Állatkísérletek azOrvostudományban

Sebészeti Műtéttani IntézetSZTE ÁOK graduális oktatás 2013 -2014 / 1

Életjelenségek speciális vizsgálómódszerei

Dr. Kaszaki József

Mitől függ a perctérfogat?

Előterhelés(Preload)

Utóterhelés(Afterload)

KontraktilitásdP/dTmax

Szívfrekvencia

CVP Perifériás érellenállás

SVR

Oxigén szállítás (DO2) Oxigén fogyasztás (VO2)

1. A perctérfogatból számolhatótovábbi paraméterek

Feltétel: Az artériás és vénás oxigén szaturáció meghatározása

Oxigénnel telített hemoglobin százalékos aránya a vérben

95-100 %70-80 %

Periféria

DO2 : a keringés által szállított oxygénmennyiség

Összetevői: ■ Oxygén tartalom

a. Hemoglobin (Hb)b. Szaturáció (SO2); a teljesen szaturált

hemoglobin 1.38 ml oxygént szállít (per gram)

■ Perctérfogat (C.O.)

DO2 [ml/min] = CO x [(1,38 x Hb x SaO2) + (0,003 x paO2)]

Oxygen szállítás (DO2)

Oxigén fogyasztás (consumption; VO2)

Oxigén szállítás (delivery; DO2)

Body/Organs

Oxigén fogyasztás = perctérfogat x (artériás – vénásoxigén tartalom)

VO2 [ml/min] = CO x 1,38 x Hb x (SaO2-SvO2)

Ha a Hgb, CO és az A/V szaturáció ismert, a VO2 kiszámítható anélkül, hogy a PO2 értéket ismernénk (oldott O2 = általában a teljes O2 tartalom < 0.3 Vol%-a):

2. Kis vérköri nyomás monitorozásPulmonális artéria nyomás

Pulmonary artery

Pulmonális artéria katéterezés– Swan Ganz katéterrel

Sárga: PA nyomásKék: CVP és injektálásFehér: termisztor kábelPiros: katétervég ballon felfújás

A Swan Ganz katéter pozíciója ajobb szívfélben

Artéria pulmonális nyomás és az ék (wedge)nyomás görbéje

Pulmonalis kapilláris éknyomás:

Hemodinamikailag a bal kamra preloadjárautal, de a mérése körüli bizonytalanságok és a számos befolyásoló tényező miatt a volumenstátus megítélésére csak fenntartásokkal alkalmazható

3. A véráramlás mérése

Elektromágneses áramlásmérés

Ultrahangos flowmérés

Laser-Doppler flowmérés

Transonic ultrahangos véráramlás mérőkészülék és perivaszkuláris áramlás érzékelő

szenzorok.

Lokális véráramlás mérés

Lokális véráramlás mérés

4. A gasztrointesztinális (GI) traktus vizsgáló módszerei

Furness, The Enteric Nervous System, 2008. nyomán

A bélidegrendszer szerveződéseMyentericus plexus

Körkörös izomréteg

Hosszantiizomréteg

Nyálkahártya

Muscularis mucosae

Submucosus plexus

Myentericus plexus

Körkörös izomréteg

Hosszantiizomréteg

Nyálkahártya

Muscularis mucosae

Submucosus plexus

Az GI traktus szekretoros, abszorpciós és motilitási funkcióinak szabályozásáért és összehangolásáért felelős struktúra a bélidegrendszer. A bélidegrendszert több kisebb, nem ganglionált, és két nagyobb, ganglionált plexus építi fel. Ezek a nyálkahártya és a körkörös izomréteg között elhelyezkedő submucosus plexus(Meissner-plexus), valamint a körkörös és hosszanti izomrétegek között található myentericus plexus (Auerbach-plexus). A bélidegrendszer önállóreflexívekkel rendelkezik, s a központi idegrendszertől való nagyfokúfüggetlenség jellemzi.

Lassú hullám Spikes

4.1. A tápcsatorna simaizomzat elektromos aktivitása

A GI kontrakciók ritmusát a simaizom membránban képződő potenciál változás, a lassú hullámok (slow waves) frekvenciája határozza meg, amelyek nem tekinthetők akciós potenciálnak.

