CD8 CD80/86(B7.1/2)

CD28

Organe lymphoïde secondaire

DC mature(« interdigitating »)

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLES/FONCTIONS IMMUNOLOGIQUES• Capacité de présentation croisée d ’antigène.

From the following article:Recent advances in antigen processing and presentationPeter E JensenNature Immunology 8, 1041 - 1048 (2007)

Voie classe I (endogène) Voie classe II (exogène)

Présentation croisée (« cross-presentation » or « cross-priming »)

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLES/FONCTIONS IMMUNOLOGIQUES

• Recrutement in situ des autres acteurs des réponses immunitaires innées et adaptatives.

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLES/FONCTIONS IMMUNOLOGIQUES• Induction de la Tolérance immunologique.

• Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans (Blood 2002 Jul 1;100(1):174-7).

• Generation of human CD8 T regulatory cells by CD40 ligand-activated plasmacytoid dendritic cells (J Exp Med 2002 Mar 18;195(6):695-704).

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES

• Généralités sur les Cellules Dendritiques :

Historique « Milestones »

Origines/PhénotypesRôles/Fonctions immunologiquesMiscellanées

• Cellules Dendritiques et Thérapie humaine :

• Interactions CD/cytomegalovirus humain

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

GENERATION DE DC MYELOIDES HUMAINES in vitro

Monocytes (tri ou adhérence)

CSH CD34+ (tri, cordon ousang mobilisé)

imDC intersticielles Langerhans imDC intersticielles

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES

• Généralités sur les Cellules Dendritiques :

Historique « Milestones »

Origines/PhénotypesRôles/Fonctions immunologiquesMiscellanées

• Cellules Dendritiques et Thérapie humaine :

• Interactions CD/cytomegalovirus humain

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

From the following article:Taking dendritic cells into medicineRalph M. Steinman & Jacques BanchereauNature 449, 419-426(27 September 2007)

CELLULES DENDRITIQUES ET THERAPIES

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DENDRITIC CELLS IN CLINICAL USE : Cancer immunotherapy

Goal : Induce a specific immune response

directed against tumoral antigens.

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LOADING ANTIGENS ON DENDRITIC CELLS

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LE MELANOME

• 1932 : 1/1500 2000 : 1/75• Enfance et UV +++• Survie à 5 ans : 70 à 85%• Seul traitement : la chirurgie

Pourtant le mélanome est immunogène

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Fragments de tumeurs

• Présentation croisée d’antigènes contenus dans des corps apoptotiques (Albert, Nature, 1998)

• Source d’antigènes de rejet tumoral ?

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Les DC internalisent les fragments

de cellules tumorales...

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

00

25002500

50005000

75007500

1000010000

00 500500 10001000 50005000

DCDC

DC+MelDC+Mel

00

20002000

40004000

60006000

80008000

00 500500 10001000 50005000

DCDC

DC+MelDC+Mel

Nombre de DC par puit

Inco

rpo

rati

on

de

Th

ymid

ine

Inco

rpo

rati

on

de

Th

ymid

ine

Cellules T CD4+ Cellules T CD8+

... puis induisent in vitro la prolifération de cellules T autologues...

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

... ainsi qu’une réponse CTL primaire

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

7.5/1 15/1 30/1 60/1Ratio effecteur : cible

% L

ys

e s

pé

cif

iqu

e (

Cr5

1)

DC chargées /Me275

DC contrôles/Me275

DC chargées /K562

DC contrôles/K562

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Cette réponse est dirigée contre des TAA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

7.5/1 15/1 30/1 60/1

Ratio effecteur : cible

% L

yse

spéc

ifiq

ue

(Cr5

1)

DC chargées/ T2 + 4PDC chargées/ T2 témoinsDC chargées/ T2 + PSADC contrôles/ T2 + 4P

CTL assay :- Cellules T éduquées vs CTRL- Cibles = cellules T2 pulsées avec peptides relevants / irrelevants

