L’ingegneria genetica applicata alla generazione di piante ed animali transgenici

Università Cattolica del Sacro CuoreCentro Ricerche Biotecnologiche

Organismi Transgenici

Si dice Transgenico un organismo nel quale sia stata introdotta una sequenza di DNA aggiuntiva (transgene) rispetto a quelle derivate dal patrimonio genetico dei progenitori.

Tale DNA potrà essere integrato nel genoma dell’organismo stesso oppure, in casi particolari, replicare autonomamente all’interno delle cellule (episoma).

Tale gene potrà essere presente nel genoma di tutte le cellule dell’organismo, comprese le cellule riproduttive, e trasmettersi perciò spontaneamente alle generazioni successive. Potrà al contrario essere presente soltanto nelle cellule di alcuni tessuti dell’organismo senza interessare le cellule riproduttive e senza perciò essere trasmesso alla discendenza (transgenesi somatica).

Nell’accezione più comune del termine si definiscono però transgenici solo gli organismi nei quali il transgene sia integrato nel genoma e trasmissibile alla progenie.

Aspetti tecnici relativi alla transgenesi nei vegetali

Positivi:

Possibilità di riprodurre interi organismi partendo da cellule somatiche (clonazione)Rapidità di sviluppo e di ottenimento di un elevato numero di individui

discendentiPossibilità di autoimpollinazione (selfing) in alcune specie

Negativi:

Poliploidia, cioè presenza di copie multiple del corredo cromosomale, in numerose varietà vegetali (essenze erbacee, patate). Da ciò derivano gli effetti di variazione somaclonale. (individui derivanti da cellule di un unico progenitore manifestano caratteri differenti)Struttura cellulare dotata di parete rigida (cellulosa) che rende

tecnicamente complessa l’introduzione di macromolecole

Sviluppo clonale e coltura in vitro di cellule vegetali: Colture da Dischi Fogliari (Leaf Disk)

✔ Le cellule somatiche vegetali, almeno in parte, mantengono una elevata potenzialità di sviluppo e differenziamento;

✔ Questa potenzialità si manifesta in natura nel processo di riparazione di una lesione con la formazione del callo

✔ Le cellule del callo presentano una spiccata tendenza alla proliferazione ma in certe condizioni possono dare luogo alla formazione di radici e foglie fino a generare un nuovo individuo

Formazione di Protoplasti

Lo sviluppo ed il differenziamento delle cellule vegetali è regolato dai segnali chimici portati da fitormoni.I fitormoni vengono divisi in auxine e citochine in base ai loro effetti.Un elevato rapporto tra auxine e citochine provoca lo sviluppo di radici mentre il rapporto inverso favorisce la formazione di germogli.

Tecniche di Transgenesi nei Vegetali.

Utilizzo di Agrobacterium spp. Come vettore

Vettori virali per la replicazione somatica

Transfezione di Protoplasti

“GeneGun “

L’applicabilità delle diverse tecnologie varia secondo la specie in esame.

In generale risulta più semplice operare con piante dicotiledoni (ad. es.: le Leguminose) che con le monocotiledoni ( quali i cereali).

Per le prime si possono utilizzare tutte le tecniche riportate, mentre per le monocotiledoni solo l’utilizzo di protoplasti e la tecnica che impiega il

“GeneGun” hanno fornito risultati accettabili.

Biologia di Agrobacterium tumefaciens

Utilizzo di Agrobacterium per la generazione di Piante transgeniche: Cointegrazione

Agrobacterium nella generazione di Piante transgeniche

Utilizzo di Agrobacterium per la generazione di Piante transgeniche:

Sistema Binario

Trasferimento genico in vegetali adulti mediante

vettori di derivazione virale

•E’ possibile sfruttare le proprietà naturali di alcuni virus dei vegetali per consentire il trasferimento di geni in individui adulti

•Tali sistemi permettono la diffusione del transgene a diverse cellule dell’organismo vegetale ed eventualmente alla discendenza

•La modificazione del vettore virale ne impedisce la diffusione nell’ambiente e l’effetto fitopatogeno.

Trasferimento genico in vegetali mediante sistemi fisici.

Trasferimento in protoplasti e ricostituzione di colture da callo

•Mentre i vettori basati sull’Agrobacterium sono efficaci nelle dicotiledoni, essi non risultano efficaci nei monotiledoni.

•In questo settore un certo successo è stato ottenuto trasformando colture di protoplasti mediante il contatto con una soluzione del DNA di interesse e successiva esposizione ad uno shock elettrico (Elettroporazione)

•I protoplasti così trattati sono poi coltivati in terreno selettivo per ricostituire nuove piantine transgeniche.

•Il metodo offre discreti accettabili in specie quali il Mais ed ilRiso ma è stato soppiantato da sistemi più semplici ed efficaci quali l’impiego del “GeneGun”

Applicazioni del trasferimento genico in campo agricolo. Organismi autorizzati negli USA.

C a r a tte r eG e n e t ic o

O r g a n is m o R ic e v e n te O r g a n is m oD o n a to r e

R e s is te n z aa g li In s e tt i(B T )

M a is , c o to n e , p a ta ta ,p o m o d o ro

B a c il lu sth u r ig e n s is

R e s is te n z aa g li e rb ic id i

M a is , s o ia , c o to n e , r is o ,b a rb a b ie to la d az u c c h e ro , l in o , c a n o la

G e n i a d a tta t i d ata b a c c o o d ab a tte r i

R e s is te n z a aV iru s

Z u c c h in i , p a p a y a , p a ta ta V iru s v e g e ta l i

R a m m o ll im e nto ra l le n ta to

P o m o d o ro P o m o d o ro ,b a t te r i , v iru s

C o n te n u to d ia c id i g ra s s im o d if ic a to

S o ia , c a n o la S o ia o a l t r iv e g e ta li

C o n tro llo d e ip o ll in i

R a d ic c h io , m a is B a tte r i d e ls u o lo

I Dubbi circa la sicurezza per il consumatore e per l’ambiente.

✔ Aspetti di salubrità per il consumatore✔ E’ possibile che i cibi transgenici risultino tossici?✔ E’ possibile che i cibi transgenici provochino allergie?✔ E’ possibile che l’ingestione di cibi transgenici portatori di geni per la resistenza agli antibiotici

possa diffondere questa caratteristica a microrganismi patogeni?

✔ Aspetti ambientali✔ L’uso di vegetali resistenti agli erbicidi ne ridurra o ne aumenterà l’utilizzo?✔ Questi organismi potranno diffondere le proprie caratteristiche di resistenza alle piante infestanti

selvatiche?✔ Potrebbero essere essi stessi delle piante infestanti?✔ L’uso ripetuto degli stessi diserbanti potrebber indurre l’insorgenza di piante infestanti ad essi

resistenti?✔ L’utilizzo di Vegetali transgenici ad attività insetticida potrebbe determinare la scomparsa di

popolazioni di insetti non nocivi e squilibri dell’ecosistema?

Tecniche di Introduzione di Transgeni in Organismi Animali

Integrazione “Random”

✔ Microiniezione pronucleareApplicabile a molte specie

necessita di zigoti

Integrazione casuale del transgene

✔ Vettori RetroviraliL’integrazione avviene nelle cellule in divisione (generazione di “mosaici”)

Sito di integrazione non prevedibile anche se non del tutto casuale

✔ Vettori LentiviraliIntegrazione efficiente anche in cellule non in divisione

✔ Elettroporazione, vettori liposomaliIntegrazione casuale

alta percentuale di ricombinazione e di inattivazione dei transgeni

✔ Sperm-Mediated DNA transportDopo la prima pubblicazione sono mancate le conferme sperimentali da parte di altri gruppi

Sviluppo embrionale

Regolazione dell’espressione

Ruolo del promotore

Microiniezione Pronucleare

Procedura di microiniezione nel topo

Procedura di microiniezione nel topo (2)

Microiniezione nel Bovino

Esempio di efficienza della tecnica di transgenesi per microiniezione nel bovino

Oociti recuperati 2470 (100%)

Oociti maturati 2297

Oociti fertilizzati 1358

Zigoti microiniettati 1154

Zigoti sopravvissuti 981

Embrioni sviluppati in vitro 687

Embrioni trasferiti (100%) 129

Vitelli nati 21

Vitelli transgenici (1.5%) 2 (0,08%)

da Krimpenfort, 1991

PUNTI CRITICI

Efficienza e costi

Regolazione e livello di espressione

Previsione degli effetti collaterali

Ciclo biologico dei retrovirus

Vettori Retrovirali

Tecniche di Introduzione di Transgeni in Organismi Animali

Integrazione Mirata

✔ Ricombinazione omologa in E.S.Cells e derivazione di animali chimericiIntegrazione mirata del transgene

Applicabile soltanto al Topo

✔ Nuclear transfer da cellule geneticamente modificateE’ la tecnica più recente ed appare come la più promettente.

Introduzione mirata del transgene. Elevata efficienza. Applicabile a diverse specie di animali domestici

Ricombinazione omologa

La ricombinazione omologa

Gene bersaglio scelto opportunamente oppure inserzione in “siti neutrali”

Iniezione in Blastocisti

Gene Targeting 1

Gene Targeting 2

Le cellule staminali embrionali

Limite nelle specie zootecniche:

Molto difficili da isolare

Chimerismo e lunghi intervalli di generazione

Nuclear transfer da cellule embrionali

Nuclear Transfer da cellule differenziate

Enucleazione e Nuclear Transfer nel topo

Enucleazione e Nuclear Transfer

Il trapianto nucleare nella pecora : Dolly

Il trapianto nucleare

Animali clonati: Dolly, Galileo

Animali clonati da cellule trasfettate: pecora che esprime il fattore IX umano

Animali clonati da cellule trasformate per ricombinazione omologa: ovino e suino. Sono stati clonati bovini da fibroblasti ottenuti da biopsia e coltivati in vitro per lunghi periodi (30 divisioni)