A GI SIMAIZOM MOTOROS AKTIVITÁSA1. Izom kontrakció csak akciós potenciál (AP) megjelenésekor történik

2. Az AP (sorozat) gyakoriságát a lassú hullámok frekvenciája szabja meg

3. A kontrakciók ereje az AP sorozat frekvenciájától függ

GI motilitás monitorozás I.A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő

bélyeg (strain gauge) szenzorral

Strain gaugeszenzor

Computer

V. jugularis

Infúzió

FSG-02 Force/displacement transducer for implantable

GI motilitás monitorozás I.A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő

bélyeg (strain gauge) szenzorral

sec

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

V

-6

-4

-2

0

2

4

6

Original recording of colon motility in rat

GI motilitás monitorozás II.Elektro-Miográfia (EMG)

A bélizomzat elektromos aktivitásának mérése extracellularis szenzorral

Extracellularsensor

Computer

V. jugularis

Infúzió

Ag/AgCl extracellularis szenzor

Szenzor típusok

testfelszíni miográfiás szenzor bélfalba implantált szenzor

Kísérleti elrendezés

testfelszíni miográfiás szenzortestfelszíni miográfiás szenzorbélfalba implantált szenzor(1 vagy 2 pár elektródával) bélfalba implantált szenzor(1 vagy 2 pár elektródával)

Elektrointesztinográfia

Mérés éber állaton. A szenzort a nyakon ejtett nyíláson át vezetjük ki, melyet az állat nem tud lerágni.

eseményFelvétel: 0,01 – 0,5 Hz

A jel:

Gyomor

Vastagbél

Vékonybél

PS: power spectrum, MA2

MA: a PS-hez tarozó legnagyobb magasság érték

Vékonybél spektrumok egy bélischaemia-reperfúziós állatból

AUC - bevarrt

0

50

100

150

200

250

300

350

baseline Ischemia1 Ischemia2 Reperfuzio1 Reperfuzio2

Sham-opIRIR+Met

Görbe alatti területek összehasonlítása

4.2. Az intesztinális permeábilitásvizsgáló módszerei

• Gravimetriás analízis• Kapilláris permeabilitás• Epitheliális permeabilitás

Gravimetriaszövet mintavétel;Nedves-súly méréseSzárítás súlyállandóságig, majd száraz-súly mérés

Nedves / Száraz súly = ödéma becslése

*

* P<0.05

*

Intact region ofthe esophagus

Treated region ofthe esophagus

*

0

0

0

0

0

1

1

1

HCl+bile

*Saline

Bile*x x

Vascular permeability index

Fig. 2

HCl

Vasculáris/kapilláris permeabilitás

Intravénás befecskendezésPermeábilitás fokozódás esetén, a festék-fehérje komplex a szövetekbe jut;A komplex kimosása az erekből;A festék extrahálása a szövetből, formamid-dal;Evans kék spektrofotometriás meghatározása a vérből és a szövetből;

Meghatározása:Evans kék (EB) festékkel, amely a plazma fehérjékhez

kötődik

Permeabilitási index = EB szövetEB plazma

Time (min)180 190 200 210 220 230 240

Plasma-Na fluorescein/lumen-Na fluorescein kg-1 x 104

0

2

4

6

8

10

HCl+bile

Saline

Bile

x

**

**

*

**

x xxx

xx

x

x

x* *

**x

x

Fig. 3

* ** *

x x

xxHCl

“lumen - plazma” irányú permeábilitás változás mérése Na-fluoreszcein (NaFL) clearence

módszerrel

“lumen - plazma” NaFl clearence =plazma NaFL / lumen NaFL

Epitheliális permeabilitás

• 5 mg/ml NaFL beadása a vizsgálandóGI lumenbe;• Vénás vérminta vétel 10 percenként (a minta tárolása sötétben);• A NaFL koncentráció meghatározása spektroflurométerrel (ex: 455 nm, em: 515 nm);

5. Képalkotó vizsgálómódszerek a mikrokeringés in

vivo monitorozására

• Arteriolák, kapillárisok, venulák hálózata (érátmérő <100 μm)• Legfőbb szerepe az oxigén átadása a szöveteknek• Struktúrája, funkciója nem egységes – szervenként eltérő• Központi szerepet játszik a véralvadási, immunológiai

folyamatokban

• A mikrokeringést meghatározó tényezők:– Beáramlási nyomás (driving pressure)– Az arteriolák tónusa és átmérője– Hemorheológiai paraméterek (viszkozitás)Együttvéve: kapillárisok nyitottsága (patency)

• A mikroperfúzió szabályozása:– Miogén (erő-mechanikai hatások)– Metabolikus (O2, CO2, laktát, H+)– Neurohumorális (NO, endothelin,

katekolaminok, stb.)

