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Universidade de São Paulo Instituto de Química
Departamento de Bioquímica
Angela Pedroso Tonon
Adaptação Celular e Molecular de Gracilaria tenuistipitata
Exposta à Cádmio e Cobre
São Paulo
14 de fevereiro de 2009
Livros Grátis
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Angela Pedroso Tonon
Adaptação Celular e Molecular de Gracilaria
tenuistipitata Exposta à Cádmio e Cobre
Tese apresentada ao Instituto de
Química da Universidade de São Paulo para
obtenção do Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)
Orientador: Prof. Dr. Pio Colepicolo
Co-orientadora: Profa. Dra. Mariana Cabral Oliveira
São Paulo
2009
Angela Pedroso Tonon
Adaptação Celular e Molecular de Gracilaria tenuistipitata Exposta à Cádmio e Cobre.
Tese apresentada ao Instituto de Química
da Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)
Aprovado em: _________________
Banca Examinadora
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição: _________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição: _________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição: _________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição: _________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Prof. Dr. ___________________________________________________________________
Instituição: _________________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________________
Pai, dedico esta tese especialmente à você, que sempre me ensinou a viver com
sua maneira peculiar de humildade e honestidade. Pelo seu inacreditável
esforço, suporte e compreensão.
Sempre te amarei...
À minha amada mãe Dona Nair, que sempre me guiou e se
dedicou inteiramente na minha educação.
Obrigada a vocês dois...
Às minhas queridas irmãs, Zanza e Adriana por toda força e incentivo
e à minha queridinha sobrinha Victória.
Agradecimentos
Em primeiro lugar gostaria de agradecer ao meu orientador Dr. Pio, pela oportunidade, incentivo, carinho e amizade. Essa oportunidade foi essencial na minha formação acadêmica.
À minha co-orientadora querida, Dra. Mariana Cabral, pelas suas discussões e ensinamentos. À Comissão de Pós-graduação do Departamento de Bioquímica da USP e aos queridos
responsáveis por parte da organização desse departamento; Milton “brigadão”, Cibele, Emiliano e Marcelo.
Às minhas queridas amigas e grandes companheiras do laboratório, Vanessita, Drica, Tha e Ka,
valeu muito meninas, por todo carinho, adoro vocês. Ao Paulinho pela ajuda na parte de construção dos microarranjos de DNA, Denise e toda
organização do CAGE. Dra. Aline e Dr. Sergio Verjovsk pela oportunidade.
Ao técnico Ed, meu grande amigão. Aos técnicos Wilton, Zilda e Sandra por toda ajuda. Aos meus amigos e copanheiros de laboratório, Aline “tão querida”, Renato, Sara, Lu, Diogo,
Moacir, Érika, Érika Pereira, Marcelo, Ernani, Pati e João. Às minhas “outras” irmãs, Marrrcita, Dê, Pri e Lay, que sempre me ajudaram em tudo; adoro
muito vocês.
Ao Dr. Jonas Collén e Dra. Catherine Boyen, pela colaboração científica no laboratório “Marine Plants and Biomolecules” da Station Biologique de Roscoff (CNRS/UPMC-Paris VI), França.
Aos amigos da França, que me receberam com tanto carinho, Valerita, Daniella flor, Jerôme, Sophie, Nicole, Audrey, Jihan e Justina.
Em especial aos meus queridos, François, Andrés e Sylvie pelos grandes ensinamentos e oportunidade de conhecer todo o laboratório. Também não deixaria jamais de agradecer ao querido Peter pela grande amizade, carinho e atenção.
À amiga Hêlo, pelo ensinamento da língua francesa e incentivo no meu estágio e a Sávia também por todo incentivo no meu trabalho.
Ao Dani, que me ajudou sempre que possível na elaboração deste trabalho, também pela atenção, amor e carinho.
À FAPESP, pelo apoio financeiro.
Resumo
Estudou-se o processo de adaptação da macroalga marinha Gracilaria tenuistipitata, cultivada
em meio contaminado por dois metais tóxicos, cobre e cádmio, comumente descartados no ambiente
marinho. Foram utilizadas nos ensaios biológicos concentrações de CE50 de 1,00 ppm para cádmio e
0,95 ppm para cobre. Tais concentrações basearam-se nas curvas de crescimentos da alga obtidas em
estudos anteriores, num período de 6 dias.
Determinou-se, a partir da técnica de ICP-AES, a capacidade da alga em absorver tais metais
durante o período de 6 dias. Os resultados indicam que G. tenuistipitata é capaz de bioacumular cobre
(17 %) e cádmio (9 %). Foram encontrados também níveis basais de cobre nas algas controles e
exposta ao cádmio. Além disso, determinou-se o repetório de outros elementos químicos, bem como
suas concentrações, para G. tenuistipitata e para duas outras algas marinhas importantes, G. birdiae e
G. domingensis, coletadas em ambientes naturais da costa brasileira.
Em investigação paralela, através da reação com cloreto de cério (CeCl3), detectou-se a
presença de H2O2 em G. tenuistipitata exposta aos metais, produzindo depósitos eletrodensos de
peridróxidos de cério. Foi possível notar aspectos morfológicos das células, após exposição de 1 hora,
1 dia e 6 dias. Observou-se que a alga produziu quantidades consideráveis de H2O2 e que os padrões
de acúmulos nesses tempos, para os dois metais, apresentaram algumas semelhanças, implicando uma
toxicidade maior no caso do cobre.
Visto que parte do genoma de todos os organismos está relacionado à codificação de proteínas
vinculadas ao controle dos efeitos nocivos gerados por diferentes tipos de estresse, também foi
analisada a variação na expressão gênica de G. tenuitipitata através da técnica de microarranjos de
cDNA. Observou-se que, em geral, as respostas ao estresse da alga aos metais foram diferentes para
categorias de genes funcionais distintas. Em resposta ao cádmio, observou-se que a alga foi capaz de
reagir mais rapidamente ao estresse. Foi visto que proteínas de defesa celular quase não variaram após
6 dias de tratamento e que alguns genes de metabolismo, síntese de proteínas, homeostase de íons e
transporte, essenciais para o desenvolvimento da alga, foram induzidos. Interpretou-se esse resultado
como um indicativo de que a alga já estaria se adaptando as condições adversas geradas por esse metal.
Para cobre a resposta foi um pouco mais complexa. Muitas enzimas de defesa foram reprimidas, assim
como alguns genes envolvidos com alta demanda de energia, síntese protéica, transcrição e
metabolismo. Em contra partida, um gene de defesa envolvido na dioxigenação de ácidos graxos
insaturados foi induzido. Genes de metabolismos, divisão celular, energia, entre outros, também foram
induzidos, indicando que a alga estaria reagindo ao estresse gerado por esse metal, mas em um
processo adaptativo mais lento, podendo cobre gerar maior capacidade tóxica. A maior parte dos genes,
cuja expressão foi alterada devido ao estresse gerado pelos dois metais, ainda não tem função celular
conhecida, demonstrando que há todo um mecanismo não identificado ligado à resposta da alga a
exposição a esses metais.
Devido à importância do gênero Gracilaria, espera-se que os dados apresentados nesse
trabalho sejam de grande valia para um compreendimento melhor dos processos celulares deste gênero,
frente à ambientes poluídos.
Palavras-chave: Gracilaria, poluição, adaptação celular, variação gênica, microarranjos, estresse
oxidativo.
Abstract
The adaptation process of the marine macroalgae Gracilaria tenuistipitata, cultived in a
medium contaminated with, copper and cadmium, was investigated. It was used in the biological
samples CE50 concentrations of 1.00 ppm for cadmium and 0.95 ppm for copper. Such concentrations
were based on the growth curves of the algae obtained in previous studies, over a period of 6 days.
It was determinated, through the use of ICP-AEC technique, the amount of metal that the
algae would be able to absorve during the period of 6 days. Results showed that G. tenuistipitata was
able to bioacumulate these two metals, about 17 % for copper and 9 % for cadmium. It was also found
basal levels in the control algae and in the one exposed to cadmium. Besides, it was determinated the
repertoire of other chemical elements, as well as their concentrations, for G. tenuistipitata and two
other important marine algae, G. birdiae e G. domingensis, colected in natural environments of the
braziliam shore.
In a parallel investigation, through the reaction with cerium chloride (CeCl3), it was detected
H2O2 activity in G. tenuistipitata exposed to the metals, producing eletron-dense accumulation of
cerium perhydroxides. It was possible to note morfological aspects of the cell, after exposure of 1
houer, 1 day and 6 days. It was found that the algae produced considerable quantities of H2O2 and that
the ccumulation patterns in these times, for both metals, showed some resemblance, implying a larger
toxicity in the copper case.
Since part of the genoma of all organisms is related to the coding of proteins linked to the
control of noxious effects generated by different types of stress, it was also analysed the variation in
the genic expression of G. tenuistipitata through cDNA microarrays technique. It was observed that, in
general, the responses to the algae stress were different for distinct functional gene categories. It was
seen that cell defense proteins have almost not changed after 6 days of treatment and that some
metabolism genes, protein synthesis, ionic homeostasis and transport, essential for the algae
development, have been induced. This result was interpreted as an indicative that the algae would
already be adapting to the adverse conditions generated by this metal. In the case of copper, the
response was a little more complex. Many defense enzymes were repressed, as well as some genes
involved with high energy demand, protein synthesis, transcription and metabolism. On the other hand,
one defense gene involved in the dioxygenation of polyunsaturated fatty acids was induced.
Metabolism genes, cell division, energy, amog others, were also induced, indicating that the algae
would be reacting to the stress generated by this metal, but in a slower adaptative process, so that
copper could have larger toxic capacity. The major part of the genes, whose expressions were changed
due to stress induced by the two metals, do not have a known celular function, showing that there is a
whole non identified mechanism linked to the algae response for the exposure to these metals.
Due to the major importance of the Gracilaria gender, it is hoped that the data presented in
this work could be of great value for a better understanding of the celular processes of this algae,
against polluted environments.
Keywords: Gracilaria, pollution, cellular adaptation, genic variation, microarrays, oxidative stress.
x
Lista de Abreviaturas
APX Ascorbato peroxidase
CAT Catalase
cDNA DNA complementar
CE50 Concentração efetiva que inibe um parâmetro em 50%
DNA Ácido desoxirribonucléico
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EROs Espécies reativas de oxigênio
EST Expressed Sequence Tag
Kb-Kpb Quilo (pares de) bases
GPX Glutationa peroxidase
GR Glutaniona redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
GST Glutationa s-transferase
H+ Próton
H2O2 Peróxido de hidrogênio
M(n-1) Metal na forma reduzida
Mn+ Metal na forma oxidada
MOPS Ácido 3-(N-morfolino) propano sulfônico
mRNA RNA mensageiro
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
NADP+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada
O2.- Ânion superóxido
OH. Radical hidroxila
xi
Sumário
1 Introdução 21
1.1 Características da Alga Marinha Gracilaria....................................................... 21
1.1.1 Espécies Brasileiras de Gracilaria....................................................... 24
1.2 Poluentes Marinhos............................................................................................26
1.2.1 Cádmio................................................................................................ 29
1.2.2 Cobre................................................................................................... 30
1.3 Espécies Reativas de Oxigênio - Estresse Oxidativo.........................................31
1.3.1 Mecanismos Celulares de Defesa Antioxidante..................................33
1.4 Biblioteca de cDNA de G. tenuistipitata............................................................35
1.5 Avaliação da Expressão Gênica......................................................................... 36
2 Objetivos 39
3 Materiais e Métodos 40
3.1 Cultivo da Alga.................................................................................................. 40
3.2 Descrição da Técnica de ICP-AES.....................................................................42
3.2.1 Condições Experimentais para ICP-AES............................................ 42
3.3 Visualização de H2O2 por Precipitação de CeCl3.............................................. 45
3.3.1 Protocolo e Soluções........................................................................... 46
3.3.2 Condições Experimentais para Detecção de H2O2.............................. 47
3.4 Extração de RNA Total...................................................................................... 48
3.5 Microarranjos de cDNA..................................................................................... 49
3.5.1 Ensaios Experimetais Utilizados nos Microarranjos de DNA............ 51
3.5.2 Marcação e Hibridização com os Microarranjos.................................51
3.5.3 Análise de Dados Gerados nos Microarranjos.................................... 52
3.5.4 Normalização dos Dados de Microarranjos........................................ 53
3.6 PCR em Tempo Real......................................................................................... 54
3.6.1 Construção dos Primers...................................................................... 54
3.6.2 Amostras de RNA............................................................................... 55
3.6.3 Técnica da RT-PCR em Tempo Real.................................................. 56
3.6.4 Extração de DNA Genômico de G. tenuistipitata............................... 56
3.7 Re-sequenciamento dos cDNAs........................................................................ 57
xii
4 Resultados 59
4.1 Absorção de Cu e Cd......................................................................................... 59
4.1.1 Análises dos Resultados de ICP-AES................................................. 59
4.1.2 Composição Elementar de Três Espécies de Gracilaria.................... 64
4.2 Análises dos Resultados de Acumulação de H2O2............................................ 66
4.2.1 Amostras Controles............................................................................. 66
4.2.2 Amostras Expostas ao Cádmio........................................................... 67
4.2.3 Amostras Expostas ao Cobre.............................................................. 69
4.3 Padronização da Extração de RNA Total.......................................................... 71
4.4 Resequenciamento das Amostras da Biblioteca................................................ 73
4.5 Análise dos Microarranjos................................................................................. 74
4.5.1 Dados de Amplificação e Purificação................................................. 74
4.5.2 Categorias Funcionais dos Genes do Microarranjo............................ 74
4.5.3 Genes Diferencialmente Expressos..................................................... 77
4.5.4 Distribuição dos Genes Induzidos e Reprimidos................................ 81
4.5.4.1 Cádmio................................................................................. 81
4.5.4.2 Cobre.................................................................................... 83
4.6 Validação dos Dados dos Microarranjos........................................................... 86
4.6.1 Qualidade do RNA.............................................................................. 86
4.6.2 Comparação de Resultados: PCR em Tempo Real e Microarranjos...87
5 Discussão 91
5.1 Absorção de Elementos Químicos..................................................................... 92
5.1.1 Absorção em G. birdiae, G. domingensis e G. tenuistipitata............. 94
5.2 Presença de H2O2............................................................................................... 96
5.2.1 Acumulação em Amostras Controle................................................... 97
5.2.2 Acumulação em Amostras Expostas ao Cádmio................................ 98
5.2.3 Acumulação em Amostras Expostas ao Cobre................................... 99
5.3 Técnicas Moleculares para Análise Transcripcional da Alga............................ 100
5.3.1 Interferência de Polissacarídeos na Extração de RNA........................ 100
5.3.2 Análise Global da Expressão Gênica da Alga.................................... 101
5.3.3 Validação dos Resultados................................................................... 105
6 Conclusões 109
Anexo A. Análise de Dados de Microarranjos 112
A.1 Dados Brutos..................................................................................................... 113
xiii
A.2 Normalização de Dados.................................................................................... 115
A.2.1 LOWESS............................................................................................ 118
A.3 Classificação de Genes Diferencialmente Expressos........................................ 119
A.3.1 O Método HTSelf............................................................................... 119
A.3.2 Estatística para Classificação............................................................. 122
A.4 Programa para Análise de Dados: “GT Microarray Analysis”........................ 123
A.4.1 Processamentos.................................................................................. 125
Anexo B. Listas de Genes Diferencialmente Expressos 129
Referências Bibliográficas 134
xiv
Lista de Tabelas
1 Produção mundial de alguns dos metais pesados mais descartados no ambiente
marinho; descarte anual nos oceanos; concentrações em águas oceânicas sob
condições normais e poluídas; volume em águas do mar contaminadas e toxicidade
dos metais em alguns organismos do fitoplâncton marinho. (pag. 28)
2 Concentrações de sais e vitaminas por litro de água do mar no meio Von Stosch
(pag. 40)
3 Controles utilizados para o meio de cultivo na técnica de ICP-AES. (pag. 43)
4 Genes utilizados como moldes na construção de primers para os experimentos de PCR
em Tempo Real. (pag. 54)
5 Análises das concentrações dos metais Cu e Cd em amostras de algas tratadas e
controle. (pag. 60)
6 Medidas de concentração de cobre e cádmio dos meios de cultivo controle. (pag. 62)
7 Resumo de resultados de absorção de metais. Para cada amostra de alga, é apresentado
o valor médio com desvio-padrão do pico de emissão [em Kcps] dos metais analisados
(essa média foi obtida através de gráficos como os das Figuras 11 e 12, considerando-
se a triplicata de amostras). (pag. 64)
8 Concentração de elementos químicos medidos por ICP-AES para as três espécies de
alga. (pag. 65)
9 Classificação das proteínas da biblioteca de G. tenuistipitata. (pag. 75)
10 Número de genes classificados representados no microarranjo, divididos em categorias
funcionais específicas. (pag. 76)
xv
11 Resumo geral dos experimentos de microarrajos. Apresenta-se o número total de genes
únicos estudados e o número de genes reprimidos, induzidos e invariantes, após
tratamento para cádmio e cobre. (pag. 78)
12 Lista de genes induzidos e reprimidos após tratamento com cádmio. É exibido também
o valor da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) com respectivo
desvio-padrão. Valores sem desvio padrão referem-se a genes que só tiveram uma
única sonda analisada. (pag. 129)
13 Lista de genes induzidos e reprimidos após tratamento com cobre. É exibido também o
valor da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) com respectivo desvio-
padrão. Valores sem desvio padrão referem-se a genes que só tiveram uma única
sonda analisada. (pag. 131)
xvi
Lista de Figuras
1 Aspecto geral da morfologia de talo de G. tenuistipitata (foto de Lopes, tese de
doutoramento, 2002). (pag. 23)
2 Aspecto morfológico de G. domingensis, G. birdiae e G. tenuistipitata (foto: Dra.
Eliane Marinho-Soriano/UFRN). (pag. 25)
3 Ação do cádmio em grupos sufidril. (pag. 30)
4 Transporte de cobre. Transporte de membrana celular: COPT1, COPT3, COPT5,
COX17, PAA1, PAA2, RAN1; fatores de detoxificação: Metalotioneinas, MTs;
Fitoquelatinas, PCs; Glutationas, GSH e Chaperonas, CCH e CCS (Adaptado de
Williams et al., 2000; Markossian & Kurganov, 2003). (pag. 31)
5 Redução do oxigênio molecular durante o processo de respiração (Adaptado de Cohen,
1989). (pag. 33)
6 Principais enzimas envolvidas no mecanismo antioxidante enzimático. (pag. 35)
7 Cultivo de G. tenuistipitata em incubadoras. Temperatura, período e intensidade de luz
e aeração são controlados. (pag. 41)
8 Representação esquemática dos três controles sobre os meios de cultivo. Cada controle
apresenta 3 frascos (A, B, C), contendo alíquotas dos meios de cultivo, cujas
concentrações de cobre e cádmio foram medidas via técnica ICP-AES. (pag. 44)
9 Curvas padrão para o cobre (A) e para o cádmio (B), utilizadas como escala de
conversão entre unidade de contagem [cps] e concentração [ppm]. (pag. 45)
10 Eletroforese em gel de agarose 1,5%, de algumas amostras das placas de DNAs
amplificadas e purificadas a partir de clones bacterianos. Foi utilizado o marcador de
xvii
peso molecular de 1 Kb Plus Ladder (Invitrogen) e foram aplicados 3 µL de cada
amplificado. (pag. 51)
11 Espectro da emissão atômica para o cálculo da concentração de cobre. Seta vermelha
representa concentração padrão de 1 ppm. Seta verde representa concentração de cobre
da alga exposta ao cobre. Seta azul representa concentração basal de cobre da alga
exposta ao cádmio. Seta lilás representa concentração de cobre da alga sem exposição.
(pag. 61)
12 Espectro da emissão atômica para o cálculo da concentração de cádmio. Seta vermelha
representa concentração padrão de 1 ppm. Seta preta representa concentração de
cádmio da alga exposta ao cádmio. (pag. 61)
13 Balanço entre as massas dos metais analisados. (pag. 63)
14 Amostras controle. Seta indica acumulação de H2O2. (PC) parede celular, (Pit-plug)
ponto de junção entre células, (CP) cloroplastos, (V) vacúolo e (G) grânulo de amido.
Escala: barra = 1µm. (pag. 67)
15 Amostras de 1 hora de exposição ao cádmio. Setas indicam acumulação de H2O2. (PC)
parede celular, (CP) cloroplastos e (G) grânulo de amido. Escala: barra = 1µm. (pag. 68)
16 Amostras de 1 dia de exposição a cádmio. Setas indicam acúmulos de H2O2. (PC)
parede celular, (CP) cloroplastos e (G) grânulo de amido. Escala: barra = 0,5 µm.
(pag. 69)
17 Amostras de 1 dia de exposição a cádmio. Setas azuis acúmulos de H2O2. Escala:
barra = 0,2 µm. (pag. 69)
18 Amostras expostas 1 hora ao cobre. Setas azuis indicam acumulação de H2O2. (PC)
parede celular e CP cloroplastos. Escala: barra = 1µm. (pag. 70)
19 Amostras expostas a 1 hora ao cobre. Setas indicam acumulação de H2O2. (CP)
cloroplastos e (G) grânulos de amido. Escala: barra = 1µm. (pag. 71)
xviii
20 Amostras expostas a 1 hora ao cobre. Setas indicam acumulação de H2O2. Escala:
barra = 1µm. (pag. 71)
21 Qualidade do RNA total das amostras Cu, Cd e controle analisadas no Bioanalyzer.
(pag. 73)
22 Distribuição em categorias funcionais dos genes selecionados, segundo dados das
Tabelas 9 e 10. No gráfico de cima, tem-se a distribuição geral de todos os genes entre
classificados, hipotéticos, hipotéticos conservados, sem classificação ou com
classificação incerta e outros. No gráfico de baixo, especificamos os grupos dos genes
classificados. (pag. 76)
23 Número de genes induzidos e reprimidos por categoria funcional (cádmio e cobre).
(pag. 80)
24 Genes induzidos e reprimidos para cádmio divididos em categorias funcionais.
(pag. 81)
25 Percentual de genes reprimidos e induzidos (cádmio) dentro de cada categoria
funcional. (pag. 83)
26 Genes induzidos e reprimidos para cobre divididos em categorias funcionais. (pag. 85)
27 Percentual de genes reprimidos e induzidos (cobre) dentro de cada categoria funcional.
(pag. 85)
28 Teste da qualidade dos primers e do RNA, utilizados na validação dos resultados de
microarranjos através da técnica de PCR em tempo real. (A) RT-PCR utilizando
amostras de RNA. (B) PCR convencional utilizando DNA genômico. As setas
correspondem aos marcadores de tamanho de 100 e 200 pb. (pag. 87)
29 Valores da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) obtidos dos
experimentos de PCR e microarranjos para os 10 genes considerados. O tratamento
xix
refere-se à exposição da alga ao cobre. São mostrados os resultados para dois genes de
referência utilizados na técnica de PCR em tempo real: EF (Elongation Factor 1 Alpha)
e Actin. (pag. 89)
30 Resultados análogos aos da Figura 29, mas considerando agora o tratamento da alga
exposta ao cádmio. Os genes (d), (e), (f) e (j) foram circulados pois foram
classificados como diferencialmente expressos pelo método HTSelf. (pag. 89)
31 Correlação entre as razões de expressão gênica de M medidas pela técnica PCR em
tempo real (eixo x) e pela técnica de microarranjos (eixo y). Cada ponto representa um
dos dez genes selecionados para validação dos resultados (Tabela 4). (pag. 90)
32 Concentrações dos elementos químicos analisados pela técnica ICP-AES encontrados
nas algas G. birdiae, G. domingensis, G. tenuistipitata. Os valores são obtidos dos
dados apresentados na Tabela 8. Considerou-se o logarítimo dos valores para uma
melhor visualização gráfica dos resultados. (pag. 96)
33 Gráficos com valores de R×G e de log2(R)×log2(G). Os dados correspondem ao
microarranjo obtido da hibridização self-self. (pag. 114)
34 Transformação de coordenadas (log2(R), log2(G)) → (A, M). Os dados apresentados
referem-se aos mesmos da Figura 33. (pag. 115)
35 Ajuste LOWESS (linha vermelha) para um conjunto de dados de microarranjo genérico.
São apresentadas curvas para três valores do parâmetro f. (pag. 117)
36 Ajuste LOWESS (curva verde corresponde à função c(A)) ao conjunto de dados de
microarranjo da Figura 33 e normalização segundo a Equação (1). (pag. 118)
37 Retrato de um passo do processo da janela deslizante para determinação dos cutoffs
dependentes da intensidade. O gráfico da esquerda mostra o diagrama (A, M) com os
dados do self-self para o microarranjo da G. tenuistipitata. (pag. 122)
xx
38 Interface do programa “GT Microarray Analysis”. Os arquivos de dados abertos
correspondem à hibridização da alga tratada com cádmio e da alga em seu meio
natural de cultivo, bem como os arquivos de dados do self-self. (pag. 124)
39 Janela “Classification” aberta após a função “Classificar” ser selecionada. As tabelas
nessa janela permitem uma classificação completa dos genes estudados. (pag. 125)
40 Gráfico superior: Diagrama (A, M) e ajuste LOWESS (curva vermelha) para o
conjunto de dados da alga tratada com cádmio. Gráfico inferior: Dados normalizados e
cutoffs (curvas azuis). Em destaque (pontos lilás), valores representado spots com
expressão diferenciada. (pag. 127)
41 Gráfico superior: Diagrama (A, M) e ajuste LOWESS (curva vermelha) para o
conjunto de dados da alga tratada com cobre. Gráfico inferior: Dados normalizados e
cutoffs (cuvas azuis). Em destaque (pontos lilás), valores representado spots com
expressão diferenciada. (pag. 128)
21
1. Introdução
1.1 Características da Alga Marinha Gracilaria
O gênero Gracilaria faz parte do grupo das algas vermelhas, da família Gracilariaceae
(Rhodophyta). As algas vermelhas se distinguem de quaisquer outros eucariotos, por não
apresentarem organização dos tilacóides empilhados, por terem grânulos de pigmentos
associados nos chamados ficobilissomos, entre outras (Pueschel, 1990). As algas deste gênero
possuem seu ciclo de vida diplobionte dividido em três fases. A primeira e segunda fase é
caracterizada por uma alternância isomórfica entre as gerações haplóide e diplóide, e a
terceira fase diplóide parasita da planta haplóide feminina (Crichtley et al, 1993).
O gênero Gracilaria possui grande utilidade para a indústria química, por serem
produtores de ficobilinas e carotenóides que são pigmentos acessórios fotossintéticos,
possuem ácidos graxos insaturados e sintetizam uma parede celular única com polissacarídeos
sulfatados (Lee et al., 1999). Esta última característica confere a este gênero um alto valor
comercial como fonte produtora de ágar, um hidrocolóide amplamente utilizado na industria
biotecnológica, farmacêutica e alimentícia. Espécies do gênero Gracilaria são responsáveis
por mais da metade da produção mundial de ágar (McHugh, 1991). O consumo de ágar é
crescente e não há perspectivas de substitutos a curto prazo para algumas de suas aplicações
(Armisen & Gálatas, 1987). As principais fazendas de Gracilaria estão localizadas em
Taiwan, Hainan, China, Chile e Hawai, havendo também produção piloto em tanques nos
USA, Caribe e Namíbia (Santelices & Doty, 1989). No Brasil, existem pequenas
Introdução
22
produções na região Nordeste do país, Rio do Fogo (RN), Fleixeiras (CE) e Pitimbu (PB) e na
região Sudeste, Angra dos Reis (RJ) e Ubatuba (SP).
Populações naturais de diferentes espécies de Gracilarias brasileiras, são mais
abundantes na costa Nordeste em comparação com outros estados do país. Estas são colhidas
de bancos naturais e vendidas para produção de colóides. A exploração desses bancos naturais
vem aumentando, não havendo nenhum tipo de controle. O Brasil possui uma extensa costa
dando oportunidade para a maricultura destas algas, entretanto não há um cultivo comercial
em grande escala, sendo que o país importa a maior parte dos colóides utilizados na indústria
(Oliveira, 1997). O constante aumento na demanda de mercado do ágar, aliado à inexistência
de manejo de cultura destas algas, tem diminuído as populações desta macroalga nos bancos
naturais e por isso, tem-se implementado o cultivo em tanques e mesmo em mar aberto
(Chiang & Lin, 1989; Oliveira, 1997).
O ágar consiste de uma família de polissacarídeos que variam nas proporções dos
grupos ácidos (Izumi & Young, 1972). Duckwort e colaboradores (1971), mostraram
diferenças na composição química do ágar de algumas espécies de Gracilaria, observando
diferenças relativas nas proporções de anidrogalactose, galactose e metil galactose. O ágar é
utilizado como espessante, estabilizante ou gelificante em diversos produtos alimentícios, tais
como em bebidas, gelatinas, geléias, queijos, maionese, pudins e cremes (Chiang & Lin,
1989). A qualidade e a composição do ágar dependem de suas características físico-químicas
específicas, mas são também fortemente relacionadas aos parâmetros ambientais, como
crescimento e ciclo reprodutivo (Daugherty & Bird, 1988).
A macroalga Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia é uma linhagem originária
do sul da China que tem habilidade de crescer em salinidades que podem variar de 7a 30‰
com um ótimo de crescimento a 21‰. Esta espécie exibe uma grande tolerância a variações
de temperatura e é resistente ao ataque de epífitas (Haglund & Pédersen, 1993). Como as
Introdução
23
demais espécies do gênero, produzem elevada quantidade de agarocolóides podendo chegar a
52,7% do peso seco (Macchiavello et al, 1999), despertando grande interesse econômico. Esta
espécie é utilizada em estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares, servindo como
organismo modelo dentre as algas vermelhas (Collén et al., 2003; Lee & Chang, 1999; Lopes
et al., 1997; Hu et al., 1996; Plastino & Oliveira, 1996).
