LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARAacute

Proacute-Reitoria de Poacutes-Graduaccedilatildeo e Pesquisa

Faculdade de Veterinaacuteria

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Veterinaacuterias

BODESINAS ESPERMADESINAS CODIFICADAS POR GENES DA VESIacuteCULA

SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS (Capra hircus)

Daacutercio Iacutetalo Alves Teixeira

Fortaleza-Cearaacute

Tese apresentada agrave Faculdade de Veterinaacuteria

da Universidade Estadual do Cearaacute como

requisito parcial para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

Doutor em Ciecircncias Veterinaacuterias

Aacuterea de concentraccedilatildeo Reproduccedilatildeo e

Sanidade Animal

Orientador Prof Dr Vicente Joseacute de

Figueirecircdo Freitas

Aos meus pais Damiatildeo Alves Maia e Maria

Luiza Teixeira Maia pelo apoio e incentivo

incondicional ao estudo

Dedico

Quem reconhece a sua ignoracircncia

Revela a mais alta sapiecircncia

Quem ignora a sua ignoracircncia

Vive na mais profunda ilusatildeo

Natildeo sucumbe agrave ilusatildeo

Quem conhece a ilusatildeo como ilusatildeo

O saacutebio conhece o seu natildeo-saber

E essa consciecircncia do natildeo-saber

O preserva de toda a ilusatildeo

Lao-Tseacute

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus por permitir a conquista de mais uma vitoacuteria na minha vida com sauacutede e

com disposiccedilatildeo para continuar lutando

A Universidade Estadual do Cearaacute em especial ao Curso de Doutorado em Ciecircncias

Veterinaacuterias por proporcionar condiccedilotildees para aprender com as disciplinas

Ao Prof Dr Vicente Joseacute de Figueirecircdo Freitas pela constante luta para

desenvolver ciecircncia com qualidade proporcionando aos seus orientandos um aprendizado

constante e sobretudo pela confianccedila e dedicaccedilatildeo durante a realizaccedilatildeo minha poacutes-

graduaccedilatildeo

Ao Prof Dr Benildo Sousa Cavada pela competecircncia e capacidade de reunir

grandes pesquisadores com fins cientiacuteficos sempre procurando incentivar os seus alunos a

unir amizade e competecircncia e tambeacutem por me colocar sempre a disposiccedilatildeo o seu

laboratoacuterio para desenvolver as atividades inerentes agrave pesquisa

Ao Prof Dr Ghandi Rhadis-Baptista pelo empenho neste trabalho sempre a

disposiccedilatildeo de ensinar os seus conhecimentos incansaacutevel em suas tarefas e com humor para

vibrar as vitoacuterias e natildeo se abater nos resultados negativos

As professoras Dra Ana Maria Sampaio Assreuy e Dra Claudia Ferreira Santos que

sempre estatildeo a disposiccedilatildeo para o ensino e por sempre manter o bom relacionamento com o

nosso grupo de pesquisa

Ao Prof Dr Davide Rondina pelo apoio teacutecnico-cientiacutefico confianccedila profissional e

principalmente pela amizade

Ao Prof MSc Rodrigo Maranguape pela disposiccedilatildeo de todos os equipamentos e

matildeo de obra para realizaccedilatildeo deste trabalho

Agrave Doutoranda Luciana Magalhatildees de Melo pela dedicaccedilatildeo e apoio imensuraacutevel na

composiccedilatildeo deste trabalho o qual estaacute apenas comeccedilando

Ao Dr Alexandre Havt pela contribuiccedilatildeo oferecida durante a confecccedilatildeo dos artigos

cientiacuteficos

Aos Professores e funcionaacuterios do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias

Veterinaacuterias (PPGCV) da UECE pelo apoio teacutecnico e burocraacutetico para o desenvolvimento

deste trabalho

Aos meus amigos da Iniciaccedilatildeo Cientifica do Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da

Reproduccedilatildeo Camila Pontes Albuquerque Deacuteborah de Melo Magalhatildees Francisco Carlos

de Sousa Isadora Machado Teixeira Joatildeo Davi Arauacutejo da Silva Karlliely de Castro

Almeida Raylene Ramos Moura e Suely Renata Gaya Avelar pela dedicaccedilatildeo aos

trabalhos e sobretudo pelo conviacutevio diaacuterio no laboratoacuterio

Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em

Ciecircncias Veterinaacuterias MV Iracelma Juliatildeo Arruda MV Aline Lima Souza MV

Anderson Pinto Almeida Quiacutemica Alexsandra Fernandes Pereira Bioacuteloga Maria Luciana

Lira de Andrade MSc Joatildeo Batista Cajazeiras MSc Ney Rocircmulo de Oliveira Paula e o

Dr Ediacutelson Soares Lopes Juacutenior pela dedicaccedilatildeo no Setor de Ovinocaprinocultura

produzindo ciecircncia de excelecircncia e pelas dias e noites de dedicaccedilatildeo ao trabalho

Aos meus amigos do Laboratoacuterio de Moleacuteculas Biologicamente Ativas ndash BIOMOL-

LAB pela dedicaccedilatildeo e esforccedilo em manter uma instituiccedilatildeo de pesquisa de qualidade

Aos Meus grandes Amigos Dr Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra Tatiane

Santi Gadelha pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento

Aos Funcionaacuterios Selmar e Ceacutesar que participam dos trabalhos diaacuterios com

responsabilidade e competecircncia

Agrave minha famiacutelia pela amizade em especial agraves minhas queridas Tias Maria Salete

Silveira e Freitas Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios Joseacute

Luciecirc Teixeira e Antocircnio Alves Maia

Aos Meus Irmatildeos e Irmatildes Delacircndio Luiz Alves Teixeira Daacuterlio Inaacutecio Alves

Teixeira Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira pelo companherismo

e exemplo de dedicaccedilatildeo agrave famiacutelia

Aos meus pais que tanto amo Damiatildeo Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por

tudo que eles me ensinaram na minha vida

Ao meu amor Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensatildeo nos momentos

ausentes e pelo incentivo nas horas difiacuteceis obrigado por estaacute sempre ao meu lado

E finalmente agrave todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuiacuteram para o

conteuacutedo desta tese e pela construccedilatildeo de minha personalidade

RESUMO

O plasma seminal de mamiacuteferos contecircm entre outras proteiacutenas denominadas

espermadesinas as quais satildeo as proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de suiacutenos e

equumlinos Estas proteiacutenas parecem estar envolvidas na capacitaccedilatildeo espermaacutertica e na

interaccedilatildeo espermatozoacuteide-ooacutecito Previamente foi relatada a presenccedila de uma proteiacutena

relacionada agraves espermadesinas no plasma seminal de caprinos Este trabalho foi executado

em duas etapas com diferentes objetivos Na primeira etapa foram realizados estudos

aprofundados sobre esta proteiacutena e foi proposta a teacutecnica de cromatografia de troca iocircnica

para obtenccedilatildeo desta proteiacutena seminal Na segunda etapa objetivou-se encontrar o gene que

codifica a espermadesina caprina O plasma seminal de quatro bodes Saanen adultos foi

agrupado e dializado contra aacutegua destilada e congelado Proteiacutenas liofilizadas foram

inseridas em uma coluna de cromatografia de troca iocircnica Proteiacutenas dializadas-liofilizadas

do pico principal da DEAE-Sephacel foi aplicado a uma coluna C2C18 acoplada ao RP-

HPLC As proteiacutenas da cromatografia DEAE-Sephacel foram dializadas e submetidas a

Heparina-Sepharose-HPLC Para alcanccedilar o segundo objetivo foi preparado o cDNA do

testiacuteculo e vesiacutecula seminal de um bode sexualmente maturo Para amplificar o cDNA

3rsquo-end foram testados dois primers desenhados de diferentes regiotildees conservadas da

espermadesina caprina O plasma seminal caprino produziu 647 plusmn 06 3 mg (media plusmn EP)

de uma fraccedilatildeo majoritaacuteria retida A proteiacutena foi primariamente denominada BSFP (proteiacutena

do fluiacutedo seminal de bode) A BSFP natildeo mostrou capacidade ligante agrave heparina Quanto agrave

clonagem e sequumlecircnciamento dos produtos de PCR levou agrave identificaccedilatildeo de trecircs novos

cDNAs codificando as espermadesinas caprinas os quais foram denominados bodesina-1 2

e 3 Todas as trecircs sequumlecircncias de aminoaacutecidos deduzidas satildeo altamente similares (50) agrave

espermadesina suiacutena e a sequumlecircncia da bodesina-2 eacute idecircntica ao N-terminal da BSFP Em

conclusatildeo a espermadesina caprina pode ser eficientemente isolada por cromatografia de

troca iocircnica e fase reversa Finalemnet estes resultados indicam que as bodesinas parecem

formar uma famiacutelia de multigenes que codificam proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado

essencial para sua funccedilatildeo bioloacutegica Ao nosso conhecimento este eacute o rpimeiro relato de

clonagem molecular das espermadesinas caprinas (bodesinas)

ABSTRACT

Mammalian seminal plasma contains among others proteins named spermadhesins which

are the major proteins of boar and stallion seminal plasma These proteins appear to be

involved in capacitation and sperm-egg interaction Previously we reported the presence of

a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma This work was carried out in two

steps with different objectives In the first step we have further characterized this protein and we

purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein In the second step we

aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin The seminal plasma from four adult

Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried Lyophilized

proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column Dialyzed-lyophilized proteins

from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2C18 column coupled to a RP-HPLC

Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin-

Sepharose High Performance Chromatography To achieve the second objective we prepared the

cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck To amplify the cDNA

3rsquo-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat

spermadhesin Goat seminal plasma yielded 647 plusmn 063 mg (mean plusmn SEM) of a major retained

fraction The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein) BSFP showed no

heparin-binding capabilities Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify

three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1 -2 and -3 All three

deduced amino acid sequences are highly similar (50) to boar AWN spermadhesin and

the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal In conclusion goat

spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies

Finally these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding

proteins with conserved CUB domain essential for their biological function To our

knowledge this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins)

SUMAacuteRIO

Lista de Abreviaturas e Siacutembolos 13Lista de Figuras 15Lista de Tabelas 17Introduccedilatildeo 18Capiacutetulo I Revisatildeo de Literatura 191 Constituintes do plasma seminal 1911 Definiccedilatildeo 1912 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal 2013 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo 292Lectinas 3121 Definiccedilatildeo 3122 Histoacuterico das lectinas 3223 Classificaccedilatildeo das lectinas 3224 Lectinas animais 35241 Galectinas 35242 Lectinas do tipo C 352421 Lectinas endociacuteticas 362422 Colectinas 362423 Selectinas 36243 Lectinas do tipo P 37244 Lectinas do tipo I 3725 Funccedilotildees das lectinas 383 Espermadesinas 4231 Anaacutelise dos genes das espermadesinas 46Justificativa 49Hipoacuteteses cientiacuteficas 50Objetivos 51Geral 51Especiacuteficos 51Capiacutetulo II Cromatografia de troca iocircnica para obtenccedilatildeo de uma espermadesina do

plasma seminal de caprinos domeacutesticos (Capra hircus) 52Material e Meacutetodos 52Resultados e Discussatildeo 54Capiacutetulo III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da

famiacutelia das espermadesinas 60Material e Meacutetodos 60Resultados 65Discussatildeo 69Conclusotildees Gerais 72Perspectivas 73Referecircncias Bibliograacuteficashelliphelliphelliphellip 74Anexo I Ion-exchange chromatography to obtain a spermadhesin-related protein

from domestic goat (Capra hircus) seminal plasma 89Anexo II Buck (Capra hircus) genes encode new members of the spermadhesin

familyhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 100

LISTA DE ABREVIATURAS E SIacuteMBOLOS

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

AQN espermadesina suiacutena

ASFP proteiacutena aacutecida do plasma seminal

AWN espermadesinas suiacutena e equina

Bmp1 proteiacutena morfogeneacutetica do osso-1

BSFP proteiacutena do fluido seminal de bode

BSP ndash A1 A2 A3 proteiacutena do plasma seminal bovino

degC graus centiacutegrados

Ca++ caacutelcio

cDNA DNA complementar

CP fosfatidal colina (colina plasmalogena)

CRISP proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas

CUB componentes do osso do ouriccedilo do mar

Da Dalton

ddH2O aacutegua tratada com dietilpirocarbonato

DNA aacutecido desoxiribonucleacuteico

DPG difosfatidilglicerol

EP losfatidal etanolamina

FISH hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia

Fn ndash 2 domiacutenio fibronectina tipo II

g grama

g gravidade

h hora

HPLC cromatografia liacutequida de alta precisatildeo

im intramuscular

kDa quilodaltons

LPC lisofosfatidilcolina

LPE lisofosfatidil etanolamina

M molar

Man-6-P manose-6-fosfato

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PA aacutecido fosfatiacutedico

PC fosfatidil colina

PE fosfatidil etanolamina

pH potencial hidrogeniocircnico

PI fosfatidil inositol

PM peso molecular

PS fosfatidil serina

PSP proteiacutena do plasma seminal de suiacutenos

PSP-I unidade I da PSP

PSP-II unidade II da PSP

RNA Aacutecido Ribonucleacuteico

rpm rotaccedilotildees por minuto

RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma

reaccedilatildeo em cadeia de polimerase

SPH esfingomielina

Sp17 Sp56 proteiacutena 17 e 56 do espermatozoacuteide

SSP-7 proteiacutena do plasma seminal do garanhatildeo

TFA aacutecido trifluoraceacutetico

UECE Universidade Estadual do Cearaacute

Uegf proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar

UFC Universidade Federal do Cearaacute

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino 19Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo

a moleacuteculas de fosforilcolina 25Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 a membrana

rica em lipiacutedios colina 27Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos 28Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o

espermatozoacuteide no trato reprodutor da fecircmea 29Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais

merolectinas hololectinas e quimerolectinas 33

Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por

sialoadesinas 38Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II 43Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio

CUB 44Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios

CUB da aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um

grande nuacutemero de resiacuteduos hidrofoacutebicos entre as duas

estruturas 46Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos (Clusters) de genes das

espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo fluorescecircncia in situ

(FISH) com expansatildeo da metaacutefase de suiacuteno 48Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal

de caprinos 55Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-

Sephacel aplicada em Coluna de Fase Reversa acoplada a um

sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta Precisatildeo ndash RP-HPLC 56

Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das

espermadesinas de suiacuteno (AQN-1 AWN) e bovina (aSFP) 57Figura 15 Cromatografia de alta precisatildeo acoplado a uma coluna de heparina-

sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel 58Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA

total 61Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli 63Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e

vesiacutecula seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA

3rsquo-end usando primers Q0 e SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os

genes da bodesina 65

Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da

espermadesina

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de

caprinos 24Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies 26Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela

capacidade de ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito

30Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas 34Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas 41Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos 47Tabela 7 cDNAs das espermadesinas 66

INTRODUCcedilAtildeO

Nos uacuteltimos anos o nordeste do Brasil vem consolidando a caprinocultura

caracterizando-se como um poacutelo produtor e gerador de tecnologias para o desenvolvimento

sustentaacutevel da regiatildeo A participaccedilatildeo do rebanho nacional de caprinos no Nordeste eacute da

ordem de 8971033 cabeccedilas perfazendo um percentual de 9375 do rebanho nacional

(ANUALPEC 2004)

Por apresentarem uma baixa produccedilatildeo de carne leite e pele a inseminaccedilatildeo artificial

continua sendo uma das teacutecnicas mais viaacuteveis para o melhoramento geneacutetico do rebanho de

caprinos no entanto para a obtenccedilatildeo de melhores iacutendices de sucesso na aplicaccedilatildeo desta

teacutecnica torna-se necessaacuterio o conhecimento da fisiologia reprodutiva destes animais

A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Essas

proteiacutenas possuem um importante papel no processo de fertilizaccedilatildeo aleacutem de exercerem

uma funccedilatildeo fisioloacutegica na reproduccedilatildeo da fecircmea Algumas destas proteiacutenas fazem parte de

um novo grupo de lectinas animais denominadas espermadesinas

As espermadesinas jaacute foram descritas em suiacutenos bovinos equumlinos e caprinos

Poreacutem nesta uacuteltima espeacutecie pouco tem sido relatado sobre a funccedilatildeo destas proteiacutenas na

fisiologia reprodutiva Neste trabalho seratildeo descritos os conhecimentos jaacute adquiridos sobre

as espermadesinas de diferentes espeacutecies aleacutem de apresentar os estudos experimentais

sobre as espermadesinas de caprinos

CAPIacuteTULO I REVISAtildeO DE LITERATURA

1 CONSTITUINTES DO PLASMA SEMINAL

11 Definiccedilatildeo

O plasma seminal eacute um fluido proveniente da secreccedilatildeo do epidiacutedimo e de glacircndulas

acessoacuterias contidas no trato reprodutor masculino que daacute suporte aos espermatozoacuteides aleacutem

de formar o secircmen (CALVETE 1996)

As glacircndulas acessoacuterias responsaacuteveis pela produccedilatildeo do plasma seminal estatildeo

situadas junto agrave uretra Em caprinos as glacircndulas vesiculares satildeo em nuacutemero de duas e satildeo

formadas por um corpo glandular A proacutestata pouco desenvolvida estaacute distribuiacuteda ao redor

do luacutemen da uretra As glacircndulas bulbo-uretrais tecircm tamanho de uma avelatilde e possuem

somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI 1988)(Figura 1)

Figura 1 Trato reprodutor masculino de caprino

12 Composiccedilatildeo e funccedilatildeo do plasma seminal

Os constituintes do plasma seminal de mamiacuteferos tem recebido consideraacutevel

atenccedilatildeo por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozoacuteides e

pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em oacutergatildeos especiacuteficos

cujas concentraccedilotildees satildeo importantes para avaliar a capacidade secretora de vaacuterias glacircndulas

sexuais anexas as quais dependem da produccedilatildeo de androacutegenos pelos testiacuteculos para

desempenhar suas funccedilotildees (MANN 1964)

O plasma seminal conteacutem uma variedade de constituintes bioquiacutemicos alguns dos

quais satildeo relativamente especiacuteficos dentro do mecanismo de regulaccedilatildeo da funccedilatildeo dos

espermatozoacuteides entretanto as exatas funccedilotildees destes componentes seminais no controle

espermaacutetico ainda natildeo estatildeo bem elucidadas (STRZEZEK amp CIERESZKO 1987)

A composiccedilatildeo proteacuteica do plasma seminal varia de espeacutecie para espeacutecie Foi

verificado em muitas espeacutecies de mamiacuteferos que o plasma seminal conteacutem fatores que

influenciam tanto na habilidade do espermatozoacuteide em fertilizar como tambeacutem causa

importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fecircmea (SHIVAJE et al 1990)

Dentre os componentes do plasma seminal podemos citar compostos inorgacircnicos

tais como aminoaacutecidos peptiacutedeos proteiacutenas de baixo e alto peso molecular carboidratos

lipiacutedios minerais hormocircnios fatores de crescimento inibidores imunossupressores

imunoglobulinas e estes variam entre as espeacutecies intervalo entre ejaculaccedilotildees e sauacutede do

animal (FRAZER amp BUCCI 1996)

Para obtenccedilatildeo de energia os espermatozoacuteides utilizam carboidratos como a glicose e

a frutose mas a principal composiccedilatildeo de carboidratos do plasma seminal eacute de frutose onde

esta influencia diretamente a motilidade espermaacutetica (CHAKRABARTI amp GUHA 1993

GONZALES 2001)

Ibarra amp Navaridas (1992) sugerem que a frutose seminal comporta-se como um

marcador das funccedilotildees das vesiacuteculas seminais sendo necessaacuterias para agrave sobrevivecircncia e

motilidade inicial da ceacutelula espermaacutetica e que o aacutecido ciacutetrico reflete a atividade secretora

da proacutestata mesmo que sua funccedilatildeo ainda seja pouco conhecida Todavia acredita-se que o

aacutecido ciacutetrico comporte-se como um ativador da fosfatase aacutecida sendo importante para

manutenccedilatildeo do equiliacutebrio osmoacutetico juntamente com o potaacutessio e o soacutedio favorecendo deste

modo agrave atividade espermaacutetica

O aacutecido ciacutetrico eacute um dos principais constituintes do plasma seminal e apresenta uma

relaccedilatildeo com os niacuteveis de testosterona plasmaacutetica ocorrendo em altas concentraccedilotildees na

maioria das espeacutecies de mamiacuteferos tendo assim elevada importacircncia para o metabolismo e

motilidade espermaacutetica por constituir-se em um agente regulador necessaacuterio em muitos

sistemas bioquiacutemicos (POLAKOSKI amp KOPTA 1982)

Os altos niacuteveis de testosterona plasmaacutetica parecem regular a quantidade de alguns

constituintes do plasma seminal pois altas concentraccedilotildees do androacutegeno aleacutem de conduzir

uma melhor libido do animal satildeo responsaacuteveis pela elevaccedilatildeo dos niacuteveis de frutose e aacutecido

ciacutetrico no secircmen caprino (NUNES et al 1982)

Aleacutem dos carboidratos diversos eletroacutelitos estatildeo presentes no plasma seminal

dentre os mais importantes foram encontrados o caacutelcio (Ca++) soacutedio (Na+) potaacutessio (K+)

magneacutesio (Mg++) cloreto (Cl-) fosfato (PO4-) e zinco (Zn ++) que podem ser indicadores na

avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (ABDEL-RAHMAN et al 2000)

Um grande aumento nas concentraccedilotildees de Na+ ou K+ do plasma seminal podem ser

indicadores de distuacuterbios na motilidade espermaacutetica reduzindo a viabilidade do secircmen em

carneiros (KAYA et al 2002) Poreacutem em estudos com plasma seminal de humanos

verificou-se que concentraccedilotildees de Mg++ Ca++ e Zn++ natildeo estatildeo correlacionadas com a

motilidade espermaacutetica (SORENSE et al 1999)

Trabalhos com plasma seminal de ovinos demonstraram que a presenccedila de uma

grande concentraccedilatildeo de Ca++ K+ e uma baixa de PO4- diminuem o metabolismo dos

espermatozoacuteides (ABDEL-RAHMAN et al 2000)

Boatman amp Robins (1991) demonstraram que o bicarbonato eacute essencial para a

hiperativaccedilatildeo e capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides de hamster poreacutem a hiperativaccedilatildeo requer

altos niacuteveis de bicarbonato em relaccedilatildeo agrave capacitaccedilatildeo

O zinco eacute encontrado no proacuteprio espermatozoacuteide e no fluido seminal onde sua

concentraccedilatildeo eacute consideravelmente maior em relaccedilatildeo a qualquer outro fluido corporal No

plasma seminal sua origem principal eacute a proacutestata (MANN amp LUTWAK-MANN 1981)

Aleacutem disso parece haver uma correlaccedilatildeo direta entre os niacuteveis de zinco no plasma seminal

e a motilidade espermaacutetica e uma fraca correlaccedilatildeo positiva entre a percentagem de

espermatozoacuteides com o movimento circular ou movimento progressivo natildeo linear e a

concentraccedilatildeo de zinco (HENKEL et al 1999)

A composiccedilatildeo destes iacuteons no plasma seminal tem relaccedilatildeo direta com a accedilatildeo de

algumas enzimas como por exemplo a aspartato aminotransferase (AAT) transaminase

glutacircmica piruacutevica (GPT) lactato desidrogenase (LDH) fosfatase alcalina fosfatase aacutecida

sendo estas bastante utilizadas para avaliaccedilatildeo da qualidade espermaacutetica (KAYA et al

Uma atividade elevada de AAT e GTP mensuradas no plasma seminal eacute indicativo

de dano ou funccedilatildeo alterada na membrana Isto ocorre provavelmente devido a maturaccedilatildeo

inadequada no epidiacutedimo como consequumlecircncia do aumento da frequumlecircncia da colheita

(KAYA et al 2002)

A fosfolipase A2 presente no plasma seminal de muitas espeacutecies eacute uma enzima com

cataacutelise especiacutefica para hidroacutelise dos aacutecidos graxos ligados a posiccedilatildeo SN-2 das moleacuteculas

de glicerofosfolipiacutedios A presenccedila da PLA2 no plasma seminal tem sido reportada no

homem (KUNZE et al 1974) touro (RONKKO 1995) carneiro (HINKOVSKA et al

1987) rato (THAKKAR amp FRANSON 1983) e bode (ROY 1957) Essas enzimas agem

sobre os fosfolipiacutedios dos diluentes levando a formaccedilatildeo de lisolecitinas e aacutecidos graxos que

exercem efeitos toacutexicos para o espermatozoacuteide Aleacutem disso esses efeitos satildeo maiores

quando haacute interaccedilatildeo entre enzimas fosfolipases e os fosfolipiacutedios presentes no meio

diluente como o leite e o plasma seminal

A localizaccedilatildeo destas enzimas tem sido demonstradas em diversas partes do trato

reprodutor masculinocomo por exemplo na vesiacutecula seminal proacutestata e principalmente

nas glacircndulas de Cowper (glacircndulas bulbo uretrais) (RONKKO 1995)

Em caprinos a glacircndula bulbouretral exerce um efeito deleteacuterio ao espermatozoacuteide

durante a estaccedilatildeo natildeo sexual sendo responsaacutevel pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de grandes

quantidades de fosfolipase A2 (NUNES et al 1982)

Quanto aos fosfolipiacutedios estes estatildeo presentes tanto no plasma seminal como nos

espermatozoacuteides e sua composiccedilatildeo se assemelha entre espeacutecies ou seja caprina (JAIN amp

ANAND 1974) ovina (SCOTT et al 1967) bovina (MASAKI amp HARTREE 1962) e

suiacutenos (JOHNSON et al 1969)

O total de fosfolipiacutedios contido no plasma seminal de caprinos eacute de 12 plusmn 01 g 100

g e nos espermatozoacuteides eacute de 00057 plusmn 0003 g 100g sendo que as colinas plasmalogenas

satildeo os fosfolipiacutedios que estatildeo presentes em maior quantidade nos espermatozoacuteides e no

plasma seminal (Tabela 1)

Tabela 1 Composiccedilatildeo fosfolipiacutedica do espermatozoacuteide e do plasma seminal de caprinos

Componentes Espermatozoacuteide () Plasma seminal ()

Fosfatidil colina - PC 25 183Fosfatidal colina (plasmalogena) ndash CP 278 191Fosfatidil etanolamina - PE 50 91Fosfatidal etanolamina - EP 09 30Esfingomielina - SPH 118 150Fosfatidil serina ndash OS 28 41Fosfatidil inositol ndash PI 18 35Lisofosfatidilcolina ndash LPC 44 55Lisofosfatidil etanolamina ndashLPE 43 96Difosfatidilgicerol - DPG 80 20Aacutecido fosfatiacutedico ndash PA 05 07Natildeo caracterizados 77 101FONTE JAIN amp ANAND 1975