0

5

10

15

20

25

30no

mbr

e de

spo

ts /

200

000

cellu

les

T

- T CTRL- T CTRL- peptides mélanomes- peptides mélanomes

- T « éduqués »- T « éduqués »- peptides irrelevants- peptides irrelevants

- T « éduqués » + peptides mélanome- T « éduqués » + peptides mélanome

Mesure de la production d’IFNg par ELISPOT : restimulation (1 nuit) des cellules T par DC + peptides relevants / irrelevants

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES

• Généralités sur les Cellules Dendritiques :

Historique « Milestones »

Origines/PhénotypesRôles/Fonctions immunologiquesMiscellanées

• Cellules Dendritiques et Thérapie humaine :

• Interactions CD/cytomegalovirus humain

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLE OF DC IN TRANSPLANT REJECTION

PRESENTATION• Key role of DCs in transplant rejection via the

presentation of alloantigens or Tolerance (immature « Passenger Leukocytes »)

MATURATION• Act of Transplantation by itself induces

maturation signals.• Role of recurrent infections.

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

ROLE OF DC IN TRANSPLANT REJECTION: Indirect and direct allorecognition.

From the following article:The complementary roles of deletion andregulation in transplantation toleranceRobert I. Lechler, Oliver A. Garden and Laurence A. TurkaNature Reviews Immunology 3, 147-158 (February 2003)

direct

indirect

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

LES CELLULES DENDRITIQUES

• Généralités sur les Cellules Dendritiques :

Historique « Milestones »

Origines/PhénotypesRôles/Fonctions immunologiquesMiscellanées

• Cellules Dendritiques et Thérapie humaine :

• Interactions CD/cytomegalovirus humain

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Introduction : le cytomégalovirus humain

- Herpesvirus (HHV-5).

- Prévalence : 40 - 100% (réservoir 100% humain).

- Primo-infection puis ré-activations/ré-infections.

- Immuno-suppresseur (idem VIH et virus de la rougeole).

Glycoprotéines d ’enveloppe (gB, gH, etc.)

Enveloppe virale

Tégument (pp65)

Capside

ADN (double brin)

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Les voies d’entrées

LC : Cellules de Langerhans

DDC : Cellules dendritiques dermales

Fibroblastes

Modes de transmission majeurs

Infection périnatale/petite enfance : muqueuse oropharyngée (lait maternel, salive).

Adultes : muqueuse génitale (sécrétions séminales).

Coupe histologique d’une muqueuse oropharyngée

Représentation schématique de l’organisation cellulaire au niveau des muqueuses

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Is DC-SIGN able to bind CMV

and to promote infection ?

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN : histoire et principales caractéristiques

• Observation : Infection par le HIV (gp120) indépendante de CD4 sur certaines lignées cellulaires.

• 1992 : clonage d ’un ADNc codant pour une lectine capable de lier le mannose et la gp120 ( du CD4), à partir d ’une banque de placenta (Curtis et al., PNAS).

• 2000 : identification d ’une lectine de type C capable de fixer ICAM-3 ( de LFA-1 et /ou l ’aD-b2 integrin), exprimée sur les DC. L ’analyse de la séquence montre une homologie complète avec l ’ADNc cloné par Curtis et al.

DC-SIGN (DC-Specific ICAM-3 Grabbing Nonintegrin).

Domainecytoplasmique

Domaine de liaison auxcarbohydrates (CRD)

Répétitions dedomaines Igidentiques

Motif YXXL

Motif LL

DC-SIGN (ou CD209) :

• Lectine de type C : 45 kDa.

• Dépendante des ions Ca2+ .

• Ligands ou pathogènes reconnus actuellement : HIV (gp120), CMV (gB), HCV, Dengue Virus, Ebola, M. tuberculosis., Leishmania, H. pylorii, Schistosoma mansoni and ICAM-2/3.

• Profils d ’expression : DC et macrophages (in vivo/in vitro).

Geijtenbeek et al., Cell, 2000

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN...

