Licenciatura en Tecnología de los Alimentos 201 8 BIOQUÍMICAaTP_2018.pdf · sobre todo de la leche (yogur, queso), de la carne (embutidos fermentados) y de productos vegetales (coliflor

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Licenciatura en Tecnología de los Alimentos 2018

Guía de Trabajos Prácticos de Laboratorio

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Bioquímica de los Alimentos

Licenciatura en Tecnología de los Alimentos

TRABAJO PRÁCTICO Nº 1

DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS INDICADORES DEL GRADO DE PERECIBILIDAD EN ALIMENTOS

El grado de perecibilidad de un alimento se entiende como una medida de su susceptibilidad a sufrir deterioro. Dicho deterioro puede ser originado por agentes físicos, químicos o microbiológicos, y conduce a la modificación de sus características organolépticas, nutricionales y de seguridad, haciendo que el alimento no sea apto para su consumo. Se debe tener presente que los microorganismos patogénicos, en general, pueden estar presentes en un alimento sin necesidad que éste presente un estado de deterioro perceptible por los sentidos. De aquí surge la importancia de conocer a través de distintos parámetros indicadores, el grado de perecibilidad de un alimento, con el fin de establecer procesos de elaboración y conservación adecuados para el mismo. El grado de perecibilidad está directamente relacionado con la composición intrínseca y las condiciones de almacenamiento del alimento. En lo que respecta al deterioro microbiológico, el crecimiento de los microorganismos requiere principalmente de nutrientes, agua, una temperatura adecuada y determinados niveles de pH.

Determinación de humedad _____________________________________________ Principio: Se aplicará un método gravimétrico basado en la eliminación de agua del

alimento y la medida de la pérdida de peso del mismo. Es un método directo y confiable, siempre y cuando no se produzca descomposición térmica de la muestra y el agua sea el único componente volátil eliminado. Es particularmente adecuado para muestras con alto contenido de humedad (entre 60 y 95 %).

Muestra: Fideos mix de cereales; sardinas en lata; dulce de batata ó membrillo; zapallo

calabaza Procedimiento: Colocar una cápsula de porcelana en una estufa entre 90-120°C

durante una hora, pasar a desecador, dejar enfriar durante al menos una hora y tarar. Pesar una cantidad conveniente de muestra en la cápsula y distribuirla uniformemente sobre su fondo. De ser posible, usar la muestra finamente triturada en un mortero. En el caso de muestras pastosas, se consigue un desprendimiento de agua más rápido y uniforme si las mismas se mezclan con arena, para lo cual deber tararse la cápsula con una pequeña cantidad de arena lavada y calcinada. En el caso de muestras con alto contenido de agua, previamente se debe desecar la misma sobre baño de agua. Colocar la cápsula en estufa entre 90-120 ºC entre 2 y 5 h (las condiciones dependerán del tipo de alimento que se trate). Retirar la cápsula de la estufa, colocar en desecador, dejar enfriar y pesar inmediatamente. Volver a la

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estufa por 30-60 minutos adicionales. Repetir el proceso las veces necesarias hasta llegar a peso constante.

Cálculos:

Contenido de humedad (%) = [(Wh - Ws) / Wh ] x 100

Donde Wh: peso de la muestra húmeda (peso fresco) Ws: peso de la muestra seca (peso seco)

Determinación de pH __________________________________________________

Muestra: jugo de uva; pepinillos en vinagre; yogur natural; bebida cola; jugo de manzanas, jugo de limón ó ananá

El pH es un parámetro utilizado para evaluar el grado de acidez de una sustancia. Está

directamente relacionado con la concentración de iones de hidrógeno, un factor que controla la ocurrencia de procesos químicos, bioquímicos y microbiológicos. El pH de un alimento será el resultado de los sistemas amortiguadores o buffers naturales que predominen en el mismo. Estos sistemas están constituidos por mezclas de ácidos (o bases) débiles y sus sales. Los valores de pH de algunos alimentos se presentan en la siguiente tabla:

Los valores bajos de pH (ácido) pueden ayudar en la conservación de los alimentos de dos maneras: directamente, inhibiendo el crecimiento microbiano, e indirectamente, disminuyendo la resistencia al calor de los microorganismos en el caso de alimentos que se someten a tratamiento térmico. Así, el conocimiento del pH resulta particularmente importante para establecer las condiciones del tratamiento térmico a aplicar (tiempo y temperatura). En general, la velocidad de destrucción térmica de las bacterias, particularmente las anaerobias formadoras de esporas, se incrementa marcadamente cuando aumenta la concentración de iones hidronio (el efecto no es tan pronunciado en el caso de hongos y levaduras).

Los alimentos conservados por acidificación natural (fermentación láctica), derivan sobre todo de la leche (yogur, queso), de la carne (embutidos fermentados) y de productos vegetales (coliflor fermentada, encurtidos, etc.). También se puede inhibir la alteración

Rango de pH Alimento pH

7 a 5,5

ACIDEZ BAJA

Leche Pollo Pescado Papas

6,3 – 6,5 5,6 – 6,4 6,6 – 6,8 5,6 – 6,2

5,5 a 4,5 ACIDEZ MEDIA

Bananas Vegetales fermentados

4,5 – 5,2 3,9 – 5,1

4,5 a 3,7 ÁCIDOS

Mayonesa Tomates

3 – 4,1 4

< 3,7 ACIDEZ ALTA

Cítricos Manzanas

3 – 3,5 2,9 – 3,3

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microbiana de algunos alimentos por acidificación artificial, por ejemplo, con ácido acético o cítrico, en el caso de productos vegetales. A pH inferiores a 4,2 se controlan casi todos los microorganismos que producen intoxicaciones alimentarias, pero algunas levaduras, hongos y bacterias acidolácticas se desarrollan bien a pH inferiores a éste. Finalmente, el pH afecta a muchas propiedades organolépticas como color, flavor y textura de los alimentos.

Procedimiento: En el caso de alimentos líquidos, bastará tomar una alícuota de

volumen adecuado y proceder a la determinación. Si se trata de una bebida con CO2 incorporado, deberá eliminarse el mismo por calentamiento ó agitación previa a la medición. Para muestras sólidas, pesar en un vaso de precipitados, 5 g del alimento homogeneizado y agregar 50 mL de agua recientemente hervida y enfriada. Agitar durante 10 minutos. Dejar decantar y medir el pH del líquido clarificado. En cualquier caso, efectuar una determinación de forma aproximada mediante papel indicador de pH y luego, con mayor precisión, utilizando un pHmetro previamente calibrado.

Determinación de acidez total ___________________________________________

Muestra: jugo de uva; pepinillos en vinagre; yogur natural; bebida cola; jugo de manzanas, jugo de limón ó ananá

Los ácidos orgánicos presentes en los alimentos influyen en el sabor, color y estabilidad

de los mismos. Los valores de acidez pueden ser muy variables; por ejemplo, en el caso de las frutas, varían desde 0,2-0,3% en manzanas de poca acidez y hasta un 6% en el limón. Los ácidos predominantes en frutas son: cítrico (citrus y frutas tropicales), málico (manzana), tartárico (uvas) y ascórbico. Los productos pesqueros, aves y productos cárnicos son de acidez muy baja y el ácido predominante es el láctico. La determinación de acidez es importante en alimentos y se realiza con diferentes fines según el caso, tales como conocer el grado de deterioro, establecer un índice de madurez, detectar fraudes, etc. También, en vinos constituye un buen índice de calidad: la presencia de 0,1% ó más de ácido acético es una indicación de descomposición.

