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CÁTEDRA: BIOQUÍMICA Carreras: Farmacia Profesorado en Química Licenciatura en Química Licenciatura en Alimentos

ESTRUCTURA DE LÍPIDOS Y MEMBRANAS BIOLÓGICAS

ESTRUCTURA DE LÍPIDOS 1- Una mezcla de 1-palmitoil-2-estearoil-3-lauroil-glicerina y de ácido fosfatídico en benceno se agita con un volumen igual de agua. Después de dejar que se separen las dos fases, cuál será el lípido que se halle en mayor concentración en la fase acuosa y por qué? 2- Se tiene una muestra de un triacilglicérido puro que por hidrólisis ácida rinde: glicerina, ácido esteárico y ácido palmitoleico en una relación molar 1:1:2. El análisis polarimétrico de la muestra indica que el triacilglicérido no posee actividad óptica. Escriba en fórmulas el triacilglicérido de la muestra. 3- Se tiene una muestra de un fosfolípido puro que por hidrólisis ácida rinde cantidades equimolares de: glicerina, ácido esteárico, ácido palmitoleico, ácido fosfórico y serina. Escriba en fórmulas el fosfolípido. 4- El índice de saponificación de una muestra de mantequilla es 230. Calcular el PM medio de los triacilglicéridos presentes. 5- Una muestra (5 g) de los triacilglicéridos extraídos de un aguacate necesitó 34 ml de KOH 0,5 N para su hidrólisis completa y la conversión en jabones de sus ácidos grasos. Calcule la longitud media de la cadena de los ácidos grasos de la muestra. 6- El índice de iodo de una muestra de mantequilla es 68. Si el índice de saponificación de la muestra es 210 ¿Cuántos dobles enlaces, como promedio, hay en las moléculas que la constituyen? 7- Se practicó una electroforesis a pH 7 de una mezcla de lípidos que contenía cardiolipina, fosfatidilglicerina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. Indique cómo se desplazarán estos compuestos ¿Hacia el ánodo, el cátodo o permanecerán en el origen? 8- ¿Cuántos mililitros de NaOH 0,1 M y 10 M se necesitarán para hidrolizar completamente 13,8 g de fosfatidiletanolamina? PM fosfatidiletanolamina: 689. 9- La cardiolipina (PM=1350), también llamada difosfatidilglicerol, está presente en gran cantidad en la membrana interna de las mitocondrias. a) Calcular cuantos ml de NaOH 0,5 M se consumirán para hidrolizar 1 g de cardiolipina. b) Si se sometiera una muestra de cardiolipina a un tratamiento con base fuerte seguido de ácido fuerte, ¿cuál sería la relación entre glicerol, ácido fosfórico, ácidos grasos? 10- Una muestra de ácido fosfatídico esterificado con colina es sometido a 2 tratamientos: a) Una parte de la misma es procesada con fosfolipasa A1 liberándose