A morfologia celular do talo de G. tenuistipitata na fase tetraesporofitica (2n) é
caracterizada pelo córtex e medula. As células corticais são pequenas e numerosas, possuindo
grandes quantidades de pigmentos, grânulos de amidos e cloroplastos. As células medulares
por outro lado, são grandes, devido às dimensões dos vacúolos, não possuem cloroplastos,
pois não há captação de luz (Figura 1). As camadas do córtex, o tamanho e o número das
células medulares e a mudança das células do córtex para as células da medula são usadas
para a identificação da espécie (Food and Agriculture Organization of The United Nations;
http://www.fao.org/fishery). Os grânulos de amido são outra característica bastante
importante para identificação desta espécie. Estas estruturas geralmente são encontradas em
grandes quantidades no citoplasma da célula ao redor dos cloroplastos (Nyvall et.al; 1999).
Figura 1: Aspecto geral da morfologia de talo de G. tenuistipitata (foto de Lopes, tese de
doutoramento, 2001).
células do córtex
células da medula
1 cm
(B)
Introdução
24
Recentemente foi construído uma biblioteca de cDNA na sua fase tetraesporofítica que
revelou informações importantes sobre o repertório genético desta alga, identificado pelas
ESTs (Expressed Sequence Tags) (Nyvall et.al; preparação). Este método foi bastante
eficiente para uma rápida obtenção e identificação de sequências codificadoras de proteínas.
Foram caracterizados vários genes de diversas categorias celulares, tais como, metabolismo,
divisão celular, energia, sínteses de proteínas, transporte entre outros.
1.1.1 Espécies Brasileiras de Gracilaria
Devido ao elevado número de espécies de Gracilaria de ocorrência na costa brasileira
(cerca de 18 espécies), espalhadas do nordeste ao sul do país (Oliveira, 1977), é considerado
de extrema importância um conhecimento mais detalhado sobre a biologia das espécies
passíveis de cultivo. Além disso, é relevante salientar à preocupação com relação a depleção
dos bancos naturais de espécies de Gracilaria. Miranda (2000), indicou que em alguns bancos
do litoral nordestino havia sinais claros de exploração causados pelo manejo inadequado.
Entre as espécies brasileiras de Gracilaria, duas que merecem destaque, G. birdiae e
G. domingensis (Figura 2), vêm sendo estudadas e comercializadas, contribuindo para o
aumento do conhecimento da biologia destas espécies. Nesse sentido, estudos pioneiros para
estas espécies em ecologia, fisiologia, morfologia, biologia molecular, entre outros, tornaram-
se de grande valia.
Introdução
25
Figura 2: Aspecto morfológico de G. domingensis, G. birdiae e G. tenuistipitata (foto: Dra. Eliane
Marinho-Soriano/UFRN).
Estudos comparativos, para alguns elementos químicos, foram realizados nessas
espécies de Gracilaria em comparação a G. tenuistipitata, esta útima utilizada como
organismo modelo para estudos. O interesse atual em se estudar essas espécies de Gracilaria
e principalmente relacionar estudos sobre poluição com metais pesados em ambientes
aquáticos passíveis de cultivo, aplicou-se o método de ICP-AES (plasma acoplado
indutivamente), para a determinação das concentrações de diferentes elementos químicos. Foi
feito uma comparação sobre o repertório de elementos químicos necessários para a
sobrevivência e crescimento destas algas.
G. domingensis
G. tenuistipitata
G. birdiae
Introdução
26
1.2 Poluentes Marinhos
Os principais acessos de poluentes marinhos ao mar, são oriundos de efluentes
industriais e municipais (ações antropogênicas). Em consequência do aumento gradativo da
poluição ambiental, organismos marinhos incluindo o fitoplâncton e macroalgas são expostos
a diferentes contaminantes químicos, os quais apresentam graus variados de toxicidade. Os
principais grupos de poluentes marinhos que impactam as zonas costeiras e oceanos em
escala mundial são produtos químicos como bifenilas policloradas (PCB), organometálicos,
pesticidas organoclorados, clorofenóis, metais pesados, além de um grande volume de
matéria orgânica lançados ao mar. (Torres et al., 2008).
Os PCBs por exemplo, foram amplamente utilizados e comercializados como fluídos
dielétricos em transformadores e capacitores, solventes, fluídos térmicos, desinfetantes entre
outros (Tanabe, 1988). Apesar de suas propriedades técnicas os PCBs deixaram de ser
comercializados devido a evidências de suas toxicidades. Estes não são biodegradáveis e são
bioacumulativos em tecidos vegetais e animais (Agency for Toxic Substances and Disease
Registry, 2000).
Outro exemplo importante são os metais pesados, geralmente em mar aberto estão em
concentrações baixas o contrário acontece em águas litorâneas perto de sistemas de rios,
emissários e esgotos (Pinto et al., 2003). Metais pesados são caracterizados por um grupo de
elementos químicos com densidade atômica maior que 5 gcm-3 ou que possuem número
atômico maior que 20 (Marques et al., 2001). Muitos desses metais, como, mercúrio (Hg),
cobre (Cu), cádmio (Cd) e chumbo (Pb) são acumulados em processos biológicos, retendo-se
por longos períodos de tempo no organismo. Este acúmulo de metais pode aumentar, através
da cadeia alimentar marinha, determinando grandes fatores de concentração. Além disso,
outro problema com relação à poluição por metais, é a alta meia-vida biológica destes
elementos (Pinto et al., 2003). Neste sentido, o fitoplâncton e macroalgas, são, provavelmente,
Introdução
27
os mais importantes vetores biológicos de metais tóxicos, uma vez que estes organismos
constituem a maior biomassa de produtores primários dos oceanos e representam o primeiro
ponto de entrada de poluentes na cadeia alimentar marinha (Torres et al., 2008). Embora
muitos metais sejam essenciais ao crescimento celular, metais como Cd, Hg e Pb não são
essenciais e consistem em elementos extremamente tóxicos (Leduc et al., 1997). A absorção
de metais tóxicos pelo fitoplâncton e macroalgas se dá provavelmente pela competição com
transportadores de metais essenciais (Guerinot, 2000).
Tais elementos promovem diversos efeitos prejudiciais aos organismos marinhos,
mesmo em baixas concentrações, da ordem de ppb (partes por bilhões) a ppm (partes por
milhões) (Nriagu & Pacyna, 1988). Observa-se na Tabela 1, a produção mundial dos
principais metais pesados, descartados anualmente no ambiente marinho (Pinto et al., 2003).
Os efeitos prejudiciais incluem; a inibição de síntese protéica e de pigmentos, crescimento,
divisão celular, taxa respiratória, fotossíntese, modificações morfológicas, redução da
biodiversidade, e promoção de estresse oxidativo celular (Leduc et al., 1997; Davies et al.,
1978). Este último, por sua vez, pode ser restabelecido pelos sistemas antioxidantes
enzimáticos ou não, presentes nos tecidos (Brezova et al., 2007). Algas, devem não somente
ter sistemas de alta afinidade por metais traço essenciais, mas também devem ser capazes de
excluir ou detoxificar metais tóxicos. Pesquisas no campo da genética mostraram que as algas
são fontes de novos elementos genéticos envolvidos no metabolismo de metais, apresentando
um potencial para aplicação biológica (Rubinelli et al., 2002).
Introdução
28
Tabela 1: Produção mundial de alguns dos metais pesados mais descartados no ambiente marinho;
descarte anual nos oceanos; concentrações em águas oceânicas sob condições normais e poluídas;
volume em águas do mar contaminadas e toxicidade dos metais em alguns organismos do fitoplâncton
marinho.
Metal Produção
(t/ano) Discartes
(t/ano) Oceanos (ng/mL)
Poluição (ng/mL)
Contaminação (m3)
Inibição do crescimento
EC50 (ng/mL)
Hg 2,0 × 103 30 0,001 > 0,01 3,00 × 1012 > 0,4 Cd 1,0 × 104 60 0,020 > 1,00 0,06 × 1012 > 25,0 PB 3,5 × 103 2350 0,030 > 5,00 0,50 × 1012 > 250,0 Cu 9,0 × 106 4500 0,100 > 2,00 2,00 × 1012 > 10,0
Adaptado de Pinto et al., 2003.
Cádmio e cobre possuem alta afinidade com grupos sulfidrílicos (-SH), podendo
inativar enzimas que participam de passos metabólicos importantes ou complexar-se com a
GSH, reduzindo a capacidade antioxidante celular (Halliwell & Gutteridge, 2007). Além disto,
estes metais podem competir com outros metais de importância biológica como cálcio (Ca+2),
alterando a sua homeostase e provocando a ativação de vários sistemas Ca+2- dependentes,
entre eles a ativação de endonucleases, e Fe+3, alterando a sua disponibilidade a reações redox.
Alguns metais também são capazes de interferir no processo fotossintético, favorecendo o
escoamento de elétrons ao oxigênio molecular (O2) (Tschiersch & Ohmann, 1993).
O sequestro e a tolerância aos metais em excessos nas algas e plantas podem ser
realizados por moléculas quelantes, tais como, metalotioneínas e fitoquelatinas (Zhou &
Goldsbrough, 1995; Rauser, 1995; Cobbet & Goldsbrough, 2002). Metalotioneínas são
polipeptídeos, ricos em cisteínas, codificados por uma família de genes. Em contraste,
fitoquelatinas é uma família de peptídeos ricos em cisteínas sintetizados enzimaticamente
(Rauser, 1995).
Apesar dos organismos disporem de estratégias defensivas, a exposição aos metais,
como consequência da poluição ambiental, pode sobrepujar a defesa antioxidante e instalar o
quadro de estresse oxidativo celular. Nestas condições, o controle dos níveis celulares de
Introdução
29
antioxidantes é fundamental para sobrevivência dos organismos em ambientes contaminados
(Halliwell, 2007; Collén, et al, 2003).
1.2.1 Cádmio
O cádmio é um metal pesado que mesmo sob baixas concentrações é tóxico. Níveis
tóxicos deste elemento podem levar à desnaturação de proteínas e ao estresse oxidativo,
resultando em danos às membranas, redução na atividade enzimática e fotossíntese, clorose
(deficiência na formação de clorofila), dentre várias outras mudanças metabólicas. Foi visto
que algumas espécies de plantas podem apresentar mecanismos de tolerância, sendo o mais
bem conhecido aquele envolvendo a quelação por tióis, como glutationa, fitoquelatinas e
metalotioneinas (Cobbett & Goldsbrough, 2002). Jiang e colaboradores (2005), descreveram
que possivelmente o mecanismo mais importante de resistência a cádmio, para algumas
espécies de fungos, plantas e algas, seria a compartimentalização em vacúolos.
Este metal não é um elemento que possui função biológica conhecida nos organismos,
mesmo assim, sua absorção por membranas plasmáticas vegetais pode ser mediado pelas
proteínas da família ZIP (IRT1 e ZNT1), Nramp, CDF e LCT1, bem como através de canais
de cálcio e potássio (Perfus-Barbeoch et al., 2002). É provável que no citosol, o cádmio é
ligado a quelantes, tais como fitoquelatinas e ácido cítrico e, posteriormente, sequestrado no
vacúolo (Clemens, 2001). Segundo Materazzi e colaboradores (2004) e Lösch (2004) o alvo
potencial da ação de metais como o cádmio, são enzimas e proteínas, que contêm grupos
sulfidril (SH) ligados entre si por ligações dissulfeto. A presença do cádmio leva à oxidação
destes grupos (Figura 3) que, reagindo com o enxofre, destrói as ligações dissulfeto,
desnaturando a proteína, resultando na redução da atividade enzimática. Exemplos deste
efeito foram descritas para enzimas do Ciclo de Krebs na mitocôndria (Shaw et al., 2006).
Introdução
30
Figura 3: Esquema da ação do cádmio em grupos sufidril.
Outro efeito do cádmio na atividade enzimática está associado ao fato de que grande
número de enzimas contém metais e a substituição destes por outro metal de mesma carga e
tamanho similar, pode resultar na inibição da atividade da enzima (Kurdziel et al., 2004).
1.2.2 Cobre
Cobre é um metal essencial para o crescimento e desenvolvimento normal de plantas e
algas, apesar de também ser potencialmente tóxico em grandes concentrações. Participa de
vários processos fisiológicos, sendo co-fator essencial para muitas metaloproteínas; no
entanto, aparecem problemas quando o cobre está presente em excesso nas células. Isso inibe
o crescimento de organismos vegetais e impede importantes processos celulares, como, por
exemplo, o transporte de elétrons na fotossíntese (Eng, 1998).
Devido à ambiguidade da importância do cobre como um co-fator essencial e como
um elemento tóxico, diferentes estratégias, como uma rede complexa de vias de transporte do
metal, evoluiu de forma a regular apropriadamente sua homeostase celular em função de
mudanças ambientais. Outras estratégias devem, impedir o acúmulo do metal na forma reativa
livre (vias de detoxificação) e assegurar a alocação adequada do metal a metaloproteína de
destino. A aquisição de cobre para dentro das células é pouco conhecido em plantas e algas.
Entretanto, recentemente um rápido progresso tem sido feito para o reconhecimento dos
processos de transporte em fungos e outros organismos eucarióticos. Consequentemente,
várias famílias de transportadores de metais têm sido identificadas (Figura 4) (Guerinot, 1998;
Himelblau & Amasino, 2000; Williams et al., 2000; Markossian & Kurganov, 2003).
SH + Cd 2+ ENZIMA
S
S Cd + 2H +
ENZIMA SH
Introdução
31
Figura 4: Caminhos identificados no transporte intracelular de cobre. Transporte de membrana celular:
COPT1, COPT3, COPT5, COX17, PAA1, PAA2, RAN1; fatores de detoxificação: Metalotioneinas,
MTs; Fitoquelatinas, PCs; Glutationas, GSH e Chaperonas, CCH e CCS (Adaptado de Williams et
al., 2000; Markossian & Kurganov, 2003).
Não existem ainda indicações palpáveis de como estes genes de transportadores são
regulados nas células. Um estudo feito por Radisky (1999), revelou que muitos
transportadores de metais, em bactérias e fungos, podem ser regulados ao nível
transcripicional por concentrações de metais extracelulares via proteínas de fator
transcripcional.
1.3 Espécies Reativas de Oxigênio
O oxigênio é utilizado como aceptor final de elétrons pelos organismos aeróbicos,
permitindo elevada produção de energia na respiração, em consequência de seu alto potencial
eletroquímico. Entretanto, devido a sua configuração eletrônica, o oxigênio pode sofrer
reduções parciais, de um elétron, e levar à formação de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs)
Mitocôndria
Golgi
Vacúolo
Citoplasma
Introdução
32
que estão constantemente presentes nas células (Figura 5). O rompimento do equilíbrio entre a
geração de EROs e as defesas antioxidantes resulta no estresse oxidativo. O conhecimento dos
mecanismos de formação e de regulação dos níveis de EROs in vivo são importantes para a
compreensão de eventos celulares relacionados ao controle da sobrevivência, da morte e da
proliferação celular. Possibilita ainda a geração de conhecimentos que permitam interferir na
modulação de tais processos, para se alcançar efeitos desejáveis em sistemas biológicos
animais e vegetais (Halliwell & Gutteridge, 2007; Bergendi et al., 1999).
As principais formas de EROs de importância biológica são o radical superóxido
(O2·-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (HO·). O radical hidroxila é o mais
reativo e pode facilmente oxidar biomoléculas. Assim é provável que o radical hidroxila reaja
nas proximidades dos sítios onde foi gerado (Halliwell & Gutteridge, 2007). O radical
superóxido pode reagir com lipídeos de membrana, proteínas, aminoácidos, ácidos nucléicos,
carboidratos e tióis (Ryter & Tyrrel, 1998). O peróxido de hidrogênio pode permear
membranas, e esta propriedade possibilita a ocorrência de reações com alvos biológicos em
compartimentos distantes do seu local de formação (Hancock & Desikan, 2001). É possível
observar na Figura 5 a redução tetravalente do oxigênio molecular, na mitocôndria, até H2O.
Introdução
33
Figura 5: Redução do oxigênio molecular durante o processo de respiração (Adaptado, Cohen, 1989).
Ressalta-se que além das EROs citadas, há outros exemplos como, o radical alcoxil,
radical peroxil, entre outras. Além disso, EROs podem se combinar com outros átomos e
formar outras espécies reativas (Halliwell & Gutteridge, 2007).
As reações radicalares podem ocorrer em três etapas denominadas de iniciação,
propagação e término, como no caso do processo de lipoperoxidação em que uma molécula de
ácido graxo é oxidada por uma espécie iniciadora (HO·, por exemplo) gerando um radical
livre que pode novamente reagir com oxigênio e/ou com outras moléculas de ácidos graxos
propagando a formação destes radicais livres. O termino ocorre quando duas espécies
radicalares reagem entre si ou quando são interceptadas por substâncias protetoras (Halliwell
& Gutteridge, 2007).
1.3.1 Mecanismos Celulares de Defesa Antioxidante
A formação endógena de EROs é uma conseqüência indiscutível do metabolismo
aeróbico (Michiels et al, 1994). Em concentrações fisiológicas as EROs têm funções
Radical superóxido
Peróxido de hidrogênio
Radical hidroxil
Introdução
34
biológicas definidas, atuando como mensageiros de sinalização. Entretanto, concentrações
supra-fisiológicas devem ser evitadas pelo organismo, considerando que sua reatividade traz
consequências celulares deletérias, causando oxidação de biomoléculas tais como proteínas,
lipídios, carboidratos, DNA e o rompimento da homeostase celular (Sies & Graf, 1985).
Para se defender da toxicidade das EROs, o organismo apresenta mecanismos de
defesa em três níveis distintos; 1) prevenção da formação de EROs; 2) eliminação de EROs
formadas e 3) reparo de moléculas modificadas por EROs (Sies, 1993). Na prevenção da
formação EROs cita-se como exemplo a restrição de spin do oxigênio que diminui sua
reatividade com biomoléculas, o transporte de oxigênio na forma ligada e não livre, a
quelação de metais durante o transporte e armazenamento, evitando a ocorrência de reação de
i.Fenton e ii.Haber-Weiss, a eficiência da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria que
mantêm a formação de EROs em nível controlado e a organização estrutural do DNA em
cromatina (Sies, 1993).
i. H2O2 + M (n-1)+ .OH + -OH + Mn+
ii. O2.- + Mn+ O2 + M(n-1)+
M(n-1)+ + H2O2 Mn+ + .OH + -OH
Na eliminação de EROs formadas, existem dois mecanismos: i) Mecanismo
antioxidante enzimático; este mecanismo (Figura 6), vastamente descrito na literatura,
incluem como principais enzimas antioxidantes, superóxido dismutase (SOD), glutationa
peroxidase (GPX), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST), catalase,
tiorredoxina redutase, entre outras (Nordberg & Arnér, 2001). i.i) Mecanismo antioxidante
não enzimático; este mecanismo é composto por moléculas que protegem alvos biológicos da
oxidação, incluindo moléculas lipofílicas ou hidrofílicas, que protegem compartimentos
apolares e polares do meio biológico, respectivamente. Cita-se como exemplo o tocoferol,
ascorbato, carotenóides e compostos fenólicos, entre outros (Ohta, 2000). Além disso, existe o
Introdução
35
terceiro mecanismo de reparo de danos do DNA. Se, por exemplo, os mecanismos
antioxidantes não conseguirem impedir os danos ao DNA, ocorrem injúrias oxidativas, que
incluem a modificação de bases de açúcares e a formação de ligações cruzadas entre fitas
duplas e simples (Dizdaroglu, 1991). Três mecanismos básicos foram descritos para reparar
danos oxidativos do DNA: reparo de excisão de bases, reparo de excisão de nucleotídeo e
reparo de erro de pareamento (Lunec et al., 2002).
Figura 6: Principais enzimas envolvidas no mecanismo antioxidante enzimático.
1.4 Biblioteca de cDNA de G. tenuistipitata
Poucos estudos moleculares foram realizados com algas vermelhas em comparação
com outros organismos. Os dados de sequências expressas (ESTs) têm revelado um método
bem sucedido para a investigação da expressão genética. Este método já foi utilizado para
alga G. gracilis com 200 ESTs sequenciadas (Lluisma & Ragan, 1997) e em grande escala
como para a alga vermelha Porphyra yezoensis com um total de 10 000 ESTs sequenciadas
(Nikaido et al., 2000).
Devido ao grande conhecimento que a técnica de ESTs pode trazer em relação à
expressão gênica de G. tenuistipitata, foi construída uma biblioteca de cDNA na fase
SOD - superóxido dismutase GPX - glutationa peroxidase
GR - glutationa redutase Catalase
e -
O 2 O 2 · -
SOD H 2 O 2
H 2 O + O 2
Catalase GSH GSSG
GR
NAPH NADP +
H 2 O
GPX
e -
O 2 O 2 · -
SOD H 2 O 2
H 2 O + O 2
Catalase 2 GSSG
GR
NAPH NADP +
H 2 O
GPX
Introdução
36
tetraesporofítica (2n) da alga, podendo assim analisar todo o seu repertório genético, em
condições normais de cultura.
A biblioteca de cDNA de G. tenuistipitata foi confeccionada utilizando amostras
coletadas em condições normais de cultura (após 18 horas da última adição de nutrientes e
depois de 2 horas de luz). Obteve-se duas bibliotecas, com médias em torno de 1600 e 600
pares de bases. As bibliotecas foram sequenciadas obtendo um total de 3631 ESTs. Após
sequenciamento da região 5´e análise, assegurou-se uma boa qualidade das sequências. Esta
biblioteca é caracterizada também por 2387 sequências únicas, 53,4 % de redundância, 49%
de bases GC e obteve-se uma média de 850 pares de bases nas sequências de leituras.
Dentre as classificações das ESTs de G. tenuistipitata várias categorias foram
separadas de acordo com o Centro de Sequências de Proteínas de Munique (MIPS). As
principais categorias analisadas foram; metabolismo, energia, crescimento, organização
celular , transporte e defesa celular (Nyvall et.al;em preparação).
1.5 Avaliação da Expressão Gênica
Análises do padrão da expressão de genes em diferentes situações fisiológicas é uma
etapa importante para a compreensão dos mecanismos envolvidos nos mais diferentes
processos celulares, incluindo, por exemplo, a resposta das células à estresses ambientais
variados. Entre as tecnologias que permitem a avaliação do transcriptoma, os microarranjos
ou chips de DNA são considerados uma alternativa excelente. Esta tecnologia possibilita a
análise quantitativa dos níveis de expressão de milhares de genes simultaneamente,
permitindo, com relativa facilidade, a avaliação global da expressão gênica em organismos,
tecidos ou células, frente aos mais variados tratamentos (Schena et al., 1998; Lockhart &
Winzeler, 2000; Schulze & Downward, 2001; Conway & Schoolnik, 2003). Os microarranjos
Introdução
37
de DNA são uma potente ferramenta para a utilização da grande quantidade de informações
que estão sendo geradas através dos projetos de sequenciamento de genomas (Schena et al.,
1998; Wolf et al., 2001).
Para a confecção dos microarranjos, fragmentos de DNA são imobilizados em um
arranjo ordenado sobre uma superfície sólida, em alta densidade. Em geral, cada ponto no
arranjo corresponde a um gene específico, podendo existir dezenas de milhares de pontos em
uma lâmina. Desta forma os fragmentos de DNA depositados no suporte sólido funcionam
como detectores moleculares para a prospecção simultânea dos níveis de expressão de cada
um dos genes representados no microarranjo frente a amostras complexas de RNA
mensageiros (mRNA). Os microarranjos atualmente em uso são de dois tipos principais:
microarranjos em lâminas de vidro (spotted DNA microarrays) e microarranjos de
oligonucleotídeos gerados por síntese de DNA in situ. Os microarranjos do primeiro tipo
podem ser construídos domesticamente ou adquiridos comercialmente, enquanto os do
segundo tipo são disponíveis apenas comercialmente. Geralmente, os fragmentos de DNA
depositados na lâmina de vidro correspondem a produtos de PCR derivados diretamente de
sequências genômicas ou de clones de cDNAs disponíveis através de coleções (bibliotecas de
cDNA) distribuídas comercialmente ou geradas nos próprios laboratórios. O tamanho destes
fragmentos está freqüentemente na faixa de 300 a 2000 pares de bases (Schena et al., 1998;
Lockhart & Winzeler, 2000; Schulze & Downward, 2001; Brazma et al., 2002).
Nos experimentos que empregam microarranjos para a avaliação do perfil de
expressão gênica, o RNA total da amostra controle (não tratada) e da amostra experimental
(tratada) é extraído e convertido em cDNA na presença de nucleotídeos acoplados a
grupamentos fluorescentes diferentes. Os cDNAs das duas amostras são então misturados e
co-hibridizados com o DNA imobilizado (designado sonda) nas lâminas de vidro. Após a
reação de hibridização, a lâmina é lavada e a intensidade de fluorescência para cada ponto é
Introdução
38
determinada pela varredura do microarranjos por um scanner, o qual possui lasers capazes de
excitar os dois fluoróforos separadamente. A intensidade do sinal fluorescente resultante em
cada ponto é quantificada e algoritmos de normalização para correção de fatores, tais como
diferenças de intensidades de incorporação e variações topográficas na lâmina, são aplicados
aos valores obtidos. O cálculo da razão das intensidades de dois sinais fluorescentes para um
mesmo ponto no microarranjo reflete a expressão relativa do gene ali representado, entre as
duas amostras biológicas que estão sendo comparadas. Deste modo, a razão das intensidades
dos dois sinais fluorescentes em cada ponto permite avaliar a expressão relativa de cada gene
representado no microarranjo. Utilizando-se a metodologia de microarranjos foi possível fazer
uma análise da expressão diferenciada de alguns genes essenciais envolvidos, no processo de
fotossíntese, transporte, no metabolismo energético, entre outros, de G. tenuistipitata.
39
2. Objetivos
O objetivo central deste trabalho foi estudar a resposta adaptativa celular e molecular
de G. tenuistipitata submetida em meio de cultivo contaminado com os metais tóxicos cobre e
cádmio, amplamente descartados no meio ambiente.
Para abordar características mais amplas desta resposta adaptativa foram realizadas as
seguintes estapas de análises:
i. Avaliar a capacidade de absorção da alga para cobre e cádmio em meio de cultivo.
ii. Analisar se realmente os metais exerceram efeitos tóxicos na alga durante 6 dias de
exposição
iii. Estimar, após este tempo de exposição, a variação da expressão gênica global em
termos de funções celulares
40
3. Matérias e Métodos
3.1 Cultivo da Alga
A Gracilaria tenuistipitata é uma espécie utilizada em estudos fisiológicos,
bioquímicos e moleculares, servindo como organismo modelo entre as algas vermelhas para
vários tipos de análises (Oliveira & Plastino, 1994). As algas são mantidas no laboratório em
incubadoras (Precision Scientific, modelo 818) com fotoperíodo de 12 h de luz (luz branca
fluorescente, 150 µmol fótons m-2s-1) e 12 h de escuro sob aeração constante (Figura 7). O
meio utilizado para o cultivo é o Von Stosch, rico em sais e vitaminas (Edwards, 1970). A
Tabela 2 representa os componentes que compõe este meio. A água do mar é filtrada,
esterilizada e diluída em 40% de água MilliQ.
Tabela 2: Concentrações de sais e vitaminas por litro de água do mar no meio Von Stosch..
Reagente mg.L-1 H2Omar
NaEDTA.2H2O 3,72 NaNO3 42,5
Na2HPO4 10,75 FeSO4.7H2O 0,278 MnCl2.4H2O 0,0198
Tiamina 0,25 Biotina 0,001
Cianocobalamina 0,001
No cultivo de G. tenuistipitata, o meio Von Stosch, é diluído em água do mar estéril a
uma salinidade de 21‰ e a temperatura nas incubadoras é sempre mantida a 20 ± 2 0C. As
Materiais e Métodos
41
algas são mantidas na proporção de 1 g de peso fresco da alga em 200 mL de meio de cultivo
e as trocas são realizadas 2 vezes na semana. Durante a manutenção, essas algas são limpas e
em caso de contaminação com cianobactérias e diatomáceas, as algas são tratadas, com
ampicilina (70 mg.L-1) e nistatina (100 µg.L-1).
Figura 7: Cultivo de G. tenuistipitata em incubadoras. Temperatura, período e intensidade de luz e
aeração são controlados.
3.2 Descrição da Técnica de ICP-AES
As análises foram conduzidas em um sistema de espectrofotômetro de emissão
atômica com fonte de plasma acoplado indutivamente (ICP-AES, Genesis, modelo SOP). Para
as análises de ICP-AES, foram utilizados recursos da Central Analítica do Instituto de
Química/USP.
Esta técnica faz uso de uma fonte de excitação de plasma de argônio para produzir
átomos excitados que emitem radiação em comprimentos de onda na faixa de 125 a 950 nm.
A emissão de radiação por átomos ou íons produz comprimentos de onda que são
característicos para cada elemento químico. Essas linhas de emissão podem ser usadas para
identificar a presença de um elemento químico na composição de materiais, através da
Materiais e Métodos
42
espectroscopia de emissão atômica. A concentração de um íon numa solução pode ser
determinada a partir da medida da intensidade da luz emitida na linha característica desse íon
numa fonte ICP. A relação entre a intensidade de luz emitida por uma solução de calibração,
contem o íon a ser analisado onde a concentração é conhecida. Logo, a partir da análise
espectroscópica da luz emitida por uma fonte ICP, é possível identificar e quantificar os íons
presentes numa solução analítica entre as concentrações de 10-1 até 10-4 mg.L-1. A composição
química de uma amostra sólida também pode ser determinada por ICP-AES, que consiste de
um sistema de introdução da amostra, fonte ICP, sistema de fornecimento de gás, gerador de
rádio freqüência, espectrômetro óptico, detectores, eletrônica e sistemas de aquisição.
3.2.1 Condições Experimentais para ICP-AES
Para avaliar os efeitos de Cu e Cd sobre G. tenuistipitata, partiu-se de concentrações
de CE50 para cobre (0,95 ppm) e cádmio (1,00 ppm), baseados em estudos prévios realizados
para a curva de crescimento desta alga, durante 6 dias de tratamento (Neto 2008, tese de
doutoramento-IQ/USP). A manutenção do cultivo da alga para o experimento de ICP-AES
foram as mesmas já esclarecidas na Seção 3.1. A seguir, foram detalhados o planejamento e a
utilização do ensaio biológico específico para a técnica ICP-AES.