Procedimiento: En el procedimiento usual para determinar la concentración total de

ácidos, una alícuota de la solución muestra se titula con una solución estándar de álcali hasta el punto en el cual ha sido añadida una cantidad equivalente de la base. Este punto final puede detectarse mediante indicadores ácido-base (cambio de color) o electrométricamente (pHmetro). El método potenciométrico resulta más conveniente para el caso de muestras coloreadas.

Para el caso de jugos de frutas o vino pipetear 10 mL (ó 5 mL en caso de jugo de limón, ó 1 ml para vinagres) en un matraz aforado de 100 mL y enrasar con agua recientemente hervida y enfriada. Valorar una alícuota de volumen conveniente (aprox. 25 mL). Para alimentos sólidos, pesar en un vaso de precipitados, 5 g del alimento homogeneizado y agregar 50 mL de agua recientemente hervida y enfriada. Agitar durante 10 minutos. Filtrar por papel en un matraz aforado de 100 mL, realizar 3 enjuagues del sólido con porciones de agua recientemente hervida y enfriada. Enrasar. Tomar una alícuota del filtrado de volumen conveniente para su valoración. El titulante es una solución valorada de NaOH 0,01 M. Como indicador se utilizará una solución etanólica al 0,5% de fenolftaleína y el punto final se reconoce por la aparición de una coloración levemente rosada.

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Cálculos: Calcular el porcentaje de acidez expresado como ácido cítrico, málico, láctico, tartárico ó acético según la muestra (g ácido/100 g o 100 mL de alimento, según el caso).

Determinación de actividad de agua ______________________________________

La calidad y seguridad de los alimentos queda en parte determinada por el control de aw durante su procesamiento, empaque y almacenamiento, de aquí la importancia de su cuantificación por medio de técnicas directas. Los primeros métodos utilizados para la medición de la aw o humedad relativa de equilibrio (HRE) de alimentos fueron básicamente adaptaciones de técnicas originalmente diseñadas por los meteorólogos para medir humedad atmosférica. Las técnicas que miden HRE son útiles para medir humedad en áreas de almacenamiento de alimentos, mientras que existen métodos que permiten conocer el nivel de humedad total de los alimentos, sin distinguir la condición del agua en el mismo, o su grado de unión. Algunos de estos métodos permiten estimar la aw utilizando isotermas de sorción. Prácticamente todos los procedimientos usados por los tecnólogos de alimentos para cuantificar de manera directa la HRE requieren de una medición en una atmósfera cerrada en equilibrio con la muestra. En la presente práctica, se aplicará un método de interpolación gráfica, propuesto en 1951 por Landrock y Proctor.

Principio: Una definición de aw establece que es la HRE a la que una sustancia no gana

ni pierde humedad a una T dada. En la práctica este concepto puede usarse para estimar con una buena precisión la aw de un alimento, aunque en lugar de determinar el punto de equilibrio, se estima gravimétricamente la pérdida o ganancia de agua de la muestra, pesando la misma antes y después de ser colocada durante un tiempo dado (de 1-2 hs) en cámaras cerradas de diferente HR. Si las cantidades de agua ganadas o perdidas por porciones de la muestra en estas cámaras se grafican en ordenadas versus aw en abscisas, la intersección de la curva con el eje horizontal representa el punto de equilibrio (donde no hay pérdida ni ganancia de agua). Es este punto de interpolación el que representa la aw de la muestra.

Pueden usarse soluciones saturadas de sales para obtener niveles de aw estándares. Usualmente se utilizan soluciones que difieran ligeramente en aw, de tal manera de asegurar que la cantidad de agua transferida sea pequeña en relación a la cantidad de las soluciones presentes. Se recomienda, para una correcta determinación, el uso simultáneo de al menos 4 soluciones en cámaras separadas.

Procedimiento: Preparar dos soluciones saturadas: A y B, de aw superior e inferior a la

esperada para la muestra, respectivamente (las diferencias deberían ser lo menor posible). Mantener las mismas a 25 °C. (Consultar a modo orientativo las tablas suministradas).

Pesar una cantidad de muestra entre 0,5- 2 g (puede utilizarse un sacabocado de diámetro adecuado) contenida en un dedal confeccionado con papel de aluminio y colocar en la depresión central de sendas placas de Conway. Llenar con ayuda de de una pipeta Pasteur la canaleta externa de la cápsula con las soluciones A y B. Sellar las placas con una placa de vidrio circular, colocando vaselina sólida en los bordes de la cápsula. Colocar las cápsulas en una estufa termostatizada a 25 °C durante 2 hs. Retirar los dedales con la muestra y pesar inmediatamente (realizar esta operación al lado de la balanza).

Cálculos: La aw de la muestra puede estimarse gráficamente o calcularse

analíticamente mediante la expresión:

aw = (b.x – a.y) / (x – y)

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Donde: a: aw de la solución A b: aw de la solución B x: (diferencia de peso de la muestra en la cápsula con la solución A/peso muestra) . 100 y: (diferencia de peso de la muestra en la cápsula con la solución B/peso muestra) . 100

Cuestionario

1) Cite las ventajas que ofrece un horno con vacío para la determinación del contenido de humedad. ¿Qué técnica de deshidratación aplicaría a alimentos con altos contenidos de azúcares o térmicamente inestables?

2) Investigue sobre métodos para la determinación de humedad aplicables a alimentos

deshidratados (muy bajo contenido de humedad) y a aquellos que contienen cantidades significativas de volátiles distintos del agua.

3) Diga si los valores obtenidos para humedad, pH y acidez de los alimentos utilizados en la

práctica responden a los estipulados en el CAA para los mismos.

aw medio

Ejemplos de alimentos

0,950

Carnes, vegetales y pescados frescos, leche, panes

0,910

Algunos quesos, carnes curadas, algunos jugos de fruta concentrados

0,870

Embutidos fermentados, quesos secos, tortas, margarina

0,800

La mayoría de jugos concentrados, leche condensada azucarada, salsas de chocolate

0,750

Dulces, mermeladas, frutas glaceadas

0,650

Melazas, algunas mieles, gelatinas, nueces

0,600

Frutas secas, algunas golosinas y mieles

0,500

Fideos, especias

0,400

Huevo en polvo

0,300

Galletitas

0,03

Leche en polvo, vegetales secos, copos de maíz, sopas deshidratadas, algunas galletitas

Sal

aw solución saturada

a 25 °C

K2Cr2O7 0,980

K2SO4 0,971

KNO3 0,924

BaCl2·2H2O 0,901

K2CrO4 0,880

Li2SO4 0,850

KCl 0,824

(NH4)2SO4 0,810

NaCl 0,752

NaNO3 0,737

SrCl2·6H2O 0,708

NaBr 0,577

Mg(NO3)2·6H2O 0,528

LiNO3·H2O 0,470

K2CO3 0,440

MgCl2·6H2O 0,330

KC2H3O2 0,224

LiCl·H2O 0,110

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4) ¿Qué diferencia hay entre pH y acidez total? 5) Deduzca la ecuación utilizada para el cálculo de la humedad. 6) Escriba las estructuras y fórmulas moleculares de los ácidos más comunes encontrados en

los alimentos y halle su peso molecular. 7) Escriba una expresión que le permita calcular la acidez total de un alimento sólido (en %

m/m) con los siguientes datos:

Vbase: volumen de álcali titulante utilizado en la valoración, en mL M: molaridad del álcali utilizado en la valoración M: masa de la muestra, en g) Valíc: volumen de la alícuota de la muestra utilizado en la valoración, en mL Vmtra: volumen total de la muestra, en mL PM: peso molecular del ácido en el cual se desea expresar el resultado

9) Deduzca la ecuación utilizada para el cálculo de la actividad de agua.

