Línea 6

Desarrollo y consolidación metodológicaen biología molecular

Programas

6.1 Construcción y caracterización de vehículos molecula-res para donación y expresión de DNA.

6.2 Aislamiento, caracterización y producción de enzimasutilizadas en ingeniería genética.

6.3 Elaboración y mantenimiento de colecciones biológicas.6.4 Síntesis química de oligonudeótidos.6.5 Utilización de la replicación exponencial de RNA para

ensayos de hibridación de segunda generación.6.6 Generación de señales fluorescentes para la detección

de agentes patógenos y empleos en otros bioensayos.

Programa 6.1 Construcción y caracterización de vehícu-los moleculares para donación y expresión de DNA.

Las técnicas de recombinación in vitro de DNA permitenel aislamiento, la caracterización y la expresión de DNA na-tivo y sintético. Se trabaja en el diseño y la construcción desistemas genéticos que permitan el aislamiento, la modifi-cación y la expresión de DNA específicos. Para ello se hanconstruido diversos vehículos moleculares de donación deDNA a partir de los cuales se trabaja para obtener vehículosde expresión, utilizando regiones de DNA que permitan latranscripción de DNA en la bacteria E. coli. Entre estas re-giones se encuentra la de regulación de los operones lac ytrp de esta bacteria, la región del promotor PL del fago lamb-da y un promotor-operador sintético.

Como resultados iniciales, se han construido variosvehículos para la donación de DNA que son utilizados enmuchos laboratorios del mundo, donde se hace ingenieríagenética. Asimismo, se han construido vehículos que per-miten una alta expresión del material genético donado.

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Proyectos específicos

Construcción de vehículos moleculares para la expresiónde DNA utilizando el promotor del operón del triptofano.P. Balbás, N. Flores, F. Valle y F. Bolívar1984/T/S/DGBM

Construcción de vehículos moleculares para la expresiónde DNA utilizando el promotor PL del fago lambda.N. Flores, P. Balbás, R. de Anda, F. Valle y F. Bolívar1984/T/SIDGBM

Construcción de vehículos moleculares con número de

copias regulable y efecto de diferentes loci de estabilidad.M. Zurita, M.E. Munguía y X. Soberón1983/P/S/DG BM

Construcción de vehículos moleculares para la síntesis deproteínas híbridas utilizando el gene que codifica para el re-presor del fago lambda.N. Flores, R. de Anda, F. Bolívar y F. Valle1984/P /SIDG BM

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Diseño de un vehículo molecular para la producción deproteínas de fácil purificación.X. Soberón1983/T/SIDGBM/USQM

Programa 6.2 Aislamiento, caracterización y producciónde enzimas utilizadas en ingeniería genética.

Se pretende estructurar una unidad de aislamiento y pu-rificación de enzimas utilizadas en ingeniería genética. Esteesfuerzo, junto con los desarrollados en otros programas deinvestigación, forma parte de una estrategia que permita dis-poner en el Centro de herramientas moleculares y de meto-dologías específicas para el aislamiento, la caracterizacióny la expresión de DNA.

Como parte de estos propósitos, se ha logrado integrar unacolección de cepas microbianas para producir enzimas in-volucradas en el manejo in vitro de DNA. Se han utilizadovarias de ellas para la fabricación de estas enzimas.

Proyectos específicos

Purificación de la endonucleasa de restricción Pst 1.1. Vichido1984/TIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción PaZ1.1. Vichido1985/TIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción SaZ 1.1. Vichido1986/PIDGBM

Purificación de la enzima T4 DNA ligasa.1. Vichido1986/PIDGBM

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Purificación de la endonucleasa de restricción Bam Hl.1. Vichido1986/P/DGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción Cro 1.1. Vichido1986/PIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción Eco Rl.1. Vichido1986/PIDGBM

Programa 6.3 Elaboración y mantenimiento de coleccio-nes biológicas.

Se trabaja en el establecimiento de varias colecciones bio-lógicas: al cepas de microorganismos de interés de laborato-rio, y bl material genético (DNA) de plásmidos y fagos. Setrabajará en un futuro en el establecimiento de una colec-ción de microorganismos de interés.

Proyectos específicos

Integración del banco de DNAs del Centro de Investiga-ción sobre Ingeniería Genética y Biotecnología I UNAM.1. Vichido1985/PIDGBM

Integración de una colección de pastas celulares de mi-croorganismos para la producción de enzimas y plásmidos.1. Vichido1985/PIDGBM

Integración de un banco de células competentes paratransformación.1. Vichido1986/PIDGBM

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Purificación de la endonucleasa de restricción Bam Hl.I. Vichido1986/PIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción Cro I.I. Vichido1986/PIDGBM

Purificación de la endonucleasa de restricción Eco Rl.I. Vichido1986/PIDGBM

Programa 6.3 Elaboración y mantenimiento de coleccio-nes biológicas.

