Les stratégies de ciblage des cellules dendritiques

Dr. Ludovic FREYBURGER, DVM, PhD

Maître de Conférences en Immunologie Clinique

Vétagro-Sup campus Vétérinaire Unité MIPIE 1 avenue Claude Bourgelat 69280 Marcy l’Etoile 04-78-87-56-61 ludovic.freyburger@vetagro-sup.fr

Nature Review Immunology In

trod

uctio

n

2

Ce que nous allons voir…

Que sont les cellules dendritiques? Quelles sont leurs fonctions principales dans la

réponses immunitaire? Pourquoi constituent-elles une cible privilégiée? Comment les atteindre spécifiquement? Quels sont les différents vecteurs utilisés et

leurs propriétés respectives?

Obj

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sage

3

Plan I. Les cellules dendritiques

A. Ontogénie B. Les sous populations C. Place dans la réponse immunitaire

II. Cellules dendritiques et manipulation de la réponse immunitaire

A. Les cellules dendritiques en immunothérapie B. Pourquoi cibler les cellules dendritiques in vivo? C. Caractéristiques d’un ciblage efficace

III. Les différents vecteurs A. Les vecteurs viraux B. Les récepteurs membranaires C. Les toxines bactériennes

4

I. Les cellules dendritiques 1868: les DC de

l’épiderme par Paul Langerhans

1973: les DC des organes lymphoïdes par Ralph Steinman et Zanvil Cohn

I. Le

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s

Immunomarquage : CD1a

Réseau de cellules dendritiques dans la peau 5

I.A.Ontogénie

Génération de DC in vitro

I. Le

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ndri

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s CD34+

CD1a+ CD14-

CD1a- CD14+

Langherans cells (LC)

Precursor LC

GM-CSF +IL-4 + TGFβ

Interstitial DC (dermal DC) GM-CSF +IL-4

Macrophages

6

I.A.Ontogénie

Schéma extrait de la thèse d’Ariane BLUM 2007 I. Le

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s

Lignage possible des DC in vivo

7

I.B.1. Les sous populations Les DC « résidentes »

Les pDC = cellules dendritiques plasmacytoïdes

Organes lymphoïdes

Les DC « migratoires »

Les mDC = cellules dendritiques myéloïdes

Tissus interstitiels (derme) Les cellules de Langerhans

Peau et épithéliums muqueux

Les précurseurs circulants Sang

DC myéloïdes : DC plasmocytoïdes :

Lin-CD11c+ CD11c- CD123+ (IL-3R+)

Dérivent des monocytes Origine lymphoïde

Production d’IFN-I++++

I. Le

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s

8

I.B.2.Phénotypes

Liu 2005

pDC : (anciennes DC lymphoïde = DC1) - nécessitent de l’IL3 - présentent l’IL3R = CD123 - synthèse précoce d’INF α et β - expriment le TLR7 et 9 mDC : (anciennes DC myéloïdes = DC2) - facteur de croissance : GM-CSF - possèdent des marqueurs myéloïdes ( CD13, CD11b/c) - expriment TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 Ne répondent pas aux mêmes stimulus

I. Le

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9

I.B.2. Phénotypes des DC humaines

Pulendran 2004 Immunological review I. Le

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10

I.B.2. Phénotypes des DC humaines

I. Le

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11

I.C.1.Présentation des antigènes I.

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12

I.C.1.Présentation des antigènes I.

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Présentation au LT4

13

I.C.1.Présentation des antigènes I.

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Réponse CD4 : - DC CD14+ induisent la différenciation des CD4 en Tfh (LT folliculat helper) qui sécrètent de l’IL-21 (importante pour le switch isotypique des LB) - DC CD14+ peuvent directement intéragir avec les LB - LC induisent la différenciation CD4 en TH2 avec la sécrétion préférentielle d’IL-4, d’IL-5, et d’IL-13. - LC peuvent induire une différenciation en TH 22, qui pourrait avoir des rôles protecteurs (MICI) ou favorisant (Psoriasis) dans des maladies inflammatoires.