Amostras de algas, foram separadas e acrescidas ao cultivo (meio Van Stosch, 60% de
água do mar filtrada e esterilizada e 40% de água MilliQ), juntamente com concentrações de
CE50 para cada um dos dois metais, foram utilizados sais de cádmio, (CdCl2) e cobre (CuSO4)
para estes ensaios. Para cada condição de tratamento foram utilizados 10 g de alga em 2 L de
meio de cultivo já acrescido do metal, sob as mesmas condições padronizadas de luz,
temperatura e aeração que a alga é mantida (Seção 3.1).
Após 6 dias de exposição aos metais, amostras de algas em triplicatas, foram coletadas
em três condições: controle (condições normais de cultivo), exposta ao metal cobre, exposta
Materiais e Métodos
43
ao metal cádmio. Foi realizada uma única coleta da alga, 6 dias após a exposição aos metais,
após a última adição de nutrientes e após 2 horas de exposição à luz do ultimo dia. Desta
maneira tentou-se reproduzir as mesmas condições de coleta da alga quando foi
confeccionada a biblioteca de cDNA. Imagina-se então, que o mesmo repertório de genes
expressos na construção da biblioteca foi abrangido, ao menos para a condição controle.
Além disso, foram utilizados também três controles dos meios de cultivo (Tabela 3 e
Figura 8). Deste modo, consegui-se medir a quantidade de cádmio e cobre no meio de cultivo
antes de submeter à alga ao tratamento e após, ao final da exposição. Para cada um dos
controles (1, 2 e 3 representados na Figura 8) foram separadas, em triplicatas, alíquotas de 20
mL do meio de cultivo de cada um dos frascos (A, B e C da Figura 8) utilizados nos ensaios
biológicos.
Tabela 3: Controles dos meios de cultivo utilizados na técnica de ICP-AES. Confira também Figura 8.
Número do Controle Descrição
1 Três frascos (A, B e C) sem adição de metais, só meio Von
Stock diluído em água do mar.
2 Os mesmos 3 frascos (A, B e C) do controle 1, mas com adição de cobre no frasco B e cádmio no frasco C.
3 Os mesmos 3 frascos do controle 2 após o tempo de exposição e retirada da alga.
Após exposição amostras de 1 g de alga, em triplicata, foram transferidas para
béqueres de 50 ml de capacidade. Adicionou-se 10 mL de HNO3 concentrado, aquecendo-se
em refluxo por 2 horas a 80°C. Após esta etapa, foi adicionado 1 mL de H2O2 30%,
mantendo-se em refluxo por 1 hora. O conteúdo foi diluído em balão volumétrico com 25 mL
de água MilliQ.
Materiais e Métodos
44
Figura 8: Representação esquemática dos três controles sobre os meios de cultivo. Cada controle
apresenta 3 frascos (A, B, C), contendo alíquotas dos meios de cultivo, cujas concentrações de cobre e
cádmio foram medidas via técnica ICP-AES. O meio Von Stock em cada frasco foi diluído em água do
mar.
Na operação de leitura do equipamento (ICP-AES) foram utilizadas cinco
concentrações padrões de 0, 1, 2, 5 e 10 ppm, para cobre e para cádmio (Figuras 9A e 9B).
Podemos observar através das “curvas padrão” (linha azul e pontos vermelhos) que o aparelho
foi ajustado, e que estas curvas servem como escala de conversão entre unidade de contagem
[cps] e concentração [ppm]. Após as medidas dos sinais, as intensidades dos elementos
medidos foram avaliadas pelo software Smart Analyzer.
alga
alga alga
cobre cádmio
Materiais e Métodos
45
Figura 9: Curvas padrão para o cobre (A) e para o cádmio (B), utilizadas como escala de conversão
entre unidade de contagem [cps] e concentração [ppm].
Foram também analisadas por ICP-AES duas outras espécies de Gracilaria brasileiras
(G. birdiae e G. domingensis), doadas pela Professora Dra. Eliane Soriano da Universidade do
Rio Grande do Norte. Estas espécies foram coletadas na praia do Cotovelo e praia do Fogo,
(Natal, Rio Grande do Norte), e não foram expostas a nenhum tipo de tratamento. Desta
maneira, foi possível analisar, entre as espécies brasileiras de Gracilaria em relação a G.
tenuistipitata, o padrão de concentração de alguns elementos químicos (Al, Ca, Fe, Mg, P, Si,
Mn, B, K, Na, Cu, Cd, Ba, Ni, Zn, Sr, Cr, Co e As).
3.3 Visualização de H2O2 por Precipitação de CeCl3
Foi detectado a formação de peróxido de hidrogênio (H2O2), um importante indicador
de estresse oxidativo. Esta metodologia foi feita em colaboração com o Dr. Jonas Collén do
laboratório “Marine Plants and Biomolecules” chefiado pela Dra. Catherine Boyen, na Station
Biologique de Roscoff (CNRS-UPMC), França.
(B) 1ppm ≅≅≅≅ 50××××103 cps (A) 1ppm ≅≅≅≅ 230××××103 cps
Materiais e Métodos
46
As algas possuem um grande aparato genético de resistência a estresses ambientais e
consequentemente, metabólico e fisiológico (Adhiya et al., 2002; Rubinelli et al., 2002).
Dessa forma, foram feitas comparações após exposições de 1 hora, 1 dia e 6 dias, detectando
diferentes níveis de acúmulo desse indicador de estresse. Detalhamos todo o procedimento a
seguir.
A atividade de H2O2 foi detectada citoquimicamente através da reação com cloreto de
cério (CeCl3), produzindo depósitos eletrodensos de peridróxidos de cério. Aqui utilizamos
ensaios histoquímicos baseados na reação de H2O2 com CeCl3 para produzir precipitados
eletrodensos insolúvel de peridroxidos de cério, Ce[OH]2OOH e Ce[OH]3OOH. Esta técnica
ultra-estrutural permite a localização precisa de sítios de acumulação ou produção de H2O2
(Czaninski et al., 1993).
3.3.1 Protocolo e Soluções
Para a localização sub-celular de H2O2 através de CeCl3, como descrito acima, todas as
soluções foram preparadas a partir de água do mar filtrada e autoclavada na proporção salina
que matem G. tenuistipitata em condições normais de cultura. Este método que é capaz de
gerar peridróxidos de cério insolúveis, foi adaptado de Bestwick et al. (1997).
Na utilização do protocolo para a técnica foram utilizadas as soluções a seguir:
1. Tampão MOPS (3-[N-morpholino] propane sulphonic acid) 50mM, pH 7.2
2. 5 mM de cloreto de cério em tampão MOPS (50 mM, pH 7.2), o pH foi
regulado para 7.2 com solução de NaOH 10 M
3. Glutaraldeído 3% diluído em água do mar, filtrada e autoclavada
4. Paraformaldeído 1,5% diluído em solução de glutaraldeído 3%
5. Etanol 25%, 50% e 75% diluído em água do mar, filtrada e autoclavada
Materiais e Métodos
47
Fragmentos dos tecidos frescos de G. tenuistipitata foram encubados em tubos
eppendorf durante 1 hora em 1 mL de solução de cloreto de cério, 5mM e MOPS, 50mM.
Após este período de exposição ao cloreto de cério os tubos foram esvaziados e fixados
durante uma hora em solução de glutaraldeído 3%.
Outra fixação foi feita durante toda noite em solução de 400 µL de paraformaldeído
1,5% e 3% de glutaraldeído. Após fixação, os fragmentos foram secos em sucessivos banhos
de etanol com concentração crescente de 25% durante uma hora, 50% uma hora duas vezes,
75% uma hora duas vezes e finalmente 100%. Esta metodologia utiliza soluções crescentes de
etanol, pois é importante desidratar todo o tecido, conservando assim suas estruturas
histológicas e citológicas. Após, os fragmentos foram embebidos em resina SPURR (Bishop’s
Stortford) com concentração crescente de etanol, novamente para desidratar, à uma
temperatura ambiente; (25%, 50% e 75% cada uma a 24 horas e 100% durante duas horas).
Os fragmentos foram polimerizados em blocos à 60ºC durante 4 dias numa orientação
horizontal (Olmos & Hellin, 1997).
Após a polimerização, os blocos foram seccionados entre 70 e 90 nm em um
ultramicrótomo (Milton Keynes), utilizando uma lâmina de diamante (Diatome, Bienne). Os
cortes foram examinados em um microscópio eletrônico de transmissão (modelo 7000;
Hitachi) com uma voltagem de 75 kV.
3.3.2 Condições Experimentais para Detecção de H2O2
As condições de manutenção do cultivo da alga para o experimento de precipitação de
H2O2 e a concentração de CE50 utilizadas (0,95 ppm para Cu e 1,00 ppm para Cd) foram as
mesmas já esclarecidas nas Seções 3.1 e 3.2.1. Todas as amostras analisadas foram oriundas
de talos tetraesporofíticos e os cortes foram realizados em uma orientação transversal. A
Materiais e Métodos
48
seguir, apresenta-se em detalhes o planejamento e a utilização do ensaio biológico específico
para esta técnica.
Amostras de algas, foram separadas e acrescidas ao cultivo (meio Van Stosch, 60% de
água do mar filtrada e esterilizada e 40% de água MilliQ), juntamente com concentrações de
CE50 para cada um dos dois metais, foram utilizados sais de cádmio, (CdCl2) e cobre (CuSO4)
nos ensaios de precipitação de H2O2. Para cada condição de tratamento, foram utilizados 1 g
de alga em 0,2 L de meio de cultivo já acrescido do metal, sob as mesmas condições
padronizadas de luz, temperatura e aeração que a alga é mantida (Seção 3.1). Para este
método a mesma proporção de alga/volume foi mantida como em cultura, mas em
quantidades menores.
Amostras da alga foram coletadas em tempos diferentes de exposição; 1 hora, 1 dia e
6 dias para o controle (condições normais de cultivo), exposta ao metal cobre e exposta ao
metal cádmio. Após a coleta, imediatamente amostras de talo foram seccionadas e os
fragmentos foram incubados em solução de cloreto de cério e tampão MOPS como descrito
na Seção 3.3.1.
3.4 Extração de RNA Total
A extração de RNA total foi padronizada utilizando o kit Concert Plant RNA Reagent
(Invitrogen). Este método foi utilizado para os experimentos de microarranjos e PCR em
tempo real. Este protocolo tem a finalidade de isolar RNA total de tecidos de plantas em
pequena escala ou em grande escala, especialmente aqueles tecidos ricos em carboidratos e
polifenólicos. Inicialmente partiu-se de amostras de alga em pequena escala. Nas instruções
do protocolo para pequena escala orienta-se a macerar no máximo 0,1 g de tecido e para
grande escala no máximo 5 g de tecido. Após maceração de 0,1 g de tecido, imediatamente
adicionou-se 0,5 mL do único reagente que é fornecido pela Invitrogen. A amostra foi
Materiais e Métodos
49
incubada por 5 minutos, seguindo-se a centrifugação, após o sobrenadante foi transferido para
um tubo eppendorf (livre de RNase). Foi adicionado NaCl 5M, seguindo de 0,3 mL de
clorofórmio. A mistura foi centrifugada durante 10 minutos onde as fases, polar e apolar
foram separadas. A fase aquosa (polar) foi recolhida e acrescentada igual volume de
clorofórmio. Centrifugou-se novamente, e o pellet foi lavado em etanol e diluído em 20 µL de
água tratada com DEPC (dietilpirocarbonato). As amostras também foram tratadas com
DNase conforme Seção 3.6.2 e essas foram lidas no espectrofotômetro NanoDrop (ND 1000),
obtendo-se uma concentração de 100 ng/µL de RNA total. Posteriormente todas as outras
amostras de RNA total utilizadas nos experimentos de microarranjos de DNA e PCR
quantitativo foram extraídas com este mesmo protocolo em grande escala (segundo fabricante,
Invitrogen). Após a extração as amostras de RNA total, foram purificadas utilizando mini-
colunas da QUIAGEN (RNeasy Mini Spin Column).
3.5 Microarranjos de cDNA
Foi utilizada a metodologia de microarranjos de DNA previamente implantada no
Departamento de Bioquímica do IQ-USP utilizando recursos do projeto temático CAGE
(Cooperação para Análise de Expressão Gênica; CageLab: http://bioinfo.iq.usp.br/cagelab
financiado pela FAPESP). Neste laboratório faz-se confecção, hibridização e análise de
microarranjos de DNA.
Para a produção dos microarranjos de DNA representando genes de G. tenusistipitata
foi utilizada uma biblioteca de cDNA contruida em nosso laboratório por Nyvall e
colaboradores, totalizando 38 placas de 96 poços, uma redundância de 53,4% e 2387
sequências únicas. Das 38 placas foram utilizadas 22 desta biblioteca e não foram feitas
seleções dos clones para construção dos microarranjos, mesmo havendo mais de uma
Materiais e Métodos
50
repetição para um mesmo clone. Deste modo, a chance de ocorrência de possíveis erros de
endereçamento durante a manipulação foi diminuída, sem contar que genes com mais de um
clone serviram de controles internos no procedimento de hibridização e análises. Estes clones
foram amplificados por PCR convencional em 100 µL de reação final, realizadas em placas
de 96 poços, a partir de 1 µL de cada estoque de clone bacteriano que são mantidos a - 70 ºC.
Os primers utilizados foram os mesmos primers do vetor pBK-CMV (T3 e T7) utilizados na
construção da biblioteca (Nyvall et.al; em preparação). A PCR típica consistia em:
desnaturação a 95ºC por 5 minutos seguida de 35 ciclos de 95ºC por 45 segundos, 55ºC de
anelamento a 30 segundos e extensão de 72ºC por 2 minutos. Após PCRs, foram feitos as
purificações em placas Multiscreen (Millipore MAFB), dos amplicons das 22 placas e análise
em gel de agarose 1,5%. (Figura 10). O conjunto de amplicons obtidos foram transferidos
manualmente para placas de 384 poços e depositados em lâminas espelhadas, utilizando o
Generation III Microarrays Spotter (GE, Healthcare). Este spotter permite a deposição de até
4608 amostras de DNA organizadas em 12 subconjuntos de 384 pontos. O conjunto total de
amostras foi depositado em duplicata nas duas metades longitudinais da lâmina, configurando
o que chamamos de set A e set B. Após deposição dos fragmentos de DNA, as lâminas foram
submetidas a 50 mJ de luz UV, para que as fitas de DNA fossem covalentemente fixadas.
Para avaliação da expressão gênica, os microarranjos foram hibridizados com cDNA
fita simples fluorescente gerado pela incorporação dos fluoróforos, Alexa flúor 555 e Alexa
flúor 647 (Invitrogen). Após a hibridização, o chip foi analisado no Generation III Scanner
(GE, Healthcare) para obtenção das imagens que refletiram a intensidade de fluorescências
dos pontos do microarranjo.
Materiais e Métodos
51
Figura 10: Eletroforese em gel de agarose 1,5%, de algumas amostras das placas de DNAs
amplificadas e purificadas a partir de clones bacterianos. Foi utilizado o marcado de peso molecular de
1 Kb Plus Ladder (Invitrogen) e foram aplicados 3 µL de cada amplificado.
3.5.1 Ensaios Experimetais Utilizados nos Microarranjos de DNA
A exposição com os metais foi elaborada com o mesmo meio de cultivo (meio Van
Stosch, 60% de água do mar filtrada e esterilizada e 40% de água MilliQ) acrescido de
concentrações (conforme CE50 de cada metal) de sais de cádmio (CdCl2) e cobre (CuSO4),
individualmente, sob as mesmas condições de luz e temperatura descrito na Seção 3.1. Foram
coletadas amostras da alga para extração de RNA, após 6 dias de exposição aos metais, após a
última adição de nutrientes e 2 horas de luz, onde poderia-se encontrar o mesmo repertório de
genes da biblioteca. Foram reproduzidas as mesmas condições de temperatura, quantidade de
nutrientes e período de luz da alga, que as usadas na preparação da biblioteca de cDNA.
3.5.2 Marcação e Hibridização com os Microarranjos
Na preparação de cDNA marcado e hibridizado com os microarranjos o RNA total foi
utilizado como molde para transcrição reversa em cDNA, utilizando-se nucleotídeos
acoplados a grupamentos fluorescente (Alexa flúor 555 e Alexa flúor 647), a enzima
Supercript III (Invitrogen) e 500 ng de iniciadores nonaméricos aleatórios. O kit utilizado para
a formação de cDNA foi o SuperScript Indirect cDNA Labeling System (Invitrogen) e todo o
procedimento foi feito de acordo com o fabricante. Após a transcrição, o RNA foi submetido
3000
2000
1000
3000
2000
1000
Materiais e Métodos
52
a hidrólise alcalina e o cDNA foi purificado em placas de filtração (Millipore, modelo
Multiscreen). A incorporação dos fluoróforos Alexa 555 e Alexa 647 foi quantificada
determinando-se a absorbância do cDNA purificado em 260 nm e 280 nm. As hibridizações
foram realizadas na presença de formamida deionizada na estação automática para
hibridações de microarranjos (CAGE). As lâminas foram lavadas com SSC (1x e 0,1x) com
presença de 2% de SDS a 55ºC e SSC 0,1x por 10 minutos a temperatura ambiente. As duas
soluções utilizadas para lavagem das lâminas, SSC e SDS (USB, Corporation), foram filtradas
em membranas com poros de 0,22 µM. As lâminas foram lavadas em água deionizada,
submetidas á secagem com nitrogênio gasoso e analisadas no Generation III Scanner (GE,
Healthcare), para a obtenção das imagens que refletem as intensidades de fluorescência dos
pontos dos microarranjos.
3.5.3 Análise de Dados Gerados nos Microarranjos
Após a varredura dos microarranjos no scanner, os dados brutos de intensidade de
fluorescência de Alexa 555 e Alexa 647 para cada ponto, foram extraídos utilizando-se o
programa ArrayVision 8.0 (Imaging Research Inc.), que delimita os contornos da imagem de
cada ponto e cria tabelas com as respectivas intensidades. Para quantificar a intensidade de
fluorescência do ponto utilizou-se a Median Artifac Removed Density (MTMDens) que
constitui uma mediana de densidade, excluindo-se os pixels que apresentaram sinal acima ou
abaixo de quatro desvios absolutos da mediana (MAD), permitindo a exclusão de pixels que
apresentassem poeiras ou artefatos de hibridização. A intensidade de fluorescência de cada
ponto foi determinada como sendo o valor de MTMDens subtraindo-se a mediana do sinal de
fundo.
Após o alinhamento e a extração das medidas foi realizada uma verificação visual das
imagens em ambos os canais para as lâminas. Sondas suspeitas de terem sinal influenciado
Materiais e Métodos
53
por manchas ou riscos receberam também marcações individuais. Ao final das análises os
dados foram extraídos e gravados em arquivos texto.
3.5.4 Normalização dos Dados de Microarranjos
A normalização foi feita pelo método do ajuste Lowess (Local Weighted Scatter-plot
Smoothing). Esse método representa um ajuste não-paramétrico local de regressão-linear
ponderada, o qual considera as intensidades não normalizadas de todos os pontos da lâmina, e
calcula os parâmetros que melhor ajustam retas para pequenos sub-conjuntos de dados nas
diferentes faixas de intensidades da emissão, no espaço log2(IA555/IA647) versus log2
(IA555IA647)1/2 (Yang et al., 2002). Para estas análises foi construído um programa “GT
Microarray Analysis”, vide Anexo A.
O desenho experimental planejado consiste no modelo reference design (Churchill,
2002), no qual as amostras tratadas com metais foram comparadas com uma condição
considerada referência. Essa condição representou o padrão de expressão gênica de G.
tenusistipitata em condições normais de crescimento a 20±2 0C no meio de cultivo, conforme
realizado para construção da biblioteca. Essa condição foi comparada com o crescimento da
alga na presença de sais de cádmio (CdCl2) e cobre (CuSO4) nas concentrações em que o
crescimento é aproximadamente inibido em 50% (CE50). Para cada metal, foi realizado
hibridações com amostras provenientes de 2 experimentos independentes (réplicas
biológicas). Para cada réplica biológica foram feitas duas hibridizações (réplicas técnicas),
invertendo os fluoróforos entre a amostra referência e teste, no que se convencionou chamar
de dye swap. Essa estratégia auxilia a normalização dos dados e corrige eventuais diferenças
de incorporação. Dessa forma utilizou-se no mínimo 6 lâminas de microarranjos para cada
metal. Levando-se em conta os problemas decorrentes de padronização da marcação
fluorescente e hibridização, foram utilizadas em torno de 17 lâminas para cada metal.
Materiais e Métodos
54
3.6 PCR em Tempo Real
Os resultados de microarranjos foram validados pela técnica de PCR em tempo real
em colaboração com o Dr. Jonas Collén do laboratório “Marine Plants and Biomolecules”
chefiado pela Dra. Catherine Boyen, na Station Biologique de Roscoff (CNRS-UPMC),
França.
3.6.1 Construção dos Primers
Foram construídos, para a PCR quantitativa, 12 primers (Tabela 4) iniciadores
planejados a partir do programa Beacon Designer (PREMIER Biosof). As sequências para
construção destes primers foram retiradas do banco de ESTs de G. tenuistipitata. Como
prioritário, na fabricação dos primers, considerou-se que os produtos gerados das PCRs
deveriam ter entre 80 e 150 pb e temperatura de anelamento entre 60 e 63ºC.
Entre os genes escolhidos, 2 foram constitutivos, aumentando a qualidade e as
estatísticas dos dados, e 10 não constitutivos que tiveram sua expressão alterada nos
resultados de microarranjos. Os primers utilizados foram:
Tabela 4: Genes utilizados como moldes na construção de primers para os experimentos de PCR em
Tempo Real.
Genes não Constitutivos
Thioredoxin Hypothetical Superoxido Dismutase Glutamate cysteine ligase Heat Shock Protein 90 Photosystem II Oxygen High Affinity Nitrate Transporte Vanadium Dependent Bromoperoxidase Zeaxanthin Glucose transferase Leucine Zipper-EF-Hand Containing Transmenbrane Protein
Genes Constitutivos Actin Elongation Factor 1 Alpha
Materiais e Métodos
55
3.6.2 Amostras de RNA
Amostras de RNA extraído das triplicatas biológicas foram tratadas com DNase
(QIAGEN), para excluir qualquer contaminação e reações cruzadas com DNA. Ao final da
extração de RNA as amostras foram submetidas ao tratamento de descontaminação com
DNase I utilizando 0,5 unidade Kunitz para uma quantidade de RNA entre 0,5 a 2 µg e 2 µL
de tampão 10x (Tris-Cl 500mM, pH 8.0; MgCl2 50 mM; DTT 10 mM). As amostras foram
deixadas a temperatura ambiente por 30 minutos para degradação do DNA e após foram
incubadas por 5 minutos a 65 ºC para inativar a DNase.
Após ensaios com DNase foram feitos PCRs convencionais (PCR master mix,
Promega) com as amostras de RNA no intuito de observar a ausência de DNA genômico
residual e garantir boa qualidade das amostras. Utilizou-se concentrações entre 25 a 50 ng de
RNA, 7,5 µL de tampão master mix 2x, 10 µM de cada primer e H2O livre de RNase
ajustando o volume final para 15 µL de reação. O programa utilizado foi: 4 minutos a 94ºC,
35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, 30 segundos a 72ºC e após os ciclos
72ºC a 2 minutos.
Além disso, foram feitos dois outros testes controles para garantir a boa qualidade dos
resultados de PCR em tempo real. O primeiro, outro PCR, como descrito acima, utilizando
DNA genômico com todos os 12 primers. Foi possível descobrir se os primers poderiam ter
homologia com outras sequências do genoma e se haveriam possíveis intros para cada gene.
O segundo teste controle foi realizado com cDNA a partir de RNA, utilizando a reação de RT-
PCR (Transcriptase Reversa seguida de PCR), para observar se haveria apenas um produto
amplificado. O protocolo utilizado foi o ImPromII Reverse Transcription System (Promega).
Cerca de 25 ng de RNA foi utilizado para cada primer na reação, 7,5 µL de tampão Acess
Quick 2x, 10 mM de cada primer, 0,5 µL de AMV-Rtase e H2O livre de RNase para um
Materiais e Métodos
56
volume final de 15 µL de reação. O ciclo do RT-PCR foi o mesmo descrito acima com a
diferença de uma etapa inicial a uma temperatura de 42 ºC por 30 minutos.
Para a formação do cDNA, na utilização do PCR em tempo real, utilizou-se a etapa
inicial do ciclo, ou seja, somente o RT (Transcripitase Reversa).
3.6.3 Técnica da RT-PCR em Tempo Real
Foi utilizado nas reações de RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) o equipamento
Chromo 4 Real Time PCR System (BioRad, Opticon). Nas amplificações o Kit utilizado foi o
SYBRgreen reaction mix (with ROX, ABgene). O cDNA foi formado a partir de amostras de
três experimentos independentes (triplicatas biológicas). Para confirmar a formação de
produtos específicos, a PCR quantitativa foi imediatamente seguida de análise da curva de
fusão dos produtos (melting curve), de acordo com as recomendações do fabricante do
equipamento (BioRad, Opticon). Foram utilizados o gene de actina e Fator de Elongação 1
ALFA como controles endógenos, para normalizar a quantidade de RNA total em cada
amostra, devido a sua expressão constitutiva (ou seja, invariável independente da situação e
período de coleta). Cada amostra para os 12 primers foi tecnicamente triplicada. A razão de
expressão de cada gene em cada amostra foi calculada usando o método de referência da
quantificação da concentração do DNA genômico de G. tenuitipitata. Este método baseou-se
na formação de uma série de curvas de diluições em triplicata com concentrações variando de
6 ng/µL a 0,0277 ng/µL, adaptado de Collén et al., 2006; Le Bail, et al., 2008.
3.6.4 Extração de DNA Genômico de G. tenuistipitata
DNA genômico de G. tenuistipitata foi extraído e purificado para as construções das
curvas de diluições utilizadas na técnica de RT-qPCR e nos testes de qualidade de RNA total
extraído.
Materiais e Métodos
57
Foi macerado 100 mg da alga em N2 líquido e o extrato transferido para um tubo
eppendorf. Então foi adicionado 800 mL de tampão de lise (Tris base 0,1 M, pH 8,0 + EDTA
0,05 M + NaCl 0,2 M + Kac 2,5 M), 100 mL de Tween 20 (10%), 8 mL de proteinase K (20
mg/mL) e 1 mL de RNAse (10 mg/mL). O tubo foi incubado por 1h a temperatura ambiente e
depois adicionado 350 mL de fenol e 350 mL de clorofórmio-isoamílico (24:1). Misturou-se
por inversão durante 3 minutos e centrifugou-se a 14000 rpm e -5 oC por 2 minutos. A fase
superior (aquosa) foi passada para outro tubo eppendorf e foi adicionado 1 volume de
clorofórmio-isoamílico (24:1). Misturou-se por inversão durante 3 minutos e centrifugou-se a
14000 rpm e 5 oC por 3 minutos. Retirou-se a fase superior (aquosa) e transferiu-se para um
novo tudo eppendorf onde adicionou-se 0,6 volumes de propanol, misturou-se por inversão. O
tubo foi centrifugado a 14000 rpm e 5oC por 15 minutos, o sobrenadante descartado. Lavou-se
com 500 mL de etanol 70% e centrifugou-se a 14000 rpm por 5minutos O sobrenadante foi
descartado e o tubo colocado no Speed Vac por 10 minutos. Adicionou-se 200 mL H2O milliQ
para ressuspender. As amostras foram submetidas em géis de agarose 1,2%.
Outros procedimentos e técnicas comumente utilizados na extração, manipulação e
modificação de ácidos nucléicos foram realizados segundo descrito em (Sambrook &
Maniatis et al., 1989) ou com protocolos específicos fornecidos com produtos, equipamentos
e kits utilizados.
3.7 Re-sequenciamento dos cDNAs
Foi realizado o re-sequenciamento aleatório de 96 amostras já amplificadas e
purificadas das 22 placas da biblioteca de cDNA, utilizada na construção do microarranjos de
G. tenuistipitata. Alíquotas na concentração de 200-500 ng/mL, determinadas por absorbância
em λ=260 nm, foram submetidas a reações de sequenciamento pelo método de terminadores
de cadeia (Sanger et.al., 1977), usando o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied
Materiais e Métodos
58
Biosystems) e as sequências foram determinadas no sequenciador ABI 3100 (Applied
Biosystems). As reações de sequenciamento foram realizadas em um ciclo de desnaturação a
94°C por 4 minutos, seguido de 35 ciclos de 94°C por 1 minutos, 60°C por 2 minutos e 72°C
por 7 minutos. Como a clonagem do cDNA no vetor pBK-CMV é unidirecional, o
sequenciamento dos cDNAs foi realizado a partir da extremidade 5’, utilizando-se o
oligonucleotídeo T3. Depois de obtidos os cronogramas das sequências, estes foram
analisados pelo programa Chromas e salvos em formato FASTA, para fazer um BlastN das 96
amostras sequenciadas com o site de informações de G. tenuistipitata que esta sendo
construído pelo grupo: http://gracilaria.ib.usp.br/mirror/gracilaria/ e com o site do NCBI,
USA (National Center for Biotechnology Information).
59
4. Resultados
4.1 Absorção de Cu e Cd
Comprovou-se quantitativamente a capacidade de absorção dos metais pesados Cu e
Cd pela G. tenuistipitata quando exposta ao meio de cultura contaminado por tais elementos.
Para tanto, foi utilizado uma técnica experimental conhecida por ICP-AES (Espectrometria de
Emissão Atômica com Plasma Acoplado Indutivamente).
Aqui, a análise principal é descobrir se realmente a alga absorve e o quanto ela
absorve dos metais, fato importante para o estudo do estresse ambiental.
4.1.1 Análises dos Resultados de ICP-AES
A partir das análises dos resultados de ICP-AES, foram encontradas as médias dos
valores com desvios-padrão (valores obtidos da triplicata) para as concentrações dos metais
absorvidos pela alga tratada com cobre, da alga tratada com cádmio e da alga controle, dos
ensaios biológicos descrito na Seção 3.2.1. Os valores estão representados na Tabela 5. Para a
alga exposta ao cobre, concentrações de cádmio também foram medidas servindo como mais
um controle para o experimento. O mesmo foi feito para a alga exposta ao cádmio,
concentrações de cobre foram medidas e para a alga controle mediu-se as concentrações dos
dois metais.