Existem vaacuterios componentes do plasma seminal que inibem o processo de

capacitaccedilatildeo preservando assim o espermatozoacuteide tais quais as proteiacutenas caltrim (inibidora

do transporte e penetraccedilatildeo do caacutelcio) Estas proteiacutenas satildeo removidas juntamente com o

plasma seminal quando passam pelo trato reprodutor feminino

Vaacuterios estudos tecircm mostrado a existecircncia de proteiacutenas do plasma seminal que se

prendem agrave membrana espermaacutetica facilitando a ligaccedilatildeo com heparina e outros

glicosaminoglicanos (GAGs) presentes no trato reprodutor da fecircmea estimulando assim a

capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides O papel regulador das proteiacutenas com afinidade a heparina

jaacute foram evidenciadas em vaacuterias espeacutecies estas possuem um papel essencial na fertilizaccedilatildeo

(CALVETE et al 1993)

Bergeron et al (2005) encontraram duas famiacutelia principais de proteiacutenas no plasma

seminal as espermadesinas que possuem um domiacutenio CUB (C1r Uegf e Bmp1) (BORK amp

BECKMAN 1993) e as proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio fibronectina tipo II (Figura 2)

No plasma seminal de bovinos a famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio

fibronectina tipo II (Fn-2) satildeo denominadas de proteiacutenas majoritaacuterias (BSP A1A2 BSP A3

e BSP 30kDa) que satildeo responsaacuteveis pela capacitaccedilatildeo dos espermatozoacuteides (DESNOYERS

amp MANJUNATH 1992) Alguns trabalhos evidenciam que as proteiacutenas do plasma seminal

satildeo absorvidas pela superfiacutecie do espermatozoacuteide apoacutes a ejaculaccedilatildeo (MENTZ et al 1990)

Figura 2 Orientaccedilatildeo espacial de diferentes conformaccedilotildees de siacutetios de ligaccedilatildeo a moleacuteculas

de fosforilcolina (A) domiacutenio fibronectina tipo 2 monocircmeros A e B (B) domiacutenio

fibronectina monocircmero A e (C) domiacutenio fibronectina monocircmero B (WAH et al 2002)

Proteiacutenas homoacutelogas as BSPs tem sido identificadas em equumlinos (CALVETE et al

1997) suiacutenos (CALVETE et al 1997) bovinos (MANJUNATH amp SAIRAM 1987)

caprinos (VILLEMURE et al 2003) ovinos (JOBIM et al 2005) e bisotildees (BOISVERT et

al 2004) (ver tabela 2) As propriedades bioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido

extensivamente estudadas (DESNOYERS amp MANJUNATH 1992 MANJUNATH amp

THERIEN 2002) O papel na fertilizaccedilatildeo especificamente na capacitaccedilatildeo espermaacutetica eacute

conferido pela ligaccedilatildeo de grupos colina a fosfolipiacutedios presentes na membrana do

espermatozoacuteide e tambeacutem a lipoproteiacutenas de alta densidade (HDL) e glicosaminoglicanos

presentes no fluido folicular e ovidutaacuterio (THERIEN et al 1995)

Tabela 2 Proteiacutenas BSPs do plasma seminal de diversas espeacutecies

Espeacutecie Proteiacutenas Fn-2

Bovina BSP-A1A2 (PDC-109) BSP-A3 BSP-30 kDa

Equumlina HSP- 1 HSP- 2 HSP- 12 kDa

Suiacutena pB1

Caprina GSP -14 kDa GSP - 15 kDa GSP -20 kDa GSP -22 kDa

Ovina BSP - A1A2 RSP ndash 15 kDa RSP ndash 16 kDa RSP ndash 22 kDa RSP ndash 24 kDa

Bisatildeo BiSV - 16 kDa BiSV - 17 kDa BiSV - 16 kDa BiSV - 18 kDa BiSV - 28 kDa

FONTE THEacuteRIEN et al 2001 VILLEMURE et al 2003

Um cluster hidrofoacutebico presente na superfiacutecie dos aminoaacutecidos parece ser

responsaacutevel pela ligaccedilatildeo destas proteiacutenas agrave membrana lipiacutedica do espermatozoacuteide (Figura

3) (CONSTATINE et al 1992 WAH et al 2002) Neste sentido evidecircncias fisioloacutegicas

do papel da PDC-109 podem ser a estimulaccedilatildeo da capacitaccedilatildeo espermaacutetica pois estas

proteiacutenas quando preacute-incubada com os espermatozoacuteides desencadeiam mais rapidamente

este processo (THEacuteRIEN et al 1995)

Figura 3 Modelo estrutural da ligaccedilatildeo do oligocircmero PDC-109 agrave membrana rica em

lipiacutedios colina (WAH et al 2002)

Estas proteiacutenas satildeo expressas em diferentes regiotildees do trato genital masculino A

HSP-12 kDa ou recentemente denominada de EQ-12 eacute produzida no corpo e na cauda do

epidiacutedimo e as HSP-1 e HSP-2 recentemente denominadas de famiacutelias SP-1 e SP-2 satildeo

sintetizadas em grandes quantidades na ampola dos vasos deferentes (EKHLASI-

HUNDRIESER et al 2005)

No trato reprodutor masculino de algumas espeacutecies de mamiacuteferos tecircm sido

encontradas proteiacutenas secretoacuterias ricas em cisteiacutenas (CRISP) que foram denominadas de

CRISP1 CRISP2 e CRISP3 Em roedores a CRISP2 (tambeacutem denominada de TPX1) e

CRISP1 (AEG1 glicoproteiacutena epididimal aacutecida-1) satildeo expressas no testiacuteculo e epidiacutedimo

respectivamente poreacutem a CRISP-3 (AEG-2 glicoproteiacutena epididimal aacutecida- 2) foi primeiro

caracterizada na glacircndula salivar (TOumlPFER-PETERSEN et al 2005)

Estas proteiacutenas caracterizam-se por possuiacuterem um domiacutenio CRD (domiacutenio rico em

cisteacuteina)(Figura 4) Recentemente foi encontrada no plasma seminal de equumlinos a CRISP-

3 onde acredita-se que essa proteiacutena possa participar do processo de fertilizaccedilatildeo

Figura 4 Estrutura das proteiacutenas majoritaacuterias do plasma seminal de equumlinos SP-1 e SP-2

que possuem um pequeno Fn-2 com uma estrutura modular AArsquo BBrsquo e ABBrsquo EQ-12

outro membro da famiacutelia das proteiacutenas com o domiacutenio Fn-2 A proteiacutena CRISP que conteacutem

um domiacutenio rico em PR-1 e um domiacutenio rico em cisteiacutena (CRD)

Outras proteiacutenas que estatildeo envolvidas com o processo de fertilizaccedilatildeo jaacute bastante

estudadas em suiacutenos satildeo as espermadesinas estas tambeacutem estatildeo presentes no plasma

seminal de diversas espeacutecies em grandes quantidades

13 O plasma seminal e seu papel na fertilizaccedilatildeo

O reconhecimento e a ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito eacute um processo espeacutecie-

especiacutefico mediado por uma seacuterie de interaccedilotildees entre moleacuteculas complementares

localizadas na superfiacutecie de gametas homoacutelogos (CALVETE et al 1993)

Em mamiacuteferos esta atividade bioloacutegica envolve mecanismos de reconhecimento a

carboidratos bem como proteiacutenas localizadas na superfiacutecie acrossomal do espermatozoacuteide

e ainda cadeias de sacariacutedeos presentes na zona peluacutecida do ooacutecito (McLESKEY et al

Figura 5 Siacutetios de interaccedilatildeo entre carboidratos e proteiacutenas regulando o espermatozoacuteide no

trato reprodutor da fecircmea (DIEKMAN 2003)

A base quiacutemica da interaccedilatildeo dos gametas tem sido recentemente estudada e

encontrou-se uma famiacutelia de proteiacutenas designadas de espermadesinas no trato reprodutor de

suiacutenos e de outros mamiacuteferos (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)

A penetraccedilatildeo do espermatozoacuteide na zona peluacutecida eacute um processo crucial durante as

etapas da fertilizaccedilatildeo A zona peluacutecida dos mamiacuteferos eacute composta por trecircs glicoproteiacutenas

que satildeo produzidas por trecircs genes nomeados de acordo com o seu tamanho Gene ZPA

ZPB e ZPC (PARRY et al 1992 HARRIS et al 1994)

Existem vaacuterias proteiacutenas que foram isoladas e parcialmente caracterizadas na

superfiacutecie dos espermatozoacuteides e que possuem uma capacidade de ligaccedilatildeo com a zona

peluacutecida do ooacutecito (Tabela 3)

Tabela 3 Proteiacutenas de espermatozoacuteide de mamiacuteferos identificadas pela capacidade de

ligarem-se agrave zona peluacutecida do ooacutecito C camundongo Ha hamster Hu humano R rato

Co coelho P porco PG porquinho da iacutendia Ca cavalo W ampla distribuiccedilatildeo

Proteiacutena Espeacutecie Carboidrato

GalTase12 C Resiacuteduo Terminal GlcNac

α-D-manosidase2 C Ha Hu R α 1-3α 1-2 Man

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

Sp563 C Ra Terminal α - Gal

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

C-type MBP6 Hu D-Manose

SLIPI3 68 kDa W Sulfogalactolipiacutedio

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

Sp172 17kDa Co (C Hu) Galactose9 heparina

54 kDa SGR10 Co Hu Galactose9

Espermadesinas3 P Hu β - Gal oligossacariacutedeos

(Pro) acrosinas11 W Polisacaacuteridos sulfatados1Gal Tase β-14-N-acetylglicosamina galactose transferase 2Proteiacutena de membrana plasmaacutetica integral 3Proteiacutena perifeacuterica 4SPI-B inibidor de proteinase serina ndash proteiacutena de ligaccedilatildeo 5 RTK receptor kinase tirosina 6 MBP proteiacutena ligante a manose 7 possivelmente GPI ndash ancora na membrana PH-20 atividade possiacutevel da hialuronidase 8 Sp17 mRNA estaacute presente nesta espeacutecie 9 Este carboidrato possui atividade ligante a uma estrutura proteacuteica do espermatozoacuteide 10SGR receptor galactosyl do espermatozoacuteide 11Proteiacutena acrossomal possui um papel secundaacuterio de moleacutecula de adesatildeo para realizar a reaccedilatildeo acrossocircmica ligando o espermatozoacuteide agrave zona peluacutecida

A zona peluacutecida eacute uma matriz extracelular transparente que envolve o ooacutecito de

mamiacuteferos antes do embriatildeo ser implantado exercendo importantes funccedilotildees durante a

fertilizaccedilatildeo e iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio A zona peluacutecida tambeacutem media o

reconhecimento entre os gametas espermatozoacuteide e ooacutecito induz a reaccedilatildeo acrossocircmica e

inibe a polispermia apoacutes a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999)

As trecircs glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida as quais formam a matriz

extracelular possuem uma estrutura fibrogranular tiacutepica apresentando ligaccedilotildees natildeo

covalentes formando um complexo proteacuteico com grande quantidade de asparagina (N-) e

serinatreonina (θ-) ligada nas cadeias de oligossacariacutedeos (WITZENDORFF et al2005)

Isto provavelmente diferencia as espeacutecies de mamiacuteferos quanto agrave sequumlecircncia de aminoaacutecido

das glicoproteiacutenas da zona peluacutecida (TOumlPFER-PETERSEN 1999)

2 LECTINAS

Lectinas satildeo proteiacutenas capazes de reconhecer e ligar-se de forma especiacutefica e

reverssiacutevel a accediluacutecares estando estes na forma mono ou polissacariacutedeo Esta caracteriacutestica

confere eventualmente as lectinas a capacidade de aglutinarem ceacutelulas e precipitarem

polissacariacutedeos ou glicoproteiacutenas A definiccedilatildeo mais utilizada atualmente propotildee que

lectinas satildeo proteiacutenas de origem natildeo imune que contecircm pelo menos um domiacutenio natildeo

cataliacutetico capaz de ligar-se de maneira reversiacutevel a mono ou oligossacariacutedeos especiacuteficos

podendo ou natildeo apresentar em sua estrutura domiacutenios cataliacuteticos (PEUMANS amp VAN

DAMME 1995) Algumas lectinas por serem monovalentes apresentam um uacutenico sitio de

ligaccedilatildeo a carboidrato natildeo possuindo a habilidade de aglutinarem ceacutelulas e outras podem

tambeacutem apresentar um ou mais siacutetios que natildeo ligam carboidratos mas expressam outra

atividade bioloacutegica (PEUMANS amp VAN DAMME 1998)

22 Histoacuterico das lectinas

Lectinas vegetais foram primeiramente descobertas por Stillmark em 1888 quando

ele estudava a toxicidade de Ricinus communis em sua tese de doutorado onde foi

verificado que ao misturar eritroacutecitos com o extrato dessa semente causava

hemaglutinaccedilatildeo Entretanto esta atividade jaacute havia sido observada por Mitchell antes de

1860 em seu estudo com veneno de cascavel e provavelmente ele foi o primeiro

pesquisador a constatar a atividade de uma lectina Mais tarde em 1902 esta atividade foi

confirmada por Simon Flexner e H Noguchy quando estes escreveram com mais detalhes

a aglutinaccedilatildeo (KILPATRICK 2002)

Apesar das lectinas animais terem sido detectadas em 1860 e as vegetais em 1888

somente em 1919 foi isolada e cristalizada a primeira lectina aquela de sementes de

Canavalia ensiformis (Tabela 4)