14 Ueno et al. 2011 seminars in Immunology

I.C.1.Présentation des antigènes I.

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Présentation au LT8

15

I.C.1.Présentation des antigènes I.

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16 Ueno et al. 2011 seminars in Immunology

Réponse CD8 : - LC beaucoup plus efficaces que CD14+ DC pour induire des CD8 - LC capables de réaliser une présentation croisée - Rôle important de l’IL-15 qui permet d’augmenter la capacité des CD14+ DC à induire des CD8 Chez la souris, différence, car CD11c+/CD8+ sont plus capables d’induire une réponse CD8 que les LC. (Population sanguine chez l’homme qui serait CD141+ et qui équivaudrait aux CD11c+/CD8a+ murines)

I.C.2. Orientation de la RI I.

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17

18 Palucka et al. JI, 2011, 186:1325–1331

I.C.2. Orientation de la RI

I.C.2. Orientation de la RI I.

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=> Plasticité fonctionnelle 19

20 P.J. Tacken, C.G. Figdor / Seminars in Immunology 23 (2011) 12–20

II. Cellules dendritiques et manipulation de la réponse immunitaire

II. Cellules dendritiques et manipulation de la réponse immunitaire

21

II.A. Les DC en immunothérapie II.

Cib

lage

des

DC

Ahlers, J. D., and I. M. Belyakov. 2009. Strategies for recruiting and targeting dendritic cells for optimizing HIV vaccines. Trends Mol Med 15:263-274. 22

II.A. Les DC en immunothérapie Cellules dendritiques sensibilisées avec lysat allogénique

II. C

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C

23

II.A. Les DC en immunothérapie Cellules dendritiques sensibilisées avec lysat allogénique - Augmentation des réponses lympho-prolifératives

contre le lysat allogéniques chez 14% des patients.

- Induction de CTL contre des peptides tumoraux chez 22% des patients mais seulement après une étape de restimulation in vitro.

- Ces réponses sont transitoires car elles ne sont observées à deux prélèvements consécutifs que chez 5.5% des patients après traitement

(Bercovici et al J Immunother 2008)

II. C

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C

24

II.B. Pourquoi cibler les DC in vivo?

II. C

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C

Preuve de concept de l’immunothérapie par DC et observation de réponses cliniques

Pas de bénéfices réels lors d’essais de phase III randomisés d’immunothérapie (Schadendorf et al, Ann

Oncol, 2006).

Après l’injection de DCs, seules 3-5% atteignent les organes lymphoïdes (restent aux NL régionaux)(De Vries et al, Cancer Res, 2003). 25

II.B. Pourquoi cibler les DC in vivo?

II. C

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C

Ce sont les meilleures CPA

Elles permettent d’induire des réponses CTL et anticorps

Moindre coût et moindre technicité que l’immunothérapie ex vivo

Plus de personnes ciblées

26

27 P.J. Tacken, Nature Review of Immunology 2007

II.B. Pourquoi cibler les DC in vivo?

II. Cellules dendritiques et manipulation de la réponse immunitaire

28

II.C. 1. Vaccination peptidique II.

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DC

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366 patients vaccinés avec des peptides dérivés

d’antigènes tumoraux, associés ou non à des

cytokines (IL-12, GM-CSF…)

⇒ 7 réponses partielles et 2 réponses complètes

Taux de réponse objective : 2,4% Rosenberg SA Nature Med 2004

Les peptides sont restreints à un allèle de CMH donné

Ils n’induisent pas de réponses immunitaires CD4

=> Utilisation de protéines qui seront apprêtées par la DC 29

II.C. 2. Vaccination protéique II.

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DC

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30

Immunisation avec une protéine recombinante associée avec un adjuvant aboutit à une réponse humorale et CD4 CTL chez seulement 1patient sur 14 => Stratégie de cross presentation II.

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DC

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II.C. 2. Vaccination protéique

31

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II.C. 2. Vaccination protéique Apprêtement d’un antigène exogène :

1) Endocytose de l’antigène

2) Lyse dans l’endosome précoce (pH 6)

3) Fusion avec des lysosomes (cathepsines B, D et S) et formation d’endosomes tardifs à pH acide (pH 4)

4) Fusion des endosomes tardifs et des vésicules « de classe II »

5) Protéolyse de la chaîne Ii qui laisse le peptide CLIP dans la cavité α1-β1 du CMHII

6) Remplacement du peptide CLIP par le peptide antigénique grâce à HLA-DM

7) Fusion des vésicules à la membrane cellulaire

8) Présentation par le CMH II des peptides exogènes à la surface cellulaire

32

II. Cellules dendritiques et manipulation de la réponse immunitaire

33

II.C. 3. Vaccination vectorisée Vecteurs permettant de cibler la présentation endogène : Protéines de choc thermique (HSP)

GRP94 (gp96), HSP70 Virus Like Particles - VLP Toxines bactériennes

Shiga toxin, CyA (Bordetella Pertussis),

Anthrax... Liposomes Autres protéines:

Tat (HIV), VP22,

SynB Peptide vector (cationic peptide), Outer membrane protein A from Klebsiella pneumoniae

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34

II.C. 3. Vaccination vectorisée

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Soluble Ova Tat-Ova

Le ciblage d’antigène au CMH de classe I est réalisé par exemple par Tat ou l’exotoxine A de Pseudomonas. Mais il n’y a pas d’induction de CTL in vivo.

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35

II.C. 3. Vaccination vectorisée

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(%)

Shibagaki N Eur J Immunol 2002

Cellules Dendritiques induites par une immunisation d’une protéine vectorisée par Tat et couplée au TRP2 Induit des CTL in vivo et une protection tumorale

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II.C.4. Maturation des DC II.

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37

II.C.4. Maturation des DC

Altin, J. G., and C. R. Parish. 2006. Liposomal vaccines--targeting the delivery of antigen. Methods 40:39-52. II. C

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38

II.C. Présentation aux LT

CMH + Peptide

TCR

Signal 1 sans signal 2

APC non professionnelle Ou DC immature

T cell

tolerance

II. C

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39

II.C. Un vecteur idéal… II.

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Pour induire une réponse CTL, le vecteur doit idéalement : • cibler un antigène exogène dans la voie d’apprêtement antigénique du CMH de classe I (avec utilisation de la machinerie cellulaire endogène)

40

41 Chen et al. Clinical and Developmental Immunology, 2010

Transfection utilisant un vecteur non viral

III. Les différents vecteurs

42 Chen et al. Clinical and Developmental Immunology, 2010

Transfection utilisant un vecteur viral

III. Les différents vecteurs

II.C. Un vecteur idéal… II.

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DC

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Pour induire une réponse CTL, le vecteur doit idéalement : • cibler un antigène exogène dans la voie d’apprêtement antigénique du CMH de classe I (avec utilisation de la machinerie cellulaire endogène) • délivrer préférentiellement l’antigène aux cellules dendritiques qui sont les APC professionnelles

43

44 Palucka et al. J of Int Medicine, 2011

II.C. Un vecteur idéal

II.C. Un vecteur idéal… II.

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DC

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cace

Pour induire une réponse CTL, le vecteur doit idéalement : • cibler un antigène exogène dans la voie d’apprêtement antigénique du CMH de classe I (avec utilisation de la machinerie cellulaire endogène) • délivrer préférentiellement l’antigène aux cellules dendritiques qui sont les APC professionnelles • Activer et faire mâturer les cellules dendritiques pour induire une réponse immunitaire efficace.

45

Ex. Stimulation des DC par les TLR

Schéma extrait de la thèse d’Ariane BLUM 2007 Les

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46

Ex.TLR et induction de réponse CD8+

Les

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47

Réponse CD8 induite par ciblage d’une protéine par DCIR sur DC (Klechevsky et al. Blood 2010):

- Si DC activées par CD40 : sécrétion de cytokines de type 2 et d’INFg par CD8

- Si DC activées par TLR7/8 : sécrétion de haut niveau d’INFg et expression accrue de granzyme et perforine

DC activées par TLR2 induisent préférentiellement des Trég plutôt que Th1 ou Th17 (Manicassamy et al. Nat Med 2009)

48 Palucka et al. J of Int Medicine, 2011

II.C. Un vecteur idéal

Nécessité de cibler la/les bonnes sous populations

II.C. Un vecteur idéal Chez la souris : ◦ Ciblage de CD11c+/CD8a+ par DEC205 => CD8+ ◦ Ciblage de CD11c+/CD8a- par DCIR2 => CD4+ ◦ Ciblage des pDC induisent une tolérance

Chez l’homme : ◦ Ciblage des DC CD14+ par DC-SIGN => réponse

humorale ◦ Ciblage des DC CD141+ par CLEC-9A

- si adjuvant : réponse CTL - si pas adjuvant : réponse humorale ◦ LC peuvent induire CTL

49 Ueno et al. 2011 Seminar in Immunology

III. Les différents vecteurs III

. Les

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Virus à enveloppe modifiée ciblant les DC

Toxines bactériennes ADN Anticorps HSP

50

III.A. Les vecteurs viraux III

. Les

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McCullough, K. C., and A. Summerfield. 2009. Targeting the porcine immune system--particulate vaccines in the 21st century. Dev Comp Immunol 33:394-409. 51

Modifié à partir de Robert-Guroff, M. 2007. Replicating and non-replicating viral vectors for vaccine development.

Curr Opin Biotechnol 18:546-556.

III.A. Les vecteurs viraux III

. Les

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52

III.A. Les vecteurs viraux

Ciblage non spécifique des cellules dendritiques Immunogénicité importante des vecteurs

⇒Développement de vecteurs viraux modifiés

permettant de cibler les DC (ex : adénovirus) ⇒Développement de vecteurs peu immunogènes

(ex : lentivirus)

Glycoprotein from Sindbis virus incorporated in the envelop of lentivirus (Yang L et al, Nature Biotech, 2008)

III. L

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53

III.B. Les récepteurs membranaires

III. L

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McCullough, K. C., and A. Summerfield. 2009. Targeting the porcine immune system--particulate vaccines in the 21st century. Dev Comp Immunol 33:394-409. 54

55 P.J. Tacken, Nature Review of Immunology 2007

III.B. Les récepteurs membranaires

III.B.1. DEC-205 III

. Les

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MHC peptide

DC (professional APC)

DEC 205

56

III.B.1. DEC-205 III

. Les

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Bonifaz L J Exp Med 2002

Différences de réponses de cellules T OT-1 suite à une immunisation d’ovalbumine vectorisée par DEC-205 avec ou sans anticorps anti CD40 (facteur induisant la maturation des cellules dendritiques)

57

III.B.2. ADN III

. Les

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s

58

III.B.2. ADN - Plasmide avec promoteur eucaryote fort recombinant avec

l’ADNc de l’antigène d’intérêt. Immunogénicité de l’ADN expliquée par la présence de séquences CpG non méthylés.

- Injection IM : liaison ADN à TLR9 et polarisation réponse TH1 - Gene gun administration : internalisation dans non CPA et

polarisation TH2

AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS - Induction réponse humorale et cellulaire - Pas d’immunogénicité intrinsèque de l’ADN` - Risque d’intégration de l’ADN dans le génome - Réponse immunologique plus faible chez homme que chez souris

III. L

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59

III.B.3. HSP III

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s Gp96/grp94, HSP70, HSP90

- Les HSPs sont des protéines conservées, qui servent de chaperons aux protéines nouvellement synthétisées

- Elles sont induites par le stress, la nécrose cellulaire mais pas par l’apoptose.

- Récepteurs spécifiques présents sur les DC (Lox-1, CD91)

- Elles facilitent la prise en charge et la présentation croisée des antigènes par les DC

- Elles induisent la production de cytokines pro-inflammatoires et la maturation des cellules dendritiques

60

III.B.3. HSP III

. Les

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s

- La vaccination avec des complexes HSP-peptides dérivés de

tumeurs autologues permet d’induire des CTL dirigés contre

le peptide complexé à l’HSP (Srivastava PK. Nat Rev

Immunol 2002)

- La vaccination avec des complexes HSP-peptides dérivés de

tumeurs autologues peut induire une activité antitumorale

prophylactique et thérapeutique dans plusieurs modèles

animaux tumoraux (Tamura Y Science 1997)

61

III.B.3. HSP III

. Les

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Limite d’utilisation des HSP :

- Nécessité de récupérer la tumeur autologue, ne fonctionne pas en

système allogénique

- La purification des HSP est délicate et chronophage

- Sur 64 patients collectés, 40% n’ont pu recevoir le traitement initial

correspondant à 1 injection hebdommadaire pendant 4 semaines,

principalement à cause d’une quantité de vaccin trop faible, ou parce

que leur mélanome à progressé pendant la préparation du vaccin. (Belli

F J Clin Oncol 2002)

62

III.C. Les toxines bactériennes III

. Les

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63

III.C.1. Mécanismes de présentation croisée

III. L

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CMH Classe I

Regurgitation

Endosome (hydrolyse)

Antigène

CMH Class I recyclé

Proteasome

RE

Golgi

HbS Ag Particle

Exotoxin A Pseudomonas

Voie d’apprêtement non cytosolique d’un antigène exogène sur le CMH I

64

III.C.1. Mécanismes de présentation croisée

Toxine anthrax (protective antigen letal factor)

Toxine diphtérique

Voie d’apprêtement endosome-cytosol d’un antigène exogène sur le CMH I

CMH Classe I

Endosome

Antigène

Proteasome RE Golgi

LLO (listériolysine)

Listeria

III. L

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65

III.C.1. Mécanismes de présentation croisée

CyAa de Bordetella pertussis

Homéodomaine d’Anténnapédia

Voie d’apprêtement membrane-cytosol d’un antigène exogène sur le CMH I

Type III secretion system

Salmonella

Proteasome RE Golgi

III. L

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66

III.C.1. Mécanismes de présentation croisée Sous Unité B de la Toxine de Shiga

Voie d’apprêtement par transport rétrograde intracellulaire d’un antigène exogène sur le CMH I III

. Les

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67

III.C. 2 Exemple de STxB

Toxine de Shigella dysenteriae, de structure AB5, se lie au récepteur Gb3 par la sous-unité B, non toxique

III. L

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68 68

III.C. 2 Exemple de STxB III

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Le récepteur Gb3 est exprimé sur les cellules dendritiques humaines et murines

69 69

III.C. 2 Exemple de STxB III

. Les

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es L’analyse par cytométrie

de flux permet de confirmer la présentation du peptide SL8 restreint par le complexe Kb

Capacité des cellules

dendritiques à stimuler in vitro le clone T « B3Z » spécifique de l’ovalbumine

STxB permet de cibler l’ovalbumine aux cellules dendritiques in vivo 70 70

III.C. 2 Exemple de STxB III

. Les

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gate for OT-I transferred cells

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CD

45.1

CFSE label

Non-TG mice DTR-TG

CFSE label

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91%

39%

9%

61% 91%

STxB-OVA immunization

No immunization

Nécessité d’avoir des DC pour induire efficacement des CTL in vivo par StxB

71 71

Conclusion

Les stratégies de vectorisation sont variées mais il est nécessaire de :

Cibler spécifiquement les cellules dendritiques Apporter un signal de maturation permettant une

présentation efficace des antigènes Faire intervenir un mécanisme de présentation

croisée des antigènes sur le CMH de classe I

72

73 P.J. Tacken, Seminars in Immunology 2011

Conclusion