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TRABAJO PRÁCTICO N°2

CARBOHIDRATOS COMPLEJOS

Análisis de pectinas en mermeladas _______________________________________ Reactivos

NaOH 1M

Acido acético 1 M

CaCl2 1 M Muestra: Utilizar con fines comparativos dos mermeladas de la misma fruta y de la misma marca, siendo una de bajas calorías.

Procedimiento: Pesar 50 g de muestra en un vaso de precipitados de 600 ml y añadir

400 ml de agua. Hervir durante 1 h manteniendo constante el volumen de agua. Transferir el contenido a un matraz aforado de 500 ml y enrasar con agua. Filtrar por papel y medir 100 ml de la solución filtrada. Añadir 100 ml de agua y 10 ml de NaOH 1 M. Dejar en reposo toda una noche. Añadir 50 ml de solución de ácido acético 1 M y dejar reposar 5 min. Añadir lentamente 25 ml de CaCl2 1 M agitando constantemente. Dejar en reposo durante 1 h. Calentar la solución hasta ebullición. Filtrar en caliente a través de un papel de filtro Whatman N°41 (banda negra) previamente tarado (para ello, el papel debe haber sido secado 1 h a 105 ºC en caja de Petri, enfriado en desecador y pesado). Lavar con agua caliente hasta que el filtrado esté libre de cloruros (utilizar una solución de AgNO3 en medio HNO3 para comprobar presencia de cloruros). Transferir papel de filtro y contenido a la caja de Petri y desecar a 105 ºC durante 3 hs (o hasta peso constante). Enfriar y pesar. Calcular el contenido de pectinas en g/100 g de producto.

Determinación de fibra bruta ____________________________________________

Principio: Este método gravimétrico puede adaptarse para todo tipo de alimentos. Se parte de una muestra exenta de grasa (si la muestra tiene menos de 1% de grasa puede usarse directamente), se trata con ácido sulfúrico en ebullición y luego con hidróxido de sodio en ebullición. El peso del residuo seco resultante menos las cenizas se considera fibra bruta. Reactivos

HCl 0,12 M

Solución madre de H2SO4 1 M

Solución de H2SO4 0,125 M (por dilución de la solución madre)

Solución madre de NaOH 10% p/v

Solución de NaOH 1,25% p/v (por dilución de la solución madre)

Agente antiespumante (alcohol amílico)

Alcohol 95 % v/v

Acetona

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Muestra: alimento deshidratado (perejil, romero, verduras desecadas) Procedimiento: Colocar un crisol de vidrio filtrante (N°1, porosidad media) en una

estufa a 100 °C durante 2 horas, pasar a un desecador, enfriar, pesar y reservar. Pesar entre 1-2 g de muestra (W1) colocar en un erlenmeyer con boca esmerilada de 1 l. Añadir 200 ml de H2SO4 0,125 M previamente calentados a ebullición (utilizar los primeros 50 ml para dispersar la muestra). Agregar gotas de agente antiespumante y conectar a un refrigerante. Calentar a ebullición suave durante 30 min con rotaciones periódicas. Filtrar a través de embudo Büchner con papel de filtro mojado. Arrastrar el residuo nuevamente al erlenmeyer con boca esmerilada, valiéndose de 200 ml de solución de NaOH 1,25% p/v, previamente calentados a ebullición. Conectar el refrigerante y calentar a reflujo 30 min. Filtrar a través del crisol de vidrio filtrante tarado, utilizando agua hirviendo para la transferencia del material. Lavar sucesivamente con varias porciones de agua hirviendo, HCl 0,12 M y nuevamente con agua hirviendo hasta neutralidad del filtrado. Lavar luego con dos porciones de alcohol y tres de acetona. Llevar a estufa a 100 °C durante 2 h. Pesar el crisol con la muestra (W2). Incinerar en horno mufla a 550 °C durante 1 h. Enfriar en desecador y pesar (W3). Cálculos: El contenido de fibra bruta será:

Fibra bruta (%) = [(W2 – W3)/ W1] x 100

Expresar en base de peso fresco de muestra.

Temperatura de gelatinización del almidón_________________________________

Muestra: Comparar almidón de maíz con almidón de trigo, mandioca o papa. Procedimiento: Calentar una suspensión de 0,5 g de almidón en 10 ml de agua en un

tubo de ensayos dentro de un baño de agua a 50°C durante 2 min. Retirar y enfriar inmediatamente. Colocar una gota de la suspensión en un vidrio portaobjetos y observar al microscopio. Calentar nuevamente el tubo de ensayos a 55°C y proceder como antes. Repetir el ensayo a 60, 65, 70, 75, 80, 85 y 90°C, examinando en cada caso al microscopio (ajustar los tiempos de calentamiento, asegurándose de que la temperatura utilizada se alcance en la suspensión). Describir los cambios observados y estimar la temperatura de gelatinización.

Cuestionario 1) Investigue en el CAA los requerimientos para mermeladas (o jaleas) de frutas, dietéticas o no, en cuanto al contenido de pectinas agregadas. ¿Cuál es el origen de estas pectinas usadas como aditivos y qué propiedades químicas hacen apta una pectina para su uso en productos dietéticos sin azúcar agregada? 2) ¿Qué se entiende por fibra bruta? ¿Es este valor fidedigno del contenido de fibra soluble e insoluble del alimento? Indague sobre otras metodologías que permitan discriminar estos tipos de fibra alimentaria. 3) Defina temperatura de gelatinización del almidón. ¿Por qué se habla de un rango de temperaturas de gelatinización?

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PROTEÍNAS ALIMENTARIAS: Extracción, propiedades y determinación

Introducción: Las proteínas son las biomoléculas más abundantes de la materia viva. Sus propiedades fisicoquímicas pueden diferir ampliamente. Sin embargo, todas tienen en

común su composición, basada en -aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, dando lugar a cadenas lineales. Algunas de ellas contienen otros componentes de distinta naturaleza, por lo que reciben el nombre de proteínas conjugadas, y a su parte no peptídica se la denomina grupo prostético. Para que las proteínas cumplan su función biológica tienen que adoptar una estructura espacial determinada, denominada nativa. La mayoría de las proteínas globulares son solubles en disoluciones acuosas y a pH próximos a la neutralidad mantienen su estructura nativa intacta. La alteración de esta estructura tridimensional conlleva la pérdida de su actividad biológica, y el proceso se denomina desnaturalización. Las propiedades fisicoquímicas cambian drásticamente, y en el caso de las proteínas globulares solubles, generalmente se produce una insolubilización. Agentes desnaturalizantes típicos son el calor, valores extremos de pH, disolventes orgánicos, metales pesados (Pb+2, Hg+2, Ag+), agentes caotrópicos y detergentes iónicos.