Se trabaja en el establecimiento de varias colecciones bio-lógicas: a) cepas de microorganismos de interés de laborato-rio, y b! material genético (DNA) de plásmidos y fagos. Setrabajará en un futuro en el establecimiento de una colec-ción de microorganismos de interés.

Proyectos específicos

Integración del banco de DNAs del Centro de Investiga-ción sobre Ingeniería Genética y Biotecnología I UNAM.I. Vichido1985/PIDGBM

Integración de una colección de pastas celulares de mi-croorganismos para la producción de enzimas y plásmidos.I. Vichido1985/PIDGBM

Integración de un banco de células competentes paratransformación.I. Vichido1986/PIDGBM

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Integración de la colección de cepas microbianas del Cen-tro de Investigación sobre Ingeniería Genética y Biotecno-logía I UNAM.I. Vichido1986/PIDGBM

Programa 6.4 Síntesis química de oligonucleótidos.

Se aplican los métodos recientes de síntesis de DNA paraactualizar la Unidad de Síntesis Química de Macromoléculas.

Se trabaja en la optimización del sistema de síntesis paraagilizar el servicio que presta a la comunidad académica delpaís, utilizando un equipo de síntesis automatizado.

Proyectos específicos

Estandarización y optimización de las técnicas de sínte-sis automatizada de oligonucleótidos.X. Soberón1986/PIDGBM

Programa 6.5 Utilización de la replicación exponencial deRNA para ensayos de hibridación de segunda generación.

El uso de la replicación exponencial de RNA para la ge-neración de señales en ensayos de hibridación tiene gran po-tencial para pruebas diagnósticas de enfermedades infeccio-sas. Se espera que en el futuro este método llegue a ser tanútil como los métodos inmunológicos para detección de pa-tógenos.

Con este propósito se ha iniciado un proyecto para explo-rar el uso de sistemas de amplificación de RNA por replica-ción exponencial, y su aplicación a ensayos de hibridación.El sistema que se propone utilizar se deriva del fago Q-beta,en el cual se ha demostrado la construcción de RNA recom-

binante con capacidad de replicación autocatalítica in vitro.

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En colaboración con los doctores Donald Millis y Fred R.Kramer, de la Columbia University, se han desarrollado nue-vos plásmidos que facilitan la construcción de RNA recom-binante. Con estos plásmidos, que contienen un promotorpara transcripción específica de RNA, se puede generar RNAre combinan te en condiciones de rendimiento y purezaóptimos.

En los experimentos iniciales se está utilizando como mo-delo el DNA repetitivo de malaria, cuya secuencia se inser-ta en el lugar apropiado dentro del vector Q-beta, al nivelde DNA, utilizando los plásmidos mencionados. La trans-cripción de la secuencia re combinan te deseada se obtieneutilizando el promotor de fago T7, en un sistema in vitro conRNA polimerasa T7. El RNA se utiliza como sonda y luegoes replicado exponencialmente por la Q-beta replicasa. Enun esquema alternativo, el RNA replicante no contiene lasecuencia de la sonda; ésta es acoplada al RNA por unióncovalente 5' -5' vía disulfuro, de modo que la secuencia sonday el RNA se pueden separar por reducción después de la hi-bridación.

Se espera que alguno de estos sistemas de generación deseñales por medio de replicación exponencial resulte mássensible y más barato en su aplicación que otros métodosque se han estado utilizando hasta ahora. Si resulta exitosoel uso de los recombinantes RNA en los ensayos diagnósti-cos de malaria, se intentará la utilización de sistemas análo-gos para ensayos en otros sistemas de importancia médicao veterinaria.

Proyectos específicos

Estudio de nuevos RNAs re combinan te s replicables y suaplicación a amplificación de señales.H. Lomelí, C. Guerra, 1. Tusié, F.R. Kramer y P.M. Lizardi1986/P/SIDBQ

Desarrollo de sondas bifuncionales que contienen RNAreplicable en unión covalente con moléculas de afinidad.

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J. Martín-Polo, C. Guerra, H. Lomelí, A. Alagón, C. Gonzá-lez, C.B. Chu, L. Orgel y P.M. Lizardi1986/P/S/DBQ

Purificación en mediana escala de Q-beta replicasa pro-ducida por sobrexpresión en E. coli.G. Estrada, C. Guerra, S. Trejo, A. Alagón y P.M. Lizardi1986/P/S/DBQ

Desarrollo de un método para detección de P. falciparumbasado en hibridización de DNA con generación de señalesde RNA replicable.H. Lomelí, C. Guerra, L Tusié, A. Alagón, F.R. Kramer yP.M. Lizardi1986/P/S/DBQ

Utilización de DNA de elementos repetitivos de Trypano-soma cruzi para un ensayo diagnóstico de la enfermedad deChagas.L Tusié y P.M. Lizardi1987/I1S/DBQ

Utilización de DNA de elementos repetitivo s de Plasmo-dium vivax para un ensayo diagnóstico de paludismoL Tusié, A. Alagón, M.H. Rodríguez y P.M. Lizardi1987/I1S/DBQ

Programa 6.6 Generación de señales fluorescentes para ladetección de agentes patógenos y empleo en otrosbioensayos.