In trafficking and T cell priming

As a pathogen binding receptor

endothelium

Dendritic cell

Naive T lymphocyte ACTIVATION

DC-SIGN

1. tethering

ICAM-2

DC-SIGN

LFA-1inactif

DC

2. arrest

ICAM-1

LFA-1actif

DC

CD2 TCR

LFA-3 pCMH

LFA-1actif

ICAM-1

DC-SIGNCD4CCR5

gp120

HIV

LT

infectionen cis

infectionen trans

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN-expressing cells bind CMV on their surface

A

parentalTHP-1

THP-1DC-SIGN

2

252

anti-DC-SIGN

MD-DC107

B

anti

-CM

V g

B (

MF

I)

0

20

40

60

80

100

low p

H20

0 5012

.5

3.12

5 0

DC-SIGN+ THP-1

parental THP-1

MD-DC

CMV concentrations (PFU/cell)

DC-SIGN+

cell

CMVparticle

DC-SIGNexpression

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DCDC-SIGN

DCtreatmentEDTA

mediummannan

anti-DC-SIGN or control

DCDC DC DC DC DC+ AD169-GFP

« trans-infection » principle

washes

Cell contactwith MRC5

Flux cytometry analyses

DC

-SIG

N P

E

GFP

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DCSIGN-dependent trans-infection of CMV permissive cells

THP-1 cells

% G

FP

+

MR

C5

cell

s

102030405060

0-

pre-treatmentCMV

-+

EGTA

70

-mannan anti

DC-SIGNcontrol

mAb

DC-SIGN+

parental

% G

FP

+

MR

C5

cell

s

51015202530

0

MD-DC

-pre-treatment

CMV-

+EGTA

-mannan anti

DC-SIGNcontrol

mAb

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN mediates CMV trans-infection but does not allow transmission of other herpesviruses

B

020406080

100120

cell-freeviruses

TB40/E

AD

169Tow

neVZVH

SV-1

A

0

10

20

30

40

TB40/E

AD

169Tow

neVZVH

SV-1

herpesvirus-pulsedDC-SIGN+ THP-1

medium

anti-DC-SIGN

control mAb

IEA

-EA

+ c

ells

(×

103)

IEA

-EA

+ c

ells

(×

103)

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN potentiates CMV trans-infection of MRC-5 cells

B

0

10

20

30

40

0.1 0.01 0.001

cell-free virusparental THP-1DC-SIGN+ THP-1+anti-DC-SIGN+control mAb

% G

FP

+ M

RC

5 ce

lls

MOI

A

0

5

1015

20

25

30

0.1 0.01 0.001

cell-free virusMD-DC+anti-DC-SIGN+control mAb

% G

FP

+ M

RC

5 ce

lls

MOI

MD-DC THP-1 cells

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN allows CMV to retain long term infectivity

0102030405060

0 2 4 6 8

Time after pulse (days)

% G

FP

+ M

RC

5 ce

lls

parental THP-1

DC-SIGN+ THP-1

cell-free virus

+anti-DC-SIGN

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Requirement of DC-SIGN cytoplasmic domain for CMV transmission

A DC-SIGNexpression

020406080

100120140

anti

-DC

-SIG

N(M

FI)

THP-1

THP-1 DC-SIGN

wt 3520

B membranebound CMV

0

20

40

60

80

100

anti

-CM

V g

B(M

FI)

THP-1

THP-1 DC-SIGN

wt 3520

C

37°C

4°C

0

10

20

30

40

50

% G

FP

+ M

RC

5 c

ells

THP-1

THP-1 DC-SIGN

wt 3520

LLYXXL YXXL

wt 3520

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

t=20minADAPI DC-SIGN

CMV Merge

B 4°C 37°C

low pHtreated

untreated

Figure 1 : Confocal imaging of immature MDDC (day 5-7 of differentiation) incubated for 2 hours at 4°C with TB40/E HCMV (20 pfu/cell) before a 1 hour subculture at 4°C or 37°C and a low pH treatment (glycine buffer, pH=3) and extensive washes. Cells were then immobilized on poly-L-lysine glass slides, fixed/permeabilized and immuno-stained with an anti-CMV gB. Images were obtained on a SP5 LSM (Leica Microsystems, Germany).