Determinación de proteínas (métodos extractivos) ___________________________

Principios: La presencia de aminoácidos y proteínas en una disolución puede ponerse de manifiesto por gran número de ensayos, generales o específicos (según el grupo funcional con el que reaccione el reactivo), basados en la formación de un compuesto coloreado entre el aminoácido o la proteína y un reactivo específico. Los distintos métodos, lógicamente, tienen diferencias de sensibilidad, especificidad, etc. Entre los métodos más utilizados para proteínas se destacan:

Ensayo de Biuret: Compuestos con enlaces peptídicos producen un cambio de color del azul al púrpura cuando reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El compuesto más sencillo que da la reacción es el Biuret, un dímero de la urea que da el nombre al ensayo, de estructura CONH2-NH-CONH2. El ensayo es bastante específico para proteínas, pero poco sensible, requiriendo de 1 a 10 mg de proteína.

Ensayo de Lowry: Es más sensible que el de Biuret, pero más tedioso de realizar. Puede detectar cantidades del orden de 0.1 mg de proteína. Se basa en la reacción de proteínas con el Cu(II) en medio alcalino y también de la reacción de grupos fenólicos (mayoritariamente tirosina en proteínas) con un reactivo denominado de Folin-Ciocalteau que contiene fosfomolibdato y fosfowolframato: naturalmente, el color desarrollado es proporcional a la concentración proteica, siempre que se trate de proteínas con un contenido medio en Tir y Trp, y no puede emplearse con soluciones proteínicas con un alto contenido en Tir libre o fenoles, en general. Sin embargo, es un ensayo muy empleado en los laboratorios.

Ensayo de Bradford: Es un ensayo rápido y sensible para cuantificar proteínas. El método se basa en el cambio de color que experimenta el colorante azul “coomassie” en

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medio ácido en presencia de proteínas. Las proteínas producen el cambio de la coloración anaranjada del reactivo a una tonalidad azulada, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas. En la práctica se utilizará el Ensayo de Biuret.

Reactivos

CuSO4.5H2O

Tartrato de Na y K 4H2O

NaOH 10% p/v

Tampón fosfato, pH 7, 10 mM

Ácido tricloroacético (TCA) 10%

Acetona

Acetato de plomo 0.2 M

Acido Acético Glacial Reactivo de Biuret: Disolver 0,375 g de CuSO4·5H2O y 1,5 g de Tartrato de Na y K·4H20 en 125 ml de agua destilada en caliente. Agregar 75 ml de NaOH al 10 % p/v y diluir a 250 ml con agua. Este reactivo es estable por algunas semanas. Muestra: clara de huevo, leche descremada

Extracción de la albúmina de clara de huevo________________________________

Procedimiento: Tomar entre 1,5 y 2 g de clara de huevo y diluir 10 veces con tampón fosfato, añadiendo entre 15 y 20 ml, según el peso de la muestra. Agitar con varilla de vidrio hasta obtener una mezcla homogénea, repartir entre los dos tubos de centrífuga que, una vez equilibrados, se centrifugarán a velocidad máxima durante unos 10 minutos. Retirar con cuidado y con ayuda de una pipeta Pasteur obtener el sobrenadante procurando no mezclar las fases. Desechar flóculos y sedimento. El sobrenadante resultante es una solución proteica de albúmina de aproximadamente 10 mg/ml.

Ensayo de Biuret ________________________________________________________

Procedimiento: Preparar una dilución 1:5 de la solución de albúmina. Rotular 4 tubos y añadir, en el orden indicado, los siguientes reactivos:

TUBO Nº 1 2 3 4

Agua destilada (ml) 2 1.8 1 -

Albúmina 1:5 (ml) - 0.2 1 2

Reactivo de Biuret (ml) 3 3 3 3

Una vez agitados, esperar 10 min y observar resultados. Optativamente, medir absorbancia a 500 nm. Con los datos obtenidos construir una gráfica Absorbancia vs Concentración.

Desnaturalización de proteínas ___________________________________________

Procedimiento: Rotular cinco tubos de ensayo del 1 al 4, y añadir a cada tubo 1 ml de la disolución de albúmina de 10 mg/ml. A continuación proceder como sigue para constatar el efecto que tienen los siguientes agentes sobre la solubilidad de la proteína:

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a) Calor: Poner el tubo 1 en un baño de agua a 100ºC durante unos minutos y observar.

b) Medio ácido: Añadir al número 2, 1 ml de ácido tricloroacético. Agitar y observar.

c) Disolventes orgánicos: Añadir al número 3, 2 ml de acetona. Agitar y observar.

d) Cationes pesados: Añadir al número 4, 1 ml de acetato de plomo. Agitar y observar.

Aislamiento y determinación de caseína de leche ___________________________

Introducir 200 ml de leche descremada en un vaso ancho de 600 ml. Calentar hasta aproximadamente 40°C y añadir gota a gota una disolución de ácido acético diluido (1 volumen de ácido acético glacial en 10 volúmenes de agua). Agitar continuamente la mezcla con una varilla de vidrio durante todo el proceso de adición. Continuar añadiendo ácido acético diluido hasta que no precipite más caseína. Agitar la caseína hasta que se forma una gran masa amorfa. Filtrar al vacío durante aproximadamente 15 minutos para separar todo el líquido que sea posible. Presionar la caseína con una espátula durante la operación de filtrado. Colocar el producto entre varias toallas de papel para ayudar a secar la caseína. Cambiar el producto por lo menos en tres o cuatro ocasiones, poniendo nuevas toallas de papel, hasta que la caseína esté completamente seca. Dejar que la caseína se seque completamente al aire durante uno o dos días y finalmente pesarla. La densidad de la leche es de 1,03 g/ml. Calcular el porcentaje de caseína aislada.

Puede utilizarse con fines comparativos, leches de diferentes fuentes: vaca, cabra, oveja.

Cuestionario

1) ¿Qué métodos de desproteinización aplicables a una muestra de un alimento puede mencionar? Enumere ventajas y desventajas.

2) a) ¿Qué significa desnaturalización de una proteína y cómo se explica? b) ¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de la clara de huevo? c) ¿Cuál de los agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización?

3) ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína?

4) ¿Qué diferencias existe entre un método extractivo y uno no extractivo para determinar proteína?

5) Escriba ecuaciones que expliquen el fundamento de los métodos de Biuret, Lowry y Bradford.

6) Tras al análisis de los resultados de los ensayos de Biuret y de Bradford ¿Cuál de ellos será más sensible para detectar proteínas y por qué? ¿Cómo podrían usarse estos métodos con fines cuantitativos?

7) a) Una proteína coagulada ¿podría dar la reacción del Biuret? b) Si se realiza la reacción del Biuret sobre un aminoácido como la Glicina ¿es positiva o negativa y por qué?

8) a) ¿Qué tipo de sistema material forma la caseína en la leche? b) Investigue sobre la estructura de la caseína de la leche y de su importancia en la industria láctea.

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PROPIEDADES FUNCIONALES DE PROTEÍNAS

I. EMULSIONES

Identificación de emulsiones _____________________________________________

Colocar una pequeña cantidad del alimento a ensayar sobre un vidrio de reloj (emplear para esta prueba: leche fluída, crema de leche, margarina, manteca, aderezo para ensaladas, mayonesa). Salpicar sobre ella una punta de espátula de la mezcla de colorantes: azul de metileno – sudán III (50:50). No mezclar. Observar el color dispersado en la fase continua sobre la superficie de la emulsión. Teniendo en cuenta la solubilidad de cada colorante, clasificar la emulsión como o/w o w/o.