23 Classificaccedilatildeo

PEUMANS amp VAN DAMME (1995) fundamentados na estrutura geral dessas

proteiacutenas (Figura 6) dividiram-nas em

a) Merolectinas consistem de um simples domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato isto eacute

satildeo monovalentes e natildeo precipitam glicoconjugados ou aglutinam ceacutelulas

b) Hololectinas consistem de dois ou mais domiacutenios idecircnticos ou muito homoacutelogos

que se ligam ao mesmo accediluacutecar ou accediluacutecares estruturalmente semelhantes Esse tipo de

lectina satildeo por definiccedilatildeo di ou multivalentes e aglutinam ceacutelulas eou precipitam

glicoconjugados

c) Quimerolectinas satildeo proteiacutenas quimeacutericas consistindo de um ou mais domiacutenios

de ligaccedilatildeo a carboidrato e de um domiacutenio natildeo relacionado agrave ligaccedilatildeo com carboidratos que

possui uma atividade enzimaacutetica bem definida ou outra atividade bioloacutegica que deve agir

independente do domiacutenio de ligaccedilatildeo a carboidrato

d) Superlectinas constituiacutedas exclusivamente de dois ou mais domiacutenios de ligaccedilatildeo a

carboidratos que reconhecem estruturalmente accediluacutecares natildeo relacionados

Figura 6 Representaccedilatildeo esquemaacutetica de trecircs tipos de lectinas vegetais merolectinas hololectinas e quimerolectinas (PEUMANS amp VAN DAMME 1995)

Tabela 4 Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinasAno Cientistas Eventos

1860 SWMitchell Descriccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do sangue como indicador da atividade das

lectinas no veneno das cobras 1888 PH Stillmark Detecccedilatildeo da aglutinaccedilatildeo das ceacutelulas por fraccedilotildees proteacuteicas de sementes1891 Ehrlich Aplicaccedilatildeo das plantas toacutexicas aglutinadas como modelos de antiacutegenos1898 M Elfrstrand Introduccedilatildeo do termo hemaglutinas1902 RKraus S Flexner

H Noguchi

Detecccedilatildeo de Glutinas bacterianas e confirmaccedilatildeo da presenccedila de

lectinas no veneno de cobras1906 HJ Bordet FP Gay Descriccedilatildeo de uma atividade para aglutinaccedilatildeo de eritroacutecitos bovinos 1907 K Landstiner H

Raubischek

Detecccedilatildeo de aglutininas natildeo toacutexicas em plantas grupos sanguumliacuteneos

1913 R Kobert Uso de ceacutelulas para purificaccedilatildeo de lectinas1919 JB Sammer Cristalizaccedilatildeo da lectinas Con A 1936 JB Sammer SF Howell Descoberta de hidratos de carbono que se ligam a moleacuteculas da Con A 1941 G K Hirst Detecccedilatildeo de aglutinas virais1947

WC Boyd KO

Renkonen

Detecccedilatildeo de um grupo especiacutefico de lectinas que identificam o grupo

sanguiacuteneo1954 WC Boyd Introduccedilatildeo do termo lectinas quando se faz referecircncia agraves ligaccedilotildees de

carboidratos-proteiacutenas1960 PC Nowell Detecccedilatildeo do potencial mitogecircnico das lectinas em relaccedilatildeo a linfoacutecitos 1965 IL Goldstein BL

Agrawal

Introduccedilatildeo de cromatografia de afinidade para isolar lectinas

1972 GM Edelman KO

Herdman CF Ainsworth

Detecccedilatildeo da sequumlecircncia e da estrutura tridimencional das lectinas

1974 G Ashwell Isolamento de lectinas do fiacutegado de mamiacuteferos1978 TC Borg-Hansen Primeiro encontro internacional sobre lectinas 1979 H Rudiger Detecccedilatildeo de ligandos endoacutegenos de lectinas vegetais 1983 LL Murdock Detecccedilatildeo da accedilatildeo intersticial das lectinas vegetais 1984 HJ Gabius R Lotan

Isolamento das lectinas de tumores

1985 H Rudiger Imobilizaccedilatildeo de glicoproteiacutenas como adsorventes para lectinas 1987 HJ Gabius e col Introduccedilatildeo de glicoconjugados em diagnoacutestico de tumores 1989 WJ Peumans Detecccedilatildeo da accedilatildeo fungicida das lectinas vegetaisFONTE SHARON amp LIS (2004)

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

As galectinas satildeo proteiacutenas com um papel de adesatildeo Estas lectinas foram

localizadas tanto no citoplasma como no nuacutecleo em diferentes tipos celulares e

ocasionalmente tambeacutem satildeo encontradas em superfiacutecie e fora da ceacutelula (LEFFLER et al

A expressatildeo eacute regulada durante o desenvolvimento por exemplo a galectina-1 eacute

predominantemente expressa no iniacutecio do desenvolvimento embrionaacuterio Em experimentos

utilizando camundongos geneticamente modificados com o gene da galectina-1 os animais

natildeo transpareceram anormalidade Estes resultados sugerem que estes animais matecircm um

sistema de compensaccedilatildeo em casos de genes importantes natildeo funcionais (LEFFLER et al

Elevados niacuteveis de galectina-3 estatildeo presentes na superfiacutecie de ceacutelulas canceriacutegenas

em metaacutestase de camundongos e do homem pois estas lectinas podem ser responsaacuteveis

pela adesatildeo das ceacutelulas no organismo sendo uma etapa necessaacuteria para a metaacutestase (LIS amp

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

Essa classe de lectinas tem sido assim denominada devido a necessidade de Ca ++

para realizar a sua atividade bioloacutegica Jaacute foram descritos 50 membros desta classe e todas

estas lectinas apresentaram um domiacutenio extracelular de reconhecimento a carboidrato (C-

CRD) constituiacutedo de 115-130 aminoaacutecidos As lectinas desta classe estatildeo agrupadas em trecircs

famiacutelias as lectinas endociacuteticas as colectinas e as selectinas (LIS amp SHARON 1998)

2421 Lectinas endociacuteticas

As lectinas endociacuteticas satildeo uma classe de lectinas do tipo-C que funcionam como

receptor de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosaminas

galactose e manose-especiacutefica As lectinas endociacuteticas do tipo II satildeo proteiacutenas

transmembranais constituiacutedas de um domiacutenio citoplasmaacutetico N-terminal uma

hidrofobicidade um domiacutenio de membrana e uma regiatildeo C-terminal composta pelo

domiacutenio CRD (LIS amp SHARON 1998)

As lectinas manose-especiacuteficas encontradas na superfiacutecie de macroacutefagos diferem

das outras lectinas endociacuteticas por apresentarem uma proteiacutena transmembranar do tipo I a

extremidade C-terminal da lectina encontra-se no citoplasma da ceacutelula e a extremidade N-

terminal fora da ceacutelula Aleacutem disso a parte extracelular desta moleacutecula apresenta trecircs

domiacutenios um domiacutenio rico em cisteiacutenas uma regiatildeo similar a do tipo II com o domiacutenio

fibronectina e um domiacutenio CRD (DRIKAMER et al 1995)

2422 Colectinas

As colectinas possuem uma funccedilatildeo similar agraves galectinas poreacutem diferem no

mecanismo que eacute realizado por MBPrsquos no soro e fiacutegado de mamiacuteferos Estas lectinas

ligam-se em oligomanosiacutedios de microorganismos infectantes causando ativaccedilatildeo do

sistema complemento sem a participaccedilatildeo de anticorpos e subsequumlente lise de patoacutegenos

(LIS amp SHARON 1998)

2423 Selectinas

As selectinas formam outra famiacutelia de lectinas tipo-C Essas lectinas participam do

papel de interaccedilatildeo de accediluacutecar com lectina no reconhecimento bioloacutegico As selectinas

mediam a adesatildeo dos leucoacutecitos em circulaccedilatildeo para ceacutelulas endoteliais do sangue um preacute-

requisito para a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos para os tecidos Este controle regula o traacutefico do

leucoacutecito para os siacutetios inflamatoacuterios e a migraccedilatildeo dos linfoacutecitos para os oacutergatildeos linfoacuteides

As selectinas satildeo divididas em trecircs tipos as selectinas ndash L (90-110kDa) selectinas ndash E

(115kDa) selectinas-P(140kDa)

243 Lectinas tipo-P

A funccedilatildeo dos receptores de manose-6-fosfato para esta lectina estaacute bem

estabelecida e estas proteiacutenas atuam como passagem de enzimas lisossomais para o

compartimento subcelular onde esse processo eacute mediado pelo reconhecimento entre a

manose-6-fosfato presentes em unidades de oligomanose de enzimas e receptores

(SHARON amp LIS 2004)

244 Lectina tipo-I

As lectinas do tipo-I parecem estar relacionadas com a interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula Essas

lectinas satildeo representadas pelas sialoadesinas do tipo CD22 que se ligam a oligossacariacutedeos

contendo resiacuteduos de aacutecido siaacutelico e as MAG (lectinas presentes na mielina associada a

glicoproteiacutenas) que participam da manutenccedilatildeo da mielina e reconhecimento neuronal

(Figura 7) Em todas estas lectinas a porccedilatildeo N-terminal possui um domiacutenio extracelular

similar

Aleacutem dessas foi descrita uma nova classe de lectinas animais as espermadesinas

que estatildeo presentes no plasma seminal ou perifericamente associadas agrave superfiacutecie de

espermatozoacuteides de vaacuterios mamiacuteferos durante a ejaculaccedilatildeo Tem-se atribuiacutedo a essa nova

classe um papel nas etapas de capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide e na ligaccedilatildeo inicial deste a

glicoconjugados da zona peluacutecida de ooacutecitos homoacutelogos durante o processo de fertilizaccedilatildeo

(CALVETE et al 1995c)

Figura 7 Interaccedilatildeo celular dependente de aacutecido siaacutelico mediado por sialoadesinas (LIS amp

SHARON 1998)

25 Funccedilotildees das Lectinas

A primeira funccedilatildeo fisioloacutegica proposta para as lectinas seria de proteiacutenas de reserva

porque lectinas de leguminosas satildeo sempre encontradas nos corpos proteacuteicos Uma segunda

proposta eacute relacionada ao transporte de accediluacutecares (LIENER et al 1986) Outra funccedilatildeo

proposta para as lectinas seria a de estar envolvida no empacotamento das proteiacutenas de

reserva desde que vaacuterias lectinas de leguminosas testadas demonstraram habilidade para

interagir com proteiacutenas de reserva de suas respectivas plantas (EINHOFF et al 1986)

Tambeacutem jaacute foi demonstrado que a lectina tem papel na elongaccedilatildeo da parede celular

na interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula na regulaccedilatildeo do crescimento na interaccedilatildeo membrana-receptor

na redistribuiccedilatildeo dos componentes da superfiacutecie celular sendo que os mais importantes

efeitos bioloacutegicos das lectinas satildeo agrave aglutinaccedilatildeo de ceacutelulas e a estimulaccedilatildeo mitogecircnica

Devido ao fato das lectinas serem encontradas tambeacutem em partes vegetativas das

plantas como folhas caules cascas de aacutervores e raiacutezes pode-se supor que a funccedilatildeo das

lectinas esteja diretamente relacionada com sua localizaccedilatildeo na planta Existem indicaccedilotildees

de que as lectinas participam do fenocircmeno de reconhecimento intercelular propondo-se

dessa maneira duas possiacuteveis funccedilotildees fisioloacutegicas as lectinas vegetais a mediaccedilatildeo da

simbiose entre bacteacuterias fixadoras de nitrogecircnio de raiacutezes de leguminosas e como agentes

de defesa de plantas contra patoacutegenos e predadores principalmente insetos e fungos

(SHARON amp LIS 1989 CHRISPEELS amp RAIKEL 1991)

As diferentes atividades bioloacutegicas apresentadas pelas lectinas advecircm da sua

propriedade de interagir com carboidratos Assim a presenccedila de accediluacutecares na superfiacutecie das

ceacutelulas correspondendo agrave porccedilatildeo gliciacutedica das glicoproteiacutenas e glicolipiacutedeos de membrana

serve como siacutetios potenciais de ligaccedilatildeo para as lectinas Essa ligaccedilatildeo poderaacute induzir uma

variedade de mudanccedilas levando agrave expressatildeo das propriedades bioloacutegicas (LIS amp

SHARON 1998)

Apesar de mais de um seacuteculo de pesquisas as possiacuteveis funccedilotildees desempenhadas

pelas lectinas nos organismos onde estatildeo localizadas ainda continuam numa posiccedilatildeo como

moleacutecula de reconhecimento ambiacuteguo com miriacuteades de aplicaccedilotildees e funccedilotildees excitantes

A aplicabilidade das lectinas oferece muitas vantagens considerando sua alta

estabilidade e sua distinta especificidade possibilitando uma ferramenta tanto para

propoacutesitos analiacuteticos como preparativos em bioquiacutemica biologia celular imunologia e

aacutereas correlatas O uso das lectinas em aacutereas cliacutenicas e na agricultura tambeacutem teve um

desenvolvimento significativo O emprego de lectinas como ferramenta biotecnoloacutegicas

tem sido cada vez mais ampliada indo desde reagentes no isolamento de substacircncias

contendo accediluacutecares como bioefetores e em bioensaios (SHARON amp LIS 2004) Abaixo satildeo

relacionadas algumas aplicaccedilotildees das lectinas

Isolamento purificaccedilatildeo e estudos estruturais de glicoconjugados

Investigaccedilatildeo de estruturas de carboidratos complexos na superfiacutecie de ceacutelulas e de

partiacuteculas subcelulares de animais bacteacuterias e viacuterus

Estudos de mudanccedilas na superfiacutecie celular sobre transformaccedilotildees malignas