CMV internalization into MDDC is dependent on Temperature

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

TfnR LAMP2EEA1

5 min.

30 min.

180 min.

HCMV gBWhole HCMV

15 min.

75 min.

gB

LAMP2

A B

Whole HCMV is internalized into early endosomes

Figure 2 : A) Confocal imaging of immature MDDC incubated for 5, 30 and 180 minutes with the TB40/E HCMV strain (20 pfu/cell) prior to be fixed/permeabilized and immuno-stained with anti-DC-SIGN (blue), -transferrin receptor or -EEA1 or -LAMP2 (green), and -CMV gB (red). B) As dexcribed in A, cells were incubated with whole HCMV or purified recombinant HCMV gB (Biomérieux, Marcy l ’Etoile, FRANCE) for 15 and 75 minutes prior staining of gB (red) and LAMP2 (green). Images were obtained on a 510 LSM Meta (Zeiss, Germany).

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

CMV is internalized by phagocytosis into MDDC

F. Halary et SERCOMI, Université Bordeaux 2.

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN expression renders low susceptible cells permissive to CMV infection

BA

0

100

200

300

400

500

600

parental DC-SIGN+

THP-1 cellsMD-DC

nu

mb

er o

f IE

A-E

A+

cells

/104

cells

0

1

2

3

4

5

viru

s p

rog

eny

(x10

5 P

FU

/ml)

parental DC-SIGN+

THP-1 cellsMD-DC MRC-5

X10

X16

X23

medium

anti-DC-SIGN

control mAb

IE and E antigensexpression

CMV progeny

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

What is the ligand ?

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

CMV gB competes with HIV gp120 for DC-SIGN

DC-SIGN+

THP-1

untreatedHIV-1 gp120 mannan anti-DC-SIGN

ctrl mAb CMV gB HSV-1 gB

VZV gB VZV gEHSV-1 gD

untreated

6

119

20 14 18

123 35 102

123 132111

parentalTHP-1

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

DC-SIGN+ cells can bind recombinant soluble CMV gB

CM

V g

B

bin

din

g (

MF

I) 020406080

100120

0

0.00

250.

05 1 20

DC-SIGN+ THP-1

MD-DC

CMV gB concentrations(µg/ml)

no mAb

anti-DC-SIGN

ctrl

0102030405060

0

0.00

250.

05 1 20

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Characterization of the DC-SIGN/ CMV gB interaction by SPR (BIAcore)

SurfacePlasmonResonance

Viralenvelopeglycoprotein

SolubleDC-SIGN(monomers)

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

A DC-SIGN homologue, DC-SIGNR, displayssimilar functional features towards CMV

A

% G

FP

+H

EK

293

T c

ells

0

5

10

15

20

25

30

ctrl

+DC-SIG

N

+DC-SIG

NR

B

glycoprotein binding (MFI)

0 20 40 60 80 100

+DC-SIGNR+DC-SIGNControl

50

5

0.50.05

0.005

0

gly

cop

rote

inco

nce

ntr

atio

ns

(µg

/ml)

0 20 40 60 800 20 40 60 80

CMV gB

HIV gp120

ctrl

Master 2 Immunologie - 03/10/2007

Acknowledgment

UMR CNRS 5164 (Bordeaux)J Déchanet-Merville, JF Moreau

Institut Pasteur (Paris)A Amara, F Arenzana-Seisdedos

IBS (Grenoble)H Lortat-Jacob, C Houlès, F Fieschi

University of Halle-Wittenberg (Allemagne)

M Messerle

INRA (Villenave d ’Ornon)T Delaunay

Aventis-Pasteur (Lyon)C Méric