Inversión de una emulsión _______________________________________________

En un frasco con tapa a rosca colocar aproximadamente 150 ml de crema de leche, cerrar herméticamente y agitar hasta observar la separación de fases. Filtrar a través de gasa. Utilizando la mezcla de colorantes, verificar la inversión de la emulsión original.

Poder estabilizante de emulgentes ________________________________________ Colocar en sendos tubos de ensayos, 3 ml de aceite vegetal y 3 ml de vinagre. Añadir

a cada uno, una pequeña cantidad de los distintos emulgentes a ensayar (yema de huevo, clara de huevo, caseína, detergente, lecitina de soja, etc.). Dejar un tubo como testigo. Agitar los tubos simultáneamente y durante un mismo tiempo, ubicándolos inmediatamente después en una gradilla. Registrar el tiempo que tarda en romperse cada emulsión. Tomando en cuenta el testigo, clasifique los emulgentes en orden creciente de poder estabilizante de la emulsión. II. ESPUMAS

Determinación del tiempo de batido óptimo _________________________________

Pesar seis muestras de equivalentes de la proteína a ensayar (30 g de clara de huevo) en sendos vasos plásticos de 100 ml. Agregar a cada uno 10-50 ml de agua. Trasvasar la primera muestra a un recipiente apto y batir durante 2 minutos a velocidad conveniente. Verter la espuma obtenida en un embudo que posee una pequeña cantidad de lana de vidrio en la parte superior del vástago, apoyado sobre una probeta de 25-50 ml. Anotar el volumen escurrido obtenido luego de 30 min. Repetir el procedimiento para las cinco muestras restantes, batiendo durante 3, 4, 5, 6 y 8 min, respectivamente. Mantener iguales el resto de las condiciones experimentales. Graficar volumen escurrido (V30) vs

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tiempo de batido y determinar gráficamente el tiempo de batido óptimo. Describir, además, el aspecto de la espuma en cada caso (floja, firme, etc.).

Efecto de distintos aditivos sobre la estabilidad de la espuma ___________________

Pesar cuatro muestras de 30 g de clara de huevo en sendos vasos plásticos de 100 ml. Agregar a cada uno 10 ml de agua. Trasvasar la primera muestra a un recipiente apto, adicionar 2 g de NaCl y batir a velocidad conveniente durante el tiempo óptimo determinado en el ensayo anterior. Verter la espuma obtenida en un embudo que posee una pequeña cantidad de lana de vidrio en la parte superior del vástago, apoyado sobre una probeta de 25-50 ml. Anotar el volumen escurrido obtenido luego de 30 min. Repetir el procedimiento para la segunda y tercera muestra, agregando 25 g de sacarosa y 0,5 g de yema de huevo, respectivamente. Mantener iguales el resto de las condiciones experimentales. Utilizar la cuarta muestra como testigo. Comparar el poder estabilizante de la espuma que ejerce cada una de los aditivos utilizados.

Efecto de enzimas proteolíticas sobre la capacidad de espumado de la clara de huevo

Obtención de proteasa de ananá: Pelar un ananá. Licuar la pulpa cercana a la cáscara utilizando un mínimo volumen de agua. Dejar en reposo unos 15 min y filtrar a través de gasa doble. Reservar el filtrado.

En un ensayo control colocar 2 claras de huevo con 5 ml de agua e incubar a 37°C durante 2 h. Batir a máxima velocidad durante 3 min. Medir V30. Paralelamente realizar la experiencia con 2 claras y 5 ml del filtrado obtenido del ananá. Proceder como con el blanco. III. UNIONES QUE DETERMINAN LA ESTRUCTURA DEL GLUTEN

Preparar una masa con 10 g de harina y 30 ml de agua. Lavarla bajo el chorro de la canilla hasta obtener el gluten. Tomar pequeñas porciones y colocarlas en sendos tubos de ensayo con tapa rosca. Agregar, respectivamente a cada tubo: agua destilada, solución de

SDS 1 % y solución de -mercaptoetanol 5%. Tapar los tubos y dejar 2 h en reposo. Observar la consistencia que resulta del gluten en cada caso. Observar al microscopio y describir lo observado.

Cuestionario 1) ¿Qué enzima aisla del ananá, qué efecto tiene sobre la capacidad de espumado de las claras de huevo y por qué? ¿Cuál es el pH y la T óptima a la cual opera?

2) Defina lo que es el gluten y explique el efecto que tiene el -mercaptoetanol sobre el mismo mediante ecuaciones. ¿Qué acción ejerce el SDS? 3) Explique el efecto de la sal y del azúcar sobre la capacidad de espumado de una proteína. ¿Qué efecto tiene la yema de huevo? Explique.

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LÍPIDOS

Los lípidos constituyen un grupo de biomoléculas ampliamente distribuido en la naturaleza.

Químicamente, es un grupo muy heterogéneo que puede clasificarse de acuerdo a su polaridad. Así, encontramos lípidos no polares que cumplen funciones de reserva energética, lubricación y protección, y lípidos polares con funciones estructurales, formando parte de las membranas biológicas. Además de éstos, otros lípidos cumplen otras funciones más específicas, como vitaminas, hormonas, etc.

De acuerdo a su hidrofobicidad, los lípidos pueden extraerse de los alimentos mediante disolventes orgánicos más o menos polares. Por otra parte, como los procesos biológicos en los que participan tienen lugar en medios acuosos, el cuerpo humano dispone de mecanismos que facilitan su transporte por dichos medios, como la construcción de lipoproteínas o la utilización de emulsionantes (sales biliares) que facilitan el contacto con las enzimas que participan en la digestión.

Numerosos productos naturales son ricos en lípidos. El aceite empleado normalmente en la alimentación, sea de girasol, oliva, soja, etc., es una mezcla de triacilglicéridos y de ácidos grasos libres, entre los que destaca el ácido oleico. Otra buena fuente de lípidos es la yema de huevo. Un huevo de gallina medio, cuyo peso oscila entre 55 y 60 g, consta de clara (65% del peso) y yema (35%), y su composición aproximada, en g, es la siguiente:

Peso total (g) Agua (g) Proteínas(g) Lípidos totales (g)

Yema 19-20 9-10 3-3,5 6-6,5

Clara 35-36 31-32 3,5-4 0-0,1

Los lípidos presentes en la yema son de naturaleza variada, destacándose los triacilglicéridos, el colesterol y los fosfolípidos. Mediante una extracción con isopropanol se disuelven preferencialmente los lípidos menos polares (donde se encuentra el colesterol), frente a los más polares (fosfolípidos). La práctica tiene como objetivo el aislamiento del colesterol de la yema del huevo y su determinación cuantitativa mediante una reacción de color. En una segunda parte de la práctica se determinará el contenido de huevos de pastas, utilizando el valor hallado en la primera parte.

Los métodos analíticos para la determinación del colesterol se dividen en colorimétricos y enzimáticos. De los primeros, el más popular es el de Liebermann-Burchard, en el que la reacción tiene lugar en un medio ácido fuerte (ácido sulfúrico). La etapa inicial del proceso consiste en la protonación del grupo hidroxilo del colesterol, seguido de su deshidratación para formar un ión carbonio 3,5-colestadieno. La oxidación secuencial de este ión carbonio alílico por el sulfúrico

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produce un compuesto cromóforo, el colestahexano-ácido sulfónico, que absorbe energía en la zona de la luz visible.