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ácido palmítico. b) En una segunda fracción de la muestra se determina el índice de iodo que resultó ser igual a 74. El PM del compuesto en cuestión es 672. Escriba una estructura que satisfaga los datos antes mencionados 11- Un extracto lipídico contiene tres lípidos en cantidades equimoleculares. Se somete una muestra de dicho extracto a cromatografía a pH=14 y se observa que 2/3 de la misma migra y el resto permanece en el origen. A pH=2 sólo 1/3 de lo sembrado migra. El análisis exhaustivo de los componentes del extracto da como resultado la presencia de glicerol, ácido fosfórico, ácidos grasos y componentes nitrogenados en relación molar: 5-3-9-1. ¿Cuales pueden ser los lípidos componentes de este extracto? 12- Para determinar la estructura de un lípido supuestamente homogéneo se somete una muestra del mismo a dos procedimientos: a) En un primer paso se determina g glicerol / g muestra. El resultado es 1/4,89. b) En un segundo paso y sobre otra porción de la muestra se realizan hidrólisis alcalina y ácida. Los productos son sometidos a cromatografía y la posterior identificación da como resultado la presencia de ácido fosfórico-glicerol-ácidos grasos en relación molar 2-3-4. Escribir una estructura que satisfaga los datos anteriores. 13- Por un procedimiento analítico se determinó que 4,45 g de un compuesto lipídico polar contenía 1 g de glicerol y 1,07 g de ácido fosfórico. Por otro análisis se encontró ácido palmítico. ¿Cuál es la estructura molecular de este compuesto? ¿Cuántos ml de NaOH 10 M serán necesarios para hidrolizar completamente 20,45 g del mismo? 14- El análisis de una muestra de un esfingolípido puro brindó la siguiente información: a) La hidrólisis exhaustiva rindió cantidades equimoleculares de ácido oleico, esfingosina, los azúcares D-glucosa y D-galactosa, el aminoazúcar D-glucosamina y el desoxiazúcar L-fucosa. (L-fucosa: 6 desoxi L galactosa). b) Mediante hidrólisis controlada se separó la cabeza polar del lípido. Sobre la fracción glucosídica purificada se realizaron estudios de metilación exhaustiva seguida de hidrólísis, obteniéndose 2,6-di-0-metil-galactosa; 2,4,6-tri-0-metil-glucosa; 2-N,N-dimetil-3,4,6-tri-0-metil-glucosamina y 2,3,4-tri-0-metil-fucosa. Escriba al menos una de las estructuras posibles del glucolípido que corresponda a los datos expuestos. Considere que todos los enlaces glucosídicos son de tipo alfa. RESPUESTAS 1. Va a ser más soluble el compuesto más polar. 4. 730 5. 18 carbonos 6. 2 dobles enlaces 7. ánodo, ánodo, origen, ánodo. 8. 400 mL, 6 mL. 9. 5,92 mL. 3 Glicerol:2Ac fosf.:4Ac grasos 10. C2 del fosfolípido esterificado con un ácido graso de 13 C y 2 dobles enlaces 11. cardiolipina, triglicérido, fosfolípido 12. cardiolipina con ácidos grasos con 16 átomos de carbono en promedio 13. 5 ml.

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MEMBRANAS BIOLÓGICAS. 1-Indique las proteínas que se extraen de la membrana por tratamiento con: a) soluciones salinas b) detergentes c) tripsina sobre la célula intacta d) tripsina sobre preparaciones de membrana

2- a) Dibuje un esquema de una membrana celular, ubicando en la misma las siguientes proteínas: D proteína intrínseca, C proteína extrínseca externa y F proteína extrínseca interna. b) Indique que proteínas serían liberadas de la membrana con cada uno de los siguientes tratamientos: I- Tratamiento de las membranas con detergente. II- Tratamiento de las células con 0,1 M NaCl. III- Tratamiento de las células en condiciones hipotónicas seguida de lavado con NaCl 0,1 M. IV- Tratamiento de las células en condiciones hipotónicas seguida de lavado con detergente. 3- La mayor parte de las membranas de las células normales contienen alrededor del 60% en peso de proteínas, y un 40% en peso de fosfoglicéridos. a) Calcule la densidad media de una membrana, suponiendo que la proteína posee una densidad de 1,33 g/cm3 y el fosfoglicérido una densidad de 0,92 g/cm3 b) Si se centrifuga una muestra del material membranoso en una solución de NaCl con una densidad de 1,05 g/cm3. ¿Sedimentaría o flotaría? 4- Una proteína esférica de membrana de hepatocitos de rata de 150 kDa se marcó con un anticuerpo fluorescente. Por experimentos tipo FRAP y SPT se determinó su movilidad en membranas aisladas. La viscosidad efectiva de esta proteína en la membrana es n=1.2 erg.seg/cm3 y su densidad 1,15 g/cm3. Dado que el coeficiente de difusión de una molécula esférica es D=kT/6¶nr (k: constante de Boltzman 1,38 x l0-l6 erg/grado; T: temperatura absoluta y r: radio de una esfera). Indique: a) ¿Cuál es el coeficiente de difusión a 34°C de la proteína en la membrana del hepatocito? b) ¿Cuál es la distancia (s) atravesada por la proteína en la membrana a dicha temperatura en 1 seg? s=(4Dt)1/2 5- Se quiere estudiar la ubicación de tres proteínas: A, B, C en la membrana plasmática del eritrocito humano. Se obtienen las siguientes evidencias experimentales: a) Se trata con detergente la membrana plasmática del eritrocito y se obtienen las tres proteínas incógnitas, de las cuales C es glicoproteína. b) Se someten fantasmas de eritrocitos al tratamiento con NaCl 1M liberándose la proteína B. c) Se preparan anticuerpos contra A, B y C en forma independiente. Estos se hacen reaccionar con los eritrocitos intactos: sólo se unen a las células los anticuerpos contra B y C (los anticuerpos no son capaces de atravesar la membrana plasmática). d) Al suspender los eritrocitos en una solución salina hipotónica, estos se hinchan y aumentan la permeabilidad de proteínas en ambos sentidos de la membrana. Al hacer reaccionar los eritrocitos en estas condiciones con antiA, antiB y antiC, se observa