A mikrokeringés fiziológiája

REOXIGENIZÁCIÓ

REPERFÚZIÓ

HIPOXIA

ISCHAEMIA

„NO-REFLOW”jelenség

MIKROKERINGÉSI ELÉGTEENSÉG

KERINGÉSI SHOCK

MiMikkrorokeringkeringééss didisszzfunfunkkcicióó

Vörösvértestek

Deformabilitás,Aggregáció

O2 transport zavar

Koaguláció

Endogénantikoagulánsok ↓Mikrovaszkuláris

trombózis

Leukocita aktiváció

Adhézió,Cytokinek,

ROS

Endothel Diszfunkció

Barrier,Koaguláció,

Regulációs zavar

Autoregulácios diszfunkció

Mikrocirkulációs shunt Oxigén ellátás-igény mismatch

Hypoxia

Celluláris Distress

Mitochondrium diszfunkcióApoptózis

Szervielégtelenség

A mikroperfúzió monitorozásának eszközeiés jellegzetességei

A A mikrocirkulmikrocirkuláácicióó monitorozmonitorozáása sa

LLéézer Doppler zer Doppler ááramlramláásmsméérrőő

OPS/SDFOPS/SDFkkéépalkotpalkotááss

NIRSNIRS

FluorescenceFluorescencequencingquencing

microscopymicroscopy

MikrogyMikrogyööngyngytechniktechnikáákk

MRIMRI

Áramlás

Áramlás

Oxigenizáció,Áramlás

Oxigenizáció,Perfúzió

Oxigéntenzió

Perfúzió,Áramlási sebesség

„„SidestreamSidestream Dark FieldDark Field””„„SDFSDF””::

az OPS tovaz OPS továábbfejlesztett bbfejlesztett verziverzióójaja

Ince C (2005) Crit Care 9:S13-S19Groner W. Nature Med (1999) 5:1209-1212

OrthogonOrthogonáálislis PolarizPolarizáácicióós s SpectrSpectráálislis kkéépalkotpalkotáás s

””OPSOPS””

Hol alkalmazható?Csak vékony, epithel réteggel fedett struktúrák esetén alkalmazható,amelyek átvilágításához elegendő a szövet mélyéről visszaérkező depolarizált fény - amely hátulról világítja meg a felszín alatti struktúrákat.

1. Ideális, nem invazív alkalmazási terület: a sublinguális régió

A A sszzublingualublingualisis mimikkrocirrocirkkululáácciióó kklinilinikkaaiijelentjelentőősséégege

Pentobarbital anaesthesia OPS mikrokeringésvizsgálat

Vérnyomás szenzor

Intestinalis tonométer CVP katéter

Transzpulmonálisperctérfogat mérés

Sublingualis tonométer

Artériás kanül

Sublinguális vs intesztinális tonometriaSublinguális tonometria vs OPS videomikroszkópia

A nyelv alatti mucosa mikrokeringA nyelv alatti mucosa mikrokeringéésesekontroll kontroll áállapotbanllapotban

A nyelv alatti mucosa mikrokeringA nyelv alatti mucosa mikrokeringééseseshockosshockos áállapotbanllapotban

Sakr et al. Crit Care Med (2004) 32:1825-1831

Azok a szeptikus páciensek, akiknél a szublinguális mikroperfúziócsökkenése kismértékű (22 %-os) volt, felépültek a súlyos kórállapotból, ellentétben azokkal, akiknél ez a csökkenés jelentős (44 %-os) volt.

A A sszzublingualublingualisis mimikkrocirrocirkkululáácciióó kklinilinikkaaiijelentjelentőősséégege

A mikrocirkulációs dysfunkció volt azegyetlen és szenzitiv tényező a végkimenetel előrejelzésében.