Resultados
60
Tabela 5: Análises das concentrações dos metais Cu e Cd em amostras de algas tratadas e controle.
Metais analisados ICP-AES
Tratamento com Cu [ppm]
Tratamento com Cd [ppm]
Controle sem tratamento [ppm]
Cádmio < 0,01 0,72 ± 0,09 < 0,01 Cobre 1,43 ± 0,03 0,22 ± 0,01 0,130 ± 0,006
Os dados presentes na Tabela 5, calculados com base nas curvas de calibração da
Figura 9, foram extraídos da análise gráfica dos picos de emissão atômica gerados pelo ICP-
AES, conforme exposto a seguir.
A Figura 11 representa o espectro de emissão atômica (unidade de contagem [cps]
versus comprimento de onda λ [nm]) para o cobre. A seta vermelha e verde representam,
respectivamente, o padrão de 1 ppm e a alga exposta ao cobre. Observa-se concentrações
basais de cobre na alga exposta ao cádmio (seta azul) e na alga controle (seta lilás). Esse
espectro representa o resultado da análise de 1 g de alga da triplicata diluída em 25 ml de
solução.
No espectro de emissão atômica para cádmio (Figura 12), não foram encontradas
outras linhas representativas se não a do padrão de 1 ppm e da alga exposta ao cádmio, setas
vermelha e preta respectivamente. O espectro da Figura 12 também representa o resultado da
análise de 1 g de alga da triplicata diluída em 25 ml de solução. As medidas das
concentrações do meio de cultivo, que serviram de controle como mencionado anteriormente,
estão representadas na Tabela 6.
Para melhor visualização e interpretação dos resultados um resumo da análise dos
espectros das Figuras 11 e 12, e dos valores contidos nas Tabelas 5 e 6 está apresentado na
Tabela 7. Pode-se observar, com um cálculo estimado simples, que a quantidade inicial de
metal inserido na solução do meio de cultivo dividiu-se, uma parte sendo absorvida pela alga
e o restante permanecendo diluído no meio.
Resultados
61
Figura 11: Espectro da emissão atômica para o cálculo da concentração de cobre. Seta vermelha
representa concentração padrão de 1 ppm. Seta verde representa concentração de cobre da alga exposta
ao cobre. Seta azul representa concentração basal de cobre da alga exposta ao cádmio. Seta lilás
representa concentração de cobre da alga sem exposição.
Figura 12: Espectro da emissão atômica para o cálculo da concentração de cádmio. Seta vermelha
representa concentração padrão de 1 ppm. Seta preta representa concentração de cádmio da alga
exposta ao cádmio.
Resultados
62
Tabela 6: Medidas de concentração de cobre e cádmio dos meios de cultivo controle.
Cu
(média dos valores ppm) Cd
(média dos valores ppm)
Meio de cultivo inicial + Cu+2 sem alga 0,94 < 0,01
Meio de cultivo + Cu+2 após tratamento (após exposição da alga ao metal)
0,77 < 0,01
Meio de cultivo inicial + Cd+2 sem alga < 0,01 0,986
Meio de cultivo + Cd+2 após tratamento (após exposição da alga ao metal)
< 0,01 0,884
Para o cobre, de acordo com os dados da Tabela 7, a massa inicial de metal era de 1,88
mg. A massa final encontrada foi de 1,54 mg, de sorte que a diferença entre essas massas
1,88–1,54=0,34 mg deve ter sido absorvido pela alga. De fato, em 1 g de alga usado na
análise ICP-AES, encontrou-se uma quantidade de 0,0358(7) mg de cobre absorvido e um
valor de 0,0033(1) mg de cobre basal. Supondo que a absorção tenha sido uniforme para toda
alga inicialmente cultivada1, como a amostra inicial apresentava aproximadamente 10 g de
alga, podemos calcular a massa de cobre absorvido como 10×(0,0358(7)-0,0033(1))=0,325(8)
mg, em boa concordância (dentro da incerteza) com o valor de 0,34 mg calculado a partir das
diferenças nos valores das concentrações final e inicial do meio. O percentual de cobre
absorvido pela alga é, então, 0,325/1,88=17,3%.
1Tal suposição pode ser validada pelo fato do desvio-padrão obtido para a massa de metal absorvido na triplicata ser pequeno (σ = 0,0007 mg). Isso indica que porções independentes de massas iguais da mesma alga absorveram aproximadamente a mesma quantidade de metal. Salientamos que a alga foi periodicamente mexida em seu meio de cultivo, durante todo o período de exposição, garantindo uma absorção uniforme do metal.
Resultados
63
A mesma análise de balanço entre massa absorvida pela alga e massa remanescente no
meio de cultivo após o tratamento, pode ser feita para o cádmio com base nos dados da Tabela
7. Com efeito, inicialmente temos 1,972 mg de cádmio no meio e, ao final da exposição, uma
massa de 1,768 mg. Assim, 1,972-1,768=0,204 mg deve ter sido a massa de cádmio absorvida
pela alga. De fato, em 1 g de alga analisada, encontramos 0,018(2) mg de metal, sem uma
quantidade basal do mesmo significativa. Novamente supondo absorção uniforme do metal
nos 10 g de alga inicialmente exposta, temos 10×0,018(2)=0,18(2) mg de cádmio absorvido.
Esse resultado também está em concordância (dentro da incerteza) com o balanço
anteriormente calculado de 0,204 mg. O percentual de cádmio absorvido é, então, de
0,18/1,972=9,1%.
O gráfico da Figura 13 mostra o balanço entre as massas dos metais analisados nos
meios de cultivo antes e após a exposição da alga, e o valor das massas dos metais absorvidos
pela alga (valores calculados da análise dos resultados ICP-AES, contidos na Tabela 7). O
percentual de absorção dos metais também é exibido.
Figura 13: Balanço entre as massas dos metais analisados.
1.881.972
1.52
1.768
0.3250.18
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
Cobre Cádmio
Massa (
mg
)
Massa de metal no meio antes da exposição
Massa de metal no meio após exposição
Massa de metal absorvida (ICP-AES)
Absorção
de 9,1%
Absorção
de 17,3%
Resultados
64
Tabela 7: Resumo de resultados de absorção dos metais. Para cada amostra de alga, é apresentado o
valor médio com desvio-padrão do pico de emissão [em Kcps] dos metais analisados (essa média foi
obtida através de gráficos como os das Figuras 11 e 12, considerando-se a triplicata de amostras). A
partir desse valor, obtém-se a concentração média dos metais em 1 g de alga diluído em 25 ml de
solução [em ppm] (esses são os valores apresentados na Tabela 5) e, finalmente, a massa bruta média
do respectivo metal encontrada nas amostras. Os dados da Tabela 6 são reapresentados, mas agora
também com os valores das massas de cada metal [em mg], considerando-se 2 L de solução do meio
de cultivo, antes (inicial) e após (final) o tratamento da alga.
Amostras Medidas Cobre Cádmio
Pico [Kcps] 330 ± 6 -
Concentração [ppm] 1,43 ± 0,03 <0,01 Alga exposta
ao Cobre Massa [mg] 0,0358 ± 0,0007 -
Pico [Kcps] 50 ± 1 36 ± 4
Concentração [ppm] 0,22 ± 0,01 0,72 ± 0,09 Alga exposta ao Cádmio
Massa [mg] 0,0060 ± 0,0002 0,018 ± 0,002
Pico [Kcps] 30 ± 1 -
Concentração [ppm] 0,130 ± 0,006 <0,01 Alga sem exposição
Massa [mg] 0,0033 ± 0,0001 -
Concentração [ppm] 0,94 <0,01 Meio inicial + cobre Massa [mg] 1,88 -
Concentração [ppm] 0,77 <0,01 Meio final + cobre Massa [mg] 1,52 -
Concentração [ppm] <0,01 0,986 Meio inicial + cádmio Massa [mg] - 1,972
Concentração [ppm] <0,01 0,884 Meio final + cádmio Massa [mg] - 1,768
4.1.2 Composição Elementar de Três Espécies de Gracilaria
Apresenta-se na Tabela 8 uma varredura da concentração para alguns elementos
químicos, que foram detectados por ICP-AES. Esta varredura foi feita para as três espécies de
Gracilaria (G. birdiae, G. domingensis e G. tenuistipitata) (Figura 2). Neste experimento
foram feitas triplicatas para as três algas, obtendo-se no final a média e desvios padrão das
triplicatas, conforme tabela abaixo.
Resultados
65
Tabela 8: Concentração de elementos químicos medidos por ICP-AES para as três espécies de alga.
Elemento Químico Gracilaria birdiae
[ppm] Gracilaria domingensis
[ppm] Gracilaria tenuistipitata
[ppm]
Al 15 ± 5 27,2 ± 2,3 4,3 ± 1,3 Ca 284 ± 11 645 ± 14,5 327 ± 6 Fe 33 ± 12 36 ± 6 30,1 ± 1,0 Mg 305 ± 30 505 ± 18 626 ± 29 P 118 ± 10 186 ± 6 376 ± 17 Si 19 ± 6 26,7 ± 1,8 16,31 ± 0,18
Mn 7 ± 3 1,7 ± 0,4 3,7 ± 0,8 B 35 ± 8 24,62 ± 0,29 27,4 ± 1,9 K 177 ± 29 38,4 ± 1,5 168,8 ± 1,5 Na 17,6 ± 2,9 9,87 ± 0,25 39,7 ± 0,7 Cu 0,20 ± 0,6 0,31 ± 0,22 0,13 ± 0,03 Cd < 0,01 < 0,01 < 0,01
Observou-se para as três algas, níveis de concentrações diferentes para os elementos
analisados. Note-se que a concentração de alumínio para G. tenuistipitata é inferior à metade
das concentrações das outras duas espécies. A concentração de cálcio por exemplo, foi duas
vezes maior para G. domingensis que para as outras espécies. G. birdiae possui quase duas
vezes mais concentração de manganês quando comparado com G. tenuistipitata e G.
domingensis. O metal Cu foi encontrado provavelmente em concentrações basais para as três
algas e Cd não foi encontrado para nenhuma das espécies.
Embora, os elementos, Ba, Ni, Zn, Sr, Cr, Co, As e Cd tenham sido analisados, os
mesmos não foram detectados.
Resultados
66
4.2 Acumúlo de H2O2 em G. tenuistipitata
Através das análises de microscopia eletrônica, observou-se vários pontos eletrodensos,
indicando presença de H2O2 em células de amostras de algas tratadas com os metais. A
atividade de H2O2 foi detectada através da reação com cloreto de cério (CeCl3), produzindo
depósitos eletrodensos de peridróxidos de cério. A reação de H2O2 com CeCl3 produz
precipitados eletrodensos insolúvel de peridroxidos de cério, Ce[OH]2OOH e Ce[OH]3OOH.
Como descrito por Czaninski e colaboradores esta técnica ultra-estrutural permite a
localização precisa de sítios de acumulação ou produção de H2O2.
Para esta técnica amostras controles foram coletadas após 1 hora, 1 dia e 6 dias,
seguindo o mesmo tempo de coletas para as amostras tratadas. Nas amostras tratadas foram
utilizadas concentrações de CE50 para cobre (0,95 ppm) e cádmio (1,00 ppm).
4.2.1 Amostras Controles
Foram observados nas amostras controles pequenos pontos de acúmulos somente na
parede celular mais externa, película, ou seja, a parte que fica em contato com o ambiente
(Figura 14, seta vermelha). Através da análise dos resultados para o controle, não foi
observada qualquer diferença significativa entre as figuras de microscopia para os tempos de
cultivos utilizados. Sendo assim, a microscopia representada na Figura 14 é o resultado que
corresponde a um dos tempos de cultivo normal.
Resultados
67
Na Figura 14, as células foram facilmente identificadas no corte transversal ultrafino
do talo. Visualizou-se os aspectos gerais das disposições das células e de algumas estruturas
celulares. Foi identificada claramente a região correspondente à parede celular (PC),
cloroplastos (CP), grânulos de amido (G) e um ponto de junção entre as células (Pit Plug).
Também foi verificada uma região central da célula, ocupada pelo vacúolo, envolvido pelo
citoplasma.
Foram encontradas diferenças morfológicas em algumas das células do córtex para
algas tratadas com os dois metais. Padrões dos pontos de acúmulos também apresentaram
características diferentes. Os resultados são apresentados a seguir.
4.2.2 Amostras Expostas ao Cádmio
A Figura 15 representa microscopia eletrônica de células da alga exposta a 1 hora a
cádmio. Nesta figura observou-se entre a interface das células uma grande dispersão de
pontos de acúmulos de H2O2 (setas azuis). Verificou-se também a existência de pequenos
Figura 14: Amostras controle,
após 1 dia. Seta indica acumulação
de H2O2. (PC) parede celular, (Pit-
plug) ponto de junção entre
células, (CP) cloroplastos, (V)
vacúolo e (G) grânulo de amido.
Escala: barra = 1µm. PC
CP
G
Pit-plug
1 µm
V
Resultados
68
pontos de acúmulos na parede celular mais externa (película) como foi observado no controle
(seta vermelha).
Outra característica peculiar visualizada nesta figura foi a de uma aparência retrátil na
morfologia de algumas células do córtex em comparação com células do controle. Também
foi observado disposições irregulares dos cloroplastos quando comparado com o controle.
Esta peculiaridade poderia ter sido causada devido a uma rápida resposta a reação da célula ao
estresse causado pelo metal.
Na Figura 16, após tratamento de 1 dia, observou-se algumas das células com padrão
de acumulação diferente (setas azuis). Os pontos de acúmulos foram também encontrados na
interface celular, mas estes mais concentrados e não tão dispersos como na Figura 15. Outra
característica encontrada em algumas células corticais esta representada na Figura 17. Foram
visualizados pontos de acúmulos ao redor de estruturas amorfas não identificadas. Estas
estruturas poderiam originar-se da degradação de cloroplastos, uma vez que células corticais
possuem grandes quantidades destes.
Figura 15: Amostras de 1 hora
de exposição ao cádmio. Setas
indicam acumulação de H2O2.
(PC) parede celular, (CP)
cloroplastos e (G) grânulo de
amido. Escala: barra = 1µm.
1 µm
PC
CP
G
Resultados
69
Os resultados referentes aos 6 dias de exposição ao cádmio, foram os mesmo
encontrados na Figura 14 e 17. Visualizou-se após 6 dias de exposição, células normais e
também células com estruturas amorfas não identificadas, como descrito acima. Neste tempo
de exposição não foram observados pontos de acúmulos como os das Figuras 15 e 16.
4.2.3 Amostras Expostas ao Cobre
A Figura 18 representa microscopia eletrônica de células após 1 hora de exposição ao
cobre. Observa-se pontos de acúmulos na interface das células (setas azuis) e pequenos pontos
de acúmulos na parede celular mais externa como foi observado no controle (seta vermelha).
Além disso, como mencionado anteriormente (Figura 15), encontrou-se a mesma aparência
retrátil na morfologia de algumas células do córtex.
Figura 16: Amostras de 1 dia de
exposição a cádmio. Setas indicam
acúmulos de H2O2. (PC) parede
celular, (CP) cloroplastos e (G)
grânulo de amido.
Escala: barra = 0,5 µm.
Figura 17: Amostras de 1 dia de
exposição a cádmio. Setas azuis
acúmulos de H2O2.
Escala: barra = 0,2 µm.
0,2 µm
CP
G
0,5 µm
PC
Resultados
70
A Figura 19 corresponde a 1 dia de exposição da alga ao cobre. Notou-se algumas
características similares as das outras figuras já apresentadas. Entretanto, observa-se uma
diferença no padrão de acumulação de H2O2 localizados na periferia de cloroplastos (setas
verdes). Também na Figura 20 foram visualizados pontos de acúmulos ao redor de estruturas
amorfas não identificadas, provável degradação de cloroplastos, como as estruturas
encontradas para cádmio representada na Figura 17.
Os resultados analisados nas microscopias após 6 dias de exposição ao cobre foram
similares ao padrão para cádmio, ou seja, células normais e células com estruturas amorfas
não identificadas.
Figura 18: Amostras expostas 1
hora ao cobre. Setas azuis indicam
acumulação de H2O2. (PC) parede
celular e CP cloroplastos.
Escala: barra = 1µm.
1 µm
CP
PC
Resultados
71
4.3 Padronização da Extração de RNA Total
Inicialmente optou-se pela extração do RNA total utilizando TRIZOL por ser uma
metodologia simples e rápida que permite processar simultaneamente um grande número de
amostras. O TRIZOL é um reagente para isolamento do RNA total das células e tecidos,
consistindo numa solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina e é uma
otimização do método de uma etapa de isolamento do RNA desenvolvido por Chomczynski &
Sacchi (1987). Durante a homogeneização ou a lise das amostras, o TRIZOL mantém a
integridade do RNA ao romper as células. A adição do clorofórmio seguida pela
centrifugação, separou a solução em uma fase aquosa e em uma fase orgânica. O RNA
permaneceu exclusivamente na fase aquosa, devido o caráter polar que lhe é conferido
principalmente pelos grupamentos fosfato. O RNA foi recuperado pela precipitação com
álcool isopropílico. De acordo com Chomczynski e Sacchi (1987), o RNA total isolado está
livre de proteínas e da contaminação por DNA, o que não foi observado nas amostras de G.
tenuistipitata mesmo quando manteve-se o máximo de cuidado. Deste modo, foi observada
constante contaminação com uma porcentagem pequena de DNA e proteínas mas uma
porcentagem razoável de polissacarídeos. É provável que durante a homogeneização, quando
Figura 19: Amostras expostas a 1 hora ao
cobre. Setas indicam acumulação de H2O2.
(CP) cloroplastos e (G) grânulos de amido.
Escala: barra = 1µm.
Figura 20: Amostras expostas a 1 hora ao
cobre. Setas indicam acumulação de H2O2.
Escala: barra = 1µm.
0,2 µm 1 µm CP
G
Resultados
72
é adicionado o TRIZOL para a dissociação completa de complexos nucleoprotéicos e após a
centrifugação, que o precipitado constituído principalmente de membranas extracelulares,
polissacarídeos e DNA com alto peso molecular, não se separa completamente da solução que
possui, proteínas, DNA e RNA total de baixo peso molecular. Quando adiciona-se
clorofórmio, a fase aquosa onde se encontra o RNA total permaneceu contaminada devido à
grande quantidade de polissacarídeos. Percebeu-se, após adição de álcool isopropílico na fase
aquosa, a formação de um pequeno “pellet gelatinoso” no fundo do tubo junto ao precipitado
de RNA. Foi assim, necessário lavar o pellet formado pelo RNA e o precipitado gelatinoso
com EtOH 75%. Após a centrifugação o pellet foi suspenso em água tratada com DEPC, um
inibidor de RNase. Nesta última fase, o pellet não se dissolveu rapidamente, provavelmente
devido contaminação com polissacarídeos. Após análise em gel de agarose e quantificação no
NanoDrop (ND-1000), percebeu-se que este método não foi eficiente.
Foram então utilizados protocolos diferentes aplicados a plantas suculentas, ricas em
polissacarídeos, na intenção de eliminá-los (Gehrig et al., 2000). As variações estavam em
adicionar ou não na primeira etapa da extração, hidrocloreto de guanidina – GHCL (GHCL 8
M, TrisHCl 50 mM, EDTA 20 mM e β-mercaptoetanol 50 mM) e após testar 7 compostos
diferentes para extrair polissacarídeos. Os compostos para precipitar polissacarídeos foram:
EtOH na concentração de 30%; EtOH 20% + KOAc 0,5 M; KOAc 0,2 M; polietileno glicol
(PEG) peso molecular 6000 2%; PEG 20000 2%; PEG 35000 2% e polivinilpirrolidone
360000 2%. Após as análises de todos os parâmetros em conjunto (contaminação por
proteínas, por polissacarídeos e maior concentração de RNA total), o tratamento com KOAc
0,2 M foi o mais eficiente para extração dos polissacarídeos pois apresentou menores desvios
entre as réplicas (Falcão, et al., 2008).
Resultados
73
Quando foram utilizadas amostras de RNA total extraídas por este ultimo método na
marcação e hibridização dos microarranjos, o sinal de fluorescência dos pontos apresentou-se
baixo, provavelmente porque a qualidade do RNA estava comprometida.
No objetivo de melhorar a síntese de cDNA, para posterior marcação e hibridização
dos microarranjos, foi necessário utilizar diferentes testes para extração de RNA total de G.
tenuistipitata. No total foram testados mais três protocolos de RNA total: RNeasy Plant Mini
Kit (QIAGEN), gradiente de densidade de Cloreto de Cério e Concert Plant RNA Reagent
(Invitrogen).
As amostras dos três métodos foram comparadas no Bioanalyzer segundo fabricante
Agilent. As analises dos resultados para as amostras de RNA extraídas com Concert Plant da
Invitrogen apresentaram-se integras sem degradação e com ótimo rendimento em torno de 4
µg/µL em grande escala (Figura 21).
Devido ao restante de polissacarídeos contaminantes, as amostras de RNA total foram
purificadas utilizando mini-colunas da QUIAGEN (RNeasy Mini Spin Column).
Figura 21: Qualidade do RNA total das amostras Cu (2), Cd (4) e controle (6), analisadas no
Bioanalyzer. O poço L, corresponde ao marcador de tamanho em Kb (6, 4, 2, 1, 0,5, 0,2, e 0,025).
4.4 Resequenciamento das Amostras da Biblioteca
Amostras aleatórias das 22 placas da biblioteca de cDNA utilizadas para construção
dos microarranjos de G. tenuistipitata, foram separadas para resequenciamento e reanotação,
no intuito de comprovarmos que não houve erros de direcionamento durante as amplificações
e purificações das placas da biblioteca. No total 96 amostras foram resequenciadas e
28S 18S
Resultados
74
manualmente reanotadas por busca de similaridade de sequência no banco público de
proteínas NCBI, USA. Foi utilizado para análises o algoritmo BLASTX (Altschul et al.,
1997). As sequências também foram comparadas com o próprio site de banco de dados que
está sendo construído para G. tenuistipitata: http://gracilaria.ib.usp.br/mirror/gracilaria/.
Todas as amostras resequenciadas concordavam com 100% de identidade com as anotações
do site da biblioteca e com o mapeamento das placas da biblioteca.
4.5 Análise dos Microarranjos
4.5.1 Dados de Amplificação e Purificação
Todas as placas da biblioteca foram amplificadas, purificadas e submetidas à geis de
agarose 1,5%. A partir do gel de purificação foi calculada aproximadamente, a concentração
da amostra de cada poço da placa, através de sua intensidade no gel, utilizando o marcador 1
Kb Plus Ladder (Invitrogen), o tamanho de cada fragmento (banda) e se havia mais do que um
amplicon em um mesmo poço (contaminação por mais de um clone). Os resultados foram
transferidos para um banco de dados de informações, sobre a qualidade, concentração, nome
da placa, nome do gene, função do gene e números de fragmentos por poço. Esses dados
foram cruciais para as análises dos genes diferencialmente expressos, ou seja, não foi
afirmado que um gene era diferencialmente expresso, antes de eliminar os clones de ESTs que
apresentavam mais de um amplicon nas amplificações. Essa técnica foi realizada, pois
poderiam ocorrer possíveis reações cruzadas durante as hibridações com os microarranjos,
podendo gerar falsos positivos.
4.5.2 Categorias Funcionais dos Genes do Microarranjo
Ao analisar o estresse ambiental de cobre e cádmio sobre a expressão gênica e o
desenvolvimento de G. tenuistipitata, estudou-se condições nas quais concentrações de EC50
Resultados
75
desses metais foram dissolvidos em meio de cultivo durante 6 dias. Os efeitos dessas
condições sobre a expressão gênica foram examinados através de hibridizações de cDNAs
em microarranjos com aproximadamente 2000 sondas representado cDNAs sequenciados a
partir de uma biblioteca de G. tenuistipitata.
Os resultados mostraram que 700 sondas são classificadas, correspondendo a
sequências de fragmentos de genes homólogos à proteínas de função determinadas em outros
organismos. Outras 560 são proteínas hipotéticas e 144 hipotéticas conservadas que
correspondem a sequências de fragmentos de genes homólogos à proteínas de função
desconhecidas. Um resumo destes dados é representado na Tabela 9 e Figura 22.
Tabela 9: Classificação das proteínas da biblioteca de G. tenuistipitata.
Classificadas 700 Hipotéticas 560
Hipotéticas Conservadas 144 Sem classificação ou classificação incerta
44
A Figura 22 mostra também a divisão em categorias funcionais celulares para aqueles
genes que foram classificados na biblioteca, ou seja, fragmentos de sequências homólogas à
proteínas de função determinadas em outros organismos.
Resultados
76
Figura 22: Distribuição em categorias funcionais dos genes selecionados, segundo dados das Tabelas
9 e 10. No gráfico de cima, tem-se a distribuição geral de todos os genes entre classificados,
hipotéticos, hipotéticos conservados, sem classificação ou com classificação incerta e outros. No
gráfico de baixo, especificamos os grupos dos genes classificados.
Tabela 10: Número de genes classificados representados no microarranjo, divididos em categorias
funcionais específicas.
Metabolismo 182 Energia 70
Divisão celular 41 Transcrição 53
Sintese de proteínas 68 Proteolise 65
Transporte 87 Defesa 52
Homeostase iônica 3 Organização celular 19
Outros 60
Categorias Funcionais dos Genes Classificados
26.0%
10.0%
5.9%
7.6%9.7%
9.3%
12.4%
7.4%
0.4%
8.6%2.7% Metabolismo
Energia
Divisão celular
Transcrição
Sintese de proteínas
Proteolise
Transporte
Defesa
Homeostase iônica
Organização celular
Outros
Categorias Funcionais Geral dos Genes Selecionados
38.7%
9.9%3.0%
48.3%
ClassificadasHipotéticasHipotéticas ConservadasSem classificação ou incerta
Resultados
77
RNA total das amostras de alga controle e expostas aos metais foram extraídas com o
reagente Concert Plant (Invitrogen), analisado no aparelho Bioanalyzer (Agilent), e utilizado
na síntese e marcação de cDNAs com fluoróforos Alexa Flúor 555 e 647 por meio do kit
SuperScript Plus cDNA Indirect Labeling System (Invitrogen).
Após as etapas de hibridizações e leitura das fluorescências das lâminas hibridizadas
(Seção 3.5.2), foram realizadas as análises dos dados de intensidade de fluorescência,
descontada o background e possíveis artefatos, para cada uma das sondas, por meio do
programa ArrayVision 6.0 (Imaging Research, Inc). A normalização das intensidades de
fluorescência foram feitas pelo método de LOWESS. Os resultados das sondas representado
genes diferencialmente expressos foi realizada por meio do método HTSelf (Vencio & Koide,
2005). Para as análises dos microarranjos, foi construído um programa baseado nos métodos
citados acima. A descrição detalhada da construção do programa e do processo de análise de
dados de microarranjos é apresentada no Anexo A.
4.5.3 Genes Diferencialmente Expressos
Foram considerados genes diferencialmente expressos aqueles em que 66% ou mais
das réplicas das sondas tinham valores de razão de expressão M fora dos limites de corte
definidos no espaço M×A, por 95% dos valores de M provenientes das hibridizações
homotípicas das condições de referência (lembrando, M = log2(IT/IC), sendo IT (tratado) a
densidade de fluorescência normalizada para a condição de estudo e IC para a condição de
referência, e A = 1/2 log2 (IT IC)).
Uma vez que não há quase nenhuma literatura, com exceção de Collén e colaboradores
(2003), a respeito do efeito de cádmio e cobre sobre G. tenuistipitata, apresenta-se aqui a
análise de alguns dos genes que tiveram sua expressão diferenciada devido aos efeitos desses
metais no meio de cultivo.
Resultados
78
Seguindo o procedimento da Seção3.5.2, o cDNA correspondente às amostras de alga
controle, foram utilizados como condição de referencia para comparação com as amostras
tratadas com os metais. Este método foi realizado para duas réplicas biológicas, no qual foram
feitas duas hibridizações (réplicas técnicas), invertendo os fluoróforos entre a amostra
referência e teste (dye swap).
Após os procedimentos de hibridização das lâminas de microarranjos, extração dos
dados de intensidade de fluorescência, normalização por LOWESS e identificação dos genes
diferencialmente expressos pelo método HTSelf, foram obtidos os resultados resumidos na
Tabela 11.
Tabela 11: Resumo geral dos experimentos de microarrajos. Apresenta-se o número total de genes
únicos estudados e o número de genes reprimidos, induzidos e invariantes, após tratamento para
cádmio e cobre.
Spots na lâmina
Genes únicos
Reprimidos Induzidos Invariantes
Cádmio 8448 1448 54 69 1325 Cobre 8448 1448 108 76 1264
A tabela representa o total do número de genes nos microarranjos que foram
considerados para a análise estatística (8448); o número de genes diferentes únicos (1448); os
genes alterados (reprimidos e induzidos) e genes cujas razões de expressão ficaram
compreendidas entre os limites de corte do teste HTSelf (invariantes, 1325 e 1264).
Baseada na anotação dos clones de G. tenuistipitata, foi realizado uma classificação
por função celular de todos os genes cuja expressão gênica foi induzida ou reprimida, em
resposta ao estresse gerado pelos metais cobre e cádmio. Estes dados estão apresentados em
formas de tabelas no Anexo B.
Também no gráfico da Figura 23 é apresentado o número de genes induzidos e
reprimidos versus a categoria funcional celular para os dois metais (cádmio e cobre). A partir
destes resultados, notou-se que os genes classificados para as diversas categorias funcionais,
Resultados
79
tanto para cádmio quanto para cobre, sofreram poucas alterações, ou seja a maioria dos genes
não tiveram sua expressão alterada. Para as proteínas classificadas como hipotéticas, houve
uma diferença maior no número de genes diferencialmente expressos para cobre (76
hipotéticas) e cádmio (51 hipotéticas), em relação as outras categorias. Totalizou-se 12,7 % de
genes com expressão gênica alterada (induzidos e reprimidos) para o tratamento com cobre e
8,4 % para cádmio.
Resultados
80
Fig
ura
23
: N
úmer
o de
gen
es in
duzi
dos
e re
prim
idos
por
cat
egor
ia f
unci
onal
(cá
dmio
e c
obre
).