Reactivos: colesterol, acetona, cloroformo, 2-propanol, anhídrido acético, H2SO4 concentrado.

Extracción de colesterol de la yema de huevo _____________________________________

Cascar un huevo de gallina con precaución y separar la clara de la yema (puede emplearse un accesorio culinario especialmente diseñado para este fin). Pesar la yema. Tomar, para la experiencia, entre 1 y 1,5 g de la yema, en un vaso de 50 ml. Añadir 10 ml de acetona fría y agitar con una varilla hasta obtener una suspensión homogénea. Verter el contenido en un tubo y centrifugar a la máxima velocidad de una centrífuga de mesa durante 5-10 minutos. Concluida la centrifugación, retirar los tubos con sumo cuidado y extraer el sobrenadante con pipeta Pasteur. Reservar. Realizar una segunda extracción del sedimento con otros 10 ml de acetona, agitando con la varilla y repitiendo todo el proceso. Juntar los extractos. Evaporar la acetona y resuspender el residuo con 5 ml de cloroformo. Transferir cuantitativamente a un matraz de 100 ml. Lavar la cápsula como otras dos porciones de 5 ml de cloroformo, pasando los lavados al matraz. Enrasar con el mismo solvente.

Determinación cuantitativa del colesterol en yema de huevo _______________________

Preparar un testigo con 160 mg de colesterol en 100 ml de cloroformo en matraz aforado (solución madre). Tomar de esta solución 5 ml y diluir a 100 ml con cloroformo (solución de trabajo). Medir 5 ml de la solución de trabajo y verter en un tubo (T). En otro tubo pipetear 5 ml de la solución clorofórmica obtenida anteriormente (M). Adicionar a M y T sendas alícuotas de 2 ml de anhídrido acético y 4 gotas de H2SO4 concentrado. Agitar durante 10 min en oscuridad. Leer A 640. Calcular los mg de colesterol por gramo de yema y por yema (considerar peso promedio de yema calculada entre las distintas comisiones).

Determinación del contenido de huevo en pastas __________________________________

Tratar 1 g de la pasta con huevo seca y finamente molida en molinillo con 10 ml de alcohol i-propílico. Dejar agitando 20 minutos. Filtrar por papel y recibir el filtrado en cápsula de porcelana. Lavar el filtrado con porciones de i-propílico, recibiendo los lavados en la cápsula. Evaporar el alcohol sobre baño María. Redisolver el residuo con 5 ml de cloroformo y pasar con ayuda de una pipeta Pasteur a un tubo de ensayo. Adicionar 2 ml de anhídrido acético y 4 gotas de H2SO4 concentrado. Agitar durante 10 min en oscuridad. Leer A 640. Considerando el contenido de colesterol por yema calculado anteriormente, calcular el contenido de yemas por kg de pasta seca.

Límites del método

Fideos secos con huevo: mínimo 0,04 % (base seca) Fideos frescos con huevo: mínimo 0,06 %

Actividades adicionales: Pueden compararse los niveles de colesterol de huevos de diferentes especies como gallina, codorniz y pato.

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Cuestionario

1) Escribir las reacciones químicas del método de medida del colesterol de Liebermann-Burchard.

2) Investigue sobre los aspectos nutricionales del colesterol.

3) ¿Cuál es el requerimiento del CAA sobre el contenido mínimo de huevo en pastas secas o fideos con huevo o al huevo? ¿Cumple con el mismo la pasta analizada?

4) ¿Qué porcentaje representa del total de lípidos el contenido de colesterol de una yema? ¿Qué otros lípidos se encuentran en la yema de huevo?




RANCIDEZ OXIDATIVA DE LÍPIDOS

Introducción: Debido a su estructura química las grasas y aceites insaturados están sujetos a deterioro oxidativo, llamado rancidez. Esta reacción en cadena involucra la formación de radicales libres, con pérdida de un hidrógeno alílico en una cadena de ácido graso, seguido de una serie de reacciones con el oxígeno. Esta descomposición origina como producto final compuestos odoríferos (aldehídos y cetonas), que dan el característico olor a rancio.

En el presente trabajo práctico se usará el caroteno como indicador del proceso de oxidación de una grasa. El caroteno tiene una estructura química semejante a la de un ácido graso, siendo altamente insaturado. En la medida que se oxida, su color anaranjado brillante se atenúa hasta tornase incoloro. Así, la velocidad de decoloración observada para el caroteno puede ser usada como indicador de la velocidad de oxidación de una grasa.

El objetivo de este TP es analizar los factores (T, luz, antioxidantes, prooxidantes) que afectan el proceso de rancidez de las grasas.

Materiales: Grasa porcina picada Caroteno Cloroformo Papel de filtro Cajas de Petri Cu SO4 0,01 % BHA o BHT 0,001% Solución saturada de sal Extracto de nabos verdes Extracto de cebollas de verdeo Extracto de papas blancas Procedimiento: A 50 g de grasa porcina picada y fundida en baño María, agregar 10 mg

de caroteno disuelto en una pequeña cantidad de cloroformo. Mediante una pinza, sumergir discos de papel de filtro de 7 cm de diámetro en dicha mezcla, retirarlos y escurrirlos. Transferirlos a cajas de Petri y aplicar los siguientes tratamientos:

I. Efecto de la T y de la luz sobre la oxidación de la grasa: a) Cerrar la Caja de Petri, envolver en papel de aluminio y almacenar en la oscuridad a T ambiente. b) Cerrar la Caja Petri y exponerla a la luz (en lo posible, luz solar directa). c) Cerrar la Caja de Petri, envolver en papel de aluminio y almacenar en heladera.

d) Cerrar la Caja Petri, envolver en papel de aluminio y almacenar en estufa a 60ºC.

II. Efectos de antioxidantes y prooxidantes:

Se analizará el efecto de las siguientes soluciones sobre el proceso de rancidez

oxidativa de lípidos: e) Agua (control) f) Solución de CuSO4 0,01 % g) Antioxidante comercial BHA 0.001% i) Solución saturada de sal j) Extracto de hojas de cebolla de verdeo k) Extracto de nabo verde l) Extracto de cáscara de papa Para cada solución, impregnar varios discos de papel en la misma y colocarlos sobre

un papel de filtro saturado con la mezcla caroteno-grasa. Invertir el fondo de la caja de Petri sobre la tapa conteniendo 10 mL de agua y colocar en estufa a 40ºC.

Notas: a) Los extractos se preparan utilizando 20 g de cada uno de los materiales vegetales triturados y 80 ml de agua a ebullición. Decantar y enfriar antes de usar. b) Con fines de comparación, los ensayos de cada grupo de experiencias (I y II) deben iniciarse a un mismo tiempo, realizando la lectura de resultados a las 2 horas.

Resultados

Describir y comparar los resultados obtenidos en cada uno de los tratamientos aplicados y evaluar las implicancias de los mismos sobre el grado de rancidez oxidativa alcanzado por la grasa.

Comparar el olor en los papeles decolorados respecto a los no decolorados.

Cuestionario

1. ¿Cuáles son los principales ácidos grasos que se encuentran en la grasa porcina? Ordénelos de acuerdo a su susceptibilidad a la oxidación.