• Vietnámi törpesertések (átlagos testtömeg: 23±3 kg) • Altatás: ketamin-xilazin indukció im., propofol fenntartó iv.• Mesterséges lélegeztetés

Jobb felső lebeny OPSmikrokeringés vizsgálat

Pulzoximéter

Endotracheálistubus

Artériás vérnyomás szenzor

Centrális vénás nyomás

Mikrocirkulációs paraméterek változása a tüdő alveolusaiban

= mikrokeringés felvétel

0.perc 15. perc 30. perc 45. perc

Thoracotomia PEEP = 5 PEEP = 10

PEEP = 15

PEEP = 5

N=6

Kevés adat ismert a PEEP okozta mikrocirkulációsváltozásokról a tüdőben

PEEP hatása az oxigenizációra

Atelektázia megszűnése - intrapulm. shunt

Parciális oxigén nyomás (PaO2)

Artériás oxigén szaturáció (SaO2)

Artériás oxigén szaturációés parciális nyomás

Idő (perc)0 15 30 45

Artériás oxigén szaturáció (%)

92

94

96

98

100

**

PEEP= 5PEEP= 10

PEEP= 15

PEEP= 5

*

Idő (perc)

Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával

0 15 30 45

Artériás oxigén parciális nyomása (Hgmm)

50

60

70

80

90

100

*

PEEP= 5PEEP= 10

PEEP= 15

PEEP= 5

*

TÜDŐ MIKROKERINGÉS (OPS)PEEP 5 vízcm

Tüdő mikrokeringés → PEEP 15 vízcm

Tüdő mikrokeringés → PEEP 5 vízcm

Alveolus terület

Idő (perc)0 15 30 45

Alveoláris terület (μm2)

500

600

700

800

900

1000

1100 *

PEEP= 5PEEP= 10

PEEP= 15

PEEP= 5

Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával

Alveolus kapillárisok perfúziós rátája

Idő (perc)0 15 30 45

Alveolus perfúziós ráta

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

* *

PEEP= 5PEEP= 10

PEEP= 15

PEEP= 5

Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával

Áramlási sebesség az alveoláris és perialveoláris kapillárisokban

Idő (perc)0 15 30 45

Alveolus vvt sebesség (μm s-1)

300

350

400

450

500

550 *

*

PEEP= 5PEEP= 10

PEEP= 15

PEEP= 5

Idő (perc)0 15 30 45

Perialveoláris vvt sebesség (μm s-1)

300

350

400

450

500

550

600*

PEEP= 5PEEP= 10

PEEP= 15

PEEP= 5

A PEEP emelése után az alveoláris és perialveoláris perfúzióeltérő dinamikájú növekedése eredményezi az artériás oxigén tenzió és szaturáció fokozódását.

A mikrokeringés és a makrokeringéskapcsolata

Normál állapotban a mikrokeringés relatíve független a globális hemodinamikai változásoktól.

DEmikrocirkulációs elváltozások mutathatók ki elfogadhatónak tekintett szisztémás hemodinamikaicélértékek esetén is;

A keringési elégtelenség megszüntetését célzó terápiás beavatkozás esetén, a mikrokeringés reakciója gyakran eltér annak globális hatásától → jellemző példája az un. „no-reflow” jelenség

Gasztrointesztinális mikrokeringés

– a keringés redisztributio áldozata keringési shockban

Idő (perc)0 30 60 90 120 150 180 210 240

Hgmm

30

60

90

120

150

zselatinhidroxietil-keményítődextrán

Vérzéses shock

Artériás Középnyomás

Volumen resuscitatio

* P<0.05 vs kontroll érték (0 perc)

A volumen reszuszcitáció végpontja: a kontroll MAP 75%-ának elérése, max. 50 ml/kg kolloid infúzió;

idő (perc)0 30 60 90 120 150 180 210 240

μm/s

200

300

400

500

600

700

800

Zselatin Hidroxietil-keményítő (Voluven)Dexrán (Rheomacrodex)

Vérzéses shock

Vörösvértest Áramlási Sebesség a Villusokban

Volumen resuscitatio

P<0.05 vs konroll érték (0 perc)

*

*

*

*

*

*#

P<0.05 vs Voluven csoport#

#*

Kaszaki J, Wolfárd A, Szalay L, Boros M: Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc 38:826-828, 2006.

OPS

Károsodott mikrocirkuláció esetén – a mikrokeringésireakciók NEM egységes természetüek, és mértékük, kiterjedésük sem hasonló.

A károsodás gyakori megnyilvánulása, a perfúzióheterogenitásának fokozódása.

Az oszcilláló mikroperfúzió (flowmotion) a lokális oxigenizáció változást indukál

(Tsai AG and Intaglietta M, Int J Microcirc Clin Exp(1991) 12:75-88).

A mikrokeringés speciális sajátossága:

a heterogenitás

A funkcionális kapilláris denzitás meghatározása

Perfundált kapillárisok hosszaterület Mikrocirkulációs shunt: amikor a

µpO2 kevesebb lesz, de a vénás pO2változatlan marad

Sinaasappel et al. J Appl Physiol (1996) 81:2297-2303.