19
21
1
5
2
5
01
0
24
7
11
42
00
32
23
00
27
42
5
9
5
2
5
21
21
00
33
10
42
88
2
7
43
87
01
43
9
35
05
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Metabolismo
Energia
Divisão celular
Transcrição
Sintese de
proteínas
Proteólise
Transporte
Defesa
Homeostase
iônica
Organização
celular
Hipotéticas
Hipotéticas
Conservadas
S/ classificação
ou incerta
Outros
Número de Genes
Induzid
o C
dR
eprim
ido C
dIn
duzid
o C
uR
eprim
ido C
u
Resultados
81
4.5.4 Distribuição dos Genes Induzidos e Reprimidos
4.5.4.1 Cádmio
A análise dos genes das amostras de alga que sofreram estresse pelo metal cádmio
permite uma representação como a da Figura 24. Esta figura mostra a distribuição dos genes
classificados como diferencialmente expressos nas categorias funcionais celulares. Para uma
visualização mais detalhada, também são apresentadas as tabelas com os nomes dos genes
induzidos e reprimidos de acordo com cada função celular considerada (Tabela 12, Anexo B).
Figura 24: Genes induzidos e reprimidos para cádmio divididos em categorias funcionais.
Notou-se que a maior parte dos genes induzidos para cádmio participa de três grandes
grupos: categoria de proteínas funcional do metabolismo, grupo de hipotéticas e hipotéticas
conservadas. O grupo das hipotéticas (34,8 % induzidas e 50,0 % reprimidos) e hipotéticas
conservadas (10,1 % induzidas e 7,4 % reprimidas) apresentaram um grande número de genes
Distribuição dos Genes Induzidos Cd
27.5%
2.9%
1.4%
1.4%
7.2%
2.9%7.2%
34.8%
10.1%1.4%
0.0%1.4%
0.0%
1.4%
Distribuição dos Genes Reprimidos Cd
50.0%
7.4%
3.7%
3.7%
9.3%
0.0%
0.0%
7.4%
5.6%
3.7%
3.7%
5.6%
0.0%
0.0%
Metabolismo Energia Divisão celular
Transcrição Sintese de proteínas Proteólise
Transporte Defesa Homeostase iônica
Organização celular Hipotéticas Hipotéticas Conservadas
S/ classificação ou incerta Outros
Resultados
82
alterados. Este fato pode indicar a existência de algum(ns) mecanismo(s) desconhecido(s)
envolvido(s) na resposta contra cádmio.
Para cádmio, a maior parte dos genes que participam da categoria funcional do
metabolismo foram mais induzidos (27,5 %) do que reprimidos (7,4 %). Dentre esses genes,
destacam-se alguns importantes para a manutenção e homeostase celular (Tabela 12, Anexo
B).
Outros genes que foram induzidos considerados importantes para o desenvolvimento e
crescimento da alga estão em outras categorias. Dentre eles, citamos dois genes na categoria
de energia celular (surfeit protein 1 e NADH dehydrogenase), outro gene de divisão celular
(CCG1 protein), cinco genes de sínteses protéicas, cinco de transporte e um de homeostase
iônica (para essas três últimas categorias, veja listagem completa na Tabela 12, Anexo B).
De uma forma geral, foi observada uma diferença de 15 genes induzidos (69) a mais
em relação aos reprimidos (54).
Apresenta-se na Figura 25 o percentual de genes induzidos e reprimidos dentro de
cada categoria funcional. Tal percentual representa um tipo de normalização, expressando a
quantia de genes diferencialmente expressos com relação ao total de genes analisados em cada
categoria funcional específica. Com isso, pode-se ter uma idéia de qual grupo apresentou
maior ou menor percentual de genes alterados. Observa-se que o grupo correspondente à
homeostase iônica foi excluído da análise, pois só apresenta 0,4 % do total de genes
considerados (todas as categorias).
Resultados
83
Figura 25: Percentual de genes reprimidos e induzidos por cádmio dentro de cada categoria funcional.
4.5.4.2 Cobre
Para a obtenção de um panorama geral da resposta transcricional de G. tenuistipitata à
presença de cobre, deve-se analisar a distribuição de genes diferencialmente expressos em
cada categoria funcional celular. Tal distribuição é representada na Figura 26, após as análises
dos dados obtidos dos microarranjos. A lista completa de genes induzidos e reprimidos por
cobre é apresentada na Tabela 13, Anexo B.
Notou-se que, semelhante ao que ocorre com cádmio, a maior parte dos genes
induzidos para cobre participa de três grandes grupos: categoria de proteínas funcional do
metabolismo, grupo de hipotéticas e hipotéticas conservadas. O grupo das hipotéticas (43,4 %
induzidas e 39,8 % reprimidos) e hipotéticas conservadas (13,2 % induzidas e 8,3 %
reprimidas) apresentaram um grande número de genes alterados. Este fato, assim como no
caso do cádmio, pode indicar a existência de algum(ns) mecanismo(s) desconhecido(s)
envolvido(s) na resposta contra cobre.
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
Meta
bolis
mo
Energ
ia
Div
isão
celu
lar
Tra
nscrição
Sin
tese d
e
pro
teín
as
Pro
teólis
e
Tra
nsport
e
Defe
sa
Org
aniz
ação
celu
lar
Outr
os
Hip
oté
cic
as
Hip
oté
ticas
Conserv
adas
Sem
Cla
ssifi
cação
Gen
es (
%)
Reprimidos Induzidos
Resultados
84
Para cobre, a maior parte dos genes que participam da categoria funcional do
metabolismo foram mais induzidos (11,8 %) do que reprimidos (7,4 %). Dentre esses genes,
destacam-se alguns importantes para a manutenção e homeostase celular (Tabela 13, Anexo
B).
Outros genes considerados importantes para o desenvolvimento e crescimento da alga
que foram induzidos estão em outras categorias. Dentre elas citamos energia celular, divisão
celular, síntese protéicas e transporte.
De uma forma geral, foi observada uma diferença de 32 genes reprimidos (108) a mais
em relação aos induzidos (76). Aqui, nota-se uma divergência em comparação ao cádmio, já
que lá se encontrou mais genes induzidos do que reprimidos.
A Figura 27 apresenta o percentual de genes induzidos e reprimidos dentro de cada
categoria funcional. Como no caso do cádmio, tal percentual representa um tipo de
normalização, expressando a quantia de genes diferencialmente expressos com relação ao
total de genes analisados em cada categoria funcional específica. Com isso, pode-se ter uma
idéia de qual grupo apresentou maior ou menor percentual de genes alterados. Novamente, o
grupo correspondente à homeostase iônica foi excluído da análise, pois só apresenta 0,4 % do
total de genes considerados (todas as categorias).
Resultados
85
Figura 26: Genes induzidos e reprimidos para cobre divididos em categorias funcionais.
Figura 27: Percentual de genes reprimidos e induzidos por cobre dentro de cada categoria funcional.
Distribuição dos Genes Induzidos Cu
11.8%
6.6%
2.6%
6.6%
2.6%
1.3%
43.4%
2.6%
2.6%
5.3%
13.2%
1.3%0.0%0.0%
Distribuição dos Genes Reprimidos Cu
7.4%
7.4%
1.9%
6.5%
3.7%
2.8%
7.4%
39.8%
0.9%0.0%
6.5%
8.3%
2.8%4.6%
Metabolismo Energia Divisão celular
Transcrição Sintese de proteínas Proteólise
Transporte Defesa Homeostase iônica
Organização celular Hipotéticas Hipotéticas Conservadas
S/ classificação ou incerta Outros
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
Meta
bolis
mo
Energ
ia
Div
isão
celu
lar
Tra
nscrição
Sin
tese d
e
pro
teín
as
Pro
teólis
e
Tra
nsport
e
Defe
sa
Org
aniz
ação
celu
lar
Outr
os
Hip
oté
cic
as
Hip
oté
ticas
Conserv
adas
Sem
Cla
ssifi
cação
Gen
es (
%)
Reprimidos Induzidos
Resultados
86
4.6 Validação dos Dados dos Microarranjos
Para a validação dos dados de microarranjos foi utilizada a técnica de PCR
quantitativa (RT-qPCR). Foram selecionados 12 genes para a fabricação de primers
específicos, oriundos da biblioteca de G. tenuistipitata. Utilizou-se três réplicas biológicas
independentes para cada uma das condições analisadas de estresse (cobre e cádmio) e para a
condição de controle.
4.6.1 Qualidade do RNA
Amostras de RNA total das triplicatas biológicas foram submetidas a tratamentos com
DNases para eliminar contaminantes de DNA e não resultar falsos positivos nas reações de
RT-qPCR. Os resultados foram analisados a partir da utilização de PCRs convencionais, para
a amplificação de DNA, como descrito na Seção 3.6.2. Não foram encontradas bandas de
DNA para este teste, assegurando descontaminação com DNA.
Outros dois testes realizados na qualidade do RNA foram: i) RT seguida de PCR, para
formação de amplicons de cDNA. Nesta última técnica foram utilizados todos os 12 primers
para verificar se o produto da amplificação seria um único fragmento de cDNA (Figura 28A).
ii) no segundo foi feito a somente a PCR, utilizando DNA genômico novamente com os 12
primers. Foi possível descobrir se os primers poderiam homologar-se com outras sequências
do genoma e se haveria possíveis intros entre cada gene (Figura 28B). Todos os
procedimentos experimentais estão descrito na Seção 3.6.2.
Resultados
87
Figura 28: Teste da qualidade dos 12 primers e do RNA, utilizados na validação dos resultados de
microarranjos através da técnica de PCR em tempo real. (A) RT-PCR utilizando amostras de RNA. (B)
PCR convencional utilizando DNA genômico. As setas correspondem aos marcadores de tamanho de
100 e 200 pb.
4.6.2 Comparação de Resultados: PCR em Tempo Real e Microarranjos
Foi feita uma comparação entre as razões de expressão dos genes obtidas por PCR em
tempo real e os experimentos de microarranjos de DNA. Essa comparação serve para
validação de todos os resultados obtidos com os microarranjos.
Os gráficos da Figura 29 apresentam as razões de expressão gênica M =
log2(Tratado/Controle) obtidas dos experimentos de microarranjos (barras em azul claro) e
dos experimentos de PCR em tempo real (barras cinzas), para o tratamento da alga com o
cobre. O gráfico (A) apresenta os valores de M utilizando o gene EF como referência na
técnica de PCR em tempo real. Já o gráfico (B) utiliza o gene Actin como referência. São
apresentadas também as incertezas das medidas (barras de erro) em ambos os gráficos. No
caso dos experimentos de microarranjos, essas incertezas são calculadas como o desvio-
padrão dos valores de M das sondas correspondentes ao gene considerado, desde que a
intensidade A da sonda seja maior do que 2,0. Esse critério é importante para selecionar
apenas sondas experimentalmente significativas. Já no caso dos resultados de PCR em tempo
real, as incertezas são calculadas como o desvio-padrão dos valores de M obtidos na triplicata
dos experimentos. Qualitativamente, observa-se uma boa concordância entre os valores
obtidos, indicando uma boa correlação entre os dados.
A B
200
100
Resultados
88
Os gráficos da Figura 30 são análogos aos da Figura 29, mas consideram os resultados
obtidos para o tratamento com o cádmio. Mais uma vez, qualitativamente, observa-se boa
concordância entre os valores exibidos.
Com o intuito de se dar uma noção quantitativa para a concordância dos resultados
apresentados nas Figuras 29 e 30, pode-se calcular uma grandeza estatística conhecida pelo
nome de “Coeficiente de Correlação de Pearson”. Tal coeficiente, batizado usualmente pela
letra r, permite medir o grau de correlação entre dois conjuntos de dados. No caso, os
conjuntos são aqueles formados pelos valores de M obtidos com a técnica de PCR em tempo
real e os correspondentes valores obtidos com a técnica de microarranjos.
Os gráficos da Figura 31 apresentam a correlação entre os resultados de PCR em
tempo real e de microarranjos. Os valores de M e as incertezas são as mesmas apresentadas
nas Figuras 29 e 30. Para cada gene considerado, plotou-se um ponto com valor no eixo x
igual ao M obtido por RT-qPCR e valor no eixo y igual ao M obtido por microarranjos. Os
coeficientes de Pearson r são exibidos em cada gráfico. O significado desses gráficos será
melhor discutido na Seção 5.3.3.
Resultados
89
Figura 29: Valores da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) obtidos dos
experimentos de RT-qPCR e microarranjos para os 10 genes considerados. O tratamento refere-se à
exposição da alga ao cobre. São mostrados os resultados para dois genes de referência utilizados na
técnica de PCR em tempo real: EF (Elongation Factor 1 Alpha) e Actin. As linhas tracejadas
vermelhas representam os limiares críticos M = +1 e M = -1, usualmente utilizados para se classificar
genes como diferencialmente expressos. Os genes (h) e (i) foram circulados pois foram classificados
como diferencialmente expressos pelo método HTSelf.
Figura 30: Resultados análogos aos da Figura 29, mas considerando agora o tratamento da alga
exposta ao cádmio. Os genes (d), (e), (f) e (j) foram circulados pois foram classificados como
diferencialmente expressos pelo método HTSelf.
(a) photosystem II oxygen (b) vanadium-dependent bromoperoxidase (c) zeaxanthin glucosyl transferase (d) hypothetical (e) high-affinity nitrate transporter (f) heat shock protein 90 (g) glutamate-cysteine ligase (h) superoxide dismutase CuZn (i) thioredoxin (j) leucine zipper-EF-containing transmembrane protein
Cu (EF)
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
a b c d e f g h i j
PCR
Array
Cu (Actin)
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
a b c d e f g h i j
PCR
Array
(a) photosystem II oxygen (b) vanadium-dependent bromoperoxidase (c) zeaxanthin glucosyl transferase (d) hypothetical (e) high-affinity nitrate transporter (f) heat shock protein 90 (g) glutamate-cysteine ligase (h) superoxide dismutase CuZn (i) thioredoxin (j) leucine zipper-EF-containing transmembrane protein
Cd (EF)
-4.0
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
a b c d e f g h i j
PCR
Array
Cd (Actin)
-4.0
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
a b c d e f g h i j
PCR
Array
Resultados
90
Figura 31: Correlação entre as razões de expressão gênica M medidas pela técnica PCR em tempo
real (eixo x) e pela técnica de microarranjos (eixo y). Cada ponto representa um dos dez genes
selecionados para validação dos resultados (Tabela 4). No gráfico (A) são apresentados os resultados
para o cobre, considerando EF como gene de referência. No gráfico (B) também são apresentados os
resultados para cobre, mas considerando Actin como gene de referência. Os gráficos (C) e (D)
apresentam os resultados correspondentes para o cádmio. Em cada gráfico apresenta-se ainda o
coeficiente de correlação de Pearson r e a linha da correlação perfeita (tracejada vermelha), onde r é
igual à 1. Finalmente, a linha de tendência para os pontos plotados (continua azul), obtida por
regressão linear, também é exibida em cada gráfico.
-4.00
-3.00
-2.00
-1.00
0.00
1.00
-4.00 -3.00 -2.00 -1.00 0.00 1.00
M PCR
M A
rray
-4.50
-3.50
-2.50
-1.50
-0.50
0.50
1.50
-4.50 -3.50 -2.50 -1.50 -0.50 0.50 1.50
M PCR
M A
rray
(A) – Cobre / EF
r = 0.796
-3.50
-2.50
-1.50
-0.50
0.50
1.50
2.50
-3.50 -2.50 -1.50 -0.50 0.50 1.50 2.50
M PCR
M A
rray
-3.50
-2.50
-1.50
-0.50
0.50
1.50
2.50
-3.50 -2.50 -1.50 -0.50 0.50 1.50 2.50
M PCR
M A
rray
(C) – Cádmio / EF
(B) – Cobre / Actin
(D) – Cádmio / Actin
r = 0.796
r = 0.871 r = 0.871
91
5. Discussão
Em resposta a quase todos os tipos de mudanças fisiológicas e condições adversas do
meio, as células e os organismos tipicamente podem detectar mudanças de um sinal e
transformá-lo numa gama de variadas intensidades. Em nível celular, isso requer um processo
de adaptação a estas mudanças, sendo uma característica intrínseca de todos os organismos
vivos (Voet, 2002). Devido à grande influência antropogênica, que cresce a cada ano,
mudanças abruptas no meio ambiente, tanto aquático e terrestre, já se tornaram fatos
corriqueiros atualmente. Para a adaptação celular de algas a variações de temperatura, pH,
nutrientes e exposição a compostos potencialmente tóxicos, entre outros, é necessário toda
uma reorganização no padrão molecular genético (Ritter et al., 2008). A partir de adventos na
tecnologia de biologia molecular e bioquímica pode-se detectar a variação do padrão de
expressão gênica em larga escala. Existem vários métodos para a detecção deste tipo de
variação, três deles usualmente utilizadas são: sequenciamento de ESTs, microarranjos de
DNA e PCR em tempo real.
O presente trabalho apresenta informações relevantes no estudo da expressão dos
genes de G. tenuistipitata, importante macroalga marinha, que sofreram alterações quando
esta alga foi submetida a estresse ambiental gerado por dois metais comumente descartados
no ambiente (Cu e Cd).
Discussão
92
5.1 Absorção de Elementos Químicos
Após exposição de 6 dias da alga aos dois metais, foi demonstrado através da técnica
de ICP-AES, que G. tenuistipitata bioacumulou cobre e cádmio. Em comparação, observou-se
que esta alga foi capaz de bioacumular maior concentração de cobre em relação ao cádmio.
Uma explicação para esta diferença na bioacumulação pode ser justificada pela habilidade que
cobre possui de ser transportado para dentro da célula, pois este metal é essencial no
metabolismo da alga, podendo existir transportadores específicos para o mesmo. Por exemplo,
em Arabidopsis thaliana foram descritos cinco membros de uma família de transportadores de
cobre (COPT1-5) e em Sacccharomyces cerevisiae foi caracterizado um gene (CTR1) que
codifica algumas proteínas específicas de membrana plasmática que requerem afinidade no
transporte de cobre para dentro da célula (Dancis et al., 1994; Grotz, 1998; Himelblau &
Amasino, 2000; Williams et al., 2000; Sancenón et al., 2003; Markossian & Kurganov, 2003).
Considerando o fato de que cobre é um metal essencial para G. tenuistipitata, por
participar de importantes reações biológicas como co-fator enzimático (amino oxidase e
citocromo c oxidase) e carreador de elétron no processo de fotossínteses (plastocianina)
(Gledhill et al., 1997; Pinto et al., 2003), observou-se também através da técnica de ICP-AES,
que concentrações basais de cobre foram encontradas na alga controle, sem exposição a cobre,
assim como na alga exposta ao cádmio, também sem exposição ao cobre. Uma vez que o
meio de cultivo Von Stosch não possui cobre em sua formulação, concentrações basais deste
metal certamente foram provenientes da água do mar. Em comparação, outro estudo
utilizando Enteromorpha flexuosa (Chlorophyta, alga verde), também demonstrou a presença
de concentrações basais de cobre para esta alga, oriundas de regiões costeiras não
contaminadas (Andrade, et al., 2004). O que este fato indica é que concentrações basais de
cobre são, sem dúvida, essencial para esta alga, sendo que esta concentração mínima foi
possível de ser detectada pela técnica de ICP-AES. Entretanto, estudos com plantas superiores
Discussão
93
e algas verdes unicelulares, demonstraram que efeitos de cobre em excesso tornam-se tóxicos
a estes organismos, podendo produzir EROs (Charrier et al., 2008). Dessa forma, ao se
realizar experimentos de exposição de G. tenuistipitata a um meio contaminado por cobre em
excesso, espera-se uma resposta molecular adaptativa a esse tipo de condição. Esse processo
de resposta e adaptação da alga é, justamente, tema de investigação deste trabalho, o qual será
discutido nas seções seguintes.
Ao contrário de cobre, cádmio não possui função biológica conhecida no metabolismo
de G. tenuistipitata ou qualquer outro organismo, mesmo assim há evidencias de seu
transporte para dentro de células (Stohs & Bagchi, 1995). Em plantas, foi demonstrado que
cádmio pode competir por transportadores de íons bivalentes, ser co-transportado com prótons,
ATPases do tipo P, entre outros (Hirschi, et al., 2000). Os efeitos biológicos de cádmio ainda
não foram bem compreendidos. Stohs & Bagchi (1995) propõem que íons de cádmio
deslocariam íons de zinco e ferro das proteínas, resultando na liberação de íons de ferro,
acessíveis para a formação da reação de Fenton, gerando EROs, desencadeando todo o
processo de estresse oxidativo.
Tendo em vista que inúmeras indústrias utilizam cádmio e cobre para manufacturar
seus produtos, gerando grandes quantidades que são liberadas no ecossistema, torna-se
importante um estudo de absorção e acumulação destes metais pelas macroalgas, para curtos e
longos períodos de tempo.
Nas análises de ICP-AES, provou-se que estes metais foram absorvidos e acumulados,
não se sabendo ao certo se dentro das células ou mesmo entre a parede celular. Por exemplo,
estudos revelaram que algumas algas podem tolerar ou metabolizar metais pesados tóxicos
por uma variedade de mecanismos. Um destes mecanismos seria a possibilidade da parede
celular sequestrar uma porcentagem destes metais, já que algumas algas são muito ricas em
polissacarídeos reativos, que poderiam adsorver metais (Cai et al., 1995; Adhiya et al., 2002).
Discussão
94
Outro mecanismo de acumulação destes metais pelas células envolve o complexo íon-ligante
processados nos vacúolos. As principais moléculas envolvidas neste processo são pequenas
proteínas constituídas de resíduos de cisteína como as metalotioneínas e as fitoquelatinas,
polímero de GSH. Os íons livres destes metais associam-se a grupos tiol da GSH e são co-
transportados para vacúolos (Wong et al., 1997; Cobbett, 2000).
A capacidade de absorção de metais pela alga pode ser complexa, pelo fato de que
muitos metais tóxicos, como cádmio, mercúrio e chumbo podem competir por transportadores
de metais essenciais na absorção (Guerrinot, 2000). Os resultados encontrados nos
experimentos de ICP-AIS demonstram que G. tenuistipitata é um organismo bioacumulador
de metais (cobre e cádmio) e, dada a sua resistência a fatores abióticos como temperatura, pH
e salinidade, seria de grande importância ecológica e econômica iniciar estudos de
bioremediação de poluição em uma dada região marinha.
5.1.1 Absorção em G. birdiae, G. domingensis e G. tenuistipitata
Diante dos dados e fatos que foram apresentados neste trabalho para G. tenuistipitata,
considerou-se também como uma valiosa contribuição analisarmos duas espécies de
Gracilaria brasileira (G. birdia e G. domingensis), através da técnica de ICP-AES. Embora
não tenha sido feito cultivo para estas duas espécies de alga brasileira em laboratório, para as
condições do experimento, isso não impossibilitou a obtenção de informações relevantes.
Assim, foi possível atribuir comparações entre o cultivo de G. tenuistipitata realizado em
laboratório, frente às condições ambientais naturais das duas outras espécies brasileiras.
Foi feita uma varredura na concentração de vários elementos químicos. Apesar do
desvio padrão de alguns elementos oscilar, em geral, para as condições do experimento
realizado, observou-se flutuações nas concentrações destes elementos podendo implicar em
diferenças fisiológicas, bioquímicas e genéticas entre estas algas (Tabela 8 e gráfico da Figura
Discussão
95
32). Podemos analisar, por exemplo, o caso do elemento Mn. Este se encontra em maior
concentração em G. birdiae em relação as outras duas espécies, indicando um caso verossímil
de que G. birdiae necessita de uma maior concentração deste metal para sua manutenção vital.
De certa forma podemos dizer que cada espécie reage a sua condição fisiológica adaptativa,
pois no caso G. tenuistipitata, mesmo estando em um ambiente totalmente controlado, sem
insuficiência de nutrientes, inclusive Mn (presente em meio Von Stoch), esta espécie
acumulou cerca de duas vezes menos Mn e G. domingensis quatro vezes menos em relação a
G. birdiae. Assim, podemos também estudar o caso de Ca e K para G. domingensis, entre
outros.
Mesmo observando diferenças nas concentrações dos elementos químicos, não foi
detectada qualquer diferença no repertorio destes, para as três espécies de algas. Os elementos,
Ba, Ni, Zn, Sr, Cr, Co, As e Cd também foram analisados, mas não foram detectados em
nenhuma alga, provavelmente não são elementos vitais para estas espécies.
Deste modo, a técnica de ICP-AES foi à melhor alternativa para a determinação de
metais-traço, e especialmente ultra-traços, sendo possível comparar, entre as três espécies de
algas citadas, o repertorio de elementos químicos necessários para a sobrevivência e
crescimento das mesmas.
Discussão
96
Figura 32: Concentrações dos elementos químicos analisados pela técnica ICP-AES encontrados nas
algas G. birdiae, G. domingensis, G. tenuistipitata. Os valores são obtidos dos dados apresentados na
Tabela 8. Considerou-se o logarítimo dos valores para uma melhor visualização gráfica dos resultados.
5.2 Presença de H2O2
Sabe-se que níveis tóxicos de cobre e cádmio podem levar a danos moleculares nas
células. Cada um dos dois metais pode exercer efeito tóxico sobre o organismo podendo gerar
EROs. As EROs podem ser moléculas radicalares ou não-radicalar (bastantes reativas),
derivadas do oxigênio. A rápida produção e acumulação de EROs, primeiramente o O2.– e o
H2O2, devido aos efeitos de metais tóxicos, vem sendo evidenciada em plantas, fungos e
mesmo em algas (Gharieb et al., 2001; Materazzi et al., 2004; Ritter et al., 2008). Em
soluções aquosas o O2.– existe em equilíbrio ácido base com a forma protonada, o radical
hidroperoxil (Sutherland, 1991). Ambas espécies, O2.– e HO2
. sofrem dismutação gerando
H2O2. O aumento da produção desta última molécula pode exercer efeitos tóxicos dentro das
células via peroxidação lipídica, degradação ou modificação de proteínas, danos no DNA
entre outros (Fridovich, 1986; Imlay & Linn, 1988). O H2O2 quando reage com CeCl3 produz
-1.50
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
Al Ca Fe Mg P Si Mn B K Na Cu
Lo
g(C
on
cen
tração
)
G. birdiae G. domingensis G. tenuistipitata
Discussão
97
precipitados eletrodensos insolúveis de peridróxidos de cério (Ce[OH]2OOH e Ce[OH]3OOH).
A partir desta reação foi possível observar em G. tenuistipitata, através de microscopia
eletrônica, em que local exatamente ocorreu maior concentração destes acúmulos eletrodensos.
Foi observado claramente a formação de acúmulos eletrodensos, em amostras de alga
controle, e submetidas aos metais. Acumulações de H2O2 foram localizados também nos três
tempos de exposição aos dois metais.
5.2.1 Acumulação em Amostras Controle
Pequenos pontos de acúmulos, em células controles, foram encontrados na parede
celular mais externa, película, ou seja, a parte que fica em contato com o ambiente (Figura 14).
Este provável estresse ocasionado na película, poderia ter sido espontaneamente causado
pelas secções realizadas antes da fixação para a microscopia. Não foram observados outros
pontos de acúmulos em outros locais.
Observou-se a partir de cortes ultrafinos do talo da alga controle, várias estruturas
como: parede celular, cloroplastos, grânulos de amido, uma pequena película externa, nunca
caracterizada anteriormente, vacúolos e junção entre as células (pit- plug) uma característica
peculiar de algas vermelhas bastante importante para troca de fluidos entre as células (Graham
& Wilcox, 2000). Outra característica observada, nessas células corticais, foi a ausência de
organização de tilacóides empilhados nos cloroplastos. Esse tipo de organização dos
cloroplastos é excluído do grupo de algas vermelhas sendo utilizado na taxonomia deste grupo.
O tilacóide geralmente é único e não ocorre empilhamento, só dobramento em alguns gêneros.
Mesmo não havendo quase nenhuma literatura em microscopia eletrônica para G.
tenuistipitata, foi possível comparar estas estruturas celulares, com estudos realizados por
Lopes, 2003, tese de doutorado IQ/USP.
Discussão
98
5.2.2 Acumulação em Amostras Expostas ao Cádmio
O padrão de acumulação para amostras exposta ao cádmio foi diferente em relação ao
padrão encontrado no controle, somente com exceção de acúmulos na película.
Uma grande quantidade de H2O2, em amostras expostas ao cádmio durante uma hora,
foi notada em algumas regiões na interface da parede celular cortical. Também observou-se
uma aparência retrátil na morfologia dessas células e disposições irregulares dos cloroplastos
podendo, esta característica, indicar uma resposta rápida da célula ao estresse causado pelo
metal. Segundo Materazzi e colaboradores (2004), cádmio pode ter influencia direta com
enzimas relacionadas à biossíntese de clorofilas, podendo gerar deformação nos cloroplastos
ou até redução destes.
Após um dia de tratamento ao metal, o padrão da acumulação foi de certa forma
diferente. Não somente foi encontrado um padrão mais disperso de acúmulos, como descrito
anteriormente, mas também encontrou-se pontos mais densos de acumulação na interface da
parede celular (Figura 16). Além disso, foram visualizados no interior das células, diferentes
pontos de acúmulos ao redor de estruturas amorfas não identificadas. Estas estruturas
poderiam originar-se da degradação de cloroplastos seguida de morte celular, pois células
corticais possuem grandes quantidades cloroplastos (Figura 17).
Diferentemente após 6 dias de exposição, não foram encontrados padrões de
acumulação localizados na interface da parede celular. Em decorrência a uma provável
adaptação fisiológica e molecular da alga, encontrou-se apenas células normais e células com
estruturas amorfas não identificadas. Essa alga poderia já ter ativado e desativado todo o
mecanismo de complexão a compartimentalização para cádmio, importante mecanismo de
tolerância. Após sua complexão, por exemplo, com substâncias quelantes, o produto (Cd-
quelador) é armazenado em estruturas celulares e/ou subcelulares como vacúolo, reduzindo
sua concentração no citosol e organelas (Kupper et al., 2007).