2. ¿Qué rol cumple el cobre en el proceso de oxidación? 3. ¿Mediante qué mecanismo actúa el BHA? 4. ¿Cómo explica los resultados obtenidos con los extractos de vegetales utilizados? 5. Busque en la bibliografía la estructura del β-caroteno y compárela con la de un ácido

graso insaturado.

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REACCIÓN DE MAILLARD

Introducción Muchos alimentos poseen colores y flavors distintivos que resultan de reacciones entre

grupos amino y componentes reductores presentes en los mismos, tales como la reacción de Maillard y la degradación de Strecker. Dependiendo de la extensión en la que ocurran estas reacciones, la formación de pigmentos y sustancias que confieren olores y sabores pueden ser deseables ó indeseables.

Bajo ciertas condiciones, los azúcares reductores pueden reaccionar con compuestos que poseen un grupo amino libre, produciéndose luego una serie de reacciones conocidas en

su conjunto como reacción de Maillard. Durante este proceso se forman compuestos -dicarbonílicos, que al reaccionar con aminoácidos, producen pirazinas aromáticas. En muchos casos, es a través de estas reacciones que se logran colores y sabores deseables en los alimentos. El objetivo del presente trabajo práctico es evaluar el aroma y color de soluciones de glucosa y distintos aminoácidos sometidas a calentamiento.

Materiales

D-glucosa Sacarosa Ácido L-aspártico L-lisina L-fenilalanina L-valina L-metionina L-leucina L-prolina L-arginina Sol. NaHSO3 0,5 M HCl diluido

Procedimiento

En un tubo de ensayos colocar 50 mg de D-glucosa y 50 mg de un aminoácido. Verter 0,5 mL de agua destilada y agitar vigorosamente. Percibir el aroma de cada uno de los tubos y registrar. Tapar cada uno de los tubos con una bolita de vidrio y colocarlos en un baño de agua hirviendo durante 45 min. Enfriar en baño de agua a T ambiente y volver a percibir los aromas correspondientes a cada solución. Registre las sensaciones, comparándolas con aromas conocidos.

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Registrar, además, el color de cada tubo tomando como referencia la siguiente escala: 0 (incoloro), 1 (amarillo pálido), 2 (amarillo oscuro), 3 (marrón). Optativamente se puede medir el color de forma cuantitativa diluyendo las soluciones a 5 mL, excepto para arginina y lisina que deberán diluirse a 500 y 1000 mL, respectivamente. Colocar en celdas de vidrio o plástico y determinar su absorbancia a 400 nm. Registrar los valores obtenidos.

Se realizarán ensayos paralelos para el caso de L-lisina y L-metionina, en los que se analizará el efecto del bisulfito de sodio y de un pH ácido.

Tubo

Azúcar 50 mg

Aminoácido

(50 mg)

Agua

NaHSO3

o,5 M

HCl

0,1 M

100ºC

Aroma

Color

A440

1

D-glucosa

Ácido L-aspártico

0,5 mL

45’

2 L-lisina

3 L-fenilalanina

4 L-valina

5 L-metionina

6 L-leucina

7 L-prolina

8 L-arginina

2a L-lisina 0,5 mL

5a L-metionina

2b L-lisina 0,5 mL

0,5 mL

5b L-metionina

2c sacarosa L-lisina

2d L-lisina 0,5

Cuestionario 1. Escriba las reacciones que ocurren entre la glucosa y los aminoácidos (RNH2) 2. Ordene los aminoácidos utilizados de acuerdo a su reactividad creciente 3. ¿Cuál es el efecto del bisulfito? ¿Cómo actúa? 4. ¿Qué acción ejerce el HCl y por qué? 5. Interprete los resultados obtenidos en los tubos 2a, 2 c y 2 d. 6. ¿Qué resultados esperaría obtener para la experiencia 2a si se reemplaza la D-glucosa

por L-fructosa?




PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO

Introducción: Algunos tejidos de plantas contienen compuestos fenólicos asociados a sus paredes celulares. En ciertos casos, también está presente la enzima polifenoloxidasa, que cataliza la reacción de conversión de tales compuestos fenólicos en quinonas, las que eventualmente generan un pigmento marrón llamado melanoidina. Se trata de un fenómeno generalmente indeseable, y ocurre en tejidos de frutas y hortalizas cuando éstos son expuestos al oxígeno durante procesamientos como el rebanado, triturado, etc. Resulta importante entonces, conocer cómo controlar esta reacción de pardeamiento durante dichos procesamientos. En el presente práctico se evaluará el efecto de distintos tratamientos sobre el proceso de pardeamiento enzimático en manzana deliciosa.

Materiales: Manzanas deliciosas sanas Tiourea 1% Ácido ascórbico Sulfito de sodio Fosfato ácido de potasio Chapa de cobre Kitasato y embudo Büchner Papel de filtro N°1 Procedimiento: Pelar y cortar manzanas en rodajas uniformes y finas. Dividir en ocho

lotes de 30 g cada uno (esta operación debe ser realizada en el menor tiempo posible). Colocar cada uno de los lotes en sendos vasos de precipitados que contengan, respectivamente, 60 mL de:

1. Tiourea al 1% (control). 2. Agua bidestilada 3. Agua bidestilada con gotas de ácido acético (pH < 4) 4. Agua bidestilada a 100 ºC 5. Agua bidestilada en presencia de una chapa de cobre 6. Agua bidestilada en presencia de burbujeo con aire (u oxígeno) 7. Agua bidestilada con 0,01 g de ácido ascórbico 8. Agua bidestilada con 0,01 g de sulfito de sodio durante 45 s, retirar el líquido y

reemplazar con 60 mL de agua bidestilada con 0,12 g de fosfato ácido de potasio.

Luego de 30 min de contacto en reposo de las rodajas de manzanas con cada solución, homogenizar el contenido de cada vaso en una licuadora y filtrar a través de papel de filtro N°1 utilizando un embudo Büchner y vacío. Pipetear 1 mL de cada uno de los filtrados obtenidos en sendos tubos de ensayo conteniendo 5 mL de agua. Agitar cada tubo, y

determinar la absorbancia de las respectivas soluciones a 475 nm mediante un espectrofotómetro (usar agua como blanco).

Resultados

Describir y comparar los resultados obtenidos en cada uno de los tratamientos aplicados respecto del control, y evaluar las implicancias de los mismos sobre el grado de pardeamiento alcanzado en cada caso.

Cuestionario

1. ¿Qué reacciones ocurren en la medida que las manzanas sufren pardeamiento? ¿Qué

intermediario es determinado a 475 nm? 2. ¿Qué acción ejerce la temperatura y el medio ácido en el proceso? Explique 3. ¿Cómo explica el resultado obtenido en las experiencias 5 y 6? 4. Explique el efecto que ejercen el ácido ascórbico y el sulfito de sodio en el proceso

de pardeamiento. 5. ¿Qué condiciones elegiría para minimizar el pardeamiento suponiendo que la

experiencia es un ensayo piloto para la fabricación de una bebida de manzana?