Térben változóheterogenitás

nem-perfundált

perfundált

A vörösvértest áramlási sebességének (RBCV) súlyozott számtani átlaga:

v1t1 + V1T1+ v2t2 + V2T2+ … vntn + VnTn

t1 + T1 + t2 + T2 + … tn + Tn

Súlyozó faktor = az áramlási periódusok relatív időtartama

RBCV(µm/sec)

≈ 700

≈ 100

időt1 t2 t3 tnT1 T3T2 Tn

v1 v1 v2 v3 vnv2 v3 vn

Gyors áramlás

Lassú áramlás

A-RBCV =

IdIdőőbeli heterogenitbeli heterogenitáássAz Az ááramlramláási mintsi mintáázat vzat vááltozltozáása a sa a villusbanvillusban

• Kiindulási állapot: folyamatos áramlás• Vérzéses shock: oszcilláció• Újraélesztés: folyamatos áramlás / oszcilláció

Szabó et al. Shock 21:320-329, 2004.

hypoperfundált terület

Normál perfúzió, magasabb RBCV értékek

(a: relative area 40%)(lower average RBCV)

(A: relative area 60%)(higher average RBCV)

Térbeli heterogenitás

A(RBCV) + a (RBCV)A + a (A + a = 1)RBCV RBCV =

RBCV RBCV = 0.6 RBCV + 0.4 RBCV

A vörösvértest áramlási sebesség (RBCV) terterüület arlet aráányosannyosanssúúlyozott lyozott áátlagatlaga

Vasomotio (flowmotion) monitorozás a bőrben

HeterogenitHeterogenitáás norms normáál kl köörrüülmlméények knyek köözzöött,tt,LLéézer Doppler flow mzer Doppler flow méérrééss

Vasomotio (flowmotion) monitorozás a tesztiszben

Termoregulációval összefüggőperiodicitás

A leukocyta-endothelsejt interakciómonitorozásának eszközei

és jellegzetességei

Leukocyta-endothel sejt interakció

Rolling Adhézió Transzmigráció

E-selectinP-selectin

(+vérlemezke)

VCAM-1ICAM-1(intercellularisadhéziós molekula 1)

L-selectin CD11a/CD18CD11b/CD18

endothelialisPECAM-1érendothel

leukocyta

leukocytaPECAM-1

kapilláris lumen

interstitium

Fluoreszcens Intravitális VideomikroszkópiaFluoreszcens Intravitális VideomikroszkópiaVideVideóó--felvevfelvevőő

MONITORMONITOR-- ggöördrdüüllőő leukocitaleukocita-- kitapadkitapadóó leukocitaleukocita--funkcionfunkcionáális kapilllis kapillááris ris denzitdenzitááss--VvtVvt ááramlramláási sebesssi sebesséégg

FFéényforrnyforrááss

CCDCCD--kamerakamera

ObjektObjektíívv

Tibia

Kontraszt erősítés (fluoreszcenstransz- és epi-illumináció)

Fluoreszcens markerek:Leukocyták – Rhodamin 6G

Vörösvértestek – FITC jelölés

Permeabilitás – Na-fluorescein

IVM video:Periosteális perfúzió és leukocyta adhézió

végtag ischaemiában

Mikrocirkulációs paraméterek változása máj ischaemia-reperfúzió

során, patkány modellben

Kontroll mikroperfúzió a májban (NaFl)Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)

Máj mikroperfúzió reperfúzió alatt (Na Fl)Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)

Leukocyta-endothel sejt interakció normál májban (IVM)

Leukocyta-endothel sejt interakció reperfúzió alatt (IVM)

Mikrocirkuláció összegzés

• Az első, ami sérül, és az utolsó ami felépül.

• A mikrocirkuláció károsodásának jele, a perfúzióheterogenitása, amely oxigén extrakciós deficitet eredményez;

• A mikroperfúzió állapota meghatározhatja a végkimenetelt;

• A mikrocirkuláció helyreállítása → terápiás végpont.

Microcirculation Recruitment ManoeuvresInce C (2005) Critical Care 9:S13-S19

• Rendezni kell a kóros áramlási heterogenitást

• Az a cél, hogy a nyissuk ki és tartsuk is nyitva a mikrokeringést a pumpafunkciótámogatásával, vazopresszorok korlátozott használatával és megfelelő folyadékadásával

Köszönöm a figyelmet!