Discussão
99
5.2.3 Acumulação em Amostras Expostas ao Cobre
Para cobre, após uma hora de tratamento (Figura 18), encontramos padrões de
acumulação de pontos semelhante com o padrão de acumulação do tempo de exposição de
cádmio de um dia (Figuras 16 e 17). Ou seja, pontos densos de acúmulos na interface das
células, pequenos pontos de acúmulos na parede celular mais externa (película) e pontos de
acúmulos ao redor de estruturas amorfas não identificadas. Notou-se entretanto uma diferença
no padrão de acumulação de H2O2 que foram localizados na periferia de cloroplastos,
aparentemente não foi observado em cádmio, podendo indicar toxicidade maior de cobre
(Figura 19, seta verde). Baszynski e colaboradores (1988), observaram em plantas superiores,
após tratamento com cobre, que houve alterações na estrutura morfológica de tilacóides e de
cloroplastos.
Semelhantemente para cobre, assim como para cádmio, após 6 dias de exposição, não
foram encontrados padrões de acumulação localizados na interface da parede celular,
encontrou-se apenas células normais e células com estruturas amorfas não identificadas.
Possivelmente a ocorrência de degradação das estruturas celulares seguida de morte de células
corticais é um evento normal, após estresse por estes metais, pois estas, são as primeiras
células a terem contato com os metais absorvidos.
Foi possível provar, após exposição aos metais, que de fato houve incremento de H2O2,
um indicador de estresse oxidativo. Tem-se como exemplo, um trabalho realizado por
Bestwick (1997) que revelou ao utilizar catalase exógena, em plantas superiores sob estresse,
que esta era assimilada pela parede celular, ocorrendo desta forma, inibição da formação de
peridróxido de cério. O mesmo não ocorreu para as outras amostras não tratadas com catalase.
Foi possível desta maneira provar que a molécula de fato detectada pela microscopia
eletrônica foi H2O2. Isso acontece porque a catalase é uma enzima antioxidante que decompõe
H2O2 gerando oxigênio (2H2O2 → 2H2O + O2). Sendo assim, moléculas de H2O2 não
Discussão
100
reagiram com moléculas de CeCl3 em solução, não havendo a formação de acúmulos de
peróxido de césio.
De maneira geral, após todas as análises presentes neste estudo e levantamento
bibliográfico podemos dizer que o primeiro efeito danoso que estes metais podem causar após
sua absorção pela alga, em curtos períodos de tempo e em concentrações de CE50, seria a
formação de moléculas altamente reativas causadoras de estresses oxidativo (Yruela et al.,
2000; Pinto et al.,2003; Collén et al, 2003).
5.3 Técnicas Moleculares para Análise Transcripcional da Alga
Através de técnicas moleculares amplamente utilizadas em estudos de biologia e
bioquímica, foi obtido um panorama global de alterações gênicas que foram ocasionadas, na
macroalga marinha G. tenuistipitata, após exposição desta ao meio de cultivo contaminado
com dois tipos de metais tóxicos comumente descartados no ambiente (cobre e cádmio).
5.3.1 Interferência de Polissacarídeos na Extração de RNA
Existe toda uma complexidade na extração de RNA de algas ricas em polissacarídeos.
Como mencionado anteriormente o gênero Gracilaria possui grande quantidade de
polissacarídeos na parede celular, por isso é importante economicamente. A dificuldade na
utilização de kits comerciais com presença de colunas de separação, não são uma boa
alternativa, pois as colunas entopem devido a grande concentração de polissacarídeos.
A utilização do protocolo de TRIZOL com GHL e KOAc foi adaptado para a extração
de RNA de G. tenuistipitata. O método é rápido simples, de baixo custo e minimizou a
contaminação com polissacarídeos e proteínas (Falcão et al., 2006). Apesar deste método ter
sido muito eficiente em estudo de PCR semi-quantitativo, para as reações de síntese de cDNA
na utilização dos microarranjos, não foi possível obter uma boa qualidade dos resultados de
Discussão
101
hibridização. Isso poderia ser explicado, pois alguns polissacarídeos podem inibir atividade de
algumas enzimas (Shioda & Marakami-Muofushi, 1987). Outra característica observada neste
trabalho para o polissacarídeo oriundo de G. tenuistipitata é sua provável interação com
ácidos nucléicos, tornando-se assim ineficiente os processos de extração de DNA em especial
RNA.
Desta maneira, depois de variadas tentativas na busca de uma metodologia de
eliminação de polissacarídeos e obtenção de ótimos rendimentos na concentração de RNA,
optou-se pela utilização de um reagente comercializado pela Invitrogen chamado Concert
RNA Reagent Plant. Este reagente foi suficiente para a obtenção de uma boa quantidade e
qualidade do RNA, atendendo as metodologias de microarranjos e PT-qPCR (Figura 21).
5.3.2 Análise Global da Expressão Gênica da Alga
A partir das análises de resultados de microarranjos podemos distinguir alguns
aspectos gerais da resposta transcricional, em termos de funções celulares de genes induzidos,
reprimidos (Tabela 12 e 13; Anexo B).
Dentre as analises da resposta transcricional gerada por cádmio e cobre, pela técnica
de microarranjos, pode-se dizer que no repertorio de genes induzidos e reprimidos ocorreram
mudanças amenas em função do tempo de 6 dias. Porém existem inúmeros estudos que
comprovam grandes variações genéticas atribuídas a um curto período de tempo de exposição
aos metais, como uma resposta rápida, por exemplo, entre estes estudos foi constatado que
vários grupos de categorias funcionas celulares foram induzidas, sendo as principais, as de
defesa, metabolismo e transporte (Collén et al., 2003; Wang et al., 2004; Collén et al., 2006;
Ritter et al., 2008). Podemos também, comparar estes resultados descritos com aqueles
encontrados em presença de H2O2, após 1 hora e 1 dia de exposição, onde a resposta da alga
ao metal foi mais intensa.
Discussão
102
Após tratamento de G. tenuistipitata aos metais, obteve-se uma variação atenuada da
resposta transcripicional. Através destes resultados foi possível inferir algumas considerações
relevantes, descrita a seguir.
Para a resposta da alga a cádmio, dentro da categoria de defesa celular, tivemos 2
genes relacionados a HSPs (Heat Shock Protein) que tiveram sua expressão reprimida; HSP
90, co-chaperone (Craig et al.,1993) e a HSP 70 (Kiang & Tsokos, 1998). A maioria das
proteínas de choque térmico são chaperoninas ou chaperonas, cuja função principal em
resposta a estresse é renovelar as proteínas desnaturadas. A HSP 70 tem capacidade de
renaturar certas proteínas e a síntese de HSP 90 em condições de estresses é aumentada
podendo redirecionar o metabolismo celular para uma maior tolerância ao estresse (Becker,
1994). Cádmio pode ainda interferir no sistema de estresse antioxidativo, como aquele
envolvendo glutationa reduzida. Assim pode haver declínios nos níveis de glutationa, isto
pode ocorrer devido a um aumento na utilização de fitoquelatinas, podendo transpota-lo até o
vacúolo. Além disso, cádmio pode também reduzir os níveis de atividades de outras enzimas
antioxidantes, pois este pode substituir outro metal de mesma carga, como por exemplo zinco
(Pietrini et al., 2003; Shaw et al., 2006). Em contra posição, um gene de efeito crucial na
homeostase de íons metálicos foi induzido (leucine zipper-EF-hand containing
transmenbrane protein), provavelmente seja uma resposta positiva da célula para regular
concentrações de íons alterados. Outros genes que estão relacionados com transportes de ínos
e moléculas como, glutathione regulated potassium, sodium/sulfate symporter, high-affinity
nitrate transporter também foram induzidos.
O fato de que poucos genes foram induzidos ou reprimidos poderia indicar que esta
alga reagiu ou ainda estaria reagindo ao estresses causado por este metal, podendo estar em
uma fase menos estressante e mais adaptada. Um exemplo que poderia indicar este fato, é a
controvérsia do que ocorreu na categoria de proteólise, foi induzido um gene dependente de
Discussão
103
ubiquitina (ubiquitin-fusion degradation), envolvido em um dos passos da via de
ubiquitinação. O processo de ubiquitinação ocorre em células onde moléculas são marcadas
por moléculas ubiquitina com o objetivo de serem reconhecidas por uma enzima proteossomo
26S, e serem degradadas (Sun & Chen, 2004). Entretanto, observa-se como divergência que o
gene para a enzima 26S proteasome regulatory p55 foi reprimido nas condições estudadas
para cádmio. Poderia este fato, ser mais um indicativo de que a alga estaria se adaptando
depois de 6 dias de exposição.
Não se pode deixar de notar também, que houve uma maior indução de genes
essenciais na categoria do metabolismo em relação a reprimidos (Tabela 12, Anexo B). Estes
genes induzidos nesta categoria estão envolvidos no metabolismo de aminoácidos, entre eles,
aparagina, aspartato e metionina. Ainda nesta categoria observamos a CDP-ME
kinase/[4(cytidine 5-diphospho)-2-C- methyl-D- erythritol kinase], que participa da síntese de
esteróis importante para manutenção celular. Além disso, foram induzidos genes das
categorias de energia, transcrição, divisão celular (CCG1 protein), este último indicando
crescimento (Bieganowski et al., 2004), entre outros.
Genes que codificam proteínas associados a pigmentos fotossintéticos como
ficoeritrinas foram reprimidos. Sabe-se que cádmio pode inibir enzimas relacionadas a cadeia
transportadora de elétrons do cloroplasto e enzimas do ciclo de Calvin (Materazzi et al., 2004).
É notada também a grande quantidade de genes tanto induzidos quanto reprimidos
considerados proteínas hipotéticas e hipotéticas conservadas, demonstrando que há todo um
mecanismo não identificado ligado em resposta a exposição da alga a este metal.
Para cobre um número ainda maior de genes de defesa foram reprimidos (Tabela 13,
Anexo B). Entretanto um estudo com a alga parda, Laminaria digitata, revelou, após uma
exposição de 72 horas da alga a estresse com cobre, que proteínas de defesa, tais como:
superóxido dismutase, peroxiredoxina e metionina sulfoxido também tiveram sua expressão
Discussão
104
reprimida (Ritter et al., 2008). Collén e colaboradores (2003), revelaram em estudos
utilizando G. tenuistipitata, exposta a estresse a estes dois metais, que algumas enzimas de
defesas (superóxido dismutase, catalase, glutationa redutase e ascorbato peroxidase), eram
induzidas significativamente após um dia e dois dias de exposição. Collén e colaboradores
(2003), associou que estes dados ocorriam devido a um desbalanço intracelular de EROs na
alga, e esta respondia com o seu mecanismo de defesa aumentando a expressão de enzimas
antioxidantes. Apesar destes genes terem papel importante contra estresse ambientais, após 6
dias de tratamento estes foram reprimidos, indicando que sua resposta pode ser imediata,
dependente do tempo.
Genes importantes para a manutenção e desenvolvimento da alga das categorias de
sínteses de proteínas, transcrição e energia também foram reprimidos numa maior
porcentagem em relação ao cádmio. Na categoria transcrição observou-se a inibição de
algumas DNA e RNA polimerases, na defesa muitas enzimas importantes no processo
antioxidante também foram inibidas, thioredoxina, HSP 70, ascorbato peroxidase e
superóxido dismutase e na parte de energia enzimas tais como as ficoeritrinas associadas a
proteínas e outras de captação de luz também foram reprimidas. Em contra partida, foi
encontrado um gene de defesa induzido, que codifica a enzima lipoxigenase, envolvida na
catálise de dioxigenação de ácidos graxos polinsaturados. A via das lipoxigenases em plantas
está envolvida na síntese de moléculas regulatórias. Os hidroperóxidos formados, pela ação
das lipoxigenases, são moléculas reativas que podem ser mobilizadas em plantas por meio de
um mecanismo envolvendo a hidroperóxido ciclase e a hidroperóxido liase (Farmer et al.,
1992). A hidroperóxido ciclase produz o ácido 12-oxo-fitodienóico que, após uma redução e
três ß-oxidações, dá origem ao ácido jasmônico, o qual é um poderoso indutor da síntese de
inibidores de proteases quando plantas estão sob estresse (Parchmann et al., 1997).
Discussão
105
De modo geral, ao contrário dos resultados encontrados para cádmio, foi observado
nos resultados para o tratamento com cobre, que genes foram mais reprimidos (108) e do que
induzidos (76). Contudo, parece que cobre exerce efeito mais tóxico em G. tenuistipitata em
relação ao cádmio, podendo levar mais tempo para a alga se adaptar.
5.3.3 Validação dos Resultados
Os resultados obtidos com a técnica de microarranjos foram validados com um método
independente, o PCR em tempo real (RT-qPCR). A comparação dos dados obtidos por ambas
as técnicas foi apresentada na Seção 4.6.2.
Quando se diz que os dados do microarranjos são validados pelos dados do RT-qPCR,
tem-se a impressão de que a técnica de RT-qPCR é a que realmente fornece a resposta correta,
sendo os resultados dos microarranjos secundários, apenas significativos se forem
compatíveis com aqueles do RT-qPCR dentro das incertezas experimentais. A validação de
dados, entretanto, não deve ser entendida assim. Por se tratar de duas técnicas experimentais
completamente distintas, as quais objetivam medir a razão de expressão gênica por meios
indiretos, é natural que diferenças existam entre os resultados encontrados. Não se pode
afirmar com segurança qual das técnicas apresenta o resultado mais próximo da realidade. O
que se espera é que os resultados de RT-qPCR corroborem com os encontrados pelos
microarranjos, no sentido de que exista uma boa correlação entre os dados medidos, e não que
eles sejam exatamente (ou até aproximadamente) iguais.
É claro que experimentos de microarranjo permitem uma avaliação das razões de
expressão de um número muito maior (global) de genes. Em comparação à técnica de RT-
qPCR, essa é a grande vantagem de se trabalhar com microarranjos. Assim, pode-se comparar
os resultados obtidos com as duas técnicas apenas para um pequeno número de genes. Sendo
Discussão
106
tais resultados compatíveis, extrapola-se a conclusão de que os demais resultados obtidos com
os microarranjos, não diretamente comparados, também são válidos.
A comparação direta entre os resultados RT-qPCR × microarranjos para os
experimentos considerados neste estudo foi apresentada nas Figuras 29 e 30. No sentido da
“validação de dados” explicada acima, em que os mesmos não devem ser exatamente iguais,
mas sim apresentarem boa correlação, concluiu-se que existe boa concordância qualitativa
entre os valores apresentados, validando, portanto, os resultados.
Observa-se, no caso do cobre (Figura 29), que os todos os valores apresentados são
compatíveis dentro das incertezas experimentais. Além disso, há também uma boa
concordância quanto ao sinal de M (gene induzido ou reprimido) encontrado em ambas as
técnicas, ocorrendo divergências apenas para os genes (b) e (j), apesar dos valores de M serem
pequenos e as incertezas relativamente grandes.
Dos dez genes selecionados para a validação de dados, no caso do cobre, apenas (h) e
(i) foram considerados diferencialmente expressos pelo método HTSelf utilizado para a
análise dos dados de microarranjos (a tabela completa dos genes diferencialmente expressas
gerada pelo HTSelf encontra-se no Anexo B). Esses genes são apresentados circulados nos
gráficos da Figura 29. Um critério bastante simples que pode ser utilizado para se considerar
um gene diferencialmente expresso é aquele onde M > 1 (induzido) ou M < -1 (reprimido).
Esse critério é conhecido pelo nome de fold-change, pois corresponde a uma variação da
expressão gênica maior que o dobre (M > 1), ou menor do que a metade (M < -1) , da situação
“tratada” com relação a “controle”. Assim, podemos observar na Figura 29 que apenas os
genes (h) e (i) apresentaram valores de M menores do que -1, tanto na medida de RT-qPCR,
quanto dos microarranjos, corroborando com as análise completa gerada pelo HTSelf que os
consideraram diferencialmente expressos.
Discussão
107
No demais, observa-se também boa concordância entre os resultados de RT-qPCR
obtidos utilizando os genes de referência EF e Actin, indicando, no caso dos experimentos
considerados, que ambos os genes são igualmente bons para realização da metodologia RT-
qPCR.
No caso do cádmio (Figura 30), praticamente as mesmas conclusões podem ser
alcançadas. Há uma concordância qualitativa entre os resultados e o sinal de M é compatível
entre as duas medidas para todos os genes.
Quanto à classificação de genes diferencialmente expressos, o HTSelf listou os genes
(d), (e), (f) e (j) como significativos. Mais uma vez esse resultado é compatível com o critério
geral e simples do fold-change (M > 1 ou M < -1 para considerar diferencialmente expresso).
Observa-se que esses quatro genes apresentam valores de M acima de 1 ou abaixo de -1 nas
medidas tanto dos microarranjos quanto do RT-qPCR. Os demais genes apresentam sempre
um dos valores de M abaixo desse limiar crítico, ou seja, -1 < M < 1 para o RT-qPCR ou para
os microarranjos. A única exceção é o gene (g), que não foi considerado diferencialmente
expresso pelo método mais refinado do HTSelf, mas apresenta valores de M menores do que -
1 nas duas medidas realizadas.
Finalmente, também para o caso do cádmio, observou-se também boa concordância
entre os resultados de RT-qPCR obtidos com os genes de referência utilizados, EF e Actin.
Para se encerrar a discussão sobre a comparação dos resultados RT-qPCR ×
microarranjos, é importante se analisar os gráficos da Figura 31, os quais apresentam a
correlação entre os dados encontrados. Em cada gráfico, tem-se 10 pontos, correspondentes a
cada gene selecionado, sendo os valores de M obtidos pela técnica de RT-qPCR (MPCR)
representados no eixo horizontal e os valores de M obtidos pela técnica de microarranjos
(MArray) do eixo vertical. São também apresentadas as incertezas em cada medida. Calculou-se,
Discussão
108
para cada conjunto de dados apresentado na Figura 31, o coeficiente de correlação de Pearson
r correspondente.
Em estatística, o coeficiente de correlação de Pearson, também chamado de
"coeficiente de correlação produto-momento" ou simplesmente de "r de Pearson", mede o
grau da correlação (e a direção dessa correlação - se positiva ou negativa) entre duas variáveis.
Este coeficiente assume apenas valores entre -1 e 1. r = 1 significa uma correlação perfeita
positiva entre as duas variáveis. r = − 1 significa uma correlação negativa perfeita entre as
duas variáveis, isto é, se uma aumenta, a outra sempre diminui. r = 0 significa que as duas
variáveis não dependem linearmente uma da outra. A interpretação usual é a de que r > 0,70
indica uma forte correlação; 0,30 < r < 0,70 indica correlação moderada e r < 0,30 indica fraca
correlação.
Se existisse uma correlação perfeita entre os dados da Figura 31, ou seja, se o
coeficiente de Pearson r fosse igual a 1, então para todos os pontos valeria MPCR = MArray,
estando esses pontos localizados exatamente sobre a reta x = y (linha tracejada vermelha nos
gráficos). Como a correlação não é perfeita, com r = 0,796 para o caso do cobre e r = 0,871
para o caso do cádmio, os pontos obtidos se distribuem em torno da linha tracejada vermelha
com boa proximidade. Acrescenta-se nos gráficos, apenas para referência, uma linha de
tendência entre os pontos, calculada por regressão linear simples (linha azul contínua).
Os valores de r obtidos tanto para cádmio quanto para o cobre, indicam uma forte
correlação entre os dados, permitindo concluir que os resultados de microarranjo estão
validados pela técnica independente de PCR em tempo real.
109
6. Conclusões
• Através da técnica de ICP-AES, foi demosntrado que G. tenuistipitata bioacumulou cobre e
cádmio. Em comparação, observou-se que esta alga foi capaz de bioacumular maior
concentração de cobre em relação ao cádmio. Além disso, também foi demostrado a presença
de níveis basais de cobre na alga. Uma varredura no repertório de elementos químicos
característicos de G. tenuistipitata, cultivada em laboratório, e de duas outras espécies
brasileiras, coletadas em ambientes naturais (G. birdiae e G. domingensis), revelou flutuações
na concentração desses elementos para cada espécie, implicando em diferenças adaptativas
fisiológica, bioquímica e genética, entre elas. Podemos assim, dizer que esses dados são
relevantes para estudos futuros na área de cultivo dessas algas, em tanques e/ou mar aberto, e
mesmo para estudos ecológicos, fisiológicos, bioquímicos e moleculares.
• Foi comprovada a presença de H2O2 em células do córtex de G. tenuiatipitata quando esta
foi submetida ao meio de cultivo contaminado com os metais cádmio e cobre. O padrão de
acumulação de peridróxidos de cério para cádmio, nos tempos de 1 hora e 1 dia, foi diferente
do encontrado para cobre. Após esses tempos de exposição (1 hora e 1 dia), houve uma
resposta rápida, “retrátil”, na morfologia celular. Entretanto, após 6 dias de exposição, foram
encontradas semelhanças adaptativas na morfologia celular da alga para os dois metais.
• Foi necessário a utilização de outra metodologia de extração de RNA, para marcação e
hibridização nos microarranjos, devido a interferência de polissacarídeos na síntese de cDNA.
Conclusões
110
• Para a técnica de PCR em tempo real, foi visto que os valores de r obtidos tanto para cádmio
quanto para o cobre, indicam uma forte correlação entre os dados de microarranjos, e que os
dois genes constitutivos utilizados também tiveram uma boa correlação entre eles. Além disso,
não foram observados introns, entre os fragamentos dos 10 genes não constitutivos,
amplificados de amostras de DNA genômico e RNA.
• Em geral a variação da expressão gênica da alga sob estresse analisada pela técnica de
microarranjos, revelou diferenças nas categorias de genes funcionais distintas. Em resposta ao
cádmio, a alga reagiu mais rapidamente ao estresse. Foi visto que proteínas de defesa celular
quase não variaram após tratamento de 6 dias e que alguns genes de metabolismo, síntese de
proteínas, homeostase de íons e transporte, essenciais para o desenvolvimento da alga, foram
induzidos. Esses dados, possivelmente mostram que após este tempo de tratamento a alga já
estaria se adaptando as condições adversas geradas. Para cobre a resposta foi mais complexa.
Enzimas de defesa foram reprimidas, assim como alguns genes envolvidos com energia,
síntese protéica, transcrição e metabolismo. De outra forma, um gene de defesa envolvido na
dioxigenação de ácidos graxos insaturados foi induzido, assim como, genes de metabolismos,
divisão celular, energia, entre outros, indicando que a alga estaria reagindo ao estresse gerado
por esse metal, em um processo adaptativo mais lento. A maioria dos genes, cuja expressão
alterou, devido ao estresse gerado pelos dois metais, ainda não tem função celular conhecida,
indicando que há um mecanismo não identificado ligado à resposta da alga a exposição a
esses metais. Podemos dizer então, que cobre exerce um poder de toxicidade maior nessa alga
em relação ao cádmio. Deste modo, torna-se um fator importante, frente a ambientes
marinhos contaminados, descobrir se os organismos desse ecossistema são capazes de reagir
positivamente e se adaptarem as novas condições.
ANEXOS
112
A. Análise de Dados de Microarranjos
Este apêndice apresenta o estudo quantitativo dos dados obtidos a partir dos
microarranjos preparados, o qual foi realizado em colaboração com o pesquisador Dr. Daniel
Augusto Cortez do Instituto de Física da USP. O objetivo desse estudo é determinar,
utilizando-se técnicas estatísticas bem conhecidas, a relação de genes diferencialmente
expressos da alga submetida ao estresse (ensaio tratado), em relação à alga exposta ao seu
meio de cultivo natural (ensaio controle).
Em um experimento típico de microarranjos utilizando dois mRNA a serem
comparados são transcritos reversos em cDNA, rotulados com dois fluoróforos diferentes
(usualmente um marcador fluorescente vermelho Cy5, e um marcador fluorescente verde
Cy3), e então hibridizados simultaneamente na lâmina de vidro. Valores de intensidade
gerados da hibridização em spots de DNA individuais são indicativos de expressão gênica, e a
comparação entre níveis de expressão gênica das duas amostras são derivadas da razão entre
as intensidades resultantes.
Exemplificando: digamos que para o gene “X” obteve-se um valor de intensidade para
o marcador associado ao ensaio tratado igual à R, e um valor de intensidade para o marcador
associado ao ensaio controle igual à G. Então, basicamente, a razão R/G corresponde à relação
entre as expressões do gene “X” para os ensaios considerados. Valores da razão R/G acima ou
abaixo de determinados cutoffs (que também serão determinados apropriadamente),
classificarão o gene como diferencialmente expresso.
Em seguida, apresenta-se os detalhes por de trás das idéias sucintamente descritas
acima. É importante ressaltar que a análise de dados de microarranjos baseia-se em
Analise de Dados de Microarranjos
113
métodos já estudados, vastamente descritos da literatura (Cui & Churchill, 2003;
Nadon & Shoemaker 2002; Tu et al., 2004; Yang et al., 2002).
A.1 Dados Brutos
Em primeiro lugar, deve-se obter os valores das intensidades de fluorêcencia emitidas
pelos marcadores associados ao ensaio tratado e ao ensaio controle, para cada gene
considerado no microarranjo.
A escolha da cor do marcador (vermelho ou verde) para indexar o ensaio tratado e o
ensaio controle é arbitrária. Em geral o ensaio tratado é marcado com vermelho e o ensaio
controle é marcado com verde. Uma técnica conhecida (dye-swap), cujo objetivo é a
comparação de resultados, baseia-se na construção de dois microarranjos idênticos, exceto
pelas cores utilizadas para os marcadores do ensaio tratado e do controle, que são trocadas.
Vamos convencionar que o marcador vermelho esteja associado aos genes do ensaio
tratado e o marcador verde esteja associado aos genes do ensaio controle. Cada hibridização é
escaneada e produz uma imagem que é processada utilizando-se o programa Array Vision 6.0.
As principais quantidades de interesse produzidas pelos métodos de análise da imagem
(correção de segmentação e background) são os pares de intensidade de fluorêcencia (R, G),
para cada gene em cada arranjo (onde R = vermelho para o marcador do tratado e G = verde
para o marcador controle). Tais valores são dados em unidades arbitrárias de intensidade e
correspondem aos dados brutos para as análises subsequêntes. É costume a construção de um
gráfico dos valores de R×G assim obtidos, denominado Scatter Plot.
Uma vez que os valores brutos de R e G costumam variar desde poucas unidades até
vários milhares, torna-se mais conveniente trabalhar com uma escala logarítmica, utilizando-
se valores de log2(R) e log2(G). Como exemplo, apresentamos na Figura 33 os gráficos de
R×G e de log2(R)×log2(G) para um dos microarranjos deste trabalho (experimento self-self).
Analise de Dados de Microarranjos
114
Como se está interessado em avaliar o quanto R é maior (ou menor) de que G, ou seja,
a distribuição dos valores de R e G ao longo da reta R = G, é conveniente efetuarmos uma
rotação de 45º no sentido horário dos eixos R e G. Trabalhando com os valores de log2(R) e
log2(G), a rotação descrita acima nos leva em um novo sistema de coordenadas que, a menos
de um fator de proporcionalidade, é dado por A = log2(RG)1/2 e M = log2(R/G). A Figura 34
apresenta a transformação (log2(R), log2(G)) → (A, M), utilizando-se os valores de R e G da
Figura 32. Toda a análise subsequente dos dados será feita com base no diagrama (A, M).
Observa-se que a nova variável A (add) pode ser interpretada como a média da
intensidade logarítmica total medida no spot, pois A = log2(RG)1/2 = (log2(R)+log2(G))/2. A
variável M (minus), por sua vez, é simplesmente o logaritmo da razão entre as intensidades, M
= log2(R/G) = log2(R) – log2(G).
Figura 33: Gráficos com valores de R×G e de log2(R)×log2(G). Os dados correspondem ao
microarranjo obtido da hibridização self-self.
Scatter Log Red-Green Plot
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
-10 -5 0 5 10 15
log2(Red)
log2(G
reen)
Scatter Red-Green Plot
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 200 400 600 800 1000 1200
Red
Gre
en
Analise de Dados de Microarranjos
115
Figura 34: Transformação de coordenadas (log2(R), log2(G)) → (A, M). Os dados apresentados
referem-se aos mesmos da Figura 33.
A.2 Normalização de Dados
Com o intuito de se aferir precisamente as modificações nas expressões gênicas a
partir dos valores medidos de R e G, é importante levar em consideração as variações
aleatórias (experimentais) e sistemáticas que ocorrem em todo experimento de microarranjo.
Por exemplo, uma bem conhecida fonte de variação sistemática surge das tendências
associadas aos diferentes marcadores. Tais tendências podem ser decorrência de uma série de
fatores, incluindo propriedades físicas dos marcadores (sensitividade a luz e ao calor, meia-
vida relativa), efetividade na incorporação do marcador, variabilidade experimental nos
processos de hibridização e processamento, ou ajuste do scanner durante o processo de coleta
de dados. Mesmo que essas tendências sistemáticas sejam pequenas, elas podem ser confusas
quando procuramos por diferenças biológicas sutis, tornando difícil a distinção entre genes
diferencialmente e constantemente expressos.
A-M Plot
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0
4,0
6,0
-5,0 0,0 5,0 10,0 15,0
A = log2(RG)/2M
= log2(R
/G)
Scatter Log Red-Green Plot
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
-10 -5 0 5 10 15
log2(Red)
log2(G
reen)
Analise de Dados de Microarranjos
116
O objetivo do processo de normalização é o de minimizar as variações sistemáticas na
medida dos níveis de expressão gênica de duas amostras de mRNA hibridizadas, de forma que
diferenças biológicas possam ser melhor distinguidas.
O processo de normalização dos dados começa com a análise do diagrama (A, M)
descrito anteriormente (Yang et al., 2002). Tal diagrama se demonstra bastante útil em termos
da identificação na razão logarítmica M de padrões dependentes da intensidade A.
A normalização utilizada no presente trabalho é conhecida como Normalização
Dependente da Intensidade (Dudoit, 2002). Esse método assume que as intensidades de
vermelho e verde estão relacionadas por uma função que depende apenas da intensidade total,
i.e. R = k(A)G, de forma que o centro da distribuição das razões logarítmicas M deve ser
deslocado para zero:
=−
→
GAk
RAc
G
R
G
R
)(log)(loglog 222 ,
onde c(A) = log2[k(A)]. A função c(A) normalmente escolhida para o processo de
normalização acima é o ajuste LOWESS (locally weighted scatterplot smoothing) ao conjunto
de dados do diagrama (A, M). O ajuste LOWESS, introduzido por Cleveland e posteriormente
aprimorado por Cleveland & Devlin (1988), também conhecido por regressão linear
localmente ponderada, é uma técnica para ajustar uma curva suave a um conjunto de dados
denso e espalhado. Em particular, ela não será afetada pela pequena porcentagem de genes
diferencialmente expressos, que aparecerão como pontos extremos no diagrama (A, M).