Estimulaccedilatildeo mitogecircnica de linfoacutecitos e estudos de divisatildeo celular constituiccedilatildeo

cromossomal celular e anormalidades cromossomiais

Separaccedilatildeo celular

Diagnoacutestico e identificaccedilatildeo de microorganismos

Tipagem sanguiacutenea

Transportadores de drogas

Defesa de plantas contra predadores

Construccedilatildeo de miacutesseis bioloacutegicos

Uso de plantas transgecircnicas expressando lectinas tornando a planta mais resistente

Lectinas como marcadores taxonocircmicos

Atividades anti-inflamatoacuteria

Atividades proacute-inflamatoacuteria

Avaliaccedilatildeo da qualidade seminal

Segundo Sharon amp Lis (2004) alguns papeacuteis fisioloacutegicos das lectinas jaacute foram

descritos e estatildeo apresentados na Tabela 5

No tocante as lectinas animais espermadesinas estudos tecircm sido realizados

procurando esclarecer o real papel destas lectinas na fisiologia reprodutiva do macho e da

fecircmea

Tabela 5 Funccedilotildees fisioloacutegicas das lectinas

Microorganismo Ameba infecccedilatildeoBacteacuteria infecccedilatildeoInfluenza Viacuterus infecccedilatildeo

Plantas Vaacuterias defesaLeguminosas Simbiose com bacteacuterias produtoras de

Nitrogecircnio

Animais Calnectin Calreticulin

ERGIC-53

Controle de biosiacutentese de glicoproteiacutenas

Colectinas Imunidade Dectinas- I ImunidadeGalectinas Regulaccedilatildeo das ceacutelulas de crescimento e

apoptose regulaccedilatildeo dos ciclos

celulares modulaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula e

interaccedilatildeo substrato-ceacutelulaMacroacutefagos receptores de

manose

Imunidade

Clearance de hormocircnios glicoproteacuteicos

sulfatadosReceptores de Man-6-P Contato das enzimas lisossomaisSelectina L Direccedilatildeo do LinfoacutecitoSelectina E e P Carreamento de linfoacutecitos para os locais

da inflamaccedilatildeoSiglecs Interaccedilatildeo ceacutelula-ceacutelula em sistemas

imunes e neurais

Espermadesinas Interaccedilatildeo espermatozoacuteideooacutecito

3 ESPERMADESINAS

As espermadesinas satildeo uma famiacutelia de proteiacutenas presentes no plasma seminal de

diversas espeacutecies de mamiacuteferos Elas se caracterizam por possuiacuterem um domiacutenio

conservado denominado CUB esta nomenclatura proveacutem das proteiacutenas em que este

domiacutenio foi primeiramente identificado C de subcomponente do complemento (Clr Cls)

U de proteiacutena do embriatildeo do ouriccedilo do mar (Uegf) e B de proteiacutena 1 morfogeneacutetica do osso

(Bmp1) (BORK amp BECKMANN 1993)

A funccedilatildeo bioloacutegica destas proteiacutenas ainda estaacute sendo estudada especula-se que elas

possam participar do processo de capacitaccedilatildeo reconhecimento e ligaccedilatildeo entre os gametas

masculino e feminino (CALVETE et al 1994)

As espermadesinas suiacutenas satildeo as mais estudadas ateacute o momento estas formam um

grupo de proteiacutenas do plasma seminal de peso molecular variando entre 12-16 kDa sendo

secretadas pelo epiteacutelio da vesiacutecula seminal em maior quantidade Aleacutem disso essas

proteiacutenas satildeo compostas por 109-133 aminoaacutecidos contendo duas pontes de disulfeto

possuindo uma identidade de 40-60 na sequumlecircncia de aminoaacutecidos (TOumlPFER-PETERSEN

et al 1996 1998) podem ou natildeo ligar-se a heparina ou ainda possuiacuterem ou natildeo N-

glicosilaccedilatildeo (CABALLERO et al 2005)

As subfamiacutelias AQN (AQN-1 AQN-2 e AQN-3) e AWN (AWN-1 AWN-2)

possuem uma nomenclatura baseada nos trecircs primeiros resiacuteduos de aminoaacutecidos de sua

sequecircncia alanina (A) glutamina (Q) asparagina (N) e triptofano (W) onde os nuacutemeros

indicam a posiccedilatildeo de eluiccedilatildeo destes peptiacutedios em coluna de HPLC de fase reversa Essas

duas subfamiacutelias satildeo proteiacutenas encontradas na regiatildeo acrossomal de espermatozoacuteides

epididimaacuterio e classificadas como proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide

(RODRIGUEZ-MARTINEZ et al 1998 JONAacuteKOVAacute et al 1998 SANZ et al 1991

1992a b e c)

Aleacutem disso a afinidade das proteiacutenas de superfiacutecie do espermatozoacuteide a

polissacarideos e sua interaccedilatildeo com heparina levam a hipoacutetese de que estas proteiacutenas

possam participar do processo de capacitaccedilatildeo espermaacutetica (TIENTHAI et al 2000) E a

capacidade destas proteiacutenas em ligar-se a glicoproteiacutenas presentes na zona peluacutecida

sugerem um papel de interaccedilatildeo entre os gametas (SANZ et al 1993 JONAacuteKOVAacute et al

1998 MANASKOVA et al 1999)

O heterodiacutemero PSP-IPSP-II eacute uma espermadesina de suiacuteno com duas subunidades

(PSP-I e PSP-II) que satildeo unidas por ligaccedilatildeo natildeo covalente e possuem 109 e 116

aminoaacutecidos respectivamente (CALVETE et al 1995a) Sua estrutura tridimensional

determinada por ROMERO et al 1996 e 1997 revelaram a arquitetura do domiacutenio CUB

desta proteiacutena

A espermadesina PSP-II apresenta um siacutetio de ligaccedilatildeo N-glicosilado e ela forma um

heterodiacutemero com especificidade a N-glicoforma da PSP-I as duas subunidades possuem

uma capacidade de ligar-se a heparina (Figura 8) enquanto que o complexo PSP-IPSP-II

natildeo possui (CALVETE et al 1995a)

Figura 8 Proposta do tetrassacariacutedeo de ligaccedilatildeo a heparina na PSP-II Em vermelho

observa-se a porccedilatildeo eletronegativa e em azul a porccedilatildeo eletropositiva da proteiacutena (SOLIacuteS et

al 1998)

As subunidades PSP-I e PSP-II ligam-se a carboidratos como a fucose galactose

manose glicosaminas galatosamina e aacutecido N-acetilneuramiacutenico (CALVETE et al

1995a)

Aleacutem disso a PSP-II e o heterodiacutemero PSP-IPSP-II apresentaram capacidade de

ligar-se a glicoproteiacutenas da zona peluacutecida de ooacutecitos isto sugere que a capacidade de

ligaccedilatildeo do espermatozoacuteide ao ooacutecito estaacute ligada agrave moleacutecula da PSP-II e natildeo a PSP-I (Figura

9) (CALVETE et al 1995a)

Foi descrito por ASSREUY et al 2002 que o complexo heterodimeacuterico (PSP-

IPSP-II) pode apresentar uma modulaccedilatildeo na atividade imune no trato reprodutor feminino

para que ocorra a fecundaccedilatildeo isto foi verificado pela presenccedila de atividade proacute-

inflamatoacuteria e imunoestimulatoacuteria deste complexo heterodimeacuterico in-vitro

Figura 9 Representaccedilatildeo da estrutura da PSP-I mostrando o domiacutenio CUB As pontes de

dissulfeto entre os resiacuteduos de cisteiacutena estatildeo em vermelho (9 a 30) e em verde (53 a 74) A

posiccedilatildeo do resiacuteduo de glicosilaccedilatildeo da PSP-I (Asn50 na bola e bastotildees vermelhos) e da PSP-

II (Asn98 bola azul)

Quanto a espeacutecie bovina satildeo conhecidas duas espermadesinas a aSFP (acidic

seminal fluid protein) e a Z13 A aSFP eacute um polipeptiacutedio natildeo glicosilado de 129kDa

purificado a partir do plasma seminal de bovinos Jaacute foram realizadas a caracterizaccedilatildeo e a

clonagem do cDNA da aSFP (WEMPE et al 1992) onde foi demonstrado que esta

proteiacutena eacute um produto da vesiacutecula seminal do tecidos da ampola do ducto deferente e do

epidiacutedimo (SCHONECK et al 1996)

A aSFP tem sido detectada tambeacutem em outros tecidos animais como caprinos

ovinos suiacutenos ratos catildees e humanos (EINSPANIER et al 1994 WEMPE et al 1992)

Em bovinos a aSFP eacute o componente majoritaacuterio encontrando-se em uma concentraccedilatildeo que

varia entre 2 a 7 mgmL (DOSTAgraveLOVAgrave et al 1994 1995 EINSPANIER et al 1994)

A estrutura primaacuteria da aSFP apresenta 114 aminoaacutecidos e duas pontes de dissulfeto

ligando as cisteiacutenas (EINSPANIER et al 1994)

ROMAtildeO et al 1997 modelaram a estrutura cristal da aSFP com uma resoluccedilatildeo de

19 degA verificando-se a presenccedila do domiacutenio CUB e a sua similaridade com a PSP-I e a

PSP-II com pequenas diferenccedilas na sequumlecircncia dos aminoaacutecidos que provavelmente

caracterizam a funccedilotildees espeacutecie-especiacuteficas destas proteiacutenas (Figura 9)

A Z13 eacute uma nova proteiacutena do plasma seminal de bovinos que possui duas pontes

de dissulfeto e uma massa molecular aparente de 13kDa Eacute uma proteiacutena natildeo glicosilada

que apresenta alta similaridade com a aSFP e natildeo possui propriedades de ligaccedilatildeo a heparina

(TADESHI et al 2000)

Foi isolado do plasma seminal de cavalos uma proteiacutena denominada SSP-7

(stallion seminal plasma) (REINERT et al 1997) com sequumlecircncia de aminoaacutecidos

homoacuteloga a espermadesina suiacutena AWN A SSP-7 e AWN apresentam a capacidade comum

de ligar-se a carboidratos da zona peluacutecida Em funccedilatildeo disso supotildee-se que estas

espermadesinas desempenham um importante papel como moleacuteculas de adesatildeo primaacuteria

nas etapas iniciais do processo de fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp CALVETE 1996)

Figura 10 Representaccedilatildeo esteacutereo da superposiccedilatildeo das cadeias Cα dos domiacutenios CUB da

aSFP (em vermelho) e PSP-I (em verde) mostrando um grande nuacutemero de resiacuteduos

hidrofoacutebicos entre as duas estruturas (ROMAtildeO et al 1997)

Recentemente foi detectada e isolada uma proteiacutena homoacuteloga as espermadesinas no

plasma seminal de caprinos (TEIXEIRA et al 2002) O seu N-terminal eacute homoacutelogo a

AQN-1 e AWN de suiacuteno e AWN (HSP-7) de equumlino sendo denominada de Proteiacutena do

Fluido Seminal de Caprinos (BSFP)

A BSFP possui uma massa molecular adquirida por MALDI-TOF de 12591 Da

estando de acordo com a massa molecular das demais espermadesinas Poreacutem ainda satildeo

necessaacuterios novos estudos no plasma seminal de caprinos visando agrave presenccedila de outras

espermadesinas

31 Anaacutelise dos genes das espermadesinas

Recentes estudos isolaram os cDNAs que codificam as espermadesinas (Tabela 6)

em suiacutenos e bovinos onde foram realizadas anaacutelise comparativa entre vaacuterias outras

espeacutecies de mamiacuteferos

Tabela 6 cDNA das espermadesinas encontradas em suiacutenos e bovinos

cDNA Espeacutecie Proteiacutena codificada (aa) Nuacutemero de acesso AWN suiacuteno 154 AJ853850AQN suiacuteno 132 AJ853854 AJ8553855PSP-II suiacuteno 137 AJ853853PSP-I suiacuteno 133 AJ853852AQN-3 suiacuteno 137 AJ853851SPADH1 (aSFP) bovino 134 M84603SPADH2 (Z13) bovino 132 AJ853856 AJ853857FONTE HAASE et al 2005

A anaacutelise da sequumlecircncia genocircmica de humanos camundongos e ratos revelaram que

80 das proteiacutenas codificadas de genes satildeo conservadas em uma relaccedilatildeo de 11 nos genes

correspondentes entre as diferentes espeacutecies de mamiacuteferos Os 20 dos genes de

mamiacuteferos remanescentes satildeo oriundos de duplicaccedilatildeo e perdas geneacuteticas observadas entre

os animais

A localizaccedilatildeo cromossomal de algumas espermadesinas jaacute foi descrita por Haase et

al (2005) Os autores verificaram que o clone RP44-374013 continha parte dos genes das

espermadesinas AWN e AQN1 marcados com digoxigenin Estes genes suiacutenos foram

hibridizados em cromossomos em metaacutefase utilizando sonda GTG atraveacutes do meacutetodo de

hibridizaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia (Figura 11)

A anaacutelise evolutiva desses genes de espermadesinas sugere que o padratildeo de

diversidade observado eacute devido agrave variaccedilatildeo ancestral recombinaccedilatildeo e novas mutaccedilotildees

(HAASE et al 2005)

Figura 11 Localizaccedilatildeo cromossomal dos agrupamentos de genes (Clusters) das

espermadesinas determinado por hibridaccedilatildeo in situ com fluorescecircncia FISH (HAASE et

al 2005)