Los sistemas sensibles de detección de agentes patógenosbasados en técnicas inmunológicas o en hibridación de áci-dos nucleicos revelan la interacción específica por medio dedos modalidades: la radiactividad (Le. autorradiografía, ra-dioinmunoensayo) y la actividad de alguna enzima que trans-forma un sustrato incoloro en producto colorido (Le. inmu-noensayo enzimático, método de Ward para detectar

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hibridación de ácidos nucleicos en nitrocelulosa). Los siste-mas que emplean radiactividad son muy sensibles pero muycostosos y tienen vida de almacenamiento muy corta. Lossistemas enzimáticos que generan color difícilmente alcan-zan el nivel de sensibilidad que tienen los anteriores, aun-que presentan la ventaja de que pueden ser automatizadosen gran medida. Resulta clara la necesidad de desarrollar al-ternativas para generar señales de altísima sensibilidad, debajo costo, simples de realizar, susceptibles de ser automa-tizadas y aplicadas masivamente.

Actualmente, una buena parte de los esfuerzos que se rea-lizan están encaminados a establecer estrategias para gene-rar señales fluorescentes que permitan la visualización ycuantificación de la interacción de una secuencia de DNA

específica (sonda detectora) para Plasmodium vivaxy el DNAparasitario en muestras de sangre sobre un soporte sólido(i.e. membranas de nitrocelulosa). En caso de tener éxito elprocedimiento, podría extenderse a otras pruebas diagnós-ticas, independientemente de que se basen en hibridaciónde ácidos nucleicos o en interacciones de otro tipo (i.e.antígeno-anticuerpo) .

Para lograr el objetivo descrito en el párrafo anterior seestán aprovechando las propiedades fluorescente s de las fi-cobiliproteínas y en particular de la ficoeritrina. En este casose cuenta con la colaboración de los doctores 1. Strayer yA. Glazer, de las universidades de Stanford y Berkeley, res-pectivamente.

Con el mismo objetivo y con la colaboración de la Geren-cia General de Biológicos y Reactivos de la Secretaría deSalud, se están desarrollando sustratos peptídicos sintéticosno fluorescentes, que mediante una transformación enzimá-tica resulten en productos insolubles y altamente fluorescen-teso Con los dos tipos de fluoróforos se están evaluando tresprocedimientos. En la breve descripción que sigue, la pala-bra "proteína" significa, indistintamente, ficobiliproteína oenzima proteolítica: a) la proteína se acopla directamente yen forma covalente a la sonda detectora; b) la proteína bio-tinilada es reconocida por estreptavidina previamente ancla-da a la sonda detectora también biotinilada; c! la proteína

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derivatizada con un hapteno es reconocida por un anticuer-po polimérico antihapteno que haya reaccionado previamen-te con el mismo hapteno unido covalentemente, a su vez,a la sonda detectora.

El caso de la proteasa involucra un paso más, en el quese agrega el sustrato para obtener la señal fluorescente. Elregistro permanente de señales generadas puede obtenersemediante una fotografía de la membrana con las muestrasbajo excitación, con luz ultravioleta de onda larga, con pelí-cula Polaroid de alta sensibilidad.

Proyectos específicos

Desarrollo de métodos para la precipitación in situ de ami-nas aromáticas fluorogénicas.J. Martín-Polo y A. Alagón1986/P/S/DBQ

Síntesis de péptidos ad hoc fluorogénicos.J. Martín-Polo y A. Alagón1986/P/S/DBQ

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Desarrollo de membranas derivadas de celulosa con car-

gas positivas rasurables, y su aplicación en la manipulaciónde macromoléculas en bioensayos.C. González, J. Martín-Polo, P.M. Lizardi y A. Alagón1986/P/S/DBQ

Desarrollo de esquemas para acoplamiento de ficobilipro-teínas a sondas de oligopéptidos.A. Alagón, J. Martín-Polo, X. Soberón y P.M. Lizardi1987/I1S/DBQ/DGBM

Desarrollo de esquemas para acoplamiento de proteasasa sondas de oligonucleótidos.A. Alagón, P.M. Lizardi, X. Soberón y J. Martín-Polo1986/P/S/DBQ/DGBM

Desarrollo de métodos para detección de patógeno s ba-sados en el uso de hibridación de DNA con generación deseñales fluorescentes.J. Cruz, 1. Tusié, C. González, G. Gurrola, P.M. Lizardi, X.Soberón y A. Alagón1986/PIS/DBQ/DG BM

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