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unión de todos ellos a la membrana plasmática. Dibuje las posibles alternativas respecto a la posición de las proteínas A, B y C en la membrana, clasificándolas de acuerdo al modelo del mosaico fluido. 6- Un laboratorio le encarga un liposoma que sirva para transportar por sangre una proteína M con acción medicamentosa. La proteína M es un homodímero de PM 15.000 compuesto por 30% Ser, 20% Lys, 15% Gly, 10% Arg, 10% Phe, 5% Val, 5% Glu, 3% Cys y 2% Tyr. El liposoma debe estar dirigido a células de páncreas. A tal fin diseña un sistema conteniendo: a- una mezcla de esfingo y glicerofosfolípidos en relación molar 1:2 b- una glicoproteína N con alto contenido en Phe y cuya parte glucosidica determina especifidad para unirse a células de páncreas. c- la proteína M. Incuba esta mezcla siguiendo un protocolo adecuado y obtiene, para su satisfacción, liposomas que responden a las expectativas terapeúticas al ser ensayadas en ratas. Haga un esquema de los liposomas indicando la ubicación de cada uno de los componentes de la mezcla. Qué esperaría obtener al tratar los liposomas en las siguientes condiciones: I- Medio isotónico con NaCl 0,15 M. II- Medio con detergentes y 0,15 M NaCl. III- Ruptura hipotónica seguida de un lavado con 0,15 M NaCl. IV- Tratamiento con tolueno. 7- La conductancia de una bicapa lipídica que contiene un carrier para un determinado antibiótico disminuye abruptamente cuando la temperatura desciende de 40°C a 36°C. Cuando la bicapa lipídica contiene un canal para el antibiótico la conductancia varía mínimamente ante el mismo cambio de temperatura. ¿Cómo explica esta observación? 8- El receptor de las proteínas de membrana de la hormona adrenalina en las células animales es una proteína integral de membrana (PM 64.000) que se cree que atraviesa la membrana 7 veces. Si se le diera la secuencia de aminoácidos de esta proteína, ¿cómo se las arreglaría para predecir que regiones de la proteína forman las hélices que abarcan la membrana? 9- Una proteína de membrana desconocida, X, se puede extraer por rotura de membranas de eritrocito en una solución salina concentrada. La X aislada se puede cortar en fragmentos mediante enzimas proteolíticas. Sin embargo, el tratamiento de los eritrocitos primero con enzimas proteolíticas seguido de rotura y extracción de los componentes de la membrana produce una X intacta. Por el contrario el tratamiento de espectros de eritrocitos (que consisten en membranas producidas por rotura de las células y eliminación de la hemoglobina) con enzimas proteolíticas seguida de rotura y extracción produce una X muy fragmentada. ¿Qué indican estos experimentos sobre la localización de X en la membrana plasmática? 10- A pH 7 el triptofano cruza una membrana formada por una bicapa lipídica unas 1000 veces más lentamente que la sustancia estrechamente relacionada indol. Sugiera una explicación para esta observación. 11- En la tabla se muestra la composición porcentual en aminoácidos de tres

NH

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proteínas: A, B y C de similar peso molecular, aisladas de membranas de eritrocitos de carnero. Además se conocen los siguientes datos: a) El tratamiento de los eritrocitos con 0,15 M NaCl en condiciones isotónicas libera

sólo una de las proteínas, la que fue caracterizada como proteína básica (pI= 9,3) b) La ruptura hipotónica de los eritrocitos, seguida de un lavado con 0,15 M NaCl,

resultó en la liberación de dos de las proteínas. c) La liberación de las tres proteínas requirió el tratamiento de las membranas con

detergente. En base a estos datos dibuje un esquema de las membranas de los eritrocitos de carnero ubicando en el mismo las proteínas A, B y C. Clasifique cada proteína de acuerdo a su ubicación en la membrana.

AMINOACIDOS A B C Alanina 5 9 4 Arginina 6 3 15 Aspártico 10 4 7 Cisteína 2 1 3 Fenilalanina 4 17 4 Glicina 4 5 3 Glutámico 12 3 8 Histidina 12 2 8 Leucina e Isoleucina 4 17 3 Lisina 6 2 18 Metionina 3 9 2 Prolina 1 1 2 Serina 13 2 9 Tirosina 6 2 7 Treonina 8 2 5 Triptofano 2 9 1 Valina 2 12 1

12- De un cultivo a 25ºC de la bacteria Anacystis nodum se obtuvieron células de las que se aislaron 6 componentes mayoritarios: 3 lípidos (A, B y C) y 3 proteínas (P, Q y R). Los 3 componentes lipídicos presentaron las siguientes características: a) El lípido A puro rindió luego de la hidrólisis completa, glicerol, ácido esteárico, ácido oleico, ácido fosfórico y treonina en cantidades equimoleculares. b) El lípido B no mostraba actividad óptica y luego de la hidrólisis completa rindió glicerol, ácido esteárico y ácido oleico. c) El lípido C rindió luego de la hidrólisis completa cantidades equimoleculares de esfingosina, ácido esteárico, D-glucosa y D-galactosa. Se determinó que las uniones glucosídicas son de tipo alfa. Los tres componentes proteicos presentaron las siguientes características: a) P es una proteína globular homotetramérica que fue liberada por simple ruptura hipotónica de la célula bacteriana. b) Q es una glicoproteína de estructura dimérica formada por las subunidades alfa y beta, que se caracterizan por poseer un elevado porcentaje de Ala, Val, Phe, Trp y Leu. La liberación de la proteína Q sólo se consiguió luego de un tratamiento con detergentes. Se determinó que la subunidad alfa contenía la porción glucosídica de la proteína.

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c) R es una proteína monomérica con un elevado contenido de Ser, Tyr y Lys. d) Se obtuvieron anticuerpos específicos para P (IgGP), R (igGR) y para cada una de las subunidades Q. Diversos estudios mostraron que el tratamiento de las células bacterianas intactas con NaCl 0,2 M no libera ninguna de las proteínas y que en estas condiciones sólo IgGalfa reacciona con su antígeno. La reacción de IgGbeta, IgGP e IgGR requiere de la ruptura hipotónica previa de las células bacterianas. En base a estos datos, escriba en fórmulas los lípidos A, B y C y haga un esquema de la célula bacteriana ubicando los componentes lipídicos y proteicos. ¿Qué cambios esperaría encontrar en los componentes si creciera la bacteria a 37ºC? Justifique su respuesta. 13- Se realizó un estudio con células adiposas de oso pardo, obteniéndose los siguientes resultados: a) Se identificaron 6 componentes mayoritarios en estas células, 4 lípidos (A, B, C y

D) y 2 proteínas (X e Y). b) El lípido A puro luego de hidrólisis completa rindió esfingosina, ácido palmítico y