JUSTIFICATIVA

A caprinocultura apresenta-se na atualidade como uma excelente opccedilatildeo no setor

primaacuterio da economia para o desenvolvimento do paiacutes Portanto a exploraccedilatildeo racional

desta espeacutecie poderaacute favorecer o fornecimento de proteiacutena de origem animal e

desenvolvimento de empreendimentos rurais Neste uacuteltimo aspecto a exploraccedilatildeo de

animais geneticamente superiores iraacute contribuir para formaccedilatildeo de um rebanho mais

produtivo

Atraveacutes da inseminaccedilatildeo artificial com secircmen de machos comprovadamente

melhoradores e da produccedilatildeo de embriotildees tanto in vivo como in vitro o rebanho caprino

nacional obteraacute uma melhoria quanti-qualitativa de maneira mais raacutepida Dessa forma o

uso de biotecnologias aplicadas agrave reproduccedilatildeo deveraacute otimizar os resultados relacionados a

reproduccedilatildeo na espeacutecie caprina

No entanto o uso destas bioteacutecnicas implica no conhecimento especiacutefico de

diferentes etapas da fisiologia reprodutiva destes animais como por exemplo o processo de

fecundaccedilatildeo que pode ser otimizado contribuindo para o melhor sucesso da inseminaccedilatildeo

artificial bem como da produccedilatildeo de embriotildees Recentemente trabalhos com espeacutecies

domeacutesticas de produccedilatildeo (suiacutenos bovinos e equumlinos entre outras) tecircm demonstrado a

presenccedila de proteiacutenas seminais ligadas agrave interaccedilatildeo de gametas Em caprinos foi verificada

a presenccedila desta proteiacutena (espermadesina) no plasma seminal

Diferentemente das demais espeacutecies de mamiacuteferos das quais jaacute foram isoladas

espermadesinas os caprinos possuem baixo volume de ejaculado Essa caracteriacutestica

dificulta ou inviabiliza a purificaccedilatildeo da espermadesina caprina BSFP atraveacutes das teacutecnicas

bioquiacutemicas utilizadas convencionalmente Aleacutem disso pode impedir a descoberta de

outras proteiacutenas minoritaacuterias de importacircncia desconhecida para a reproduccedilatildeo da espeacutecie

Assim a biologia molecular apresenta-se como uma ferramenta uacutetil para transpor este

problema

HIPOacuteTESES CIENTIacuteFICAS

A BSFP uma espermadesina presente no plasma caprino pode ser adequadamente

purificada por cromatografia de troca iocircnica associada agrave cromatografia de afinidade a

heparina

A BSFP eacute codificada por um gene expresso no trato reprodutor masculino em

especial na vesiacutecula seminal e no testiacuteculo

OBJETIVOS

bull Caracterizar a espermadesina caprina (BSFP) e identificar o gene que a

codifica

Especiacuteficos

bull Estudar um meacutetodo para melhorar a purificaccedilatildeo da espermadesina BSFP

bull Identificar o gene que codifica a espermadesina BSFP

bull Identificar os tecidos do trato reprodutor masculino nos quais o gene da

BSFP eacute expresso

bull Clonar e sequumlecircnciar o gene da BSFP

CAPIacuteTULO II ndash CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA PARA OBTENCcedilAtildeO DE

UMA ESPERMADESINA DO PLASMA SEMINAL DE CAPRINOS DOMEacuteSTICOS

(CAPRA HIRCUS)

Local e Animais Experimentais

O experimento foi realizado no Laboratoacuterio de Fisiologia e Controle da Reproduccedilatildeo

(LFCR) da Universidade Estadual do Cearaacute-Faculdade de Veterinaacuteria e no Laboratoacuterio de

Moleacuteculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab) da Universidade Federal do Cearaacute ambos

localizados em Fortaleza-CE Brasil (3deg43rsquoS 38deg30rsquoW)

Quatro bodes da raccedila Saanen (Capra hircus) de idade variando entre dois e quatro

anos foram usados para colheita de secircmen Estes animais eram criados em baias de 4 m2 de

aacuterea e bem ventiladas Os animais foram alimentados com capim elefante (Pennisetum

purpureum) e com concentrado (no miacutenimo 18 de proteiacutena bruta) Os mesmos tinham

livre acesso a aacutegua e sal mineral

Colheita e conservaccedilatildeo do secircmen

O secircmen foi colhido duas vezes por semana agraves 700 da manhatilde utilizando uma

vagina artificial com temperatura e pressatildeo controladas Para o procedimento da colheita

foi utilizada uma fecircmea caprina com estro induzido por injeccedilatildeo intramuscular de benzoato

de estradiol Apoacutes a colheita o secircmen foi avaliado para os seguintes paracircmetros volume

(mL) motilidade massal (escala de 0 a 5) e motilidade individual progressiva (escala de 0 a

O secircmen colhido foi centrifugado a 800 g por 10 min e o pellete de

espermatozoacuteides foi descartado O sobrenadante (plasma seminal) foi estocado a -20degC

para ser usado posteriormente

Isolamento

Um pool do plasma seminal foi dializado contra aacutegua destilada para em seguida ser

congelado As proteiacutenas liofilizadas (20 mg) foram dissolvidas em tampatildeo fosfato 002M

(pH 70) e colocados em coluna de troca iocircnica (DEAE-Sephacel 12 x 20 cm) a qual foi

previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo Apoacutes remoccedilatildeo do material natildeo retido a

coluna foi eluiacuteda com um gradiente de NaCl (0-1M)

As proteiacutenas dializadas-liofilizadas obtidas no pico da DEAE-Sephacel foram

aplicadas a uma coluna C2C18 (100 x 46 mm 3microm 120 Aring Amersham Bioscience

Uppsala Sueacutecia) acoplada a um sistema de cromatografia liacutequida de alta precisatildeo de fase

reversa (RP-HPLC) As proteiacutenas foram eluidas usando os seguintes tampotildees 01 (vv)

de Aacutecido Trifluoroaceacutetico (TFA) diluiacutedos em aacutegua (solvente A) e 01 (vv) de TFA em

acetonitrila (Solvente B) primeiramente 0 de B (7 minutos) logo apoacutes um gradiente de

0-40 de B (por 4 minutos) 40-45 de B (por 11 minutos) e 100 de B (10minutos)

isocraticamente As fraccedilotildees foram colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280

nm As proteiacutenas eluiacutedas foram liofilizadas e analizadas posteriormente por eletroforese

Detecccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo

O Gel de Eletroforese de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS-PAGE) foi

realizado a 125 de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970) O N-terminal

da espermadesina putativa foi sequumlenciado em um Applied Biosistems 477A (Applied

Biosystems Foster City USA)

As proteiacutenas obtidas na cromatografia de DEAE-Sephacel foram dializadas logo

apoacutes diluiacutedas em tampatildeo de fosfato 002M (pH 70) concentradas em 05 mL e colocadas

em uma coluna de Alta Precisatildeo de Heparina-Sepharose (07 x 25 cm 34 microm Amersham

Bioscience Uppsala Sueacutecia) a qual foi previamente equilibrada com o mesmo tampatildeo

Apoacutes a amostra ser colocada dentro da coluna o fluxo foi parado por 15 minutos para que

as proteiacutenas ligassem a mesma Logo apoacutes o fluxo foi retomado e o pico natildeo retido da

coluna foi eluiacutedo com gradiente de concentraccedilatildeo da NaCl (0-1M) As fraccedilotildees foram

colhidas a um fluxo de 1mLmin e monitoradas a 280nm As proteiacutenas eluiacutedas foram

liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE como descrito anteriormente

Muacuteltiplo alinhamento para procura de similaridade

A sequumlecircncia de aminoaacutecidos foi alinhada usando o programa CLUSTAL W

(CHENNA et al 2003) A aacutervore do cladograma foi feita usando o mesmo programa de

acordo com o meacutetodo PHYLIP (SAITOU amp NEI 1987)

RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Embora vaacuterias proteiacutenas do plasma seminal de diferentes espeacutecies de mamiacuteferos

possuam uma estrutura primaacuteria homoacuteloga (EINSPANIER et al 1994 REINERT et al

1996 JONAacuteKOVAacute et al 1998) seus papeacuteis no processo de fertilizaccedilatildeo podem ser

diferentes As proteiacutenas relacionadas agraves espermadesinas suiacutenas tambeacutem foram encontradas

no plasma seminal de bovinos e equumlinos (EINSPANIER et al 1994 1991 CALVETE et

al 1995b) Poreacutem pouca atenccedilatildeo tem sido demonstrada agraves proteiacutenas de caprinos

homoacutelogas agraves espermadesinas suiacutenas

O secircmen colhido durante todo o periacuteodo experimental mostrou valores normais de

volume motilidade massal e motilidade individual progressiva Estes valores estatildeo de

acordo com os paracircmetros esperados para machos caprinos usados em centros de

inseminaccedilatildeo artificial (LEBOEUF et al 2000)

O plasma seminal caprino apoacutes ter sido passado em uma coluna cromatograacutefica de

troca-iocircnica DEAE-SEPHACEL (Figura 12) apresentou uma fraccedilatildeo maior retida de 647 plusmn

063 mg (meacutedia plusmn EP n=10) O rendimento destas proteiacutenas eluiacutedas foi de 3235 plusmn 316

(mm) em relaccedilatildeo ao material inicial

Figura 12 Cromatografia de troca iocircnica DEAE-Sephacel do plasma seminal de caprinos

A coluna foi lavada com 002M de tampatildeo fosfato pH 70 a taxa do fluxo foi de 30 mLh e

o material retido foi eluiacutedo com gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl

A figura 13 mostra o padratildeo de eluiccedilatildeo do pico retido na coluna de troca iocircnica

sendo passado em RP-HPLC A proteiacutena estudada foi obtida em estado puro e a sequumlecircncia

destas cromatografias foram eficientes para purificar esta proteiacutena como demonstrado por

SDS-PAGE (figura 13 ndash inserccedilatildeo) Esta proteiacutena mostrou uma massa molecular aparente de

12 kDa e foi primariamente nomeada de BSFP (Proteiacutena do Fluiacutedo Seminal de Caprinos)

como foi previamente descrito por Teixeira et al (2002) A massa molecular foi verificada

pelos mesmos autores usando MALDI-TOF e exibiu um valor de 12591 Da O valor da

massa molecular foi similar agrave reportada para AWN uma proteiacutena multifuncional de 14

kDa isolada do plasma seminal de suiacutenos a qual eacute a espermadesina mais bem caracterizada

estruturalmente ateacute o momento (ENSSLIN et al 1995 JELINKOVA et al 2003

JELINKOVA et al 2004)

Figura 13 Cromatograma dos picos da fraccedilatildeo retida em colunas DEAE-Sephacel aplicada

em Coluna de Fase Reversa acoplada a um sistema de Cromatografia Liacutequida de Alta

Precisatildeo ndash RP-HPLC As proteiacutenas foram eluiacutedas usando 01 (vv) de TFA diluiacutedos em

aacutegua (Solvente A) e 01 (vv) de acetonitrila em TFA (Solvente B) Anexo Anaacutelise em

eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1 Plasma seminal de caprinos 2 Plasma

seminal de caprinos apoacutes cromatografia DEAE e 3 BSFP (proteiacutena do fluiacutedo seminal de

caprinos) obtida por RP-HPLC (seta dentro do cromatograma)

A sequumlecircncia do N-terminal da BSFP foi determinada por um sequumlenciador

automaacutetico e estaacute demonstrada na Figura 14A A BSFP exibiu uma homologia na sequumlecircncia

do seu N-terminal com as espermadesinas suiacutenas (AQN-1 e AWN) equumlina (AWN) e

bovina (aSFP) (Figura 14B) Aleacutem disso a BSFP tambeacutem exibiu um alto grau de

similaridade (50) com a sequecircncia do N-terminal da AQN-1 suiacutena Alguns membros da

famiacutelia das espermadesinas apresentam 40 a 90 de identidades de sequumlecircncia mas natildeo

foram equivalentes funcionalmente (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)

Figura 14 Comparaccedilatildeo da sequumlecircncia de aminoaacutecidos do N-terminal das espermadesinas

de suiacuteno (AQN-1 AWN) equinio (AWN) e bovina (aSFP) A) Alinhamento realizado pelo

CLUSTAL W ldquordquo medias idecircnticas dos resiacuteduos dentro da coluna para todas as sequumlecircncias

e ldquordquo substituiccedilatildeo das medias semi-conservadas B) Cladograma obtido pelo alinhamento

CLUSTAL W

Proteiacutenas do plasma seminal da famiacutelia das espermadhesinas ligantes a

carboidratos e heparina estatildeo ancoradas na superfiacutecie do espermatozoacuteide de suiacutenos e

equumlinos apoacutes a ejaculaccedilatildeo Essas proteiacutenas parecem participar do processo de capacitaccedilatildeo

espermaacutetica no reconhecimento e mecanismo inicial de ligaccedilatildeo proteiacutena-carboidrato

presente em gametas homoacutelogos durante a fertilizaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN amp

CALVETE 1996 REINERT et al 1996)

Poreacutem cada espermadesina exibe diferentes tipos de afinidade dependendo datildeo seu

estado de glicosilaccedilatildeo e agregaccedilatildeo (TOumlPFER-PETERSEN 1999) Aleacutem disso outras

espermadesinas natildeo mostraram interaccedilatildeo com heparina e glicoconjugados da zona peluacutecida

por exemplo a PSP-I (VARELA et al 1997) o complexo PSP-IPSP-II (SOLIacuteS et al

1998) e a espermadesina de bovinos aSFP (ROMAtildeO et al 1997) Em nosso estudo a