O grau de suavidade da curva LOWESS ajustada é determinado por um parâmetro f
(smoothing parameter ou bandwidth parameter) que controla a largura da janela de dados
utilizados em cada regressão local ponderada. Quanto maior a largura da janela, mais suave
será a curva resultante. Uma janela menor resultará em maiores variações locais (Figura 35).
Valores típicos de f para a normalização de dados de microarranjos variam desde 0,2 até 0,5.
(1)
Analise de Dados de Microarranjos
117
Figura 35: Ajuste LOWESS (linha vermelha) para um conjunto de dados de microarranjo genérico.
São apresentadas curvas para três valores do parâmetro f.
Apresenta-se no gráfico da Figura 36 o processo de normalização prescrito pela
Equação (1) para os dados de microarranjo da Figura 33. A curva verde no gráfico do lado
esquerdo representa o ajuste LOWESS aos pontos (A, M) com o parâmetro f igual à 0.25.
Em seguida se apresenta alguns detalhes mais técnicos sobre o cálculo do ajuste
LOWESS para um conjunto de dados genérico.
Analise de Dados de Microarranjos
118
Figura 36: Ajuste LOWESS (curva verde corresponde à função c(A)) ao conjunto de dados de
microarranjo da Figura 33 e normalização segundo a Equação (1).
A.2.1 LOWESS
O método LOWESS requer o uso de regressão linear ponderada. Cada ponto no
conjunto de dados apresenta um peso associado. Assim, inicialmente é fornecido um conjunto
de pontos e pesos (xi, yi; wi), 0 ≤ wi ≤ 1. Os coeficientes angular S e linear L da reta ajustada a
esse conjunto de pontos são dados pelas bem conhecidas fórmulas de regressão linear:
( )22 ∑∑ ∑∑∑∑ ∑
−
−=
iiii
iiiiiiii
xwxw
ywxwwyxwS
( )22
2
∑∑ ∑∑∑∑ ∑
−
−=
iiii
iiiiiiiii
xwxw
xwyxwywxwL
O ajuste LOWESS é calculado em cada ponto do conjunto de dados. Para cada um
desses pontos, uma reta é ajustada a partir de um conjunto de dados vizinhos. O método exige
que seja fornecido um parâmetro f (entre 0 e 1) que controla a quantidade de pontos utilizados
em cada regressão local.
A-M Plot and LOWESS Fit (Self+Self)
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0
4,0
6,0
-5,0 -3,0 -1,0 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0
A = log2(RG)/2
M =
lo
g2(R
/G)
Analise de Dados de Microarranjos
119
A.3 Classificação de Genes Diferencialmente Expressos
Quando se analisa dados de microarranjos, uma questão central é como classificar
genes diferencialmente expressos. Para responder a essa questão é necessário fixar um nível
de cutoff para as razões das intensidades das hibridizações que nos permita decidir se um gene
é diferencialmente expresso ou não. Existem muitas formas matemáticas de se definir tal
cutoff . Uma estratégia simples e amplamente utilizada consiste em arbitrariamente escolher
uma razão constante, comumente um limiar tal que R = 2G (M = 1) ou G = 2R (M = -1).
Genes com razões fora desse limiar são considerados diferencialmente expressos (métdodo
conhecido pelo nome de fold-change).
Outra abordagem baseia-se em estratégias experimentais tal como o uso de
hibridizações self-self. Experimentos self-self são obtidos rotulando o mesmo material
biológico com dois marcadores Cy3 e Cy5 e hibridizando-os simultaneamente na mesma
lâmina. Essa estratégia tem sido usada para derivar cutoffs dependentes da intensidade e
classificar genes como diferencialmente expressos ou divergentes em diversos estudos de
microarranjos (Tu et al., 2002).
A utilização de experimentos self-self é a base do método HTSelf desenvolvido por
Vêncio & Koide (2005), o qual será aplicado no presente trabalho para a classificação dos
genes diferencialmente expressos. Observa-se que o método já havia sido aplicado com
sucesso em diversos outros experimentos.
A.3.1 O Método HTSelf
Aqui, expõem-se as idéias contidas em Vencio & Koide (2005) para descrever o
método HTSelf.
A idéia básica é se determinar à função densidade de probabilidade (FDP) nula do
teste a partir de experimentos self-self. Como a hipótese “não há hibridização diferencial entre
Analise de Dados de Microarranjos
120
duas amostradas sondadas” é válida para todos os genes num experimento self-self, é possível
utilizar todos os genes spotados para estimar a FDP nula. Com uma quantidade adequada de
dados (todos os genes spotados), o uso de técnicas não-paramétricas é possível.
Para levar em consideração as características dependentes da intensidade dos dados, a
FPD nula é estimada a partir de uma janela deslizante, que desliza sobre toda a gama de
intensidades medidas. Esse procedimento resulta na determinação de cutoffs dependentes da
intensidade, os quais podem ser prontamente aplicados para experimentos não-self-self. Dessa
forma, é implicitamente assumido que o mesmo processo estocástico que gerou o ruído
experimental nos experimentos self-self está também atuando nos dados não-self-self. Assim,
razões logarítmicas acima ou abaixo dos cutoffs dependentes da intensidade podem ser
classificados como diferencialmente expressos.
A determinação da FDP nula em uma janela de dados de um experimento self-self se
faz a partir do chamado Kernel Density Estimator. A característica desse método é que o
mesmo é independente do modelo e é capaz de aproximar a FDP de uma variável aleatória
apenas utilizando suas medidas experimentais.
Depois de se estimar a FDP nula de das razões logarítmicas normalizadas M para uma
dada janela de valores de intensidades A, um intervalo de credibilidade definido por um
parâmetro 0 < α < 1 pode ser determinado. Resumidamente, o algoritmo para se definir os
cutoffs dependes da intensidade é:
(1) define-se uma janela deslizante no eixo A através de dois parâmetros: a largura da
janela e o incremento (passo) de deslizamento. Cada passo da janela deslizante
delimita um subintervalo de valores de A;
(2) para cada subintervalo de A selecionado em (1), estima-se a função densidade de
probabilidade M | A usando o Kernel Density Estimator gaussiano;
Analise de Dados de Microarranjos
121
(3) integra-se a função densidade de probabilidade estimada em (2) ao redor do modo
até que probabilidade definida pelo parâmetro α seja atingida. Os intervalos obtidos
são chamados intervalo de credibilidade;
(4) os passos (2) e (3) são repetidos até que a janela tenha deslizado sobre todos os
valores possíveis de A.
A Figura 37 mostra um retrato estático do algoritmo descrito acima em um passo
arbitrário.
Depois de se determinar os cutoffs dependentes da intensidade, diferentes experimentos
de microarranjos feitos sob as mesmas condições do experimento self-self podem ser
estudados. Por exemplo, suponha que a medida (a, m) de um spot apresente a razão
logarítmica m fora do cutoffs gerados com credibilidade 99%. Então, ele pode ser classificado
como diferencialmente expresso, uma vez que há apenas 1% de chance de que o valor de m
obtido seja devido a erros técnicos aleatórios.
Analise de Dados de Microarranjos
122
Figura 37: Retrato de um passo do processo da janela deslizante para determinação dos cutoffs
dependentes da intensidade. O gráfico da esquerda mostra o diagrama (A, M) com os dados do self-self
para o microarranjo da G. tenuistipitata. O subintervalo A considerado está delimitado entre as linhas
verticais do gráfico da esquerda. O histograma dos valores de M mostrado no gráfico da direita foi
construído utilizando os dados entre as linhas verticais pretas do gráfico da esquerda. O Kernel Density
Estimator (linha verde) e as fronteiras do intervalo de credibilidade de 95% (linhas verticais vermelhas)
também são apresentados. Essas fronteiras definem os cutoffs dependentes da intensidade para o
intervalo considerado. Mostra-se ainda no gráfico da esquerda os valores dos cutoffs para todos os
intervalos de A percorridos pela janela deslizante, resultando nas linhas azuis.
A.3.2 Estatística para Classificação
Uma vez obtido os valores dos cutoffs em função das intensidades com o método
HTSelf , o teste de comparação pode ser aplicado para todos os spots dos experimentos não-
self-self. Como o teste é aplicado em spots individuais, ele não depende do número de réplicas.
Se tiver um número de observações replicadas para um dado gene, após a aplicação do teste
em cada spot, é possível se determinar facilmente se eles estão acima ou abaixo dos cutoffs e
classificar o gene como diferencialmente expresso ou não. Mais especificamente, suponha que
existam n réplicas para um dado gene “X”, com u observações acima dos cutoffs, d
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0
4,0
6,0
-5,0 -3,0 -1,0 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0
A
M N
orm
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
M Norm
Analise de Dados de Microarranjos
123
observações abaixo dos cutoffs e i observações entre os cutoffs, tal que n = u + d + i. Diremos
que o gene “X” é diferencialmente expresso se as probabilidades
idu
u
n
uupP
++==.
ou
idu
d
n
ddownP
++==.
estiverem acima de um certo limiar P0. Tipicamente considera-se P0 = 66%, embora existam
trabalhos que consideram P0 = 50%, ou seja, tal que se pelo menos metade das réplicas de um
gene estiverem acima ou abaixo dos cutoffs, considera-se que existe diferenciação de
expressão.
A.4 Programa para Análise de Dados: “GT Microarray Analysis”
O processo de análise dos dados de microarranjos requer um óbvio esforço numérico
no sentido de se calcular a normalização dos dados, os cutoffs para os experimentos self-self a
partir do método HTSelf e a classificação de genes diferencialmente expressos. Em
colaboração com o Dr. Daniel Augusto Cortez (IFUSP), desenvolveu-se um programa para
implementação dos passos acima, o qual foi utilizado nas análises deste estudo. O programa
criado denomina-se “GT Microarray Analysis” e será brevemente explicado a seguir.
A proposta do programa visa basicamente tornar automatizado o processo de análise
dos dados obtidos. A entrada inicial do programa é o arquivo de dados gerado pelo software
Array Vision 6.0, o qual contém as intensidades de fluorescência geradas a partir da análise
das imagens escaneadas dos arranjos. Além disso, o programa requer que sejam inseridos
parâmetros pertinentes ao processo de normalização e ao cálculo dos cutoffs via HTSelf.
Também é possível carregar um arquivo contendo a identificação dos spots com os genes
biológicos correspondentes, para que seja feita uma classificação.
Analise de Dados de Microarranjos
124
O programa “GT Microarray Analysis” foi desenvolvido de forma especializada,
sendo específico para a configuração do microarranjo e o mapa do chip utilizado aqui. A
interface com o usuário é bastante amigável, sendo possível a visualização dos dados de uma
forma rápida e fácil. Após as análises, arquivos com os dados brutos e as respostas são
gerados para manipulação e criação de gráficos em planilhas comerciais como o MS Excel.
A Figura 38 apresenta a interface do programa “GT Microarray Analysis” com um dos
arquivos de dados aberto. A Figura 39 mostra a interface gerada (classificação dos genes)
após toda a análise dos dados.
Figura 38: Interface do programa “GT Microarray Analysis”. Os arquivos de dados abertos
correspondem à hibridização da alga tratada com cádmio e da alga em seu meio natural de cultivo, bem
como os arquivos de dados do self-self.
Analise de Dados de Microarranjos
125
Figura 39: Janela “Classification” aberta após a função “Classificar” ser selecionada. As tabelas nessa
janela permitem uma classificação completa dos genes estudados.
A partir do final de 2008, iniciou-se mais uma colaboração com os Drs. Daniel Cortez
(IFUSP) e Ricardo Vencio (MedUSPRB) para o desenvolvimento de um novo programa
(provisoriamente batizado pelo nome de MaDA – Microarray Data Analyser) que seja
genérico o suficiente para a análise de dados gerais de microarranjos, com uma configuração
arbitrária dos chips. Em breve, a publicação dos detalhes da construção desse programa será
submetido a revista específica da área.
A.4.1 Processamentos
A seguir, como exemplo, apresenta-se dois processamentos dos dados com o programa
“GT Microarray Analysis”. O primeiro exemplo refere-se ao microarranjo preparado pela
Analise de Dados de Microarranjos
126
hibridização da amostra de alga exposta ao cádmio com a alga em seu meio natural de cultivo,
mais os dados do experimento self-self. O segundo, refere-se à exposição da alga ao cobre.
O primeiro gráfico da Figura 40 ilustra o diagrama (A, M) obtido e o ajuste LOWESS
sobre os dados. Os pontos no gráfico representam apenas spots não-vazios com intensidade
Red e Green positivas. O segundo gráfico apresenta os valores normalizados das razões de
intensidades M, junto com as curvas de cutoffs geradas pela análise dos dados do self-self
(com o método HTSelf). Os pontos acima ou abaixo dos cutoffs são apresentados em destaque,
pois representam spots com expressão gênica diferencial. Observa-se que muitos desses spots
podem corresponder a réplicas de um mesmo gene biológico. Tal gene só será considerado
diferencialmente expresso se a maioria dos spots correspondentes estiverem acima (gene
induzido), ou abaixo (gene reprimido) dos cutoffs.
Os gráficos da Figura 41 são análogos aos da Figura 40, mas consideram os dados do
tratamento da alga exposta ao cobre.
Analise de Dados de Microarranjos
127
Figura 40: Gráfico superior: Diagrama (A, M) e ajuste LOWESS (curva vermelha) para o conjunto de
dados da alga tratada com cádmio. Gráfico inferior: Dados normalizados e cutoffs (curvas azuis). Em
destaque (pontos lilás), valores representado spots com expressão diferenciada.
A-M Plot and LOWESS Fit
-14.0
-12.0
-10.0
-8.0
-6.0
-4.0
-2.0
0.0
2.0
4.0
6.0
-5.0 -3.0 -1.0 1.0 3.0 5.0 7.0 9.0 11.0
A = log2(RG)/2
M =
lo
g2
(R/G
)
Normalized Data and Cutoffs with 95% credibility
-6.0
-4.0
-2.0
0.0
2.0
4.0
6.0
-5.0 -3.0 -1.0 1.0 3.0 5.0 7.0 9.0 11.0
A = log2(RG)/2
MN
orm
= M
- L
OW
ES
S(A
)
Analise de Dados de Microarranjos
128
Figura 41: Gráfico superior: Diagrama (A, M) e ajuste LOWESS (curva vermelha) para o conjunto de
dados da alga tratada com cobre. Gráfico inferior: Dados normalizados e cutoffs (cuvas azuis). Em
destaque (pontos lilás), valores representado spots com expressão diferenciada.
A-M Plot and LOWESS Fit
-14,0
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0
4,0
6,0
-5,0 -3,0 -1,0 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0
A = log2(RG)/2
M =
lo
g2
(R/G
)
Normalized Data and Cutoffs with 95% credibility
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0
4,0
6,0
-5,0 -3,0 -1,0 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0
A = log2(RG)/2
MN
orm
= M
- L
OW
ES
S(A
)
129
B. Listas de Genes Diferencialmente Expressos
Tabela 12: Lista de genes induzidos e reprimidos após tratamento com cádmio. É exibido também o
valor da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) com respectivo desvio-padrão. Valores
sem desvio padrão referem-se a genes que só tiveram uma única sonda analisada.
Cádmio Induzido Reprimido
Categoria Gene M Gene M
3-dehydroquinate synthase-300138 2.07 2-dehydro-3-deoxy-phosphoheptonate aldolase-200250
-0,58±0,41
asparaginase-200089 1.96±0.27 phosphoglycerate dehydrogenase-301590
-1,05±0,47
asparagine synthase-300449 0,43±0,28 phosphoglucomutase-301544 -0,72±0,39
aspartate aminotransferase 1-200007 0,72±0,48 acid phosphatase-300081 -0,92±0,59
aspartate aminotransferase 2-301375 0,56±0,35
aspartate aminotransferase 3-301378 0,35±0,43 dihydrolipoamide dehydrogenase-200245
1,09±0,92
methionine adenosyltransferase-200270
1,04±0,53
phosphatidyltransferase-200493 1,65±0,18
threonine dehydratase-301696 1,68±0,37 alcohol dehydrogenase transcription effector-300127
1,66±0,98
hydroxymethyltransferase-300712 0,19±0,47
ADP ATP carrier protein-200001 0,85±0,16
glucan 1 4-alpha-glucosidase-301510 1,25±0,43
leukotriene-A4 hydrolase-300133 2,01±0,21
protein disulphide isomerase-301658 1,10±0,33
protein disulphide isomerase-301659 0,58±0,12 methylenetetrahydrofolate reductase-300182
1,16±0,40
Metabolismo
4-(cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase-200344
1,01±0,87
surfeit protein 1-300184 1,02±0,39 phycoerythrin-associated linker protein 1-200042
-0,66±0,49 Energia
NADH dehydrogenase-301017 0,98±0,39 phycoerythrin-associated linker protein 2-301417
-0,76±0,16
Divisão celular
CCG1 protein-301807 1,02±0,36
Transcrição transformer 2 splicing factor-200022 0,98±0,93
40s ribosomal protein S4-300369 0,63±0,42 30S ribosomal protein S21-301962 -0,43±0,12
40S ribosomal protein S7-300156 1,74 60S ribosomal protein L26-300655 -1,19±0,61
methionyl aminopeptidase-200068 1,95±0,18 60S ribosomal protein L37-300782 -1,43±0,31 translation initiation factor 3 subunit 3-301611
1,34±0,73
Sintese de proteínas
translation initiation factor 3-301432 0,51±0,49
oligopeptidase B-300378 0,64±0,17 26S proteasome regulatory subunit p55-301555
-0,52±0,17 Proteolise
ubiquitin-fusion degradation protein-301624
1,68±0,15 exoenzymes regulatory protein-200094
-0,91±0,51
glutathione-regulated potassium-efflux system protein kefB-300202
1,97±0,04 urea transport protein-200253 -1,10±0,60 Transporte
sodium/sulfate symporter-300151 1,80 coatomer β-300239 -0,45±0,17
130
high-affinity nitrate transporter-200425
1,30±0,77
coatomer-200216 0,81±0,24
lipophorin receptor-200069 0,79±0,43
heat shock protein 70-1-300219 -1,23±0,52
heat shock protein 70-2-301647 -0,55±0,53 Defesa
heat shock protein 90-200400 -1,20±0,52
Homeostase iônica
leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein-300619
1,16±0,11
hypothetical protein-200177 0,67±0,31 hypothetical protein-200041 -1,10±0,29
hypothetical protein-200231 1,66±0,19 hypothetical protein-200276 -1,50±0,18
hypothetical protein-200366 0,43±0,20 hypothetical protein-200387 -1,30±0,63
hypothetical protein-200446 1,23±0,59 hypothetical protein-300042 -1,37±0,00
hypothetical protein-300051 2,41 hypothetical protein-300070 -0,65±0,48
hypothetical protein-300067 1,86 hypothetical protein-300074 -0,87±0,54
hypothetical protein-300117 1,27±1,00 hypothetical protein-300075 -0,85±0,69
hypothetical protein-300120 0,91±1,01 hypothetical protein-300197 -0,55±0,84
hypothetical protein-300143 1,69±0,23 hypothetical protein-300240 -0,44±0,15
hypothetical protein-300171 0,66±0,17 hypothetical protein-300624 -1,70±0,31
hypothetical protein-300432 0,38±0,57 hypothetical protein-300663 -0,62±0,37
hypothetical protein-300554 1,46±0,03 hypothetical protein-300669 -1,39±0,34
hypothetical protein-300563 2,03±0,03 hypothetical protein-300727 -1,73±0,12
hypothetical protein-300566 0,59±0,66 hypothetical protein-300740 -1,15±0,64
hypothetical protein-300567 0,95±0,11 hypothetical protein-300762 -1,10±0,10
hypothetical protein-300680 0,41±0,75 hypothetical protein-300775 -1,35±0,35
hypothetical protein-300854 0,82±0,23 hypothetical protein-300810 -1,23±0,45
hypothetical protein-301024 1,56±0,50 hypothetical protein-300816 -2,04±0,47
hypothetical protein-301636 1,77±0,04 hypothetical protein-300819 -1,55±0,86
hypothetical protein-301665 0,99±0,30 hypothetical protein-300829 -0,55±0,39
hypothetical protein-301763 1,38±0,87 hypothetical protein-300830 -1,69±0,16
hypothetical protein-301841 1,11±0,19 hypothetical protein-300864 -0,68±0,24
hypothetical protein-301920 0,55±0,29 hypothetical protein-301416 -0,71±0,03
hypothetical protein-301953 1,50±0,43 hypothetical protein-301477 -0,82±0,29
hypothetical protein-301486 -0,87±0,52
hypothetical protein-301547 -0,54±0,20
Hipotéticas
hypothetical protein-301890 -1,92±0,36
conserved hypothetical protein-200175
1,29±0,72 conserved hypothetical protein-200188
-0,92±0,22
conserved hypothetical protein-200324
1,06±0,52 conserved hypothetical protein-200248
-0,96±0,43
conserved hypothetical protein-300041
1,98±0,05 conserved hypothetical protein-300779
-1,13±0,95
conserved hypothetical protein-300047
2,21 conserved hypothetical protein-301653
-0,60±0,23
conserved hypothetical protein-300052
1,23±0,32
conserved hypothetical protein-301493
0,89±0,13
Hipotéticas Conservadas
conserved hypothetical protein-301790
1,98±0,10
proline-rich protein-300801 1,01±0,23 proline-rich protein-200077 -0,62±0,47 Sem classificação ou incerta proline-rich protein-300834 -1,03±0,32
transposase-200228 1,27±0,39 dentin sialophosphoprotein-200447 -0,80±0,23
warthog gene-200121 -0,99±0,81
Outros
GABA-A receptor epsilon-like -1,02±0,19
131
subunit-300887
Polyprotein A-300811 -0,81±0,29
polyprotein-301632 -1,79±0,40
Tabela 13: Lista de genes induzidos e reprimidos após tratamento com cobre, É exibido também o
valor da razão da expressão gênica M = log2(Tratado/Controle) com respectivo desvio-padrão, Valores
sem desvio padrão referem-se a genes que só tiveram uma única sonda analisada,
Cobre Induzido Reprimido
Categoria Genes M Genes M
beta-hydroxylase-301445 1,79±0,39 oxidoreductase-300707 -1,08±1,24
isoleucine--tRNA ligase-300765 1,04±0,74 2-dehydro-3-deoxy-phosphoheptonate aldolase-200250
-2,08±1,02
phosphatidyltransferase-200493 1,52±0,44 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase-300743
-0,51±1,65
phosphoglycerate dehydrogenase-300063
1,85 aspartate aminotransferase-301378 -1,66±1,23
proline synthetase associated protein-300746
0,75±0,36 phosphoglycerate dehydrogenase-301590
-2,65±0,86
O-linked GlcNAc transferase-300106 0,24±1,05 pseudouridine synthase-300694 -1,44±0,20
glucan 1 4-alpha-glucosidase-301510 1,67±0,37 O-linked N-acetylglucosamine transferase-300091
-1,61±0,70
glyoxylate reductase (NADP+)-300825
0,87±0,70 diphosphate--fructose-6-phosphate 1- phosphotransferase-301427
-1,51
Metabolismo
protein disulphide isomerase-301659 0,60±0,74
ATP synthase-301582 1,77±3,52 alternative oxidase-200189 -0,18±1,65
cytochrome b5 reductase-200017 2,17±0,00 NADH dehydrogenase-300611 -1,59±0,45
surfeit protein 1-300184 1,41±0,37 light-harvesting -200131 -0,97±0,77 fructose-bisphosphate aldolase-301575
1,88±0,49 light-harvesting complex I -200237 -1,19±1,09
malate dehydrogenase-200098 2,00±0,40 light-harvesting complex I α -200316 -1,49±0,22
light-harvesting protein I β-200423 -0,54±0,53
Energia
phycoerythrin-associated linker protein 2-301417
-0,34±0,50
calcium/calmodulin-dependent protein kinase-200037
0,26±1,54 cell division control protein 45-300556
-1,75±2,98 Divisão celular
chromatin assembly complex-300061 1,83 uracil-DNA N-glycosylase-301524 -1,10±1,19
zinc finger protein-300673 1,21±3,48 RNA-binding protein-200278 -1,58±0,59 RNA polymerase sigma factor A-300173
1,30±0,38 DNA-directed RNA polymerase III subunit 2-300092
-1,11±0,59
transcription factor-300165 1,69±0,20 DNA-directed RNA polymerase II second largest subunit-300246
-1,80±0,58
DNA binding protein-300878 0,97±1,12 RNA polymerase II CTD phosphatase-300720
-1,00±0,98
helicase-300555 1,26±0,61 transcription elongation factor TFIIS-300380
-1,42±0,81
transcription factor BTF3-300732 -0,04±1,97
Transcrição
RNA binding protein-300799 -1,37±0,24
multiple RNA binding domain-301846
0,70±1,15 30S ribosomal protein S21-301962 -1,12±0,32
translation initiation factor 2-300149 1,75±0,26 60S ribosomal protein L26-300655 -2,17±0,69
60S ribosomal protein L3-200394 -1,06±0,98 Sintese de proteínas
plastid 50S ribosomal protein L15-301865
-1,51±0,35
Proteolise exoenzymes regulatory protein-301492
1,93±0,00 peptidylprolyl isomerase A-300818 -2,68±0,29
132
peptidylprolyl isomerase-301898 -1,29±0,44
26S proteasome regulatory subunit p55-301555
-1,45±0,70
coatomer-200216 1,12±0,39 transporter-301542 -1,65±0,18
kinesin-related antigen-301901 3,00±0,24 sucrose transporter protein-200473 -2,87
integral membrane transporter protein-301401
-1,01±1,28
urea transport protein-200253 0,00±1,99
coatomer β -300239 -1,28±0,32
coatomer α-301916 -1,24±0,80
component of vesicle-mediated transport-200326
-1,15±0,79
Transporte
clathrin light chain-300699 -1,84±0,57
lipoxygenase-200043 0,69±1,10 peptide methionine sulfoxide reductase-301579
-2,00±0,95
thioredoxin-200110 -1,44±1,26
heat shock protein 70-200213 -1,16±0,64
heat shock protein 70-301647 -0,87±1,03
hemolysin-200023 -1,39±0,29
ascorbate peroxidase-200476 -1,68±0,10
Defesa
superoxide dismutase CuZn-200440 -1,20±0,39
Organização celular
mucin-300865 -0,39±1,16
hypothetcal protein-300736 0,97±1,25 hypothetical protein-200129 -1,26±1,75
hypothetical protein-200015 0,80±0,67 hypothetical protein-200135 -2,00±0,93
hypothetical protein-200040 0,56±0,46 hypothetical protein-200269 -1,77±0,91
hypothetical protein-200074 0,50±1,09 hypothetical protein-200352 -0,62±1,36
hypothetical protein-200112 0,49±1,53 hypothetical protein-200373 -0,68±0,99
hypothetical protein-200167 0,08±1,32 hypothetical protein-200421 -1,32±0,45
hypothetical protein-200177 0,64±0,56 hypothetical protein-200460 -1,08±0,84
hypothetical protein-200185 1,59 hypothetical protein-300095 -1,37±0,55
hypothetical protein-200231 1,02±0,55 hypothetical protein-300120 -0,62±1,62
hypothetical protein-200301 1,89±0,43 hypothetical protein-300143 -0,18±1,82
hypothetical protein-200383 2,98 hypothetical protein-300240 -0,91±0,79
hypothetical protein-200431 0,44±0,65 hypothetical protein-300242 -0,68±0,49
hypothetical protein-200466 1,81±0,12 hypothetical protein-300265 -0,19±1,92
hypothetical protein-200500 1,38±1,12 hypothetical protein-300289 -1,04±0,31
hypothetical protein-300049 1,75±0,25 hypothetical protein-300350 -1,50±1,08
hypothetical protein-300140 1,59±0,30 hypothetical protein-300367 -0,83±0,97
hypothetical protein-300142 1,75 hypothetical protein-300430 -0,99±0,66
hypothetical protein-300285 0,92±1,70 hypothetical protein-300440 -1,22±1,08
hypothetical protein-300365 0,51±0,51 hypothetical protein-300624 -1,50±0,66
hypothetical protein-300554 0,78±0,42 hypothetical protein-300663 -2,27±0,80
hypothetical protein-300559 1,06±0,34 hypothetical protein-300709 -2,00±0,39
hypothetical protein-300802 0,82±1,17 hypothetical protein-300717 -2,93±1,32
hypothetical protein-300815 1,03±0,90 hypothetical protein-300719 -1,45±0,59
hypothetical protein-300836 2,20 hypothetical protein-300737 -1,56±0,66
hypothetical protein-300855 0,16±0,55 hypothetical protein-300752 -1,76±0,44
hypothetical protein-300882 0,19±1,92 hypothetical protein-300762 -0,56±1,10
hypothetical protein-301023 2,39 hypothetical protein-300804 -1,38
hypothetical protein-301390 0,67±0,53 hypothetical protein-300809 -1,30±0,85
hypothetical protein-301400 5,15 hypothetical protein-300819 -2,42±1,07
hypothetical protein-301425 2,03 hypothetical protein-300827 -1,61±0,82
Hipotéticas
hypothetical protein-301473 1,83±0,25 hypothetical protein-300828 -1,00±1,79
133
hypothetical protein-301670 1,37±1,25 hypothetical protein-300829 -2,81±0,48
hypothetical protein-301682 1,56±0,39 hypothetical protein-300867 -1,76
hypothetical protein-300888 -1,54±0,46
hypothetical protein-300994 -1,27±0,11
hypothetical protein-301416 -0,66±0,61
hypothetical protein-301523 -1,47±0,87
hypothetical protein-301536 -1,81
hypothetical protein-301546 -0,83±0,64
hypothetical protein-301563 -1,02±0,30
hypothetical protein-301675 -1,00±1,54
hypothetical protein-301717 -1,27±1,13
hypothetical protein-301925 -1,18±0,34
conserved hypothetical protein-200324
2,73±1,76 conserved hypothetical protein-200175
-1,22±1,49
conserved hypothetical protein-300050
1,66±0,13 conserved hypothetical protein-200378
-1,22±0,75
conserved hypothetical protein-300052
1,36±0,39 conserved hypothetical protein-300224
-1,50±0,19
conserved hypothetical protein-300059
2,14±0,14 conserved hypothetical protein-300692
-1,92±0,06
conserved hypothetical protein-300148
1,67±0,38 conserved hypothetical protein-300777
-2,01±0,55
conserved hypothetical protein-300152
1,18±0,36 conserved hypothetical protein-301374
-1,65±1,27
conserved hypothetical protein-300890
2,58 conserved hypothetical protein-301539
-0,96±1,44
conserved hypothetical protein-301468
1,74±0,33 conserved hypothetical protein-301653
-0,73±0,58
conserved hypothetical protein-301469
1,66±0,21 conserved hypothetical protein-301666
-0,87±0,73
Hipotéticas Conservadas
conserved hypothetical protein-301912
1,75±0,06
proline-rich protein-300877 1,99±0,26 WD-40 repeat protein-301377 -1,92±0,52
proline-rich protein-301424 0,31±1,29 WD-repeat protein-300873 -2,38±1,04
proline-rich protein-301471 1,15±0,27 proline-rich protein-300834 -0,95±0,44
Sem classificação ou incerta
serine-rich protein-301638 1,52±0,35
cell wall surface anchor family protein-200377
0,71±0,23 cell wall surface anchor family protein-200429
-1,88±1,35
beta transducin-200061 0,58±1,71 GTP-binding protein-200201 -0,46±1,71
polyprotein-300811 -1,97±1,00
polyprotein-300833 -1,59±0,50
Outros
polyprotein-300859 -1,56±0,66
134
Referências Bibliográficas
Adhiya, J., X. H. Cai, et al. Binding of aqueous cadmium by the lyophilized biomass of
Chlamydomonas reinhardtii. Colloids and Surfaces a-Physicochemical and
Engineering Aspects, v.210, n.1, Oct 16, p.1-11. 2002.
Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Toxicological profile for
polychlorinated biphenyls (PCBs). Atlanta, GA. U.S. Department of Health and
Human Services, Public Health Service. 2000.
Altschul, S. F., T. L. Madden, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of
protein database search programs. Nucleic Acids Research, v.25, n.17, Sep 1, p.3389-
3402. 1997.
Andrade, L. R., M. Farina, et al. Effects of copper on Enteromorpha flexuosa (Chlorophyta)
in vitro. Ecotoxicol Environ Saf, v.58, n.1, May, p.117-25. 2004.
Armisen, R.; Gálatas, F. Production, properties and uses of agar. In Production and
utilization of from commercial seaweeds. Editor McHugh, D.J. FAO Fish. Tech. Pap.,
288, 1-57. 1987.
Baszynski, J. Superconductivity above 110-K in the Orthorhombic Phase of the Y-Ba-Cu-O
Ceramic Compounds. Journal of Applied Physics, v.63, n.8, Apr 15, p.4214-4214.
1988.
Becker, J. e E. A. Craig. Heat-Shock Proteins as Molecular Chaperones. European Journal of
Biochemistry, v.219, n.1-2, Jan 15, p.11-23. 1994.
Bergendi, L., L. Benes, et al. Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life
Sciences, v.65, n.18-19, Oct 1, p.1865-1874. 1999.
135
Bestwick, C. S., I. R. Brown, et al. Localization of hydrogen peroxide accumulation during
the hypersensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv phaseolicola.
Plant Cell, v.9, n.2, Feb, p.209-221. 1997.
Bieganowski, P., K. Shilinski, et al. Cdc123 and checkpoint forkhead associated with RING
proteins control the cell cycle by controlling eIF2 gamma abundance. Journal of
Biological Chemistry, v.279, n.43, Oct 22, p.44656-44666. 2004.
Bird, C. J. e E. L. Rice. Recent Approaches to the Taxonomy of the Gracilariaceae
(Gracilariales, Rhodophyta) and the Gracilaria-Verrucosa Problem. Hydrobiologia,
v.204, Sep 28, p.111-118. 1990.
Brazma, A., H. Parkinson, et al. ArrayExpress - a public repository for microarray gene
expression data at the EBI. Nucleic Acids Research, v.31, n.1, Jan 1, p.68-71. 2003.
Brezova, V., D. Dvoranova, et al. Photochemical properties of camptothecin in the presence
of copper(II) ions: The role of radicals as prospective species in photodynamic therapy,
v.37. 2007. 48-51 p. (Molecular Biotechnology)
Cai, X. H., J. Adhiya, et al. Heavy metal binding properties of wild type and transgenic algae
(Chlamydomonas sp.). New Developments in Marine Biotechnology, p.189-192. 1998.
Charrier, B., S. M. Coelho, et al. Development and physiology of the brown alga Ectocarpus
siliculosus: two centuries of research. New Phytologist, v.177, n.2, p.319-332. 2008.
Chiang Y.M. & Lin J.L. Nitrate uptake by nitrogen-starved plants of the red alga Gracilaria
tenuistipitata. J. Phycol. 37: 287-93. 1989.
Chomczynski, P. e N. Sacchi. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, v.162, n.1, Apr, p.156-9.
1987.
Clemens, S. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta, v.212,
n.4, Mar, p.475-486. 2001.
136
Cleveland, W. S. e S. J. Devlin. Locally Weighted Regression - an Approach to Regression-
Analysis by Local Fitting. Journal of the American Statistical Association, v.83, n.403,
Sep, p.596-610. 1988.
Cobbett, C. e P. Goldsbrough. Phytochelatins and metallothioneins: Roles in heavy metal
detoxification and homeostasis. Annual Review of Plant Biology, v.53, p.159-182.
2002.
Cobbett, C. S. Phytochelatin biosynthesis and function in heavy-metal detoxification. Current
Opinion in Plant Biology, v.3, n.3, Jun, p.211-216. 2000.
Collen, J., C. Herve, et al. Expression profiling of Chondrus crispus (Rhodophyta) after
exposure to methyl jasmonate. Journal of Experimental Botany, v.57, n.14, Nov,
p.3869-3881. 2006.
Collen, J., E. Pinto, et al. Induction of oxidative stress in the red macroalga Gracilaria
tenuistipitata by pollutant metals. Arch Environ Contam Toxicol, v.45, n.3, Oct,
p.337-42. 2003.
Conway, T. e G. K. Schoolnik. Microarray expression profiling: capturing a genome-wide
portrait of the transcriptome, v.47. 2003. 879-889 p. (Molecular Microbiology)
Craig, E. A., B. D. Gambill, et al. Heat-Shock Proteins - Molecular Chaperones of Protein
Biogenesis. Microbiological Reviews, v.57, n.2, Jun, p.402-414. 1993.
Crichtley, A.T. Gracilaria (Rhodophyta, Gracilariales): an economically important
agarophyte. In Seaweed cultivation and marine raching. Editores Ohno, M. &
Critchley, A.T. JICA, Yolosuka, Japan. 89-112. 1993.
Cui, X. e G. A. Churchill. Statistical tests for differential expression in cDNA microarray
experiments. Genome Biol, v.4, n.4, p.210. 2003.
137
Czaninski, Y., R. M. Sachot, et al. Cytochemical-Localization of Hydrogen-Peroxide in
Lignifying Cell-Walls. Annals of Botany, v.72, n.6, Dec, p.547-550. 1993.
Dancis, A., D. Haile, et al. The Saccharomyces cerevisiae copper transport protein (Ctr1p).
Biochemical characterization, regulation by copper, and physiologic role in copper
uptake. J Biol Chem, v.269, n.41, Oct 14, p.25660-7. 1994.
Daugherty, B. K. e K. T. Bird. Salinity and Temperature Effects on Agar Production from
Gracilaria-Verrucosa Strain-G-16. Aquaculture, v.75, n.1-2, Dec 1, p.105-113. 1988.
Davies, G., M. F. Elshazly, et al. Synthesis, X-Ray Crystal-Structure, and Properties of a
Tetranuclear Complex Formed by Oxidation of Copper(I) Chloride with Molecular
Dioxygen in N-Methylpyrrolidin-2-One - Isolation of a Catalyst for Oxidative
Coupling of Phenols by Dioxygen. Journal of the Chemical Society-Chemical
Communications, n.23, p.1045-1046. 1978.
Dizdaroglu, M. Chemical Determination of Free Radical-Induced Damage to DNA. Free
Radical Biology and Medicine, v.10, n.3-4, p.225-242. 1991.
Duckwort.M, K. C. Hong, et al. Agar Polysaccharides of Gracilaria Species. Carbohydrate
Research, v.18, n.1, p.1-&. 1971.
Dudoit, S., Y. H. Yang, et al. Statistical methods for identifying differentially expressed genes
in replicated cDNA microarray experiments. Statistica Sinica, v.12, n.1, Jan, p.111-
139. 2002.
Edwards, P. Ilustrated guide to sea weeds and sea grasses, in the vicinity of Porto Aransas,
Austin, Texas. Contr. Mar. Sc., v. 15, 1-228. 1970.
Eng, B. H., M. L. Guerinot, et al. Sequence analyses and phylogenetic characterization of the
ZIP family of metal ion transport proteins. Journal of Membrane Biology, v.166, n.1,
Nov 1, p.1-7. 1998.
138
Falcao, V. D. R., A. P. Tonon, et al. RNA Isolation method for polysaccharide rich algae:
agar producing Gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta). Journal of Applied Phycology,
v.20, n.1, Feb, p.9-12. 2008.
Farmer, E. E. e C. A. Ryan. Octadecanoid Precursors of Jasmonic Acid Activate the Synthesis
of Wound-Inducible Proteinase-Inhibitors. Plant Cell, v.4, n.2, Feb, p.129-134. 1992.
Fridovich, I. Biological Effects of the Superoxide Radical. Archives of Biochemistry and
Biophysics, v.247, n.1, May 15, p.1-11. 1986.
Gehrig, H. H., K. Winter, et al. An improved RNA isolation method for succulent plant
species rich in polyphenols and polysaccharides. Plant Molecular Biology Reporter,
v.18, n.4, p.369-376. 2000.
Gharieb, M. M. Pattern of cadmium accumulation and essential cations during growth of
cadmium-tolerant fungi. Biometals, v.14, n.2, Jun, p.143-151. 2001.
Gledhill, M., M. Nimmo, et al. The toxicity of copper(II) species to marine algae, with
particular reference to macroalgae. Journal of Phycology, v.33, n.1, Feb, p.2-11. 1997.
Graham, L.E.; Wilcox, L.W. Algae. Prentice Hall. 2000.
Grotz, N., T. Fox, et al. Identification of a family of zinc transporter genes from Arabidopsis
that respond to zinc deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, v.95, n.12, Jun 9, p.7220-7224. 1998.
Guerinot, M. L. The ZIP family of metal transporters. Biochim Biophys Acta, v.1465, n.1-2,
May 1, p.190-8. 2000.
Haglund, K. e M. Pedersen. Outdoor Pond Cultivation of the Subtropical Marine Red Alga
Gracilaria-Tenuistipitata in Brackish-Water in Sweden - Growth, Nutrient-Uptake,
Cocultivation with Rainbow-Trout and Epiphyte Control. Journal of Applied
Phycology, v.5, n.3, Jun, p.271-284. 1993.
139
Halliwell, B., Gutteridge, J.M. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford. 4ª edição.
2007.
Hancock, J. T., R. Desikan, et al. Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways.
Biochemical Society Transactions, v.29, May, p.345-350. 2001.
Himelblau, E. e R. M. Amasino. Delivering copper within plant cells. Current Opinion in
Plant Biology, v.3, n.3, Jun, p.205-210. 2000.
Hirschi, K. D., V. D. Korenkov, et al. Expression of arabidopsis CAX2 in tobacco. Altered
metal accumulation and increased manganese tolerance. Plant Physiol, v.124, n.1, Sep,
p.125-33. 2000.
Hu, S. X., C. H. Tang, et al. Cadmium accumulation by several seaweeds. Science of the
Total Environment, v.187, n.2, Aug 30, p.65-71. 1996.
Imlay, J. A. e S. Linn. DNA Damage and Oxygen Radical Toxicity. Science, v.240, n.4857,
Jun 3, p.1302-1309. 1988.
Izumi, K. Chemical heterogeneity of the agar from Gracilaria verrucosa. J Biochem, v.72, n.1,
Jul, p.135-40. 1972.
Jamieson, D. Saving sulfur. Nat Genet, v.31, n.3, Jul, p.228-30. 2002.
Jiang, R. F., D. Y. Ma, et al. Cadmium hyperaccumulation protects Thlaspi caerulescens from
leaf feeding damage by thrips (Frankliniella occidentalis). New Phytologist, v.167, n.3,
Sep, p.805-813. 2005.
Kiang, J. G. e G. C. Tsokos. Heat shock protein 70 kDa: Molecular biology, biochemistry,
and physiology. Pharmacology & Therapeutics, v.80, n.2, Nov, p.183-201. 1998.
Kupper, H., A. Parameswaran, et al. Cadmium-induced inhibition of photosynthesis and long-
term acclimation to cadmium stress in the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens.
New Phytologist, v.175, n.4, p.655-674. 2007.
140
Kurdziel, B.M.; Prasad, M.N.V.; Strzalka, K. Photosynthesis in heavy metal stressed plants.
In: Prasad, M.N.V. Heavy metal stress in plants: From biomolecules to ecosystems.
2nd ed. Springer. India. 146-181. 2004.
Le Bail, A., S. M. Dittami, et al. Normalisation genes for expression analyses in the brown
alga model Ectocarpus siliculosus. Bmc Molecular Biology, v.9, Aug 18, p.-. 2008.
Lee, T. M., Y. C. Chang, et al. Differences in physiological responses between winter and
summer Gracilaria tenuistipitata (Gigartinales, Rhodophyta) to varying temperature.
Botanical Bulletin of Academia Sinica, v.40, n.1, Jan, p.93-100. 1999.
Lluisma, A. O. e M. A. Ragan. Expressed sequence tags (ESTs) from the marine red alga
Gracilaria gracilis. Journal of Applied Phycology, v.9, n.3, p.287-293. 1997.
Lockhart, D. J. e E. A. Winzeler. Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature, v.405,
n.6788, Jun 15, p.827-836. 2000.
Lopes, N. P., M. J. Kato, et al. Circadian and seasonal variation in the essential oil from
Virola surinamensis leaves. Phytochemistry, v.46, n.4, Oct, p.689-693. 1997.
Lopes, P.F. Caracterização Bioquímica e regulação da Nitrato Redutase na Macroalga
Marinha G. tenuistipitata. Tese de Doutorado. Instituto de Química da Universidade
de São Paulo. 2001.
Lopes, P. F., M. C. De Oliveira, et al. Characterization and daily variation of nitrate reductase
in Gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta). Biochemical and Biophysical Research
Communications, v.295, n.1, Jul 5, p.50-54. 2002.
Losch, R. Plant mitochondrial respiration under the influence of heavy metals. In: Prasad,
M.N.V. Heavy metal stress in plants: From biomolecules to ecosystems. 2nd ed.
Springer, India, 2004. 182-200. 2004.
141
Lunec, J., K. A. Holloway, et al. Urinary 8-oxo-2 '-deoxyguanosine: Redox regulation of
DNA repair in vivo? Free Radical Biology and Medicine, v.33, n.7, Oct 1, p.875-885.
2002.
Macchiavello, J., R. Saito, et al. A comparative analysis of agarans from commercial species
of Gracilaria (Gracilariales, Rhodophyta) grown in vitro. Hydrobiologia, v.399, Apr 1,
p.397-400. 1999.
McHugh, D.J. Worldwide distribution of commercial resources of seaweeds including
Gelidium. In International Worshop on Gelidium. Editores Juanes, J.A.; Santelices, B.
& McLachlan, J.L. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 10-29. 1991.
Markossian, K. A. e B. I. Kurganov. Copper chaperones, intracellular copper trafficking
proteins. Function, structure, and mechanism of action. Biochemistry-Moscow, v.68,
n.8, Aug, p.827-837. 2003.
Marques, M. J., E. Martinez-Conde, et al. Heavy metals pollution of aquatic ecosystems in the
vicinity of a recently closed underground lead-zinc mine (Basque Country, Spain).
Environmental Geology, v.40, n.9, Aug, p.1125-1137. 2001.
Materazzi, S., S. Aquili, et al. Biomimetic complexes: thermal stability, kinetic study and
decomposition mechanism of Co(II)-, Ni(II)- and Cu(II)-4(5)-hydroxymethyl-5(4)-
methylimidazole complexes. Thermochimica Acta, v.421, n.1-2, Nov 1, p.19-24. 2004.
Mf, C. Gracliaria (Rhodophyta, Gracilariales): an economically important agarophyte. . Japan:
JICA. 1993. 89-112 p. (Ohno M & Critchley)
Michiels, C., M. Raes, et al. Importance of Se-Glutathione Peroxidase, Catalase, and Cu/Zn-
Sod for Cell-Survival against Oxidative Stress. Free Radical Biology and Medicine,
v.17, n.3, Sep, p.235-248. 1994.
Miranda, G.E. Avaliação do Impacto da Explotação (simulada) da Alga Agarófita Gracilaria
caudata J. Agardh no litoral do Estado da Paraíba. Dissertação de Mestrado. Instituto
de Biologia da Universidade de São Paulo. 2000.
142
Nadon, R. e J. Shoemaker. Statistical issues with microarrays: processing and analysis. Trends
Genet, v.18, n.5, May, p.265-71. 2002.
Neto, A.M. Efeito de Poluentes Metálicos nos Níveis de Pigmentos Fotossintéticos Presentes
em Algas marinhas e Avaliação do Papel Estrutural de Carotenos em Membranas
Miméticas. Tese de Doutorado. Instituto de Química da Universidades de São Paulo.
2008.
Nikaido, I., E. Asamizu, et al. Generation of 10,154 expressed sequence tags from a leafy
gametophyte of a marine red alga, Porphyra yezoensis. DNA Research, v.7, n.3, Jun
30, p.223-227. 2000.
Nordberg, J. e E. S. J. Arner. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian
thioredoxin system. Free Radical Biology and Medicine, v.31, n.11, Dec 1, p.1287-
1312. 2001.
Nriagu, J. O. e J. M. Pacyna. Quantitative assessment of worldwide contamination of air,
water and soils by trace metals. Nature, v.333, n.6169, May 12, p.134-9. 1988.
Nyvall, P., J. Pelloux, et al. Purification and characterisation of a novel starch synthase
selective for uridine 5 '-diphosphate glucose from the red alga Gracilaria tenuistipitata.
Planta, v.209, n.1, Jul, p.143-152. 1999.
Ohta, J., Y. H. Kwon, et al. Cysteine dioxygenase and gamma-glutamylcysteine synthetase
activities in primary cultured hepatocytes respond to sulfur amino acid
supplementation in a reciprocal manner. Amino Acids, v.19, n.3-4, p.705-728. 2000.
Oliveira. The seaweed resources of Brazil. In Seaweed of the world. Editores Critchley, A.T.
& Ohno, M. Japan International Cooperation Agency, Yokosuka. 366-371. 1997.
Oliveira, E.C. Algas marinhas bentônicas do Brasil. Tese de Livre-Docência. Universidade de
São Paulo. 1977.
143
Parchmann, S., H. Gundlach, et al. Induction of 12-oxo-phytodienoic acid in wounded plants
and elicited plant cell cultures. Plant Physiology, v.115, n.3, Nov, p.1057-1064. 1997.
Pashalidis, S., L. M. Moreira, et al. Whole-genome expression profiling of Xylella fastidiosa
in response to growth on glucose. Omics, v.9, n.1, Spring, p.77-90. 2005.
Perfus-Barbeoch, L., N. Leonhardt, et al. Heavy metal toxicity: cadmium permeates through
calcium channels and disturbs the plant water status. Plant Journal, v.32, n.4, Nov,
p.539-548. 2002.
Pietrini, F., M. A. Iannelli, et al. Interaction of cadmium with glutathione and photosynthesis
in developing leaves and chloroplasts of Phragmites australis (Cav.) Trin. ex steudel.
Plant Physiology, v.133, n.2, Oct, p.829-837. 2003.
Pinto, E., T. C. S. Sigaud-Kutner, et al. Heavy metal-induced oxidative stress in algae. Journal
of Phycology, v.39, n.6, Dec, p.1008-1018. 2003.
Plastino, E. M. e E. C. Oliveira. Approaches to the identification of terete Brazilian
Gracilariaceae (Gracilariales, Rhodophyta). Hydrobiologia, v.327, Jul 26, p.145-148.
1996.
Pueschel. Cell Structure In Biology of Red Algae. Cambridge: Cambridge University Press.
1990. 7-41 p.
Radisky, D. e J. Kaplan. Regulation of transition metal transport across the yeast plasma
membrane. Journal of Biological Chemistry, v.274, n.8, Feb 19, p.4481-4484. 1999.
Rauser, W. E. Phytochelatins and Related Peptides - Structure, Biosynthesis, and Function.
Plant Physiology, v.109, n.4, Dec, p.1141-1149. 1995.
Ritter, A., S. Goulitquer, et al. Copper stress induces biosynthesis of octadecanoid and
eicosanoid oxygenated derivatives in the brown algal kelp Laminaria digitata. New
Phytologist, v.180, n.4, p.809-821. 2008.
144
Rubinelli, P., S. Siripornadulsil, et al. Cadmium- and iron-stress-inducible gene expression in
the green alga Chlamydomonas reinhardtii: evidence for H43 protein function in iron
assimilation. Planta, v.215, n.1, May, p.1-13. 2002.
Ryter, S. W. e R. M. Tyrrell. Singlet molecular oxygen (O-1(2)): A possible effector of
eukaryotic gene expression. Free Radical Biology and Medicine, v.24, n.9, Jun,
p.1520-1534. 1998.
Sambrook, J.; Fritch, E.F. & Maniats, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Segunda
edição, Cold Sring Harbor Laboratory Press. 1989.
Sancenon, V., S. Puig, et al. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis
thaliana. Plant Mol Biol, v.51, n.4, Mar, p.577-87. 2003.
Santelices, B. e M. S. Doty. A Review of Gracilaria Farming. Aquaculture, v.78, n.2, May,
p.95-133. 1989.
Schena, M., R. A. Heller, et al. Microarrays: biotechnology's discovery platform for
functional genomics. Trends in Biotechnology, v.16, n.7, Jul, p.301-306. 1998.
Schulze, A. e J. Downward. Navigating gene expression using microarrays--a technology
review. Nat Cell Biol, v.3, n.8, Aug, p.E190-5. 2001.
Shaw, J. R., T. D. Dempsey, et al. Comparative toxicity of cadmium, zinc, and mixtures of
cadmium and zinc to daphnids. Environmental Toxicology and Chemistry, v.25, n.1,
Jan, p.182-189. 2006.
Shioda, M. e K. Murakamimurofushi. Selective-Inhibition of DNA Polymerase-Alpha by a
Polysaccharide Purified from Slime of Physarum-Polycephalum. Biochemical and
Biophysical Research Communications, v.146, n.1, Jul 15, p.61-66. 1987.
Sies, H. Strategies of Antioxidant Defense. European Journal of Biochemistry, v.215, n.2, Jul
15, p.213-219. 1993.
145
Sies, H. e P. Graf. Hepatic Thiol and Glutathione Efflux under the Influence of Vasopressin,
Phenylephrine and Adrenaline. Biochemical Journal, v.226, n.2, p.545-549. 1985.
Stohs, S. J. e D. Bagchi. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions. Free Radic Biol
Med, v.18, n.2, Feb, p.321-36. 1995.
Sun, L. J. e Z. J. Chen. The novel functions of ubiquitination in signaling. Current Opinion in
Cell Biology, v.16, n.2, Apr, p.119-126. 2004.
Sutherland, M. W. The Generation of Oxygen Radicals during Host Plant-Responses to
Infection. Physiological and Molecular Plant Pathology, v.39, n.2, Aug, p.79-93. 1991.
Tanabe, S. A Need for Reevaluation of Pcb Toxicity. Marine Pollution Bulletin, v.20, n.6, Jun,
p.247-248. 1989.
Torres, M. A., M. P. Barros, et al. Biochemical biomarkers in algae and marine pollution: A
review. Ecotoxicology and Environmental Safety, v.71, n.1, Sep, p.1-15. 2008.
Trevors, J. T., G. W. Stratton, et al. Cadmium Transport, Resistance, and Toxicity in Bacteria,
Algae, and Fungi. Canadian Journal of Microbiology, v.32, n.6, Jun, p.447-464. 1986.
Tschiersch, H. e E. Ohmann. Photoinhibition in Euglena-Gracilis - Involvement of Reactive
Oxygen Species. Planta, v.191, n.3, Aug, p.316-323. 1993.
Tu, Y., G. Stolovitzky, et al. Quantitative noise analysis for gene expression microarray
experiments. Proc Natl Acad Sci U S A, v.99, n.22, Oct 29, p.14031-6. 2002.
Vencio, R. Z. e T. Koide. HTself: self-self based statistical test for low replication microarray
studies. DNA Res, v.12, n.3, p.211-4. 2005.
Voet, D.; Voet, J.G.; Pratt, C.W. Fundamentos de Bioquímica. ARTMED. 2002.
146
Wang, C., Z. Shen, et al. Heavy metal contamination of agricultural soils and stream
sediments near a copper mine in Tongling, People's Republic of China. Bulletin of
Environmental Contamination and Toxicology, v.73, n.5, Nov, p.862-869. 2004.
Williams, G. V. M., D. J. Pringle, et al. Contrasting oxygen and copper isotope effects in
YBa2Cu4O8 superconducting and normal states. Physical Review B, v.61, n.14, Apr 1,
p.R9257-R9260. 2000.
Wolf, M., W. El-Rifai, et al. Novel findings in gene expression detected in human
osteosarcoma by cDNA microarray. Cancer Genetics and Cytogenetics, v.123, n.2,
Dec, p.128-132. 2000.
Wong, K. Y., M. Q. Zhang, et al. A luminescence-based scanning respirometer for heavy
metal toxicity monitoring. Biosensors & Bioelectronics, v.12, n.2, p.125-133. 1997.
Yang, Y. H., S. Dudoit, et al. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite
method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res,
v.30, n.4, Feb 15, p.e15. 2002.
Yruela, I., M. Alfonso, et al. Copper effect on the protein composition of photosystem II.
Physiologia Plantarum, v.110, n.4, Dec, p.551-557. 2000.
Zhou, J. M. e P. B. Goldsbrough. Structure, Organization and Expression of the
Metallothionein Gene Family in Arabidopsis. Molecular & General Genetics, v.248,
n.3, Aug 21, p.318-328. 1995.
147
Súmula Curricular
Angela Pedroso Tonon
Nascimento: 26/03/1978
Nacionalidade: Brasileira
Cidade: Barretos
E-mail: [email protected]
1. Formação Acadêmica
Colégio Soares de Oliveira, Barretos, SP, 1996
1997-2000. Bacharelado em Ciências Biológicas – Universidade Paulista Julio de Mesquita
Filho – UNESP/São José do Rio Preto.
1999-2000. Iniciação Científica: Diversidades alélica da proteína MSP-2 – CNPq.
2001-2003. Mestrado em Parasitologia- Depto. De Parasitologia - ICB/USP – FAPESP
Projeto: Diversidade alélica e reconhecimento imune da proteína de superfície de merozoitos
2 (MSP-2), na Amazônia brasileira.
2. Estágio no Exterior
Station Biologique de Roscoff (CNRS-UPMC/Paris VI), França. Laboratório : “Marine Plants
and Biomolecules”.
Doutorado Sanduíche 10/06/2008- 26/12/2009 (FAPESP)
Projeto : “Diferença na expressão de 10 genes, envolvidos na adaptação de Chondrus cripus e
Gracilaria tenuistipitata submetidas a extresses ao cádmio e cobre”. As metodologias
utilizadas foram: Curva de crescimento para C. cripus realizada para cádmio e cobre; PCR em
tempo real utilizado para as duas espécies, identificação por microscopia eletrônica de H2O2
pela precipitação com cloreto de cério.
Resposável: Dra. Catherine Boyen e Dr. Jonas Collén.
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3. Publicações
Cardozo, K. H. M., T. Guaratini, A.P., Tonon, et al. Metabolites from algae with economical impact. Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology, v.146, n.1-2, Jul-Aug, p.60-78. 2007. Falcao, V. D. R., A. P. Tonon, et al. RNA Isolation method for polysaccharide rich algae: agar producing Gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta). Journal of Applied Phycology, v.20, n.1, Feb, p.9-12. 2008. Ferreira, M. U., A.P. Tonon., et al. Sequence diversity and evolution of the malaria vaccine candidate merozoite surface protein-1 (MSP-1) of Plasmodium falciparum. Gene, v.304, Jan 30, p.65-75. 2003. Hoffmann, E. H. E., L. A. Da Silveira, A.P. Tonon., et al. Geographical patterns of allelic diversity in the Plasmodium falciparum malaria-vaccine candidate, merozoite surface protein-2. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, v.95, n.2, Mar, p.117-132. 2001. Marrelli, M. T., A.P. Tonon., L. F. Souza, et al. Taxonomic and phylogenetic relationships between Neotropical species of ticks from genus Amblyomma (Acari : Ixodidae) inferred from second internal transcribed spacer sequences of rDNA. Journal of Medical Entomology, v.44, n.2, Mar, p.222-228. 2007. Tonon, A. P., E. H. E. Hoffmann, et al. Plasmodium falciparum: sequence diversity and antibody recognition of the Merozoite surface protein-2 (MSP-2) in Brazilian Amazonia. Experimental Parasitology, v.108, n.3-4, Nov-Dec, p.114-125. 2004. Carvalho A., Cardozo, K. H. M., T. Guaratini., A.P. Tonon, et al. Circadian Protection Against Oxidative Stress in Marine Algae. Hypnos, v.1, p.142 - 157, 2004. Brienze W.V., A.P. Tonon., F. Pereira , M.U. Ferreira, et al. Low sensitivity of polymerase chain reaction for diagnosis of tuberculous meningitis in southeastern Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.34, p.389 - 393, 2001.
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