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ADITIVOS EN PRODUCTOS CÁRNICOS

Las sales sódicas y potásicas de nitritos se encuentran en la carne y productos

cárnicos, ya que se utilizan comúnmente en el proceso de curado con el fin de desarrollar y

fijar el color (los nitritos forman en la carne óxido nítrico que reacciona con los

compuestos hemo para dar nitrosomioglobina, que es el pigmento responsable del color

rosa de las carnes curadas), para inhibir el crecimiento de microorganismos (género

Clostridium), y para desarrollar sabores característicos (esto es debido a su efecto

antioxidante). El posible peligro del agregado de estas sales lo constituye la formación de

nitrosaminas, que son productos tóxicos para el organismo. Los nitratos también pueden

reducirse a nitritos y generar este tipo de compuestos.

En el caso del dióxido de azufre (SO2) y los distintos sulfitos inorgánicos (SO3=, HSO3

-,

S2O5=), utilizados como aditivos alimentarios, el mecanismo de acción es la inhibición del

deterioro provocado por bacterias, hongos y levaduras, así como las reacciones de

pardeamiento enzimático y no enzimático que tienen lugar durante el procesamiento de los

alimentos ó el almacenamiento de los mismos. A pesar de su amplio uso y de su eficacia

como conservadores, a los sulfitos se les atribuyen diversos efectos adversos en humanos,

relacionados con su ingestión. Otro aspecto a tener en cuenta es la pérdida del valor

nutricional de algunos alimentos debido a la capacidad que tienen los sulfitos para

descomponer la vitamina B1 en sus componentes, sobre todo en alimentos ricos en tiamina

como la carne.

Objetivos

Determinar mediante una técnica de análisis químico cuantitativo el contenido de

nitritos en muestras de embutidos

Analizar mediante una técnica de análisis químico cualitativo la presencia de sulfitos

en muestras de embutidos

Parte 1) Determinación de nitritos (método cuantitativo)

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El ión nitrito se puede determinar utilizando la reacción de diazotación que él mismo

sufre con las aminas (reacción modificada de Griess-Ilosvay). El compuesto ácido p-

aminobencenosulfónico (I) se diazotiza de acuerdo con la siguiente reacción:

NH2SO3H + N+

SO3H NNO2

- + 2 H+ + 2 H2O

(I) (II)

Posteriormente, la sal de diazonio obtenida como producto (II) se une a la -

naftilamina (III) formando un azo compuesto de color rosa (IV).

N+

SO3H N +

NH2

+ 2 H+SO3H N N NH2

(III) (IV)

El producto coloreado se utiliza para la cuantificación de nitritos mediante un

método espectrofotométrico. La ventaja principal de este método consiste en que se

pueden determinar con mayor exactitud y de una manera simple, trazas de sustancias. En

nuestro caso las cantidades absolutas de nitritos que se van a determinar son demasiado

pequeñas.

Procedimiento

a) Preparación de las soluciones

Nota: es condición necesaria usar agua destilada libre de nitritos para el desarrollo de la

técnica.

Reactivo A: disolver 0,5 g de ácido sulfanílico (ácido 4-aminobencenosulfónico) en 30

mL de ácido acético glacial y diluir la solución con 120 mL de agua.

Reactivo B: disolver 0,5 g de 1-naftilamina en 30 mL de ácido acético glacial y diluir

la solución con 120 mL de agua.

Reactivo de color: la solución debe contener volúmenes iguales de los reactivos A:B

(1:1)

Solución patrón de nitritos (P): Pesar con exactitud 1 g de NaNO2 p.a. seco, disolver

y llevar a 100 mL con agua en matraz volumétrico.

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Solución de trabajo (T): Debe contener 10 g NaNO2/mL (preparar por dilución de la

solución patrón).

Solución saturada de HgCl2: Preparar tomando en cuenta la solubilidad de la sal a 20

C, según datos tabulados.

b) Preparación de la muestra

Pesar aproximadamente 50 g de muestra homogeneizada en procesadora y colocarla en

un dedal de papel. Desgrasar mediante un extractor Soxhlet durante 3 horas. Evaporar el

residuo de solvente dejándola bajo campana. Pesar el material magro y seco del dedal y

transferir a un vaso de precipitados de 250 mL. Agregar agua a temperatura aproximada a

80 C hasta cubrir el producto. Dejar con agitación permanente durante 1 hora, y agregar

luego unos 100 mL de agua adicionales y 10 mL de solución saturada de HgCl2. Mezclar y

dejar enfriar a temperatura ambiente. Filtrar y transferir a un matraz de 250 mL. Llevar a

volumen con agua libre de nitritos. Está será la solución M.

A partir de la siguiente tabla preparar en tubos de ensayos, previamente rotulados, las

soluciones que le permitirán realizar la curva de calibrado y determinar el contenido de

nitritos en la muestra.

Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8

Solución T --- 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00 --- ---

Solución M --- --- --- --- --- --- --- 0,50 1,00

Agua 4,6 4,5 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 4,10 3,60

Reactivo de color 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

Agitar. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 15 min y leer en

espectrofotómetro a una longitud de onda de 520 nm. Nota: Es importante realizar en

forma paralela el ensayo para la muestra y para los puntos de la curva patrón.

Trazar un gráfico absorbancia vs concentración con los valores obtenidos de cada una de

las soluciones patrones. Calcular el contenido de nitritos (g NO2- /100 g muestra) presentes

en la muestra por medio de la curva estándar. Presentar los resultados obtenidos

Parte 2) Determinación de sulfitos (método cualitativo)

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El dióxido de azufre es un gas no inflamable incoloro que se disuelve fácilmente en agua,

se hidrata para formar acido sulfuroso y entonces disociarse a bisulfito y sulfito. En

condiciones fisiológicas a pH 7.4, el sulfito es la forma química predominante. Sin

embargo, en solución ácida el sulfito se asocia a un protón y forma bisulfito y acido

sulfuroso.

El ión bisulfito reduce al colorante verde de malaquita, provocando su decoloración

mediante la siguiente reacción:

N(CH3)2

N+(CH3)2C

HSO3

N(CH3)2

N+(CH3)2CHSO3-

Reactivos

Solución de colorante verde de malaquita 25%.

Solución de bicarbonato de sodio 5%

Procedimiento

Tomar aproximadamente 3.5 g de muestra, colocarla en un vaso de precipitados de 250

mL y cubrirla con solución de bicarbonato. Homogeneizar durante 2 ó 3 minutos en baño

ultrasónico. Extender una pequeña porción sobre papel parafinado. Añadir 0,5 mL de

solución de verde de malaquita al 20% y mezclar de 2 a 3 minutos. Observar si hay ó no

coloración.

Normalmente cuando las muestras no contienen sulfitos se torna de un color azul verde

(intenso) y cuando los contiene decoloran al colorante, de manera que la coloración es

poco intensa o no existe.

Cuestionario

1) Describa los riesgos potenciales del uso de nitritos y sulfitos en alimentos.

2) Busque en la legislación vigente las normativas referentes al uso de los aditivos

determinados en los alimentos cárnicos utilizados en el presente trabajo práctico.

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3) Compare los resultados obtenidos con los que establece el CAA. Establezca una

conclusión referida a la calidad del producto.

4) ¿Se puede evitar el uso de estos aditivos en alimentos cárnicos?, de ser así, ¿cuáles

propondría?

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Licenciatura en Tecnología de los Alimentos 201 8 BIOQUÍMICAaTP_2018.pdf · sobre todo de la leche (yogur, queso), de la carne (embutidos fermentados) y de productos vegetales (coliflor