BSFP natildeo mostrou capacidade de ligar-se agrave heparina como observado no poccedilo 1 uma

fraccedilatildeo natildeo retida da DEAE-Sephacel aplicada em coluna de heparina-Sepharose e analisada

por Gel de eletroforese poliacrilamida-SDS (Figura 15)

Figura 15 Cromatografia liacutequida de alta pressatildeo acoplada a uma coluna de heparina-

sepharose da fraccedilatildeo retida em DEAE-Sephacel Inserccedilatildeo Anaacutelise das fraccedilotildees proteacuteicas por

Eletroforese em Gel de poliacrilamida ndash SDS 1) proteiacutenas natildeo-ligantes a heparina 2)

espermadesinas suiacutenas (14 kDa) 3) proteiacutena ligante a heparina 4) marcador de massa

molecular de cima para baixo albumina seacuterica bovina (66 kDa) ovalbumina (45 kDa)

glicealdeiacutedo-3-fosfato-desidrogenase (36 kDa) anidrase carbocircnica (29kDa) tripsinogecircnio

(24kDa) inibidor de tripsina (201 kDa)α -lactalbumina (142 kDa)

Em caprinos outro grupo de proteiacutenas (GSP-14 GSP-15 GSP-20 e GSP-22 kDa)

foi isolado do plasma seminal e separado de acordo com a afinidade agrave heparina

(VILLEMURE et al 2003) Similarmente agrave GSP-14 e GSP-15 kDa BSFP foi observada

na fraccedilatildeo natildeo ligante agrave heparina Poreacutem baseado na sequumlecircncia do N-terminal dos

aminoaacutecidos a BSFP e a GSP satildeo consideradas proteiacutenas diferentes

As espermadesinas de diferentes espeacutecies domeacutesticas especialmente suiacutenos

(CALVETE et al 1995b) e equumlino (CALVETE et al 1997) satildeo obtidas rotineiramente

por cromatografia de afinidade agrave heparina como primeiro passo de isolamento

No entanto no presente estudo o iniacutecio do fracionamento do plasma seminal por

cromatografia de troca iocircnica foi um meacutetodo simples e eficiente em relaccedilatildeo ao anterior para

obter a BSFP Em nosso conhecimento esta eacute uma nova abordagem para simplificar a

purificaccedilatildeo das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas

CAPIacuteTULO III ndash Genes de bode (Capra hircus) que codificam novos membros da

famiacutelia das espermadesinas

Isolamento de RNA do tecido do testiacuteculo e vesiacutecula seminal

O testiacuteculo e a vesiacutecula seminal foram excisados de um bode (Capra hircus) adulto

sem raccedila definida O animal foi anestesiado e sacrificado de acordo com as normas de bem

estar animal (VAN ZUTPHEN amp BALLS 1997) A vesiacutecula seminal foi acessada por

procedimento ciruacutergico seguindo sua localizaccedilatildeo anatocircmica (ASDOWN amp DONE 2003)

Duas amostras representativas do testiacuteculo foram obtidas a partir de duas diferentes aacutereas

topoloacutegicas Apoacutes a coleta os tecidos foram imersos em nitrogecircnio e mantidos ateacute o

isolamento total de RNA Este foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen Carlsbad-

CA EUA) De forma resumida uma grama de cada amostra congelada foi macerada ateacute a

forma de poacute e adicionada ao reagente Trizol (10 mL) Apoacutes a homogenizaccedilatildeo da amostra

utilizando o glass-Teflon foi realizado o isolamento por separaccedilatildeo de fase e precipitaccedilatildeo do

RNA utilizando clorofoacutermio e aacutelcool isopropiacutelico respectivamente (Figura 16) Os pellets

de RNA total foram lavados com etanol a 70 e dissolvidos em aacutegua com RNAase O

RNAM foi obtido a partir do RNA total utilizando-se kit de purificaccedilatildeo de RNAm

(Invitrogen Carlsbad-CA EUA) contendo colunas cromatograacuteficas de afinidade a

oligo(dT) celulose A produccedilatildeo e a qualidade do RNA total e RNAm foram determinadas

por espectrofotometria usando 260 nm e uma relaccedilatildeo 260280 nm respectivamente

Figura 16 Esquema simplificado da fase de separaccedilatildeo e precipitaccedilatildeo do RNA total

Siacutentese e amplificaccedilatildeo da fita de cDNA

A primeira fita de cDNA foi sintetizada atraveacutes da transcriptase reversa acoplada a

uma reaccedilatildeo de cadeia de polimerase (RT-PCR) utilizando um 3rsquoadaptor-Oligo (dT)-18 (QT

5-CAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T18)-3) 06 microg de mRNA e

Moloney Murine Leukemia Viacuterus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) (Promega

Madison-WI EUA) A 3rsquo amplificaccedilatildeo raacutepida de cDNA final (3rsquoRACE) foi desenvolvida

atraveacutes da reaccedilatildeo de polimerase em cadeia (PCR) Foram utilizados dois primers gene-

especiacuteficos (SMD-SE1 e SMD-SE2) O SMD-SE1 (5rsquo-CCTTGCTCAGTACAGC-3rsquo) foi

desenhado a partir de regiotildees homoacutelogas das sequumlecircncias de proteiacutenas da famiacutelia das

espermadesinas de suiacutenos e equumlinos (PSP-I PSP-II AQN-1 AWN HSP-7) O outro primer

gene-especiacutefico SMD-SE2 (5rsquo-TGTGGGGGNGTCCNCAGA-3rsquo) foi desenhado a partir

da sequumlecircncia do N-terminal da proteiacutena espermadesina de caprino descrita anteriormente

(TEIXEIRA et al 2002) O primer anti-senso foi complementado pelo QT nomeado de Q0

(5-CCAGTGAGCAGAGTGACGA-3) da Clontech (Mountain View-CA EUA) Os

produtos foram analisados com gel de agarose a 1 e corados com brometo de etiacutedio

Clonagem dos genes da espermadesina de bode

A subclonagem foi realizada com o sistema pGEM-T Easy Vector (Promega

Madison-WI EUA) Para realizaccedilatildeo deste meacutetodo 30 microg de RNA total foi adicionado a

reaccedilatildeo de polimerase em cadeia contendo 1microgmicrol do adaptador QT 1microL de inibidor de

RNase-livre e 5microL de ddH2O perfazendo um total de 27microL de reaccedilatildeo Em seguida esta

reaccedilatildeo foi colocada a 70degC por 5 minutos Os tubos foram mantidos em gelo para impedir a

formaccedilatildeo de estruturas secundaacuterias Foi adicionado o template contendo 10microL de tampatildeo

MMLV-RT (Moloney murine Leukemia Viacuterus Reverse Trascriptase) 10microL dNTPs

(10mM) foi realizada uma leve agitaccedilatildeo e incubado por 60 minutos a 37 degC

A transformaccedilatildeo de E coli (JM109 Promega Madison-WI EUA) com produtos da

sub-clonagem foi realizada pelo meacutetodo do cloreto de caacutelcio (Figura 17)

Figura 17 Transformaccedilatildeo da bacteacuteria E coli

As ceacutelulas foram concentradas por centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em soluccedilatildeo

contendo cloreto de caacutelcio As ceacutelulas competentes contendo DNAs plasmiacutedicos foram

agitadas apoacutes receberem um choque teacutermico As ceacutelulas foram cultivadas em meio natildeo

seletivo contendo 1 de triptona 05 de extrato de levedura 025 de NaCl 4 de aacutegar

e 10microgmL de ampicilina O meio foi colocado em placa de petri e incubado a 37degC por 13

horas Apoacutes esse periacuteodo as colocircnias recombinantes foram colhidas sob condiccedilotildees esteacutereis e

incubadas em meio LB liacutequido

A extraccedilatildeo e a purificaccedilatildeo dos plasmiacutedios foram realizadas pelo meacutetodo de lise

alcalina atraveacutes do kit GFX Micro Plasmid Prep (GE Healthcare Piscataway-NJ EUA)

Os plasmiacutedios purificados foram quantificados em espectofotocircmetro

Sequumlecircnciamento e anaacutelise da sequumlecircncia de DNA

Os possiacuteveis candidatos a clone foram sequumlenciados usando os primers M13F ou T7

como primers senso e M13R ou SP6 da Clontech (Mountain View-CA EUA) As

sequumlecircncias de nucleoiacutedeos foram obtidas em um sistema de anaacutelise de DNA MegaBACE

(GE Healthcare EUA) A procura para comparaccedilatildeo dos genes encontrados foi realizada em

um banco de dados utilizando o BLAST (ALTSCHUL et al 1990) do National Center for

Biotechnology Information - NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)

As sequumlecircncias de aminoaacutecidos obtidas a partir dos cDNAs das espermadesinas de

caprinos foram comparadas em um banco de proteiacutenas no NCBI (httpwwwrcsborgpdb)

usando a ferramenta de busca e alinhamento de proteiacutenas denominada BLASTP

(ALTSCHUL et al 1997) Algumas sequumlecircncias foram escolhidas pelo melhor escore apoacutes

alinhamento e foram usadas para identificar resiacuteduos conservados das sequumlecircncias

homoacutelogas Aleacutem disso foi realizada uma comparaccedilatildeo com o alinhamento e a relaccedilatildeo

filogeneacutetica com as sequumlecircncias das espermadesinas de mamiacuteferos Sus Scrofa (AAB21990

P26322 S39434) Equus caballus (P80720) e Bos taurus (AAA30745) sendo usado o

programa Clustal W (HIGGINS et al 1994) disponiacutevel no site do European

Bioinformatics Institute (EBI) (httpwwwebiacuk)

RESULTADOS

Siacutentese e amplificaccedilatildeo do cDNA

A RT-PCR usando o protocolo do adaptador QT promoveu o isolamento da fita

completa de cDNA (Figura 18A) Nenhum produto do PCR foi verificado apoacutes testes com

os primers Q0SMD-SE1 tanto do tecido de testiacuteculos e vesiacutecula seminal (dados natildeo

mostrados) Poreacutem usando os primers Q0 e SMD-SE2 foi detectado uma banda de

aproximadamente 700 pares de base (pb) unicamente na vesiacutecula seminal (Figura 18B)

Figura 18 (A) Anaacutelise eletroforeacutetica do cDNA sintetizado de testiacuteculo (T) e vesiacutecula

seminal (SV) apoacutes RT-PCR (B) Amplificaccedilatildeo do cDNA 3rsquo-end usando primers Q0 e

SMD-SE2 As bandas em SV satildeo os genes da bodesina

Identificatificaccedilatildeo do cDNA das espermadesinas de bode

Os cDNAs das espermadesinas de caprinos (Capra hircus) foram isolados por

screening de 40 clones recombinantes de insertos de bacteacuterias com primers especiacuteficos

M13R e M13F usando PCR A anaacutelise da sequumlecircncia de nucleotiacutedeos de 33 clones

recombinantes revelou trecircs insertos correspondendo agraves espermadesinas maturas (Tabela 7)

denominados de Bodesina-1 (Bdh-1) Bodesina-2 (Bdh-2) e Bodesina-3 (Bdh-3) Todos os

trecircs clones contendo os insertos variaram entre 604 e 608 pares de base interposto no open

reading frames (ORF) na posiccedilatildeo 1 a 315 e terminados por dois stop coacutedons consecutivos

(TAGTGA) A regiatildeo codificante apresentou aproximadamente 259 pares de base da regiatildeo

3rsquo natildeo codificante (3rsquoUTR) O local do possiacutevel sinal de poliadenilaccedilatildeo (AATAAA) estava

presente nos nucleotiacutedeos 579 578 e 577 para Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 respectivamente

Tabela 7 cDNAs das espermadesinas

5rsquo-UTR ORF 3rsquo-UTR Proteiacutena

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

Bdh-1 Desconhecido 315 260 105 a DQ204877 Este trabalhoBdh-2 ldquo 315 259 105 b Submetido ldquoBdh-3 ldquo 315 258 105 a ldquo ldquoAWN 29 465 217 154 AJ853850 Haase et al 2005

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

aSFP 29d 405 252 134 M84603 Haase et al 2005AQN-3 29 414 266 137 AJ853851 Haase et al 2005a = Proteiacutena matura com N-terminal incompletob = Proteiacutena matura sem sete resiacuteduos de aminoaacutecido do N-terminal descrito anteriormente (Teixeira et al 2002)c = Duas alternativas de splices variantes da AQN-1 descritad = O siacutetio da transcriccedilatildeo inicial dos genes bovinos onde foram inferidas pela comparaccedilatildeo da sequumlecircncia genocircmica bovina e suiacutena onde evidecircncias experimentais foram avaliadas

Alinhamento da sequumlecircncia de proteiacutenas e procura por similaridade

As proteiacutenas maduras deduzidas das sequumlecircncias de cDNA apresentaram

aproximadamente 105 resiacuteduos de aminoaacutecidos A anaacutelise da estrutura primaacuteria das trecircs

proteiacutenas mostrou uma regiatildeo conservada que prediz um uacutenico domiacutenio CUB (Figura 19)

tiacutepico das proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas

A similaridade entre as isoformas 1 2 e 3 das bodesinas variaram de 97 a 98

calculada pelo programa Clustal W com paracircmetros padrotildees A Bhd-2 apresentou uma