Ser en cantidades equimoleculares. El lípido B mostraba actividad óptica y luego de hidrólisis rindió glicerol, ácido palmítico y ácido esteárico en una relación molar 1:2:1. El lípido C fue identificado como colesterol. El lípido D rindió luego de hidrólisis completa glicerol, ácido oleico, ácido esteárico, ácido fosfórico y Thr en cantidades equimoleculares.

c) El componente X se identificó como una glicoproteína con un alto contenido de Phe, Val, Leu y Trp. De esta glicoproteína se obtuvieron 2 anticuerpos diferentes IgG1 e IgG2.

d) La proteína Y era globular y tenía un PM de 360.000. e) El tratamiento de los adipocitos intactos en un medio isotónico con 0,15 M NaCl no

liberó ninguna proteína y en estas condiciones sólo IgG1 se unió a X. f) La ruptura hipotónica de los adipocitos, seguida de un lavado con 0,2 M NaCl,

liberó en solución a la proteína Y y en estas condiciones tanto IgG1 como IgG2 se unieron a X.

La liberación en solución de X e Y requirió de un tratamiento con detergente. En base a estos datos escriba en fórmulas los lípidos A, B y D y haga un esquema completo de los adipocitos indicando la localización de los componentes mayoritarios A, B, C, D, X e Y. 14- La fosfolipasa A2 hidroliza el ácido graso de la posición beta de los fosfolípidos, dando ácidos grasos libres y los lipoderivados correspondientes. Cuando esta enzima actúa sobre glóbulos rojos suspendidos en medio isotónico no se produce hemólisis. El análisis de los fosfolípidos de membrana de glóbulos rojos tratados con fosfolipasa A indica que cerca de los dos tercios del contenido de fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina resiste la acción de la enzima mientras que el tercio restante es hidrolizado. Cuando se trabaja con glóbulos rojos hemolizados todos los fosfolípidos son sensibles a la hidrólisis enzimática. ¿Qué puede deducir de este experimento acerca de la ubicación de los fosfolípidos en la bicapa lipídica? 15- Usted ha estado trabajando para caracterizar el metabolismo lipídico de una cepa bacteriana termofílica capaz de resistir temperaturas mayores a 50ºC. Como parte de ese trabajo, ha determinado la composición de los lípidos de membrana de esta bacteria. A efectos comparativos, realiza la misma medición en una cepa de una especie cercana que es termosensible, no creciendo ésta a temperaturas mayores a

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37ºC. Asigne cada serie de datos a la cepa correspondiente y explique su decisión.

Composición de lipídos % Serie A % Serie B

Fosfolípidos con ácidos grasos saturados 25 57

Fosfolípidos con ácidos grasos insaturados 41 19

Esteroles 18 10

Otros 16 14

16- La enzima X es una proteína de membrana mitocondrial interna y está formada por dos polipéptidos (a de 40.000 de peso molecular (PM) y b de 22.000 de PM) unidos por fuerzas no covalentes. Se dispone de preparaciones de membranas mitocondriales abiertas y de mitocondrias sometidas a diversos tratamientos, obteniéndose las siguientes fracciones: TRATAMIENTOS I) Membranas mitocondriales abiertas + detergente 10.000g x 60 min P1 S1 II) Membranas mitocondriales abiertas + NaCl 0.5 M P2 S2 III) Vesículas de membrana interna (right side out) + tripsina 10.000g x 60 min P3 S3 IV) Membranas mitocondriales internas abiertas + tripsina 10.000g x 60 min P4 S4 V) Mitocondrias obtenidas de células tratadas con cloranfenicol (F5). En las distintas fracciones se ensayó la actividad enzimática y la composición polipeptídica de la proteína X.

10.000g x 60 min

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Actividad

enzimática (*) Polipéptido a Polipéptido b

I P1 0 NO NO S1 100 SI (40 kDa) SI (22 kDa)

II P2 0 SI (40 kDa) NO S2 0 NO SI (22 kDa)

III P3 100 SI (30 kDa) SI (22 kDa) S3 0 NO NO

IV P4 0 SI (20 kDa) NO S4 0 NO NO

V F5 0 SI NO (*) Expresada en unidades arbitrarias Puede concluirse que: a) El polipéptido ___________ es una proteína integral de membrana. b) El polipéptido ___________ es una proteína periférica. c) La actividad enzimática de la proteína X depende de la presencia de: i)a, ii) b, iii) a y b. d) El polipéptido que es periférico está ubicado en la membrana interna mitocondrial

sobre la cara: i) de la matriz mitocondrial ii) del espacio intermembrana.

e) ¿En que compartimentos celulares se sintetizan los polipéptidos a y b? f) ¿Que le indica el hecho de que el tratamiento con tripsina de las vesículas de

membrana interna right side out (III) no afecte a la actividad enzimática? g) Haga un esquema de un trozo de membrana mitocondrial y ubique, con su

orientación correcta, a y b de acuerdo con lo respondido a las preguntas anteriores. 17- Membrana de levaduras.

a) Indique los lípidos que podrían ser componentes de las mismas. Ácido láurico Gangliósido Ácido linoleico Esfingomielina Fosfatidilinositol Cerebrosido Triacilglicérido Ácido oleico Ácido palmítico Fosfatidilserina Colesterol Prostaglandina Fosfatidilcolina Ácido linolénico Ácido esteárico b) Indique el compuesto que utilizaría para la extracción de las proteínas

extrínsecas de estas membranas. Cloruro de sodio Cloroformo Urea Etanol SDS Betamercaptoetanol Sacarosa Celulasa Albúmina Tritón X-100 KOH Inositol c) Indique entre los ácidos grasos listados en el ítem a) el que más probabilidad

tiene de ser encontrado en organismos criófilos.

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RESPUESTAS 1. a) Periféricas b) Periféricas, ancladas a lípidos e integrales c) Hidrólisis de parte de la proteína integral que se expone al medio fuera de la membrana d) Hidrólisis interna y externa de segmentos proteicos de proteína integral ubicados fuera de la membrana. 2. I- C, D, F. II- C. III- C, F. IV- C, D, F 3. 1,17 g/cm3, sedimentaría 4. a) 5 10-9 cm2/s b) 0,00014 cm 5 A intrínseca con proyección hacia el lado citosólico, B extrínseca externa, C intrínseca 6. I- -. II- M, N, EL y FL. III- M. IV- EL, FL, N y M 7. Ver diferencias entre “carrier” y canal. 8. Ver índice hidropático 9. Indican que es interna y extrínseca 10. Porque el Trp está cargado lo que dificulta su paso por difusión 11. A proteína extrínseca interna, B proteína intrínseca, C proteína básica extrínseca externa 12. Se aumenta el % de ácidos grasos saturados. 13. Proteína X es integral. Fracción 1 (atacada por IgG1) expuesta al exterior de la célula. Fracción 2 hacia el interior. La proteína Y no forma parte de la membrana y se libera cuando se rompe la célula. Y es extrínseca interna. 14. Fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina se hallan en mayor porcentaje en la cara interior de la membrana del glóbulo rojo. 15. A termosensible; B termofílica. 16. a) a; b) b; c) iii) a y b; d) ii; e) a núcleo; b mitocondrias f) b no es esencial para la catálisis.

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MATERIAL SUPLEMENTARIO Definiciones útiles:

-Indice de saponificación es el número de mg de KOH necesarios para saponificar 1 g de triacilglicérido. PM KOH = 56 -Indice de Iodo es el número de gramos de I2 absorbidos por 100 g de aceite o grasa. PM I2 = 254. -PA fósforo: 31. PA nitrógeno: 14.

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Ácidos grasos: saturado y con una insaturación cis

Triacilglicérido

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Glicerofosfolípidos

Porciones hidrofóbicas e hidrofílicas de un glicerofosfolípido

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La unión a la ceramida es a través de un enlace glucosídico.

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Sitios de corte de fosfolipasas.

Esquema de membrana según el modelo de mosaico fluido

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Glicoforina

Índice hidropático