Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
ANTANAS ŠIAUČIŪNAS
LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DIKLOFENAKO NATRIO
DRUSKA FORMULAVIMAS IR STABILUMO VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai:
prof. dr. Vitalis Briedis
prof. dr. Anna Maria Fadda
KAUNAS, 2015
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis,
Data
LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DIKLOFENAKO NATRIO DRUSKA
FORMULAVIMAS IR STABILUMO VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai: prof. dr. Vitalis Briedis prof. dr. Anna Maria Fadda Data
Recenzentas Darbą atliko Magistrantas Antanas Šiaučiūnas Data Data
KAUNAS, 2015
3
TURINYS
TURINYS .................................................................................................................................. 3
SANTRAUKA ........................................................................................................................... 5
SUMMARY ............................................................................................................................... 6
PADĖKA ................................................................................................................................... 7
SANTRUMPOS ........................................................................................................................ 8
ĮVADAS ..................................................................................................................................... 9
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ................................................................................... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA .................................................................................... 11
1.1. Liposominių nanonešiklių apžvalga ........................................................................ 11
1.1.1. Liposomų panaudojimas lokaliam gydymui ........................................................ 13
1.1.2. Liposomų klasifikacija ir jų pašalinimas iš organizmo ........................................ 14
1.2. Liposomų gamyboje naudojamos medžiagos ......................................................... 15
1.2.1. Fosfolipidai .......................................................................................................... 15
1.2.2. Cholesterolis ......................................................................................................... 16
1.3. Liposomų charakterizavimas in vitro ..................................................................... 17
1.3.1. Liposomų lamelių skaičiaus nustatymas .............................................................. 17
1.3.2. Liposomų dalelių dydžio analizė ......................................................................... 18
1.3.3. Liposomų išvaizda ir drumstumas ....................................................................... 18
1.3.4. Liposomų zeta potencialas ................................................................................... 19
1.3.5. Liposomų inkorporavimo efektyvumas ............................................................... 19
1.3.6. Vaistinės medžiagos atpalaidavimas iš liposomų ................................................ 20
1.4. Naujo tipo lipidiniai nanonešikliai .......................................................................... 20
1.4.1. Transferosomų apžvalga ...................................................................................... 20
1.4.2. Etosomų apžvalga ................................................................................................ 22
2. TYRIMO METODAI ................................................................................................... 24
2.1. Tyrimo objektas ........................................................................................................ 24
2.2. Tyrimo medžiagos .................................................................................................... 24
2.2.1. Reagentai: ............................................................................................................. 24
2.2.2. Įranga: .................................................................................................................. 24
2.3. Lipidinių nanonešiklių gamyba ............................................................................... 25
4
2.3.1. Nanonešiklių homogenizavimas .......................................................................... 27
2.4. Analitiniai metodai ................................................................................................... 27
2.4.1. Lipidinių nanonešiklių vidutinio dalelių dydžio ir PDI nustatymas .................... 27
2.4.2. Lipidinių nanonešiklių zeta potencialo nustatymas ............................................. 28
2.4.3. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimas ............................................................ 28
2.4.4. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumo nustatymas .......................... 28
2.4.5. Statistinė analizė ................................................................................................... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ......................................................................... 30
3.1. Lipidinių nanonešiklių homogenizavimo metodo parinkimo analizė .................. 30
3.2. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumo tyrimo rezultatai ............... 31
3.3. Lipidinių nanodalelių dydžio nustatymo rezultatai .............................................. 32
3.4. Lipidinių nanonešiklių stabilumo, nustatant nanodalelių zeta potencialą, tyrimo
rezultatai .............................................................................................................................. 34
3.5. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai ............................................. 35
4. IŠVADOS ...................................................................................................................... 39
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ......................................................................... 40
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ........................................................................................ 41
7. PRIEDAI ....................................................................................................................... 45
5
SANTRAUKA
LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DIKLOFENAKO NATRIO DRUSKA
FORMULAVIMAS IR STABILUMO VERTINIMAS A.Šiaučiūno magistro baigiamasis darbas, moksliniai vadovai prof. dr. V.Briedis ir prof. dr.
A.M.Fadda; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos
katedra, Kaunas. Università degli studi di Cagliari, department of environmental and life science,
Cagliari (Italija).
Darbo tikslas – įvertinti lipidinių nanonešiklių (liposomų, transferosomų, etosomų) su
inkorporuota diklofenako natrio druska fizikines–chemines savybes, stabilumą ir inkorporavimo
efektyvumą. Uždaviniai – pagaminti lipidinius nanonešiklius (liposomas, transferomoas, etosomas)
naudojant plono lipidų sluoksnio hidracijos metodą; nustatyti lipidinių nanonešiklių fizikines–
chemines savybes: vidutinį dalelių dydį, dispersiškumą ir zeta potencialą; įvertinti lipidinių
nanonešiklių stabilumą; įvertinti lipidinių nanonešiklių gebą inkorporuoti diklofenako natrio druską.
Tyrimo metodai. Liposomų, transferosomų ir etosomomų gamybai naudotas plono lipidų
sluoksnio hidracijos metodas, homogenizavimui – ultragarsinis metodas. Į visus lipidinius nešiklius
inkorporuota diklofenako natrio druska. Lipidinių nanonešiklių vidutinis dalelių dydis, polidispersijos
indeksas ir zeta potencialas nustatytas naudojant Zetasizer Nano (Malvern, JK) analizatorių. Dalelių
stabilumas vertintas matuojant visų formuluočių vidutinį dalelių dydį ir PDI praėjus 1val., 1d., 2d.,
1sav., 2sav., ir 1 mėn. po pagaminimo. Inkorporavimo efektyvumui nustatyti atskirta laisva
diklofenako natrio druska nuo lipidinės nanonešiklio suspensijos. Diklofenako natrio druskos kiekis
nešikliuose nustatytas spektofotometrijos metodu.
Rezultatai ir išvados. Liposomų dalelių dydis po ciklinio homogenizavimo buvo 39 proc.
mažesnis lyginant su necikliškai homogenizuotomis dalelėmis. Transferosomų ir etosomų atvejais šis
skirtumas buvo atitinkamai 40 proc. ir 13 proc. mažesnis. Visų lipidinių nanonešiklių zeta potencialas
buvo < −44,5 mV. Nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai parodė, kad po 1 mėnesio stabiliausi buvo
liposominiai nešikliai, kadangi jų dalelių dydžio pokyčiai po 1 mėn. buvo statistiškai nereikšmingi
(p>0,05). Liposomų inkorporavimo efektyvumas buvo 13,1 proc. ir 33,75 proc. didesnis nei
atitinkamai transferosomų ir etosomų. Tyrimų rezultatai patvirtino ultragarso tinkamumą visų trijų tipų
lipidinių nanodalelių homogenizavimui. Suformuluotų liposomų stabilumas yra pakankamas. Etosomų
ir transferosomų formuluotės turi būti toliau vystomos siekiant pritaikyti diklofenako natrio druskos
vaisto formos gamybai. Cikliškai homogenizuotos liposomos tinkamos atlikti biofarmacinius tyrimus
siekiant nustatyti diklofenako natrio druskos atpalaidavimo kinetiką.
6
SUMMARY
FORMULATION AND STABILITY EVALUATION OF LIPID NANOCARRIERS WITH INCORPORATED DICLOFENAC SODIUM
The aim of the study was to evaluate physico-chemical properties, stability and incorporation
efficiency of vesicular carriers (liposomes, transfersomes, ethosomes), containing diclofenac sodium.
Tasks – to prepare vesicular carriers (liposomes transferomoas, etosomas) using a thin lipid layer
hydration method; to determine vesicular carriers physical and chemical properties: average particle
size, polydispersity and zeta potential; to assess stability of vesicular carriers; to assess vesicular
carriers ability to incorporate diclofenac sodium salt.
Liposomes, transfersomes and ethosomes were prepared by using a thin lipid layer hydration
method and homogenised by using ultrasonic method. Diclofenac sodium salt was incorporated in all
vesicular carriers. Particle size, polydispersion index and zeta potential of vesicular carriers was
determined by using the Zetasizer Nano (Malvern, UK) analyzer. Stability of vesicular carriers was
evaluated by measuring particles size and PDI for 28 days. To evaluate incorporation efficiency of
vesicular carriers, first of all, free diclofenac sodium was separated from suspension. Amount of
diclofenac sodium was evaluated by using spectrophotometric method.
Particles size of liposomes, transfersomes and ethosomes after cyclic homogenization was
39%, 40% and 13% lower compared to the non-cyclical homogenized particles. Vesicular carriers zeta
potential was <-44.5 mV. Vesicular carriers stability studies showed that after 1 month the most stable
was liposomes because their particle revealed lowest size changes after 1 month. Incorporation
efficiency of liposomes was 13.1% and 33.75% higher than transfersomes and ethosomes. The results
confirmed the suitability of ultrasonic method for all three types of vesicular carriers homogenisation.
Stability of formulated liposomes was considered as sufficient. Ethosomes and transfersomes should
be reformulated for futher studies. Biopharmaceutical evaluation should be considered as the next step
in the development.
7
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju magistro baigiamojo darbo vadovams: prof. dr. Vitaliui Briedžiui ir prof.
dr. Anna Maria Fadda už pagalbą, paramą ir patarimus atliekant eksperimentinę dalį ir magistro
baigiamojo darbo rašymo metu.
Dėkoju Kaljario universiteto darbuotojams ir doktorantams: dr. Carla Caddeo, dr. Maria
Letizia Manca ir Michele Schlich už pagalbą ir patarimus atliekant magistro baigiamojo darbo
eksperimentinę dalį.
Dėkoju LSMU FF klinikinės farmacijos katedros darbuotojams ir doktorantams: prof. dr.
Kristinai Ramanauskienei, lekt. dr. Modestui Žiliui ir Agnei Mazurkevičiūtei už pagalbą ir patarimus
rašant magistro baigiamąjį darbą.
8
SANTRUMPOS
%, proc
chol
d
h
IE
Min
NVNU
P90G
pav
PDI
PEG
R2
RES
UV
procentai
cholesterolis
dienos
valandos
inkorporavimo efektyvumas
minutės
nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo
fosfoliponas 90G
paveikslas
polidispersiškumo indeksas
polietileno glikolis
regresijos koeficientas
retikuloendotelinė sistema
ultravioletiniai spinduliai
9
ĮVADAS
Ilgėjanti gyvenimo trukmė skatina ieškoti priemonių, kurios užtikrintų geresnę gyvenimo
kokybę. Didelė dalis žmonių, ypač senyvo amžiaus, vartoja vaistus, todėl farmacijos pramonė ieško
būdų kaip užtikrinti mažesnes vaistų dozes, ilgesnį ir efektyvesnį jų veikimą, sumažinti vaistų šalutinį
poveikį.
Lipidiniai nanonešikliai yra sferinės formos vezikulės, sudarytos iš centre esančios vandeninės
fazės, kuri padengta vieno ar kelių sluoksnių fosfolipidų [1–6]. Lipidinių nanonešiklių grupei
priskiriamos liposomos, transferosomos ir etosomos. Transferosmų ir etosomų sukūrimą lėmė ribotos
liposomų pritaikymo galimybės pernešant lokaliai vartojamas vaistines medžiagas [7,8]. Nors visų šių
tipų nanodalelės gaminamos pritaikant panašias technologijas, tačiau jų stabilumas ir geba
inkorporuoti vaistines medžiagas skiriasi.
Lipidinių nanonešiklių savybės, pernešant vaistines medžiagas, gali būti pritaikytos įvairioms
patogenezėms gydyti dėl jų pakankamo stabilumo, mažo toksiškumo, efektyvumo ir universalumo
parenkant priimtiniausią vartojimo būdą [2–4]. Dažniausiai lipidiniai nanonešikliai pritaikomi
pernešant ribotai vandenyje tirpias vaistines medžiagas. Dabartiniu metu sparčiai tiriamos galimybės
pritaikyti lipidinius nanonešiklius įvairios prigimties vaistinių medžiagų pernašai į biologinius
audinius [6].
Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo (NVNU) yra viena iš dažniausiai vartojamų vaistų grupių.
Jie vartojami gydant chroniškus reumatoidinio artrito simptomus, osteoartritą, dismenorėją dėl
analgetinio, antipiretinio ir priešuždegiminio poveikio. Vartojant juos ant odos įprastinėmis
farmacinėmis vaistų formomis (geliais, kremais, tepalais), jų biologinis prieinamumas yra ribotas.
Diklofenako natrio druska yra vienas iš dažniausiai vartojamų NVNU. Jos įterpimas į lipidinius
nanonešiklius galėtų pagerinti medžiagos skvarbą į gilesnius odos sluoksnius ir sisteminę kraujotaką.
Darbo tikslas – įvertinti lipidinių nanonešiklių (liposomų, transferosomų, etosomų) su
inkorporuota diklofenako natrio druska fizikines–chemines savybes, stabilumą ir inkorporavimo
efektyvumą.
10
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti lipidinių nanonešiklių (liposomų, transferosomų, etosomų) su inkorporuota
diklofenako natrio druska fizikines–chemines savybes, stabilumą ir inkorporavimo efektyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Pagaminti lipidinius nanonešiklius (liposomas, transferosomas, etosomas) naudojant plono lipidų
sluoksnio hidracijos metodą.
2. Nustatyti lipidinių nanonešiklių fizikines–chemines savybes: vidutinį dalelių dydį, dispersiškumą ir
zeta potencialą.
3. Įvertinti lipidinių nanonešiklių stabilumą.
4. Įvertinti lipidinių nanonešiklių gebą inkorporuoti diklofenako natrio druską.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Liposominių nanonešiklių apžvalga
Pirmą kartą liposomos pagamintos 7-ame dešimtmetyje Kembridže, Anglijoje. Hematologas A.
D.Bangham atlikdamas bandymus su elektoriniu mikroskopu pastebėjo, kad fosfolipidai vandeniniame
tirpale linkę suformuoti uždaras pūsleles – liposomas [9,10]. Liposomų dalelių dydis gali būti nuo 0,02
µm iki 10 µm. Liposomų savybės priklauso nuo pasirinktos gamybos technologijos ir naudojamų
medžiagų. Jos gaminamos iš natūralių ir/ar sintetinių fosfolipidų, tačiau kitos medžiagos, tokios kaip
cholesterolis, taip pat gali būti naudojamos gaminant liposomas, siekiant pagerinti jų savybes.
Liposomų viduje esančioje vandeninėje terpėje talpinamos vandenyje tirpios medžiagos (1A
pav.). Lipofilinės ir amfilfilinės medžiagos išsidėsto liposomų membranos fosfolipidų dvisluoksnyje
(1B pav.) [4].
1 pav. Liposomos strukūra: A – inkorporuota hidrofilinė medžiaga, B – inkorporuota
lipofilinė medžiaga [11]
Liposomos vartojamos skystomis (suspensijos), kietomis (sausi milteliai) ir pusiau kietomis
(geliai, kremai) vaisto formomis, dažniausias vartojimo būdas – ant odos arba parenteraliai. Patekusios
į organizmą, liposomos atpažįstamos kaip svetimos dalelės ir endocituojamos retikuloendotelinės
sistemos (RES) makrofagų kepenyse ir blužnyje [12]. Todėl įprastos liposomos tinkamos pernešant
vaistus į šių organų ląsteles.
Liposomos, naudojamos pernešant vaistus in vivo, privalo išlikti stabilios ilgesnį laikotarpį tam,
kad pasiektų specifinius taikinius. Norint išvengti greito liposomų pašalinimo iš kraujotakos dėl RES
12
poveikio, prie liposomų paviršiaus prijungiamos polietileno glikolio (PEG) molekulės (2 pav.). PEG –
tai hidrofilinis polimeras, turintis skirtingą molekulinę masę, priklausomai nuo monomerų
pasikartojimo skaičiaus. Polimeras sudaro erdvinį barjerą, kuris apsaugo nuo sąveikos su fagocitinėmis
ląstelėmis ir liposomų cirkuliacijos sisteminėje kraujotakoje laikas pailgėja. Šio tipo liposomos, dar
vadinamos stealth liposomomis, taikomos gydyme, kuriame nebuvo galima panaudoti įprastinių
liposomų [13]. Pagrindinis ilgo veikimo liposomų bruožas yra tai, kad jos nesiakumuliuoja RES ir gali
pasiskirstyti po tas organizmo vietas, kur kraujagyslių sienelės pralaidumas yra didesnis [12]. Šiomis
savybėmis pasižymi organizmo vietos, kuriose yra patologinių pakitimų (navikai, infekcijos,
uždegimai). Taip apsaugomas organizmas nuo nepageidaujamų reakcijų į vaistą. Būtent dėl šios
savybės liposomos pradėtos plačiai naudoti vėžio gydyme. Chemoterapijos efektyvumas yra labai
ribotas dėl toksinio vaistų poveikio. Įterpus vaistinę medžiagą į liposomas, pasikeičia vaisto
pasiskirstymas, sumažinamas nepageidaujamas toksinis poveikis ir padidinamas gydymo
veiksmingumas. JAV maisto ir vaistų administracija patvirtino du liposominius preaparatus, kurie
pradėti vartoti vėžio gydyme JAV, ES ir Japonijoje. DaunoXome® pagamintas iš mažų liposomų,
kuriose įterptas daunorubicinas. Šis preaparatas yra rinkoje nuo 1990 m. Kitas preparatas – Doxil®,
pagamintas iš erdviškai stabilizuotų liposomų su įterptu doksorubicinu. Su Doxil® atlikti tyrimai
parodė, kad šis vaistas turi 4,5 karto mažesnį kardiotoksinį poveikį nei įprasta vaisto forma vartojamas
doksorubicinas [4].
2 pav. Liposoma su prijungtu PEG [11]
Liposomos gali būti naudojamos norint apsaugoti veikliąją medžiagą nuo fermentų suskaidymo.
Tokioms liposomoms ruošti naudojami lipidai yra atsparūs fermentų poveikiui, o veiklioji medžiaga,
esanti liposomų viduje, apsaugoma, kol dalelės cirkuliuoja ekstraląsteliniame skystyje. Pavyzdžiui, β-
13
laktamazei jautrūs antibiotikai (penicilinai, cefalosporinai) yra įterpiami į liposomas ir taip apsaugomi
nuo nepageidaujamo β-laktamazės poveikio [10].
Norint pagerinti amfotericino B, kuris yra pirmo pasirinkimo vaistas gydant sistemines
grybelines infekcijas, tirpumą, atlikta daug tyrimų su liposomomis. Dėl blogo tirpumo vandenyje
amfotericinas B dažnai vartojamas įterptas į miceles. Tačiau micelės nėra stabilios vartojant
sistemiškai, o dozė privalo būti maža dėl vaisto neurotoksiškumo ir nefrotoksiškumo. Tuo tarpu
liposomos yra stabilesnės koloidinės dalelės, todėl amfotericinas B efektyviau nugabenamas į
makrofagus ir ženkliai sumažinamas nepageidaujamas poveikis. Tokio tipo amfotericinas prieinamas
JAV ir Europoje (AmBisome®) [14].
Katijoninės liposomos kuriamos siekiant pagerinti genetinių medžiagų pernešimą į organizmą.
Lipidų katijoninės dalys sąveikauja su neigiamą krūvį turinčiomis DNR ir sukondensuoja molekules į
stabilesnę struktūrą. Gaunami lipidų-DNR kompleksai inkorporuojami į liposomas, tai suteikia jiems
apsaugą bei skatina patekimą į ląsteles ir raišką.
1.1.1. Liposomų panaudojimas lokaliam gydymui
Liposominių preparatų naudojimas per odą pagrįstas tuo, kad lipidų vezikulių dvisluoksnio ir
natūralių ląstelių membranos struktūra labai panaši. Tai suteikia liposomoms savybę keisti membranos
praeinamumą ir jungtis prie jos. Dermatologijoje liposomos vartojamos dėl drėkinamojo ir atstatančio
odą poveikio. Liposomos taip pat gali būti vartojamos skatinant odos regeneraciją. Lipidai yra
pakankamai hidratuoti, todėl net ir neturėdami aktyvių medžiagų, drėkiną odą. Dažniausiai to pakanka
pagerinti odos elastingumą ir apsauginę funkciją, kurias dažnai sutrikdo įprastas odos senėjimas [15].
Plačiai tyrinėjama liposomų savybė pernešti skirtingas medžiagas į epidermį ar dar gilesnius
odos sluoksnius. Tai leidžia pradėti naudoti liposomas įvairiems odos susirgimams gydyti. Įprastos
vaistų formos, tokios kaip tirpalai, kremai, tepalai, perneša vaistines medžiagas per stratum corneum,
priklausomai nuo koncentracijos. Tačiau daugiasluoksnės liposomos gali pernešti vaistus į stratum
corneum, epidermį ir tikrąją odą per 30 minučių didesnėmis kocentracijomis nei kitos ant odos
vartojamos vaistų formos [4].
Į liposomas galima įterpti įvairias vaistines medžiagas, labiausiai paplitusios yra trys vaistų
grupės: kortikoidai, retinoidai ir vietiniai anestetikai [16,17]. Lasch (1989) tyrinėjo liposominio
preparato su hidrokortizoliu poveikį žmogaus odai [17]. Jis nustatė, kad toks preparatas perneša
didesnį kortizolio kiekį, o tai labai svarbu, nes kortizolis vartojant ilgalaikiam odos gydymui
nepasižymi pašaliniu poveikiu, bet dažnai nepasiekiama pakankama jo koncentracija ūmioms
dermatozėms gydyti. Dėl šios priežasties didesnė hidrokortizolio kocentracija turės geresnį terapinį
14
efektą. Dvigubai aklame, atsitiktiniame, lyginamajame tyrime betametazono dipropionatas, įterptas į
liposomas, buvo lygintas su įprastu betametazono dipropionato preparatu [16]. Pastebėta, kad
pacientams, sergantiems atopine egzema ir vartojantiems liposominį betametazono dipropionatą, net ir
mažesnėmis koncentracijomis, uždegimo požymiai sumažėjo labiau nei vartojant tradicinį preparatą.
Kita svarbi vaistų grupė – retinoidai. Šios vaistinės medžiagos vartojamos vietiškai, sergant
nesudėtinga acne vulgaris forma [18]. Tretinoino gelio vartojimas sukelia vietinį perštėjimą ir gydymo
pradžioje gali sukelti ligos paūmėjimą. Šių nepageidaujamų reakcijų galima išvengti vartojant
liposominį tretinoiną. Schafer-Korting (1994) atliktame dvigubai aklame tyrime buvo bandoma
nustatyti liposominio tretinoino efektyvumą ir toleravimą pacientams, sergantiems nekomplikuota
acne vulgaris [19]. Rezultatai parodė, kad mažiau koncentruota liposominė tretinoino vaisto forma
turėjo vienodą efektyvumą ligos gydyme ir pasižymėjo mažesniu odos dirginimu. Šiuos privalumus
lėmė didesnis liposominio tretinoino praeinamumas ir lėtesnis vaisto atpalaidavimas.
Norint sukelti ilgalaikę vietinę anesteziją reikalinga didelė anestetiko koncentracija. Gesztes ir
kt. (1988) atlikti tyrimai nustatė, kad tetrakainas, įterptas į liposomas, pasižymėjo geresne anestezija
(mažesnė vaisto koncentracija, ilgesnis anestezijos laikas) lyginant su įprastiniais nejautrą
sukeliančiais kremais [20]. Panašūs rezultatai gauti naudojant kitą vietinį anestetiką lidokainą, kuris
yra prekyboje JAV nuo 1998 m. (ELA-Max®).
1.1.2. Liposomų klasifikacija ir jų pašalinimas iš organizmo
Liposomos skirstomos pagal dydį ir fosfolipidų dvisluoksnių skaičių į 3 pagrindines grupes:
1. Daugialameliarinės (DL) – tai liposominės dalelės, turinčios daugiau nei vieną fosfolipidų
dvisluoksnį. Šių pūslelių dydis nuo 100 nm iki keleto mikrometrų, priklausomai nuo jų
paruošimo būdo. Dėl didelio fosfolipidų dvisluoksnių skaičiaus jos taikomos pernešant
lipofilinius vaistus.
2. Mažos monolameliarinės (MML) – tai liposominės dalelės, turinčios vieną fosfolipidų
dvisluoksnį. Dalelių dydis nuo 20 iki 100 nm. Jos tinkamesnės parenteraliniam vartojimui
lyginant su DL, nes yra homogeniškos dydžiu. Tačiau dėl mažo dydžio jos pasižymi prastesne
inkorporavimo geba.
3. Didelės monolameliarinės (DML) – tai liposominės dalelės, turinčios vieną fosfolipidų
dvisluoksnį. Dalelių dydis nuo 100 nm iki keleto mikrometrų. Labiausiai tinkamos inkorporuoti
vandenyje tirpias medžiagas, nes turi didesnę hidrofilinę ertmę lyginant su MML [21].
15
Pašalinimas iš organizmo. Liposomų opsonizaciją ir pašalinimą iš organizmo atlieka
retikuloentonelinė sistema (RES). Greitis, per kurį iš sisteminės kraujatokos bus pašalintos liposomos,
priklauso nuo liposomų sudėties ir dalelių dydžio. RES – tai dalis žmogaus imuninės sistemos, kurios
pagrindinis tikslas pašalinti svetimkūnius iš organizmo. RES susideda iš makrofagų, kurių daugiausiai
yra kepenų Kupferio ląstelėse, plaučiuose ir blužnyje. Po injekcijos liposomos padengiamos serumo
baltymais – opsoninais. Po to jos fagocituojamos RES ląstelių ir didžioji dalis liposomų patenka į
kepenis ir blužnį.
Didelės liposomos (>200 nm) yra greitai opsonizuojamos ir RES pagalba pašalinamos iš
sisteminės kraujotakos, po to akumuliuojasi blužnyje. Opsonizacijos greitis lėtėja mažinant liposomų
dydį. Mažos liposomos turi sąlyginai didesnį paviršiaus plotą, todėl prie jų membranos prisijungia
mažiau opsoninų ir makrofagai lėčiau jas pašalina. Liposomos, kurių dalelių dydis nuo 70 nm iki 200
nm ilgiau išlieka sisteminėje kraujotakoje ir turi didesnę tikimybę pasiekti taikinį.
Lipidų išsidėstymas liposomų membranose turi didelę įtaką fizikinėms membranos savybėms:
pralaidumui, elastiškumui ir paviršiaus krūviui. Ši savybė, kaip ir prieš tai minėtas dalelių dydis, svarbi
liposomų pašalinimui iš organizmo. Neutralaus krūvio liposomos, dėl tankiai membranoje
išsidėsčiusių fosfolipidų, ilgiau išlieka sisteminėje kraujotakoje ir lėčiau atpalaiduojama veiklioji
medžiaga, lyginant su krūvį turinčiomis liposomomis. Baltymų opsonizacija prie liposomų paviršiaus
sumažėja dėl tankaus lipidų išsidėstymo membranose. Cholesterolis, naudojamas liposomų gamyboje,
stabilizuoja membraną ir padeda išvengti vaistinės medžiagos netekimo, be to jis sumažina opsoninų
prisijungimą ir prailginą liposomų buvimą in vivo. Tam tikri plazmos baltymai turi afinitetą
liposomoms, kuris stiprėja, jei liposomos turi krūvį. Katijoninės dalelės greičiau pašalinamos iš
sisteminės kraujotakos, todėl jų gyvavimo pusperiodis in vivo trumpesnis. Anijoninės liposomos,
turinčios fosfatidilserino, fosfatidilglicerolio, greitai aptinkamos makrofagų ir pašalinamos iš
kraujotakos [12,22].
1.2. Liposomų gamyboje naudojamos medžiagos
1.2.1. Fosfolipidai
Liposomų gamyboje naudojami įvairūs fosfolipidai ir jų mišiniai. Fosfolipidai yra sudėtiniai
lipidai sudaryti iš glicerolio, fosfato ir riebalų rūgščių. Fosfolipidų molekulės pasižymi amfipatinėmis
savybėmis – į hidrofilinę dalį (galvutę) įeina 2-etilamonio fosfato fragmentas, o į hidrofobinę dalį
(uodegėlę) – ilgos angliavandenilių grandinės, priklausančios riebalų rūgščių esteriams.
Angliavandenilių grandinės gali turėti nuo 14 iki 24 anglies atomų. Kiekviena jų turi bent vieną
16
dvigubąjį (nesotųjį) ryšį. Šis ryšys suteikia molekulei galimybę deformuotis ir mažina standumą.
Skirtingi uodegėlių ilgiai ir dvigubųjų ryšių skaičius lemia fosfolipidų dvisluoksnio takumą [23].
Fosfolipidams, kaip ir visoms kitoms amfipatinėms medžiagoms, būdinga tai, kad patekusios
į vandenį jos savaime sudaro tam tikras struktūras. Jos būna dviejų tipų: sferinės (viduje paslėptos
uodegėlės, o paviršius padengtas polinėmis galvutėmis) arba plokščios (hidrofobinės uodegėlės
išsidėsto tarp dviejų hidrofilinių galvučių sluoksnių – dvisluoksnio). Tokį fosfolipidų išsidėstymą
vandeniniame tirpale nulemia hidrofobinės reakcijos tarp nepolinių grandinių. Taigi jiems būdingas
savaiminis užsidarymas, suformuojant uždaras erdves [23].
3 pav. Fosfolipidų cheminė sudėtis [24]
Fosfatidiletanolaminai yra etanolamino ir fosfatido rūgšties esteriai. Jie išskiriami iš galvos
smegenų audinių. Fosfatidilserinai išskiriami iš širdies raumenų, smegenų ir kepenų. Juose yra amino
rūgšties serino. Fosfatidilcholinai yra esteriai sudaryti iš aminoalkoholio cholino ir fosfatido rūgšties.
Jie randami žmogaus nervų sistemoje. Fosfatidilcholinas dar žinomas kaip lecitinas, gaunamas
natūraliu ir sintetiniu būdu. Jis lengvai išskiriamas iš kiaušinio trynio ir sojos pupelių. Galima išskirti ir
iš galvijų stuburo smegenų ir širdies, bet šis procesas sunkesnis lyginant su prieš tai paminėtu.
Lecitinai, gaunami iš natūralių šaltinių, būna mišiniuose su įvairiais fosfatidilcholinais, kurie turi
skirtingo ilgio angliavandenilių grandines. Lecitinas, išskiriamas iš augalinių žaliavų, turi daugiau
neprisotintų grandinių, o lecitinai, gaunami iš žinduolių, turi daugiau prisotingų grandinių.
Fosfatidilcholinai – pagrindiniai fosfolipidai, naudojami gaminant liposomas, dėl santykinai mažos
gamybos kainos, lyginant su kitais fosfolipidais, neutralaus krūvio ir cheminio inertiškumo [23].
1.2.2. Cholesterolis
Cholesterolis (chol) – tai viena iš dažniausiai naudojamų papildomų medžiagų gaminant
liposomas. Jis įterpiamas į fosfolipidų dvisluoksnį ir turi įtakos liposomų savybėms. Chol stabilizuoja
ir sutvirtina liposomų membraną. Chol molekulė (4 pav.) turi 4 angliavandenilių žiedus, kurie nulemia
17
stiprias hidrofobines savybes. Hidroksilinė OH grupė, prijungta prie cholesterolio molekulės galo,
suteikia silpnas hidrofilines savybes. Chol gali būti įterptas į liposomų membranos dvisluoksnį ne
didesniu nei 1:1 santykiu. Tačiau jis gali būti naudojamas tik kaip papildoma medžiaga, gerinanti
liposomų savybes [25].
4 pav. Cholesterolio molekulė [24]
1.3. Liposomų charakterizavimas in vitro
Lipidinių nanonešiklių kokybė nustatoma stebint keletą parametrų. Dažniausiai
charakterizuojamos lipidinių nanonešiklių savybės yra vidutinis dalelių dydis (VDD), polidispersijos
indeksas (PDI), zeta potencialas (ZP), inkorporavimo efektyvumas (IE), fosfolipidų dvisluoksnio
sudėtis ir dalelių sluoksniuotumas.
1.3.1. Liposomų lamelių skaičiaus nustatymas
Lipidinių nanonešiklių lamelių skaičių lemia gamyboje naudojami fosfolipidai ir paruošimo
metodas. Inkorporavimo efektyvumui ir vaisto atpalaidavimo iš nešiklio greičiui didelę reikšmę turi
lipidų dvisluoksnių skaičius, esantis lipidiniame nanonešiklyje. Lamelių skaičius taip pat turi įtakos in
vivo vaisto pasiskirstymui ir poveikiui. Dėl šių priežasčių svarbu nustatyti lipidinių nanonešiklių
sluoksniuotumą.
Lipidinių nanonešiklių lamelių skaičius nustatomas pagal P31 branduolių magnetinį rezonansą
(BMR). Pridėjus Mn2+ jonų pasikeičia fosfolipidų, kurie sudaro pūslelių išorinį sluoksnį, P31 BMR
signalas. Mn2+ reaguoja su neigiamo krūvio fosfolipidų fosfatų grupėmis, taip pakeičia gaunamą
signalą. Lipidinių nanonešiklių lamelių skaičius nustatomas lyginant gautus signalus prieš pridedant
Mn2+ jonus prie suspensijos su dalelėmis ir po pridėjimo [26].
18
1.3.2. Liposomų dalelių dydžio analizė
Vidutinis lipidinių nanonešiklių dalelių dydis ir pasiskirstymas pagal jį – vieni svarbiausių
parametrų, ypač jei nešikliai vartojami inhaliuojant ar parenteraliai. Nanodalelių dydžio nustatymas
vykdomas keletu metodų. Dalelių dydžio nustatymui naudojant elektroninį mikroskopą, galima tiksliai
apžiūrėti individualias liposomas. Vienas iš metodo trūkumų – tiksliam tokio tyrimo atlikimui
reikalingi įgūdžiai. Norint įvertini visą mėginį, reikia išmatuoti ne mažiau nei 400 dalelių, todėl reikia
daug papildomo laiko [4].
Kitas lipidinių nanonešiklių dalelių dydžiui nustatyti naudojamas metodas – dinaminės
šviesos sklaidos (angl. dynamic light scattering – DLS) metodas. Jis paprastesnis ir greičiau atliekamas
lyginant su elektroniniu mikroskopavimu. DLS metodas remiasi Brauno dalelių judėjimu. Atliekant
DLS matavimus, nustatomas pro mėginį praėjusios išskaidytos šviesios intensyvumas. Gauti signalai
apdorojami ir gaunami intensyvumo funkciniai grafikai ir nustatomas vidutinis dalelių dydis mėginyje
[27].
5 pav. Dinaminės sklaidos metodo schema (1 – lazeris, 2 – lęšiai, 3 – kiuvetė su mėginiu, 4
– apertūra, 5 – jutiklis, 6 – kompiuteris) [28]
1.3.3. Liposomų išvaizda ir drumstumas
Liposomų suspensijos išvaizda gali kisti nuo permatomos iki drumstos, priklausomai nuo
sudėties ir dalelių dydžio. Jei drumstumas turi melsvą atspalvį, tai reiškia, kad mėginyje dalelės yra
homogeniškos. Pilkšva ar pilka spalva gali reikšti neliposominę dispersiją ar mikrokristalus. Optinis
mikroskopas gali aptikti liposomas ar kitas nereikalingas daleles, jei jų dydis > 0,3 um. Liposomų
tirpalams būdingos savybės: panaši į vandens tirpalo paviršiaus įtemptis, putojimas ir greitai kylantys
19
burbulai. Dėl per didelio paviršiaus hidrofobiškumo lėtai kylantys burbulai gali būti kaip indikatorius,
kad tirpale yra neliposominių lipidų [4].
1.3.4. Liposomų zeta potencialas
Didžioji dalis koloidinių dispersijų vandeninėje terpėje turi elektrinį krūvį. Tam įtaką daro
paviršiaus grupių jonizacija (disocijuodamos rūgštinės grupės suteikia neigiamą paviršiaus krūvį, o
bazinės – teigiamą) ir krūvį turinčių medžiagų adsorbcija (katijoniniai surfaktantai gali būti adsorbuoti
dalelių ir suteikti joms teigiamą krūvį, o anijoniniai – neigiamą paviršiaus krūvį). Zeta potencialas yra
bendras dalelės krūvis, kurį ji įgauna tam tikroje terpėje [29]. Tai fizikinė savybė, kuri būdinga visoms
dalelėms suspensijoje. Zeta potencialo matavimas skirtas nustatyti koloidinės sistemos stabilumui. Jei
suspensijoje visos dalelės turi didelį teigiamą ar neigiamą krūvį, jos bus linkusios stumti viena kitą,
neformuojant agregatų. Zeta potencialas nustatomas elektroforezės šviesos sklaidos metodu. Matuojant
zetą potencialą naudojamas specialus lazeris, kuris sukuria šviesos srautą, einantį per mėginio centrą.
Sukuriamas elektrinis laukas, kuris visoms dalelėms, einančioms pro matavimo talpą, suteikia šviesos
srauto kitimus, pamatuojamas dalelių judėjimas. Pagal judėjimo kryptį nustatomas potencialas, o pagal
judėjimo greitį – potencialo dydis (zeta potencialas). Zeta potencialo matavimo rezultatai gali būti
vienas iš parametrų, rodančių sistemos stabilumą [29,30].
1.3.5. Liposomų inkorporavimo efektyvumas
Liposomų preparatai sudaryti iš inkorporuotų ir neinkorporuotų vaistinės medžiagos frakcijų.
Nustatant inkorporavimo efektyvumą pirmiausiai atskiriamos prieš tai minėtos frakcijos. Frakcijų
atskyrimui taikomi keli skirtingi metodai. Vienas iš jų yra centrifugavimas naudojant mikrokolonėlę.
Metodas pagrįstas skirtingų dalelių dydžiu tarp laisvo ir inkorporuoto vaisto. Atliekant tyrimą
neskiesta liposomų suspensija lašinama į ,,Sephadex” gelinę kolonėlę, ji sukama 2000 rpm greičiu 3
minutes siekiant išstumti liposomas į centrifugavimo kamerą. Po to pridedama 250 µl vandens ir
centrifugavimas kartojamas. Neinkorporuotas vaistas lieka prisijungęs prie gelio, o liposominės
pūslelės atsiskiria nuo gelio ir surenkamos po centrifugavimo [4].
Kitas liposomų atskyrimo nuo laisvos vaistinės medžiagos metodas – dializė. Naudojamos
tam tikro angų diametro dydžio dializės membranos. Liposomų mėginiai nepertraukiamai dializuojami
buferiniame tirpale. Laisva vaistinė medžiaga difunduoja į akceptorinę terpę, o liposomos su įterptu
vaistu lieka dializinėje membranoje.
20
Ultracentrifugavimas – vienas iš paprasčiausių ir greičiausių metodų, naudojamų norint
atskirti liposomas, kuriose yra įterptas vaistas, nuo aplinkos. Paimta analitė centrifuguojama 5000 rpm
greičiu 50 min, esant +4 oC temperatūrai. Taip pat galima centrifuguoti esant 3000 rpm greičiui 30 min,
bet prieš centrifugavimą, į mėginį reikia įdėti atitinkamą kiekį protamino tirpalo (10 mg/ml) tam, kad
susidarytų agregatai ir įvyktų sedimentacija [4].
Atskyrus liposomas, su inkorporuota medžiaga, nuo aplinkos, lipidų dvisluoksnis yra
suardomas ir nustatomas išsiskyrusios medžiagos kiekis. Kiekybinės analizės metodas parenkamas
pagal medžiagos savybes. Pagrindiniai analizės būdai – spektrofotometrija, fluorescencinė
spektroskopija ir kiti fizikocheminiai metodai [4,26]. Dažniausiai inkoporavimo efektyvumas
apskaičiuojamas procentais, lyginant medžiagos kiekį, esantį liposomose, su kiekiu, kuris naudotas
gamyboje.
1.3.6. Vaistinės medžiagos atpalaidavimas iš liposomų
Lipidinių nanonešiklių vaistinės medžiagos atpalaidavimo tyrimas atliekamas naudojant
dializės kameras. Liposomos patalpinamos į dializės apvalkalą, kurio membrana neadsorbuoja
vaistinės medžiagos ir ji gali laisvai pereiti remiantis difuzijos principu. Keli mililitrai liposomų
suspensijos įlašinami į dializės apvalkalą, kuris hermetiškai uždaromas ir patalpinamas į uždarą
kamerą su tirpikliu. Viso bandymo metu sistemoje palaikoma 37 oC temperatūra. Atpalaiduota
vaistinės medžiagos dalis nustatoma efektyviosios skysčių chromatografijos, spektrofotometrijos ar
kitu patvirtintu metodu. Paėmus mėginį iš kameros, atgal įpilamas toks pats tirpiklio kiekis. Bandymas
kartojamas 3 kartus, išvedami rezultatų vidurkiai, nustatoma atpalaiduotos vaistinės medžiagos dalis
atitinkamais laiko intervalais.
1.4. Naujo tipo lipidiniai nanonešikliai
1.4.1. Transferosomų apžvalga
Įprastos ant odos vartojamos liposomos nėra efektyvios pernešant vaistines medžiagas, todėl
per pastaruosius du dešimtmečius skirta daug dėmesio ieškant naujų lipidinių nanonešiklių, kurie būtų
tinkamesni vietiniam gydymui. Siekiant pagerinti ant odos vartojamų vaistinių medžiagų pernešimą,
XX dešimtmečio pradžioje, sumodeliuotos deformuojamos liposomos – transferosomos [7]. Lyginant
su įprastinėmis liposomomis, kurias gaminant naudojami fosfolipidai, trasnferosomoms papildomai
naudojami surfaktantai (natrio cholatas, natrio deoksicholatas ir įvairūs polisorbatai) [7]. Surfaktantai
21
sumažina lipidų dvisluoksnio stabilumą ir suteikia transferosomomų nanodalelėms lankstumo [7].
Transferosominių nanonešiklių atsiradimas svarbus faktorius siekiant pagerinti lokaliai vartojamų
vaistų efektyvumą. Lyginant su kitomis ant odos vartojamomis vaistų formomis, transferosomos turi
šiuos privalumus: jos pagerina vaistų prasiskverbimą pro pirminius odos sluoksnius, transferosomų
gamyboje naudojamos medžiagos yra visiškai saugios, todėl tinkamos farmaciniams ir kosmetiniams
preparatams kurti [7,31,32].
6 pav. Transferosomos schema [32]
Transferosomų veikimo principas nėra tiksliai žinomas. Transferosomų savybė prasiskverbti
per odą pernešant vaistines medžiagas aiškinama keliomis teorijomis. Vienoje iš jų teigiama, kad
transferosomos pasižymi skvarbumu dėl savybės leidžiančios joms keisti dydį ir taip pereiti pro mažas
poras [33]. Kiti šaltiniai teigia, kad transferosomos dehidratuoja odos paviršių, taip susidaro osmosinio
slėgio skirtumas tarp vidinio ir išorinio odos paviršiaus, o tai leidžia transferosomoms pereiti į stratum
corneum ir gilesnius odos sluoksnius [34]. Transferosomos, kaip ir liposomos, pasižymi hidrofilinėmis
ir hidrofobinėmis savybėmis, todėl į jų vidų taip pat gali būti inkorporuotos įvairios medžiagos.
Pagrindinis transferosomų skirtumas lyginant su liposomomis yra tai, kad transferosomos gali
deformuotis ir pereiti per mažas poras (nuo 5 iki 10 kartų mažesnes, lyginant su transferosomų
skersmeniu) neprarandant inkorportuotos medžiagos [35]. Ši savybė leidžia transferosomoms geriau
prasiskverbti pro stratum corneum. Todėl didelės molekulinės masės medžiagos (pvz. insulinas) gali
būti naudojamas vietiškai, taip išvengiant invazinių vaisto vartojimo būdų [1]. 2001 m. atliktame
tyrime palygintos transferosomų ir liposomų savybės pernešant 5-floruracilą (5-FU) pro odą [36]. In
vitro vaisto atpalaidavimo tyrimo pro odą rezultatai parodė, kad transferosomos tinkamesnės pernešant
22
5-FU. Taip pat pastebėta, kad procentinė 5-FU dalis patekusi į odą buvo didesnė lyginant su
inkorporuota į transferosomas vaisto dalimi. Autoriai teigia, kad nanonešiklių sudėtis turėjo įtakos
odos savybėms ir taip pagerino 5-FU difuziją į epidermį [36].
Transferosomų efektyvumas ir indiferentiškumas kitų vaistinių medžiagų atžvilgiu leidžia jas
pritaikyti įvairiems terapiniams poreikiams. Šveicarų reguliavimo tarnyba (SwissMedic) įregistravo
transferosominį NVNU ketoprofeną, kuris jau prieinamas rinkoje pavadinimu Diractin. Kiti vaistai
pagaminti transferosomų pagrindu, remiantis vokiečių kompanija IDEA AG, yra klinikinių tyrimų
stadijoje [31].
1.4.2. Etosomų apžvalga
1997 metais Touitou pristatė naujo tipo lipidinius nanonešiklius – etosomas. Šios pūslelės
skiriasi nuo kitų lipidinių nanonešiklių savo sudėtimi, struktūra ir veikimo mechanizmu. Etosomos –
tai minkštos lipidinės pūslelės, susidedančios iš fosfolipidų, etanolio ir vandens. Jų pavadinimas
pasirinktas dėl santykinai didelės etanolio koncentracijos (20 – 45 proc.) jų viduje. Pūslelių dydis gali
kisti nuo 10 nanometrų iki kelių mikrometrų. Etosomos skirtos vartoti ant odos, nes gali pasiekti
giliausios odos sluoksnius ir sisteminę kraujotaką. Etosomos naudojamos pernešant vaistines
medžiagas neinvaziniais metodais. [37–41].
6 pav. Etosomos schema [41]
Geresnė etosomų skvarba pro odą lyginant su liposomomis yra pagrindinis jų privalumas.
Etosomų nanodalelės turi transferosomoms būdingą savybę – deformabilumą. Lyginant su
liposomomis, kurios yra standžios, etosomos gali keisti savo formą ir praeiti pro mažas odoje esančias
Fosfolipidų dvisluoksnis
Etanolinis (20-45%) tirpalas
23
poras. Etosomų veikimo mechanizmui įtakos turi gamyboje naudojamas etanolis. Vartojant etosomas
ant odos, etanolis pirmiausia sąveikauja su intraląstelinių lipidų polinėmis galvutėmis, sumažindamas
stratum corneum esančių lipidų takumą. Dėl šio poveikio pasikeičia lipidų daugiasluoksnio tankis
odoje, padidėja praeinamumas pro jį, o tai leidžia joms pernešti didesnius vaisto kiekius į gilesnius
odos sluoksnius [39].
2010 m. S. D. Maurya ir kt. atliktame tyrime į etosomas inkorporuotas vaistas nuo ŽIV
indinaviras. Tyrime stebėtas vaistinės medžiagos pernešimo efektyvumas vartojant ant odos.
Indinaviro absorbcija vartojant per os priklauso nuo pH reikšmės, o didelė dalis vaisto pašalinama
pirminio metabolizmo metu. Vaisto vartojimas vietiškai – tinkama alternatyva prailginant vaisto
gyvavimo pusperiodį. Tyrimo rezultatai parodė, kad vartojant preparatą su etosomomis, jo
prasiskverbimas atitinkamai 2,06, 4,32 ir 8,5 karto geresnis lyginant su etanoliniu vaisto tirpalu,
liposomomis ir vandenyje ištirpinto vaisto tirpalu [42].
Dvigubai aklas, dvigubai užkoduotas, randomizuotas, palyginamasis tyrimas atliktas su
antivirusiniu vaistu acikloviru. 5 proc. etosominis acikloviras palygintas su 5 proc. acikloviro kremu
(Zovirax) odos herpes infekcijai gydyti. Tyrimo autoriai remdamiesi gautais rezultatais teigia, kad
etosominis acikloviras buvo efektyvesnis lyginant su acikloviro kremu [43].
Mokslinių tyrimų duomenys patvirtina etosomų ir transferosomų aktualumą ir svarbą
lokaliam vartojimui. Tiriamajame darbe atliktas šių dalelių stebėjimas ir palyginimas su liposomomis.
24
2. TYRIMO METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – lipidiniai nanonešikliai su diklofenako natrio druska:
• Liposomos
• Transferosomos
• Etosomos
2.2. Tyrimo medžiagos
2.2.1. Reagentai:
Etanolis 96,6 proc. (v/v), Sigma Aldrich®, Milanas, Italija
Diklofenako natrio druska, Galeno®, Potenca, Italija
Cholesterolis, Sigma Aldrich®, Milanas, Italija
Metanolis, Sigma Aldrich®, Milanas, Italija
Polisorbatas 80, Galeno®, Potenca, Italija
Chloroformas, Sigma Aldrich®, Milanas, Italija
Puslaidė membrana SpectraPor, 12-14 kDa pore size, Spectrum Laboratories®, JAV
P90G, Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Vokietija
2.2.2. Įranga:
Spektrofotometras: Lambda 25, Perkin Elmer, JAV
Svarstyklės: KERN Balingen, Vokietija
Rotacinis garintuvas: Buchi, Vokietija
Magnetinė maišyklė: IKA® C – MAG H57, IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija
Ultragarsinis homogenizatorius su įleidžiamu zondu: Soniprep 150, MSE Crowley, JK
Dydžio ir zeta potencialo analizatorius: Zetasizer nano, Malvern Instruments, JK
Vakuuminė pompa: Edwards® 2 Two-Stage High Vacuum Pump E2M2, JK
Ultragarsinė vonelė: Bransonic®, Danbury, JAV
Ekstruderis: LiposoFast, Avestin®, Vokietija
Sūkurinė maišyklė: Velp Scientifica®, Italija
25
2.3. Lipidinių nanonešiklių gamyba
Liposomas, transferosomas ir etosomas galima paruošti naudojant keletą skirtingų metodų
[3,4,7,37]. Šiame tyrime nanonešiklių paruošimui naudotas plono lipidų sluoksnio hidracijos metodas.
Šis metodas dažnai naudojamas ir lengvai taikomas laboratorinėmis sąlygomis, tačiau suformuotos
dalelės būna daugiasluoksnės (MLV), skirtingo dydžio ir formos [4].
7 pav. Lipidinių nanonešiklių paruošimo schema: 1,2 – lipidų sluoksnio paruošimas; 3 – lipidų sluoksnio hidracija; 4 – nanonešiklių dalelių dydžio sumažinimas; [44]
Lipidinių nanonešiklių gamybos schema pateikta 7 paveiksle.
Lipidų sluoksnio paruošimas (1 stadija, 7 pav.). Lipidų sluoksnis ruošiamas apvaliadugnėje
25 ml talpos kolboje. Fosfolipidų dvisluoksniui sudaryti naudojamas fosfatidilcholinas (P90G). Kiti
gamyboje naudoti reagentai pateikti 1 lentelėje. Gaminant liposomas ir transferosomas P90G tirpintas
etanolyje, o ruošiant etosomos P90G tirpinimui naudotas chloroformas, nes cholesterolis netirpus
etanolyje. Naudojant automatines pipetes į apvaliadugnę kolbą dozuojamos reikiamos medžiagos (1
lentelė), po to tiksliai atsveriama, suberiama ir ištirpinama diklofenako natrio druska (DND).
Tirpiklio pašalinimas ir sluoksnio sudarymas (2 stadija, 7 pav.). Po lipidų sluoksnio paruošimo
kolba prijungiama prie rotacinio garintuvo (BUCHI, Switzerland) ir įmerkiama į vandens vonią (50°C
temperatūra). Mažinant slėgį garinamas tirpiklis iki lipidų sluoksnio susiformavimo indo apačioje.
1
4
3 2
26
Tuomet kolba atjungiama nuo rotacinio garintuvo. Siekiant pašalinti visus tirpiklio pėdsakus, kolba
prijungiama prie vakuuminės pompos ir paliekama 5 valandoms.
1 lentelė. Lipidinių nanonešiklių komponentų kiekiai pagal nanonešiklio tipą
Nanonešiklio
tipas Kodas
Medžiagos
P90G Diklofenakas Tween 80 Cholesterolis
Liposomos L1
425 mg
100 mg - -
L2 50 mg - -
Transferosomos T1 100 mg 78 mg -
T2 50 mg 78 mg -
Etosomos E1 100 mg - 30mg
E2 50 mg - 30 mg
Lipidų sluoksnio hidracija (3 stadija 7 pav.). Lipidų sluoksniui hidratuoti naudoti tirpalai
priklausomai nuo nanonešiklio tipo (2 lentelė). Supylus atitinkamus tirpalus hidracijai, kolba įstatoma į
rotacinį garintuvą ir įmerkiama į 50 °C temperatūros vandens vonią 30 min. Gauta suspensija
paliekama 1 valandai stabilizuotis.
2 lentelė. Lipidinių nanonešiklių lipidų sluoksniui hidratuoti naudoti tirpalai
Nanonešiklis Medžiagos
Liposomos 10 ml H2O
Transferosomos 10 ml C2H5OH (7%)
Etosomos 10 ml C2H5OH (30%)
Nanonešiklių dalelių dydžio sumažinimas (4 stadija 7 pav.). Po lipidų sluoksnio hidracijos,
pagamintos lipidinių nanonešiklių dalelės yra didelės (500nm<), heterogeniškos (PDI<400) ir
daugiasluoksnės (MLV). Norint suvienodinti ir sumažinti dalelių dydį suspensijoje naudojamas vienas
27
iš homogenizacijos metodų. Bandymai atlikti su liposominiais nanonešikliais naudojant ultragarsinę
vonelę, ultragarsinį homogenizatorių su įleidžiamu zondu ir ekstruderį. Pagal gautus rezultatus,
tolimesnėje darbo eigoje naudotas tik tinkamiausias metodas. Po hidracijos praėjus 1 valandai, 10 ml
suspensijos su nanonešikliais homogenizuota trimis skirtingais metodais. Bandymai kartoti 3 kartus,
rezultatuose pateikiamas jų vidurkis.
2.3.1. Nanonešiklių homogenizavimas
a) Homogenizavimas ultragarsinėje vonelėje. Sūkurine maišykle suplaktos liposomos
supilamos į stiklinius buteliukus po 5 ml. Veikiamos ultragarsu 3 kartus po 20 min naudojant
ultragarsinę vonelę (Bransonic®, JAV). Tarp intervalų veikimo ultragarsu daromos 10 minučių
pertraukos.
b) Homogenizavimas ekstruderiu. Pagal įrenginio gamintojų pateiktą schemą paruošiamas
ekstruderis (LiposoFast, Avestin® - http://www.avestin.com/English/lf.html), naudojama 200 nm porų
membrana. Vienas iš švirkštų pripildomas liposomų suspensija. Po to atliekama 11 paspaudimų į abi
puses. Po paskutinio paspaudimo liposomų suspensija perpilama į stiklinį buteliuką.
c) Homogenizavimas ultragarsu su įleidžiamu zondu. Sūkuriniu maišytuvu suplaktos
liposominių nanonešiklių suspensijos padalinamos į dvi vienodas dalis ir supilamos į stiklinius
buteliukus. Stiklinis buteliukas laikomas ledo vonelėje, į jį įleidžiamas zondas. Pirmoji dalis veikiama
ultragarsu 5 ciklais 3 s įjungiant ir 2 s išjungiant. Ciklai kartojami 8 kartus, tarp intervalų 1 minutės
pertrauka (ciklinis metodas). Kita suspensijos dalis paruošiama taip pat kaip ir pirmoji, tačiau
homogenizuojama tik 1 kartą 20 s (neciklinis metodas). Skirtingų homogenizacijos metodų
palyginimui naudoti tik necikliniu režimu gauti nanonešikliai.
2.4. Analitiniai metodai
2.4.1. Lipidinių nanonešiklių vidutinio dalelių dydžio ir PDI nustatymas
Pagamintų nanodarinių hidrodinaminis radiusas ir polidispersiškumas nustatytas dinaminės
šviesos sklaidos metodu. Tyrimui naudotas Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments, UK)
analizatorius. Praskiestų distiliuotu vandeniu lipidinių nanonešiklių suspensijų VDD ir
polidispersiškumas matuojamas 173° kampu, 25 °C temperatūroje.
28
2.4.2. Lipidinių nanonešiklių zeta potencialo nustatymas
Lipidinių nanonešiklių zeta potencialas nustatytas lazerinės Doplerio elektroforezės metodu.
Tyrimui naudotas Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments, UK) analizatorius. Praskiestų distiliuotu
vandeniu lipidinių nanonešiklių suspensijų zeta potencialas matuojamas 12° kampu, 25 °C
temperatūroje. Naudojamos vienkartinės kapiliarinės kiuvetės (9 pav.).
8 pav. Kiuvetė naudojama nustatant zeta potencialą (http://departments.agri.huji.ac.il/zabam/zetasizer.html)
2.4.3. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimas
Skirtingų lipidinių nanonešiklių formuluočių stabilumas nustatytas stebint polidispersiškumo
indekso (PDI) ir vidutinio dalelių dydžių pasikeitimus. Mėginiai analizuoti praėjus skirtingiems laiko
intervalams nuo pagaminimo: 1 valandai, 1 dienai, 2 dienoms, 1 savaitei, 2 savaitėms ir 4 savaitėms.
Viso tyrimo metu nanonešikliai laikyti uždaruose stikliniuose buteliukuose, kambario temperatūroje.
PDI ir vidutinio dalelių dydžio nustatymo metodika aprašyta skirsnyje 2.3.1.
2.4.4. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumo nustatymas
Lipidiniai nanonešikliai atskirti nuo laisvos diklofenako natrio druskos dializės metodu. Iš
kiekvienos skirtingos suspensijos paimami 2 ml mėginio ir įterpiami į membranos vidų. Akceptorinė
terpė – 1 l vandens, kuris pakeistas nuo dializės pradžios praėjus 1 valandai. Membranos su mėginiais
patalpinamos vandens vonelėse ir uždedamos ant magnetinės maišyklės. Tyrimas atliekamas kambario
29
temperatūroje. Praėjus 2 valandoms nuo tyrimo pradžios, mėginiai iš membranų perkeliami į tuščius
buteliukus su kamščiais.
Diklofenako kiekis suspensijose nustatytas prieš ir po dializės. Į kiuvetę pilama 10 µl mėginio
ir 3990µl metanolio. Metanolis pasirinktas kaip tirpiklis tam, kad visas diklofenako kiekis išsiskirtų iš
lipidinių nanonešiklių. Spektrofotometru matuojama absorbcija 280 nm bangos ilgyje. Lyginamasis
tirpalas – metanolis. Gauti rezultatai lyginami pagal diklofenako natrio druskos kalibracinę kreivę (10
pav.). Kalibracinis diklofenako natrio druskos grafikas sudaryas iš 6 skirtingų tirpalo koncentracijų.
Gauti duomenys įvertinti pagal diklofenako natrio druskos kalibracinio grafiko tiesinės
regresijos lygtį y =38,911x + 0,0078; R2 = 0,99887.
9 pav. Diklofenako natrio druskos kalibracinis grafikas
Procentinis inkorporavimo efektyvumas (IE proc.) apskaičiuotas pagal lygtį:
Inkorporavimo efektyvumas = konc. A x 100 / konc. B - 10 µl mėginio iki dializės + 3990 µl MeOH (B)
- 10 µl mėginio po dializės + 3990 µl MeOH (A)
2.4.5. Statistinė analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) ir ,,SPPS
20.00“ (IBM, JAV) programas. Apskaičiuotas tyrimų duomenų matematinis vidurkis ir santykinis
standartinis nuokrypis. Duomenų statistinis patikimumas įvertintas Vilkoksono priklausomų imčių
testu.
30
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Lipidinių nanonešiklių homogenizavimo metodo parinkimo analizė
Nanodalelių homogenizacija buvo taikoma mažesnėms nei 200 nm vezikulėms gauti, kurių
PDI <0,3. Atlikti 3 skirtingi homogenizacijos metodai, rezultatai pateikiami 10 pav.
10 pav. Lipidinių nanonešiklių homogenizavimo parinkimo rezultatai (VDD – vidutinis dalelių dydis, PDI – Polidispersiškumo indeksas)
Rezultatai parodė, kad ultragarsinės vonelės naudojimas nėra tinkamas homogenizavimui, nes
gautų nanodalelių dydis buvo didesnis nei 200 nm. Ekstruderio metodo rezultatai atitiko keliamus
reikalavimus, tačiau metodas atmestas, nes reikalauja daugiau laiko, lyginant su kitais metodais. Šis
metodas nepakankamai sandarus, todėl prarandama dalis tiriamųjų nanonešiklių dispersijų. Iš 10 pav.
diagramos matyti, kad naudojant ultragarsinį homogenizatorių su įleidžiamu zondu gaunami rezultatai
atitinka keliamus tikslus, todėl likusiame tyrime taikytas tik šis metodas.
Tikslesniam homogenizacijos, naudojant ultragarsinį homogenizatorių su įleidžiamu zondu,
įtakos nanonešiklių parametrams įvertinimui, metodas taikytas 2 skirtingais režimais (S1 – ciklinis
režimas, S2 – neciklinis režimas). Formuluočių kodai pateikiami 3 lentelėje.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Ult. vonelė Ult. Zondas Ekstruderis
Polid
ispe
rsiš
kum
o in
deks
as
Dal
elių
dyd
is, n
m
Homogenizavimo metodas
VDD
PDI
31
3 lentelė. Formuluočių kodų paaiškinimai
Nanonešiklio tipas Kodas Natrio diklofenako
druskos koncentracija Homogenizavimo
režimas
Liposomos
L1S1 1%
Neciklinis L1S2 Ciklinis L2S1
0,5% Neciklinis
L2S2 Ciklinis
Transferosomos
T1S1 1%
Neciklinis T1S2 Ciklinis T2S1
0,5% Neciklinis
T2S2 Ciklinis
Etosomos
E1S1 1%
Neciklinis E1S2 Ciklinis E2S1
0,5% Neciklinis
E2S2 Ciklinis
3.2. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumo tyrimo rezultatai
Atlikus spektrofotometrinę analizę, buvo nustatytas lipidiniuose nanonešikliuose
inkorporuotos diklofenako natrio druskos kiekis. 11 pav. pateikiamos procentinės inkorporavimo
efektyvumo (IE) reikšmės. Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 3 lentelėje.
11 pav. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo tyrimo rezultatai
32
Didžiausias IE nustatytas liposomose, jų inkorporavimo geba buvo 13,1 proc. ir 33,75 proc.
didesnė negu atitinkamai transferosomų ir etosomų. Palyginus skirtingų formuluočių IE, nustatyta, kad
ciklais homogenizuotų dalelių inkorporavimo geba buvo didesnė nei nanodalelių, homogenizuotų
necikliniu režimu, išskyrus L2S1 ir L2S2 atvejus. Vertinant transferosomų inkorporavimo rezultatus,
didžiausia geba išsiskyrė T1S2 formuluotė, tarp etosominių nanonešiklių – E2S2. Gauti rezultatai
parodė, kad 1 ar 0,5 proc. diklofenako natrio kiekis, inkorporuotas į nanodalelių vidų, neturėjo įtakos
jų procentiniam IE.
Saeed Ghanbarzadeh ir Sanam Arami atlikti tyrimai parodė kitokius inkorporavimo rezultatus.
Natrio diklofenakas buvo inkorporuotas į liposomas, transferosomas ir etosomas. Didžiausias IE
nustatytas etosominiuose nanonešikliuose 51,72 proc. Tyrimo rezultatų skirtumus galėjo sąlygoti
skirtinga gamybos metodika ir nanodalelių homogenizacija ekstruderiu [45].
3.3. Lipidinių nanodalelių dydžio nustatymo rezultatai
Pagaminti lipidiniai nanonešikliai buvo tiriami dinaminiu šviesos sklaidos metodu. 12 pav. ir
13 pav. pateikiami matavimų rezultatai gauti po nanonešiklių homogenizacijos praėjus 1 dienai.
Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 3 lentelėje.
12 pav. Lipidinių nanonešiklių dalelių dydžio nustatymo rezultatai po homogenizavimo
33
Iš matavimo rezultatų pastebima, kad didžiausio diametro dalelės gautos liposominėse
suspensijose, kurios homogenizuotos necikliniu režimu (L1S1 ir L2S1). Vertinant homogenizavimo
režimo įtaką nanodalelių dydžiui, rezultatai parodė, kad cikliniu režimu paveiktos dalelės buvo
mažesnės už necikliniu režimu paveiktas daleles: liposomose skirtumas buvo 38,7 proc., atitinkamai
transferosomose - 40,1 proc. ir etosomose - 12,8 proc.. Mažiausi dalelių dydžiai (<50 nm) nustatyti
etosominių nanonešiklių Rezultatai parodė, kad inkorporuotos diklofenako natrio druskos kiekis
neturėjo įtakos dalelių dydžiui ir svarbiausias faktorius buvo homogenizavimo režimas.
Norint tiksliau įvertinti nanodalelių dydžio matavimų rezultatus, būtina atsižvelgti į jų
polidispersiškumą. Polidispersiškumas – tai nevienodų matmenų dalelių buvimas sistemoje. PDI
reikšmės gali būti nuo 0 iki 1. Remiantis moksline literatūra, nanodalelės, kurių PDI reikšmės yra nuo
0,1 iki 0,25, pasižymi vienodumu ir didesniu stabilumu [46]. Didesnės nei 0,25 PDI reikšmės nurodo
dispersijos heterogeniškumą ir mažesnį stabilumą. 13 pav. pateikiamos PDI reikšmės, gautos atlikus
matavimus dinaminės šviesos sklaidos metodu.
13 pav. Lipidinių nanonešiklų polidispersiškumo nustatymo rezultatai po homogenizavimo 13 pav. pateiktoje diagramoje matyti, kad visų lipidinių nanonešiklių formuluočių vidutinės
PDI reikšmės yra iki 0,25. Tai rodo, kad gautos sistemos yra sąlyginai homogeniškos. Mažiausias
polidispersiškumas nustatytas etosominiuose nešikliuose (<0,126).
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
Polid
ispe
rsiš
kum
o in
deks
as
Skirtingos nanonešiklių formuluotės
L1S1 L1S2 L2S1 L2S2 T1S1 T1S2 T2S1 T2S2 E1S1 E1S2 E2S1 E2S2
34
3.4. Lipidinių nanonešiklių stabilumo, nustatant nanodalelių zeta potencialą, tyrimo rezultatai
Praėjus 1 dienai po lipidinių nanonešiklių homogenizavimo, buvo atliktas jų zeta potencialo
nustatymo tyrimas. 14 pav. pateikiami eksperimentinių lipidinių nanonešiklių zeta potencialo
matavimų rezultatai. Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 3 lentelėje.
Gauti rezultatai rodo, kad visų skirtingų formuluočių zeta potencialas yra mažesnis nei - 44,5
mV. Remiantis moksline literatūra, jei nanodalelių zeta potencialas yra <-30 mV arba >30mV, tokie
nanonešikliai yra laikomi stabiliais [4,29,30]. Lyginant zeta potencialo matavimų rezultatus su VDD ir
inkorporavimo efektyvumo rezultatais pastebėta, kad dydžiai tarpusavyje nekoreliuoja. Ultragarsinio
dalelių homogenizavimo su įleidžiamu zondu režimo įtaka zeta potencialui taip pat nenustatyta.
Serbijos ir Slovėnijos mokslininkai (2013) atliko tyrimą, kuriame liposomų fosfolipidų
dvisluoksniui sudaryti naudotas fosfolipidas P90G [47]. Jų gauti zeta potencialo matavimo rezultatai
buvo nuo -53,1 iki -43,7 mV. Kitame tyrime, kuriame liposomų gamybai naudotas P90G, rezultatuose
pateiktos zeta potencialo reikšmės buvo mažesnės nei -30 mV [48]. Šių tyrimų rezultatai patvirtina
fosfolipido P90G įtaką lipidinių nanonešiklių paviršiaus krūviui ir tinkamumą, siekiant gauti stabilias
nanodaleles.
14 pav. Lipidinių nanonešiklių zeta potencialo nustatymo rezultatai
35
3.5. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai
Lipidinių nanonešiklių stabilumas buvo įvertintas laiko atžvilgiu: nuo homogenizavimo iki 28
dienų laikotarpio. Stebėtas nanodalelių dydis (sudėtys pateiktos 3 lentelėje) ir polidispersiškumas.
Liposomų rezultatai pateikiami 15, 16 pav., transferosomų 17,18 pav., etosomų 19,20 pav.
15 pav. Liposominių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai
16 pav. Liposominių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai (PDI)
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
1h 1d 2d 7d 14d 28d
Polid
ispe
rsiš
kum
o in
deks
as
Laiko intervalai
L1S1 L1S2 L2S1 L2S2
36
Liposomų dalelių dydis stabilumo tyrimo metu pasiskirstė nuo 53 iki 93 nm, PDI – 0,2-0,25
intervale. Statistinė tyrimų rezultatų analizė parodė, kad nėra statistiškai reikšmingo skirtumo (p>0,05)
tarp nanonešiklių dalelių dydžio tirtame laiko intervale.
17 pav. Transferosomų stabilumo tyrimo rezultatai
18 pav. Transferosomų stabilumo tyrimo rezultatai (PDI) Transferosomų dydis stabilumo tyrimo metu pasiskirstė nuo 43,37 iki 87,3 nm, PDI – 0,07-
0,25 intervale. Statistinė tyrimų rezultatų analizė parodė, kad yra statistiškai reikšmingas skirtumas
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
1h 1d 2d 7d 14d 28d
Polid
ispe
rsiš
kum
o in
deks
as
Laiko intervalai
T1S1 T1S2 T2S1 T2S2
37
tarp nanonešiklių dalelių dydžio tirtame laiko intervale. T1S1 formuluotės dalelių dydis per 28 dienų
laikotarpį padidėjo 11 proc., atitinkamai T1S2 – 45 proc., T2S1 – 10 proc. ir T2S2 – 30 proc., PDI
sumažėjo T1S1 – 55 proc. , T1S2 – 59 proc., T2S1 – 9 proc., T2S2 – 3 proc. Tyrimo rezultatai rodo,
kad mažiausiu stabilumu pasižymėjo T1S2 ir T2S2 formuluotės, tačiau T2S1 nanonešiklių dispersija
dėl mažos PDI reikšmės tapo labiau homogeniška. Statistiškai reikšmingi nanodalelių pokyčiai,
išskyrus T1S1, atsirado praėjus skirtingiems laiko intervalams: T1S1 – 14d; T1S2 – 7d.; T2S2 – 7d.
19 pav. Etosominių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai
38
20 pav. Etosominių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai (PDI)
Etosomų dydis stabilumo tyrimo metu pasiskirstė nuo 22,58 iki 113,14 nm, PDI - 0,08 – 0,2
intervale. Statistinė tyrimo rezultatų analizė parodė, kad yra statistiškai reikšmingi skirtumai tarp
nanonešiklių dalelių dydžio tirtame laiko intervale. E1S1 formuluotės dalelių dydis po 28 dienų
padidėjo 71 proc., atitinkamai E1S2 – 76 proc., E2S1 – 57 proc. ir E2S2 – 75 proc., PDI sumažėjo
E1S1 47 proc., E1S2 – proc., E2S1 – 42 proc., E2S2 – 44 proc. Tyrimo rezultatai rodo, kad nestabilios
buvo visos etosominės formuluotės. Didžiausias etosominių nanonešiklių dalelių pokytis užfiksuotas
tarp 14 ir 28 dienų intervalo. Svarbus faktas – tai, kad etosominių nanonešiklių PDI liko sąlyginai labai
mažas t.y. dispersinių sistemų dalelių dydis kito panašiu greičiu.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
1h 1d 2d 7d 14d 28d
Polid
ispe
rsiš
kum
o in
deks
as
Laiko intervalai
E1S1 E1S2 E2S1 E2S2
39
4. IŠVADOS
1. Tyrimo rezultatai patvirtina, kad pasirinktas lipidinių nanonešiklių gamybos metodas yra
tinkamas liposomų, transferosomų ir etosomų gamybai su inkorporuota diklofenako natrio druska.
2. Patvirtintas ultragarso tinkamumas homogenizuoti lipidines nanodaleles. Nustatyta, kad
ciklinis ultragarsinio homogenizavimo metodo režimas yra tinkamesnis, nes pagaminamos mažesnio
vidutinio dydžio dalelės.
3. Pritaikyta technologija pagamintos liposomos su diklofenako natrio druska yra
stabilesnės nei transferosomos ar etosomos po 1 mėn. laikymo, nes nustatyti mažiausi dalelių pokyčiai.
4. Visi suformuluoti lipidiniai nanonešikliai inkorporavo nemažiau kaip 34 proc. natrio
diklofenako. Didžiausios diklofenako natrio druskos inkorporavimo efektyvumas nustatytas cikliniu
režimu homogenizuotose liposomose, lyginant su transferosomomis, etosomomis.
40
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Rekomenduojama tęsti tyrimus su diklofenako natrio druska, atliekant vaistinės medžiagos
atpalaidavimo iš nanonešiklio eksperimentus ir skvarbos pro odą tyrimus. Toliau vystant tyrimus
svarbu optimizuoti transferosomų ir etosomų sudėtis, siekiant pagerinti jų inkorporavimo efektyvumą.
Šiame darbe gautų transferosomų ir etosomų savybių pagerinimui, aktualu atlikti tyrimus su skirtingais
gamyboje naudotų medžiagų santykiais.
41
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Sinico C, Fadda AM. Vesicular carriers for dermal drug delivery. Expert opinion on
drug delivery. 2009;6:813–25.
2. Rattanapak T, Young K, Rades T, Hook S. Comparative study of liposomes,
transfersomes, ethosomes and cubosomes for transcutaneous immunisation: Characterisation and in
vitro skin penetration. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2012;64:1560–9.
3. Storm G, Crommelin DJ. Liposomes: quo vadis? Pharmaceutical Science &
Technology Today [Internet]. 1998;1:19–31. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1461534798000078
4. Laouini a., Jaafar-Maalej C, Limayem-Blouza I, Sfar S, Charcosset C, Fessi H.
Preparation, Characterization and Applications of Liposomes: State of the Art. Journal of Colloid
Science and Biotechnology [Internet]. 2012 [cited 2014 Apr 29];1:147–68. Available from:
http://openurl.ingenta.com/content/xref?genre=article&issn=2164-
9634&volume=1&issue=2&spage=147
5. Vanniasinghe AS, Bender V, Manolios N. The potential of liposomal drug delivery for
the treatment of inflammatory arthritis. Seminars in arthritis and rheumatism [Internet]. Elsevier Inc.;
2009 [cited 2014 May 4];39:182–96. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18926560
6. Attama AA, Momoh MA, Builders PF. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems :
A Revolution in Dosage Form Design and Development [Internet]. 2012 [cited 2015 Mar 12].
Available from: http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/40253.pdf
7. Benson H a E. Transfersomes for transdermal drug delivery. Expert opinion on drug
delivery. 2006;3:727–37.
8. Elsayed MM a, Abdallah OY, Naggar VF, Khalafallah NM. Deformable liposomes and
ethosomes as carriers for skin delivery of ketotifen. Pharmazie. 2007;62:133–7.
9. Madni A, Sarfraz M. Liposomal Drug Delivery: A Versatile Platform for Challenging
Clinical Applications. Pharmacy and Pharmaceutical Sciences [Internet]. 2014 [cited 2015 Mar
12];17:401–26. Available from: http://ejournals.library.ualberta.ca/index.php/JPPS/article/view/20528
10. Dua J., Rana A., Bhandari A. Liposomes : methods of preparation and applications.
International Journal of Pharmaceutical Studies and Research. 2012;
11. Briedis V, Drakšienė G, Bernatonienė J, Savickas A, Kasparavičienė G, Klimas R.
Parenteraliniai preaparatai ir jų technologija. Kaunas; 291 p.
42
12. Yan X, Scherphof GL, Kamps J. Liposome opsonization. Journal of liposome research.
2005;15:109–39.
13. Immordino ML, Dosio F, Cattel L. Stealth liposomes: Review of the basic science,
rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine.
2006;1:297–315.
14. Blau IW, Fauser AA. Review of comparative studies between conventional and
liposomal amphotericin B (Ambisome) in neutropenic patients with fever of unknown origin and
patients with systemic mycosis. Mycoses. 2000;43:325–32.
15. Betz G, Aeppli A, Menshutina N, Leuenberger H. In vivo comparison of various
liposome formulations for cosmetic application. International journal of pharmaceutics [Internet]. 2005
[cited 2015 May 5];296:44–54. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037851730500147X
16. Korting HC, Zienicke H, Schafer-Korting M, Braun-Falco O. Liposome encapsulation
improves efficacy of betamethasone dipropionate in atopic eczema but not in psoriasis vulgaris.
European journal of clinical pharmacology. 1990;39:349–51.
17. Wohlrab W, Lasch J, Taube KM, Wozniak KD. Skin permeation of liposomal
incorporated hydrocortisone. Die Pharmazie. 1989;44:333–5.
18. Thielitz A, Gollnick H. Topical retinoids in acne vulgaris: update on efficacy and safety.
American journal of clinical dermatology. 2008;9:369–81.
19. Schafer-Korting M, Korting HC, Ponce-Poschl E. Liposomal tretinoin for
uncomplicated acne vulgaris. The Clinical investigator. 1994;72:1086–91.
20. Gesztes A, Mezei M. Topical anesthesia of the skin by liposome-encapsulated
tetracaine. Anesthesia and analgesia. 1988;67:1079–81.
21. Akbarzadeh A, Rezaei-Sadabady R, Davaran S, Joo SW, Zarghami N, Hanifehpour Y,
et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters [Internet].
Nanoscale Research Letters; 2013;8:1. Available from: Nanoscale Research Letters
22. Moghimi SM, Hunter a. C, Andresen TL. Factors Controlling Nanoparticle
Pharmacokinetics: An Integrated Analysis and Perspective. Annual Review of Pharmacology and
Toxicology [Internet]. 2012;52:481–503. Available from:
http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-pharmtox-010611-134623
23. Li J, Wang X, Zhang T, Wang C, Huang Z. ScienceDirect A review on phospholipids
and their main applications in drug delivery systems. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences
[Internet]. Elsevier Ltd; 2015;10:81–98. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ajps.2014.09.004
24. Šačkus A, Martynaitis V, Degutytė R. Medicininė chemija. Vilnius; 2008. 126 p.
43
25. Lee S-C, Lee K, Kim J, Lim S. The effect of cholesterol in the liposome bilayer on the
stabilization of incorporated Retinol. Journal of liposome research. 2005;15:157–66.
26. Edwards K a, Baeumner AJ. Analysis of liposomes. Talanta [Internet]. 2006 [cited
2014 May 4];68:1432–41. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18970482
27. Makuška R. Polimerų tyrimo metodai. Kaunas; 2012. 307 p.
28. Xu C, Cai X, Zhang J, Liu L. Fast nanoparticle sizing by image dynamic light scattering.
Particuology [Internet]. Chinese Society of Particuology; 2014;2–5. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.partic.2014.04.014
29. Honary S, Zahir F. Effect of zeta potential on the properties of nano-drug delivery
systems - A review (Part 1). Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 2013;12:255–64.
30. Malvern. Zeta potential: An Introduction in 30 minutes. Zetasizer Nano Serles
Technical Note MRK654-01 [Internet]. 2011;2:1–6. Available from:
http://scholar.google.com/scholar?hl=en&btnG=Search&q=intitle:Zeta+Potential+An+Introduction+in
+30+Minutes#0
31. Rajan R, Biju Mukund V, Jose S, Vasudevan D. Transferosomes - A vesicular
transdermal delivery system for enhanced drug permeation. Journal of Advanced Pharmaceutical
Technology & Research. 2011;2:138.
32. Ravi K, Singh M, Rana a C. Transferosomes : a Novel Approach for Transdermal Drug
Delivery. International Research Journal of Pharmacy. 2012;3:20–4.
33. Schätzlein a., Cevc G. Non-uniform cellular packing of the stratum corneum and
permeability barrier function of intact skin: A high-resolution confocal laser scanning microscopy
study using highly deformable vesicles (Transfersomes). British Journal of Dermatology.
1998;138:583–92.
34. Cevc G, Blume G. Lipid vesicles penetrate into intact skin owing to the transdermal
osmotic gradients and hydration force. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes
[Internet]. 1992;1104:226–32. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/000527369290154E
35. Cevc G. Transfersomes, liposomes and other lipid suspensions on the skin: permeation
enhancement, vesicle penetration, and transdermal drug delivery. Critical reviews in therapeutic drug
carrier systems. 1996;13:257–388.
36. El Maghraby GM, Williams a C, Barry BW. Skin delivery of 5-fluorouracil from
ultradeformable and standard liposomes in-vitro. The Journal of pharmacy and pharmacology.
2001;53:1069–77.
44
37. Akiladevi D, Basak S. Ethosomes - a noninvasive approach for transdermal drug
delivery. International Journal of Current Pharmaceutical Research [Internet]. 2010 [cited 2015 Feb
18];2:2–5. Available from: http://www.ijcpr.org/Issues/Vol2Issue4/228.pdf
38. Touitou E, Godin B, Weiss C. Enhanced delivery of drugs into and across the skin by
ethosomal carriers. Drug Development Research [Internet]. 2000;50:406–15. Available from:
http://dx.doi.org/10.1002/1098-2299(200007/08)50:3/4<406::AID-DDR23>3.0.CO;2-M
39. Rakesh R, Anoop KR. Ethosomes for transdermal and topical drug delivery.
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2012. p. 17–24.
40. Bendas ER, Tadros MI. Enhanced transdermal delivery of salbutamol sulfate via
ethosomes. AAPS PharmSciTech. 2007;8:E107.
41. Verma P, Pathak K. Therapeutic and cosmeceutical potential of ethosomes: An
overview YR - 2010/7/1. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research. 2010;1:274–
82.
42. Maurya SD. Enhanced trandermal permeation of indinavir sulfate through stratum
corneum via. Novel permeation enhancers: Ethosome. Der pharmacia lettre [Internet]. 2010;2:208–20.
Available from: http://scholarsresearchlibrary.com/ABR-vol1-iss2/ABR-2010-1-2-87-90.pdf
43. Horwitz E, Pisanty S, Czerninski R, Helser M, Eliav E, Touitou E. A clinical evaluation
of a novel liposomal carrier for acyclovir in the topical treatment of recurrent herpes labialis. Oral
surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 1999;87:700–5.
44. Lopes SC de A, Giuberti C dos S, Rocha TGR, Ferreira D dos S, Leite EA, Oliveira
MC. Liposomes as Carriers of Anticancer Drugs. Cancer Treatment - Conventional and Innovative
Approaches. 2013.
45. Ghanbarzadeh S, Arami S. Enhanced transdermal delivery of diclofenac sodium via
conventional liposomes, ethosomes, and transfersomes. BioMed Research International. 2013;2013.
46. Sabeti B, Noordin MI, Mohd S, Hashim R, Dahlan A, Akbari Javar H. Development
and characterization of liposomal Doxorubicin hydrochloride with palm oil. BioMed research
international [Internet]. 2014;2014:765426. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3985191&tool=pmcentrez&rendertype=ab
stract
47. Isailović BD, Kostić IT, Zvonar A, Dordević VB, Gašperlin M, Nedović V a., et al.
Resveratrol loaded liposomes produced by different techniques. Innovative Food Science and
Emerging Technologies. 2013;19:181–9.
48. Gupta AS, Kshirsagar SJ, Bhalekar MR, Saldanha T. Design and development of
liposomes for colon targeted drug delivery. Journal of drug targeting [Internet]. 2013;21:146–60.
Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23373543
45
7. PRIEDAI
1 priedas. Šiaučiūnas A. Lipidinių nanonešiklių su diklofenako natrio druska
formulavimas ir stabilumo vertinimas. 67 - oji kasmetinė JAUNŲJŲ MOKSLININKŲ IR TYRĖJŲ
KONFERENCIJA. Gegužės 27 - 29 d., 2015. Kaunas, Lietuva.