Leu5 e uma Ser104 ao inveacutes de His5 e Gln104 quando comparada com as demais

bodesinas Aleacutem disso a Bdh-3 mostrou um resiacuteduo de lisina em substituiccedilatildeo a uma

arginina em Bdh-1 e Bdh-2 na posiccedilatildeo 64 Finalmente a Bdh-1 apresentou uma leucina na

posiccedilatildeo 65 enquanto as outras bodesinas tinham uma fenilalanina (Figura 19A) Outras

discrepacircncias de nucleotiacutedeos foram vistas entre os cDNAs das bodesinas mas eles

ocorreram dentro da regiatildeo 3rsquoUTR

A comparaccedilatildeo das sequumlecircncias dos aminoaacutecidos preditas das bodesinas analisadas no

banco de dados do NCBI revelou similaridade com outras espermadesinas As sequumlecircncias

com alta similiaridade (39 a 51) foram alinhadas e usadas para identificar os resiacuteduos

conservados das sequumlecircncias homoacutelogas (Figura 19B) A mais elevada identidade foi

verificada com a espermadesina AWN de suiacuteno (49 a 51)

Figura 19 Muacuteltiplo alinhamento da sequumlecircncia de aminoaacutecido da espermadesina (A)

Alinhamento das bodesinas deduzidas do cDNAs A diferenccedila dos resiacuteduos de aminoaacutecidos

entre as bodesinas estatildeo demonstradas nas caixa Resiacuteduo de cisteiacutena (c) estatildeo mostradas

em cinza O resiacuteduo sobrescrito forma o N-terminal descrito por Teixeira et al 2002 (B) O

Alinhamento das espermadesinas de caprinos suiacutenos equumlinos e bovinos Os resiacuteduos de

aminoaacutecidos caracteriacutesticos satildeo definidos pelas duas sequumlecircncias (CUB sign) e a posiccedilatildeo dos

elementos secundaacuterios (CUB pred) do domiacutenio CUB estatildeo mostrados com os seguintes

coacutedigos a aromaacutetico (Phe Tyr Trp) h hidrofoacutebico (leu Ile Val Met Ala) t polar (Gly

Pro Asn Gln His Ser Thr) Oslash negativamente carregado (Glu Asp) + positivamente

carregado (Arg Lys) β β-fita (ligaccedilatildeo βa β-i) As duas pontes de disulfeto (S sim S) entre

os resiacuteduos de ciacutesteiacutena (c) que satildeo conservadas em todas as moleacuteculas das espermadesinas e

no mesmo domiacutenio CUB estaacute mostrado em cinza

DISCUSSAtildeO

Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o isolamento purificaccedilatildeo N-

terminal e massa molecular de uma proteiacutena estruturalmente caracterizada como a primeira

espermadesina de bodes (BSFP) (TEIXEIRA et al 2002) Poreacutem natildeo foi descrito o gene

que codifica esta proteiacutena Para alcanccedilar o objetivo deste trabalho foram testados dois

primers (oligonucleotiacutedeos) desenhados a partir de regiotildees conservadas de BSFP e outras

espermadesinas

Natildeo foi possiacutevel observar nenhum produto de PCR apoacutes a avaliaccedilatildeo do cDNA

proveniente dos tecidos de testiacuteculo e da vesiacutecula seminal usando o primer SMD-SE-1

Provavelmente o gene que codifica a BSFP de caprinos natildeo parece mostrar a mesma regiatildeo

conservada como as demais espermadesinas onde SMD-SE1 foi desenhada Por outro lado

o primer especiacutefico SMD-SE2 desenhado baseado no N-terminal descrito previamente

(TEIXEIRA et al 2002) foi capaz de detectar uma banda de aproximadamente 700 pb

apenas na vesiacutecula seminal Assim talvez a BSP natildeo eacute sintetizada ou ela eacute produzida em

baixas quantidades no testiacuteculo Resultados similares foram observados para PSP-I PSP-II

e AWN (TOumlPFER-PETERSEN et al 1998)

Apoacutes a clonagem e sequumlecircnciamento foram detectados trecircs diferentes cDNA que

poderiam transformados nas trecircs isoformas Bdh-1 Bdh-2 e Bdh-3 Assim foi demonstrado

que todas as trecircs sequumlecircncias satildeo altamente similares e apresentam o domiacutenio CUB (BORK

amp BECKMAN 1993) Poreacutem ainda natildeo foram demonstradas as regiotildees que codificam a

sequumlecircncia inteira do N-terminal o peptiacutedeo sinal e o 5rsquo-UTR devido a posiccedilatildeo onde o

primer senso-especiacutefico SMD-SE2 foi desenhado Todavia a sequumlecircncia de aminoaacutecidos

obtida do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) eacute idecircntica agrave sequumlecircncia da proteiacutena

deduzida da Bdh-2 o que indica uma alta probabilidade de que a Bdh-2 eacute a mesma proteiacutena

isolada anteriormente (BSFP)

Poucas diferenccedilas foram encontradas entre os cDNAs das bodesinas e estas

implicaram em divergecircncias na sequumlecircncia de aminoaacutecidos de todas as trecircs proteiacutenas

deduzidas A Bodesina-2 mostrou uma timina no nucleotiacutedeo 14 ao inveacutes de uma adenina

na Bdh-1 e Bdh-3 Isto poderia codificar um aminoaacutecido polar (histidina) em substituiccedilatildeo a

um aminoaacutecido hidrofoacutebico (leucina) em outras bodesinas O mesmo resiacuteduo polar foi

tambeacutem visto na sequumlecircncia do N-terminal da BSFP (TEIXEIRA et al 2002) A sequumlecircncia

consenso do domiacutenio CUB apresenta um resiacuteduo de aminoaacutecido hidrofoacutebico no mesmo

siacutetio (VARELA et al 1997) De acordo com Romatildeo et al (1997) existem resiacuteduos

hidrofoacutebicos que estabilizam a organizaccedilatildeo β-barril e definem o domiacutenio CUB Natildeo foi

possiacutevel assegurar se estes achados determinariam uma diferenccedila significativa na estrutura

da Bdh-2 quando comparada agraves outras espermadesinas Entretanto fora deste domiacutenio CUB

conservado espermadesinas de caprinos podem mostrar caracteriacutesticas estruturais que satildeo

uacutenicas para cada proteiacutena como observado na aSFP em relaccedilatildeo as PSP-I e PSP-II

(ROMAtildeO et al 1997) Estas diferenccedilas particulares podem ter implicaccedilotildees na relaccedilatildeo

estrutura-atividade e no reconhecimento espeacutecie-especiacutefico durante as funccedilotildees

reprodutivas

Aleacutem disso o c-DNA da Bdh-2 indicou um coacutedon diferente na posiccedilatildeo 310

determinando uma substituiccedilatildeo semi-conservativa de Ser104 rarr Gln104 comparada agraves

Bdh-1 e Bdh-3 Esta substituiccedilatildeo natildeo afetaria a estrutura do domiacutenio da CUB

provavelmente porque este resiacuteduo de aminoaacutecido eacute situado fora da ultima folha beta do C-

terminal

Foram observadas mutaccedilotildees conservadas nos nucleotiacutedeos 191 e 193 que

exerceriam substituiccedilotildees similares ao niacutevel do aminoaacutecido (64 Arg rarr Lys e 65 Phe rarr

Leu) Baseado em proteiacutenas com o consenso do domiacutenio CUB estas posiccedilotildees contecircm

resiacuteduos carregados positivamente e hidrofoacutebicos respectivamente (BORK 1991)

Consequumlentemente foi presumido que estas variaccedilotildees natildeo interfeririam na dobra da

proteiacutena

Fazendo uma avaliaccedilatildeo de todos os resultados as bodesinas parecem pertencer a

uma famiacutelia de proteiacutenas com domiacutenio CUB conservado Os membros da famiacutelia das

espermadesinas apresentam uma estrutura similar padratildeo de enovelamento mas natildeo satildeo

funcionalmente equivalentes (BERGERON et al 2005) As Bodhesinas deduzidas

mostraram uma identidade mais elevada com a proteiacutena AWN de suiacuteno e a HSP-7 de

equumlino Estas proteiacutenas parecem ter um papel de reconhecimento de gametas

espermatozoacuteide-ooacutecito bem como na capacitaccedilatildeo do espermatozoacuteide (TOumlPFER-

PETERSEN et al 1998) Entretanto eacute necessaacuterio esclarecer se os cDNAs da bodesinas

realmente codificam proteiacutenas redundantes ou com funccedilotildees distintas

CONCLUSOtildeES GERAIS

O estudo inicial indicou que o plasma seminal de caprinos conteacutem uma proteiacutena que

estaacute estruturalmente relacionada agraves proteiacutenas da famiacutelia das espermadesinas Esta proteiacutena

pode ser eficientemente isolada por cromatografia de troca iocircnica

As bodesinas identificadas neste trabalho parecem formar uma famiacutelia de

multigenes que codificam proteiacutenas com estrutura conservada do domiacutenio CUB Ao nosso

conhecimento este trabalho eacute o primeiro relato de clonagem molecular de espermadesinas

caprinas (bodesinas)

PERSPECTIVAS

Mais investigaccedilotildees sobre as proteiacutenas do plasma seminal de caprinos podem ser

adicionadas aos nossos estudos para avaliar o processo de capacitaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo dos

espermatozoacuteides aos ooacutecitos desta espeacutecie

Apoacutes a identificaccedilatildeo dos genes que codificam as espermadesinas caprinas seratildeo

necessaacuterios experimentos posteriores que verifiquem a expressatildeo e caracterizaccedilatildeo destas

proteiacutenas codificadas

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135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

Tese apresentada agrave Faculdade de Veterinaacuteria

da Universidade Estadual do Cearaacute como

requisito parcial para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

Doutor em Ciecircncias Veterinaacuterias

Aacuterea de concentraccedilatildeo Reproduccedilatildeo e

Sanidade Animal

Orientador Prof Dr Vicente Joseacute de

Figueirecircdo Freitas

Dedico

Lao-Tseacute

AGRADECIMENTOS

graduaccedilatildeo

cientiacuteficos

deste trabalho

RESUMO

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

Dedico

Lao-Tseacute

AGRADECIMENTOS

graduaccedilatildeo

cientiacuteficos

deste trabalho

RESUMO

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

Dedico

Lao-Tseacute

AGRADECIMENTOS

graduaccedilatildeo

cientiacuteficos

deste trabalho

RESUMO

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

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p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

Lao-Tseacute

AGRADECIMENTOS

graduaccedilatildeo

cientiacuteficos

deste trabalho

RESUMO

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

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v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

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159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

AGRADECIMENTOS

graduaccedilatildeo

cientiacuteficos

deste trabalho

RESUMO

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

cientiacuteficos

deste trabalho

RESUMO

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

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Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

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al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

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Cytology v177 p 57-113 1998

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159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

RESUMO

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

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308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

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15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

RESUMO

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

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p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

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Cytology v177 p 57-113 1998

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Physiology v 109 p 347-352 1995

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320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

ABSTRACT

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

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Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

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Menthuen p 343-350 1964

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Cytology v177 p 57-113 1998

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Physiology v 109 p 347-352 1995

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186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

SUMAacuteRIO

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

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Cytology v177 p 57-113 1998

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p89-117 1982

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320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

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M molar

mg miligrama

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mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

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LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

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RTK5 95 kDa C Hu

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glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

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24 Lectinas Animais

241 Galectinas

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242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

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fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

α alfa

β beta

γ gama

microl microlitros

Ca++ caacutelcio

Da Dalton

g grama

g gravidade

h hora

im intramuscular

kDa quilodaltons

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

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PM peso molecular

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espermadesina

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(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

M molar

mg miligrama

min minutos

mL mililitros

mRNA RNA mensageiro

PM peso molecular

SPH esfingomielina

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

LISTA DE FIGURAS

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

espermadesina

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

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Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

reprodutivas

terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

LISTA DE TABELAS

(ANUALPEC 2004)

GONZALES 2001)

(KAYA et al 2002)

Suiacutena pB1

15-20- kDa SP1-B34 C Hu

APz (52 kDa) P

RTK5 95 kDa C Hu

PH ndash 207 11 W

p-105452 P

2 LECTINAS

glicoconjugados

H Noguchi

Raubischek

WC Boyd KO

Renkonen

Agrawal

1972 GM Edelman KO

24 Lectinas Animais

241 Galectinas

SHARON 1998)

242 Lectina tipo-C

2422 Colectinas

2423 Selectinas

243 Lectinas tipo-P

244 Lectina tipo-I

similar

SHARON 1998)

fecircmea

Nitrogecircnio

ERGIC-53

manose

Imunidade

imunes e neurais

3 ESPERMADESINAS

1992a b e c)

desta proteiacutena

al 1998)

1995a)

espermadesinas

os animais

(HAASE et al 2005)

al 2005)

JUSTIFICATIVA

produtivo

problema

heparina

OBJETIVOS

codifica

Especiacuteficos

(CAPRA HIRCUS)

Isolamento

CLUSTAL W

RESULTADOS

cod (aa)

Acesso ao

Referecircncia

AQN-1 2931 399 250276c 132 AJ853854

AJ853855

Haase et al 2005

DISCUSSAtildeO

espermadesinas

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terminal

proteiacutena

PERSPECTIVAS

44 p 806-813 1991

661 2004

282 p9-12 1991

v 13 p 11-16 2005

p35-40 1995c

Letters v 407 p 201-206 1997

v63 n7 p733-734 1993

308 2003

Hoppe-Seyler v 376 n12 p 733-738 1995

p 361-393 1994

p 2053-2062 2005

Menthuen p 343-350 1964

p 347 1962

Cytology v177 p 57-113 1998

p283 1982

Physiology v 109 p 347-352 1995

p89-117 1982

186 1997

320 1998

15-17 1996

159 p 318-319 1957

p331-337 1999

86 n 2 p 373-375 1987

p 41-51 2001

Science v 89 p 159-170 2005

v 1 p 39-50 2003

135-185

Espeacutecie

Proteiacutenas Fn-2

Documents

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS