b. RETROTRASCRIZIONEb. RETROTRASCRIZIONE

TRASCRIZIONE INVERSA: nel citosol, consente di sintetizzare DNA a doppio filamento a partire dal genoma a RNA di HIV.

FORMAZIONE DEL DNA PROVIRALE

• costituita da p51 e p66

• La sua attività richiede la presenza di Mg++ e la presenza di un innseco a RNA, cioè il tRNAlys contenuto nel capside di HIV

• No proof-reading: tasso di errore 1/2000-10000 basi

RETROTRASCRIZIONE e RETROTRASCRIZIONE e TRASPORTO NEL NUCLEOTRASPORTO NEL NUCLEO

1. Sintesi di una molecola complementare di DNA a partire dall’RNAss.

2. catena ibrida DNA-RNA3. RNasi H degrada l’RNA dell’ibrido4. sintesi del filamento complementare di DNA

FORMAZIONE DEL DNA PROVIRALE

Il DNA provirale è quindi trasportato nel NUCLEO, mediante passaggio attraverso i pori nucleari

DNA provirale

DNA provirale

vpr: • è una proteina di 15 KDa

• è contenuta nel virione maturo• trasporta nel nucleo, dopo la retrotrascrizione, il DNA virale (pori

nucleari)

c. Trasporto del DNA provirale nel c. Trasporto del DNA provirale nel nucleonucleo

d. INTEGRAZIONEd. INTEGRAZIONE

Avviene ad opera dell’enzima INTEGRASI. Il DNA provirale si integra in posizione casuale nel genoma della cellula ospite

• Sintesi dell’RNA dal DNA provirale integrato è operata dall’enzima cellulare RNA-polimerasi II

e. TRASCRIZIONE e FORMAZIONE DELL’RNA e. TRASCRIZIONE e FORMAZIONE DELL’RNA GENOMICO VIRALEGENOMICO VIRALE

• U3U3: Forma l'estremità 5’ del genoma provirale. Contiene gli elementi promoter per la trascrizione del provirus (TATA box, CAT box, siti di legame per fattori trascrizionali)

• U5U5: Contiene i segnali di fine trascrizione

• Proteine precoci: Tat, Rev, Nef

• Proteine tardive: gag, pol, env, vif, vpr, vpu

tat : è il principale enancher della trascrizione di HIV• 86 aa, 14 kDa

• dopo essere stata sintetizzata nel citosol, rientra nel nucleo, dove svolge la sua funzione

• potente attivatore della TRASCRIZIONE

• si lega alle sequenze TAR (Tat Responsive Element) al 5’ degli mRNA nascenti aumentando l’attività della RNA polimerasi II cellulare

• in assenza, la trascrizione sarebbe inefficiente

Avviene nel citosol, ad opera del complesso di traduzione della cellula ospite e segue la sequenza di trascrizione dei differenti mRNA:

1. Tat, Rev, Nef: proteine precoci

2. Gag, Pol, Env, Vif e Vpu: proteine tardive

f. TRADUZIONE E FORMAZIONE DELLE f. TRADUZIONE E FORMAZIONE DELLE PROTEINE VIRALIPROTEINE VIRALI

ENV: envelope

gp41 (TM)

gp160

gp120

(SU)Legame con il recettore delle cell CD4+

Fusione del virus con la cellula ospite

ENVENV

GAG: group specific antigen

p24 (CA): principale

costituente NC

p55

p17 (MA)

p15

p9p7

Stabiliscono legami con l’RNA

GAGGAG

POL: polymerase

p31 (IN)

p66 (TI)

p12 (PR)

Trascrittasi inversa

Proteasi

POLPOL

Endonucleasi-integrasi

g. ASSEMBLAGGIO e g. ASSEMBLAGGIO e FUORIUSCITA DEL VIRUSFUORIUSCITA DEL VIRUS

HIV e AIDS: STORIA

• AIDS AIDS zoonosi: zoonosi: sembra che SIV abbia superato la barriera di specie (scimmia-uomo) nel secolo XIX e si sia diffuso in Africa (passaggi seriale hanno reso possibile l’adattamento di questo virus agli uomini)

• 1981 (Stati Uniti)1981 (Stati Uniti) --> aumento inspiegabile e improvviso dei casi di polmoniti da Pneumocystis Carinii e Sarcoma di Kaposi in giovani maschi omosessuali

• 19821982:: primi casi in individui soggetti a trasfusioni di sangue e primi casi in individui soggetti a trasfusioni di sangue e primo caso di trasmissione materno-fetale. Per la prima volta si primo caso di trasmissione materno-fetale. Per la prima volta si parla di parla di Sindrome da Immunodeficienza AcquisitaSindrome da Immunodeficienza Acquisita

Isolamento dell’agente infettivo:

• Science, 1983: il virologo francese Luc Montagnier (Istituto Pasteur, Parigi) riporta l’isolamento di un nuovo virus che potrebbe essere l’agente responsabile della trasmissione della malattia. Il virus viene isolato dalle cellule coltivate in laboratorio di un paziente omosessuale con linfonodi ingrossati. Il virus viene denominato Lav (Virus associato a linfoadenopatia)

• Science, 1984: Robert Gallo, direttore del laboratorio di biologia cellulare dei tumori del National Cancer Institute, riporta l’isolamento da pazienti malati di Aids di un retrovirus, candidato a essere il responsabile della malattia, chiamandolo HTLV-III (Virus umano della leucemia a cellule T di tipo III).

• Inizia così una vera e propria battaglia legale fra i due prestigiosi istituti di ricerca, che rivendicano entrambi la paternità della scoperta

• 2008: Luc Montagnier vince il premio nobel in fisiologia e medicina

UN PO’ DI STORIA..

Vie di trasmissione di HIV:

• sessuale= modalità di contagio prevalente nel mondo

• parenterale= scambio di siringhe infette

• trasfusioni= riduzione sostanziale in seguito all’introduzione dei test di screening per Ab specifici per HIV

• verticale= da madri infette ai figli

• TRASMISSIONE VERTICALE

65%

23%

12%

Trasmissione intrauterina

Trasmissione intrapartum

Allattamento al senomaterno

EPIDEMIOLOGIAEPIDEMIOLOGIA

PATOGENESI

CELLULE TARGET:

• cellule T CD4+,

• cellule dendritiche,

• cellule monocito-macrofagiche

PROGRESSIVA DISTRUZIONE DELLE CELLULE DEL SISTEMA IMMUNITARIO CHE PORTA AD UNA FASE TERMINALE DEFINITA AIDS

1. PUNCTURED MEMBRANE

Virus destroys the cell as a result of budding

Uninfected CD4 cell

Gp120 negative

Cells Fuse

Killing of CD4 cells2. Syncytium

Formation

Infected CD4 cell

Gp120 positive

Cytotoxic T cell

Killing of CD4 cells3. Cytotoxic T cell-mediated

lysis

Killing of CD4+ cells4. Binding of free Gp120

to CD4 antigen makes uninfected T4 cell look

like an infected cellComplement-mediated

lysis

Killing of CD4+ cells4. Binding of free Gp120

to CD4 antigen makes uninfected T4 cell look

like an infected cellComplement-mediated

lysis

infezione acuta primaria latenza clinica

AIDS

LE TRE FASI DELL’INFEZIONE DA HIV

                                                                                                               

                

INFEZIONE ACUTA PRIMARIA

• periodo immediatamente successivo al contagio

• FASE ASINTOMATICA. SINDROME SIMIL-INFLUENZALE O SINDROME SIMILE ALLA MONONUCLEOSI. FREQUENTE LINFOADENOPATIA

• VIREMIA: elevata replicazione virale e diffusione del virus nell’organismo

Linfociti T CD4+

RNA virale

LATENZA CLINICA

• LATENZA CLINICA: ASINTOMATICA

• VIREMIA: BASSA O ASSENTE

• DIMINUZIONE lenta ma continua dei CD4, che vengono lisati dal virus ma anche ricostituiti

1) Presenza di reservoir cellulari e anatomici

- reservoir anatomici: sistema nervoso centrale e apparato genitale maschile

- reservoir cellulari: linfociti T CD4+ quiescenti

Perchè il sistema immunitario Perchè il sistema immunitario non riesce a eradicare non riesce a eradicare

l’infezione?l’infezione?

• HIV si replica in modo produttivo solo nelle cellule T attivate, mentre nelle cellule T naive e nelle cellule T della memoria (quiescenti), il virus rimane in forma latente

• In alcuni casi, le cell T attivate e infettate possono sopravvivere e trasformarsi in cell T della memoria, dove quindi il virus può sopravvivere sotto forma di provirus

Il virus non può mai essere eradicato completamente dal corpo

2. Insorgono mutazioni negli epitopi bersaglio del virus TASSO DI ERRORE DELLA RETROTRASCRITTASI : 1/2000-10000 BASI

• L’accumulo di varianti virali differenti in un individuo è quindi dovuto a:

errori della RT polimerasi Pressione selettiva dell’immunità umorale e

cellulare

Perchè il sistema immunitario Perchè il sistema immunitario non riesce a eradicare non riesce a eradicare

l’infezione?l’infezione?

AIDS CONLAMATA

• SVILUPPO DI PATOLOGIE OPPORTUNISTICHE (virus, batteri, funghi e parassiti)

• SVILUPPO DI NEOPLASIE (sarcoma di Kaposi, linfoma non-Hodgkin)

• DISORDINI NEUROLOGICI (AIDS dementia complex: deficit cognitivo, disordini motori e comportamentali)

TERAPIA (1)

Classi di farmaci approvati dalla FDA:

1. inibitori nucleosidici/nucleotidici della trascrittasi inversa

2. inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa

3. inibitori della proteasi4. inibitori della fusione

Prima: Monoterapia. •Uso di una singola classe di inibitori•Comparsa di ceppi virali farmaco resistenti

Oggi: Highly Active Antiretroviral Treatment (HAART): combinazione di due o più differenti classi di inibitori

• Diminuzione della carica virale, incremento delle cellule CD4+

• La comparsa di varianti virali con mutazioni è rallentata

• Drammatica diminuzione della mortalità, tempi di sopravvivenza più lunghi: malattia cronica a lunga decorrenza

TERAPIA (2)

Inibitori nucleosidici/nucleotidici della trascrittasi inversa

• ZIDOVUDINA, LAMIVUDINA

• Inibiscono la retrotrascrizione

• Agiscono come terminatori di catena in seguito al loro inserimento nella catena nascente di DNA provirale

Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa

• Inibiscono la retrotrascrizione

• Si legano direttamente ad un sito specifico della trascrittasi, alterandone il funzionamento

• NEVIRAPINA

Inibitori della proteasi

• Inibiscono la processazione delle poliproteine del virus dando luogo a delle particelle virali non infettanti

• NELFINAVIR, SAQUINAVIR, LOPINAVIR

Inibitore della fusione virale

• ENFUVIRTIDE: peptide di 36 aa. che si lega a gp41 impedendo che avvenga la fusione con la membrana della cellula ospite

Epatite: infiammazione del fegatoEpatite virale: causata dai virus dell’epatite, che hanno come target specifico di replicazione gli epatociti

1.NECROSINECROSI di una elevata quantità di epatociti; riversamento nel sangue di varie sostanze contenute nelle cellule epatiche, ed in particolare di transaminasi; se troviamo le transaminasi aumentate nel sangue potrebbe essere in corso una epatite.

2. INFIAMMAZIONE2. INFIAMMAZIONE, afflusso nel fegato di elevata quantità di cellule infiammatorie (leucociti) richiamate da un agente nocivo ingrossamento del fegato;

EPATITE VIRALEEPATITE VIRALE

……ma vari altri virus possono causare ma vari altri virus possono causare epatiteepatite

• CMV• EBV• HSV• VZV• Adenovirus• Virus della Rosolia• Virus della Parotite• Virus delle febbri emorragiche• Enterovirus (cox e echo)

TIPI DI MALATTIA EPATICATIPI DI MALATTIA EPATICA

• Epatite Acuta•Epatite che guarisce in meno di 6 mesi.

• Epatite Cronica (EC)•Epatite che si protrae per più di 6 mesi.

• CirrosiProgressiva riduzione delle capacità funzionali dell'organo.

• Carcinoma epatocellulare (HCC)Tumore maligno primitivo del fegato.     

-MARCATO AUMENTO DEGLI INDICI DI NECROSI EPATICA (transaminasi fino a 2-3.000; v.n. 0- 45). - QUADRO CLINICO:

-Periodo di incubazionePeriodo di incubazione: varia in base al tipo di agente virale: 15-50 giorni per l'epatite A, 2 - 6 mesi per l'epatite B, 15 giorni - 4 mesi per l'epatite C. •Periodo preittericoPeriodo preitterico: presenza di sintomi aspecifici (stanchezza, mancanza di appetito, nausea, febbre, dolore epatico) Durata: pochi giorni. •Periodo ittericoPeriodo itterico: colorazione giallastra della cute e delle sclere (ittero) e colorazione scura delle urine (color marsala); scompaiono i sintomi della fase preitterica. Aumento spiccato delle transaminasi. Durata variabile da 2 a 4 settimane. •Periodo di convalescenzaPeriodo di convalescenza: Guarigione (evoluzione favorevole; progressiva riduzione delle transaminasi nell’arco di alcuni mesi).

EPATITE ACUTAEPATITE ACUTA

• È molto rara!• virus epatitici maggiori (più raramente da HCV)• infiammazione molto severa • distruzione quasi completa dell'organo (oltre l'80%)• rapida compromissione delle fondamentali attività metaboliche del fegato. •terapia: trapianto di fegato

EPATITE FULMINANTEEPATITE FULMINANTE

• Infiammazione permanente del fegato (l’epatite permane per più di 6 mesi)• Transaminasi costantemente elevate • Virus epatite B, C e Delta

EPATITE CRONICAEPATITE CRONICA

CIRROSI CIRROSI

• Grado più severo di compromissione del fegato: cicatrizzazione di ampie zone del fegato, fibrosi.Il fegato sviluppa quindi una serie di cicatrici che sostituiscono le cellule epatiche

• Alterazione della struttura dell'organo e delle sue capacità funzionali

La cirrosi, a differenza della epatite cronica, è un processo irreversibile e può essere causa di morte sia per la progressiva riduzione delle capacità funzionali del fegato sia in quanto favorisce l'insorgenza del tumore primitivo del fegato (epatocarcinoma).

Virus dell’ Epatite B (HBV)Virus dell’ Epatite B (HBV)

Famiglia: Hepadnaviridae

CARATTERISTICHE GENERALI• Genoma: molecola di DNA

circolare di 3.2 kb, a doppio filamento parzialmente incompleto

• virioni: 40nm• envelope• presenza di una polimerasi virale

con funzione di trascrittasi inversa• Tropismo epatico prevalente

Epatite B Virus (HBV) (1)

• HBV è l’unico componente di questa famiglia in grado di infettare l’uomo

• L’infezione è associata a: epatite acuta, fulminante, cronica, epatocarcinoma

• Marcata variazione geografica nell’incidenza di HBV. Fra le regioni endemiche: Asia sud-orientale, Africa, Medio Oriente

Epatite B Virus (HBV) (2)

Concentrazione di HBV in vari

fluidi corporeiConcentrazione di HBV in vari

fluidi corporei

Alta ModerataBassa/NonRilevabile

sangue liquido seminale urinesiero secrezioni vaginali feci

essudati da ferite saliva sudore

lacrimelatte materno

Tramissione: parenterale, sessuale, materno-fetale, trapianti

• Capside: icosaedro, 200 copie della proteina C (antigene C: HBcAg)• All’interno del capside: DNA genomico + trascrittasi inversa• Envelope: 3 glicoproteine (preS1, preS2, S). S è l’antigene di superficie:

HBsAg

Struttura

Una delle caratteristiche peculiari dell'HBV e' l'enorme eccesso con cui vengono prodotte alcune proteine virali (in particolare le proteine di superficie e la forma secretoria della proteina nucleocapsidica). L'esubero di sintesi delle proteine di superficie fa si che solo una piccola porzione di esse vengano utilizzate per la costituzione del rivestimento del virione, la maggior parte viene invece secreta sottoforma di particella (sferica o filamentosa) difettiva, che non e' infettiva, in quanto non contente l'acido nucleico virale.

Ciclo replicativo di HBV

RNA pol II

Patogenesi• Danno epatico: è principalmente una conseguenza

della risposta immunitaria cellulo-mediata

Fasi di un’infezione acuta da HBV

Tipica Epatite B Acuta

ALT

HBsAg

HBeAg

HBV DNA

Normal

Months After Exposure

ALT a

nd

HB

V D

NA

IU/L

an

d m

illion

cop

ies/m

l Symptoms

0100200300400500

600700800900

1000

0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48 60

Epatite fulminante

Nell’1-2% dei casi sintomatici acuti, il paziente può andare incontro ad epatite fulminante:

• Necrosi epatica molto più estesa

• Quadro clinico drammatico con possibile evoluzione in insufficienza renale e coma

• Letale nell’8% dei casi

• Cause: infezioni con ceppi di HBV molto virulenti, co-infezione con HDV o un altro virus dell’epatite, risposta immunitaria incontrollata da parte del paziente

Infezione cronica

• Un tempo esisteva la distinzione fra epatite cronica attiva e epatite cronica persistente

• Oggi si distingue fra epatite cronica minima ed epatite cronica grave (con progressione e frequente evoluzione a cirrosi e HCC)

Carcinoma primitivo del fegato

• Nei pazienti con infezione persistente da HBV, il rischio di sviluppare un carcinoma primitivo del fegato è circa 200 volte più elevato che nei soggetti non infetti

• Il legame molecolare fra oncogenesi e infezione da HBV è poco chiaro

• Alcune ipotesi: possibilità di integrazione del genoma virale nel genoma della cellula ospite, ruolo della proteina X di HBV

Tipica Epatite B Cronica

ALT

HBsAg

HBeAg

HBV DNA

Normal

Months After Exposure

ALT a

nd

HB

V D

NA

IU/L

or

million

cop

ies/m

l

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48 60

• Trattamento: Farmaci immunomodulatori: per stimolare il riconoscimento da parte del sistema immunitario degli antigeni virali. InterferonAnaloghi nucleosidici della trascrittasi inversa

• Prevenzione

Immunoprofilassi attiva: vaccino contro l'HBV, costituito da  particelle di HBsAg preparate artificialmente con la tecnica del DNA ricombinante (ingegneria genetica). Dal 1991 la vaccinazione è obbligatoria in Italia per tutti i nuovi nati e per i bambini al 12° anno di età e viene particolarmente consigliata alle persone a rischio (conviventi dei portatori ed operatori sanitari).Immunoprofilassi passiva: in caso di esposizione accidentale (es. puntura accidentale con ago contaminato) è possibile somministrare immunoglobuline umane specifiche contro l'HBV, entro 2-4 ore dall'esposizione. La protezione fornita ha una durata di 2-3 settimane.

Ciclo vaccinale iniziale:   -  1^ dose:   tempo 0   -  2^ dose:   dopo 1 mese   -  3^ dose:   dopo 6 mesi Richiami:   -  ogni 4-5 anni, previo controllo del titolo anticorpale   Protezione:   -  il vaccino risulta efficace in oltre il 90% dei casi;   -  l'efficacia viene dimostrata con la presenza di anticorpi      protettivi (HBsAb) alla fine del ciclo vaccinale.

Vaccinazione anti epatite B.

VIRUS DELL’EPATITE D (DELTA) VIRUS DELL’EPATITE D (DELTA) (HDV)(HDV)

• Non appartiene ad alcuna famiglia di virus animali

• genoma: RNA circolare a filamento singolo, complessato con la proteina antigene delta

• envelope contenente HBsAg, derivante da HBV

È quindi necessaria la presenza di HBV!

Trasmissione e Sintomi HDV

• HDV è trasmesso con le stesse modalità di HBV (però trasmissione sessuale è meno frequente)

Il danno epatico è sostanzialmente simile a quello prodotto nelle altre epatiti:

• Ittero• Urine scure• Crampi addominali

Non è disponibile alcun trattamento specifico per HDV

Dato che HDV dipende dalla coinfezione con HBV per la sua replicazione, i metodi utilizzati per la prevenzione dell’infezione da HBV sono efficaci anche nel prevenire quella da HDV

Non esiste un vaccino, quindi gli individui con infezione cronica da HBV possono essere protetti da HDV unicamente limitando la possibilità di esposizione

HDV – Prevenzione e trattamento