LOS CIDOS FENLICOS EN CARIPSIDE DE DOS CULTIVOS DE TRIGO, CENTENO Y TRITICALE QUE MUESTRAN UNA RESISTENCIA DIFERENTE A LA BROTACIN DE LA PRE-

COSECHA.

Resumen

Este estudio confirma el importante papel de compuestos fenlicos en la latencia de la cariopsis de cereales. Investigaciones se llevaron a cabo en dos cultivos de trigo (Elena y Alba), centeno (Amilo y Dan' kowskie Zote), y triticale (Ugo y Bogo), con caractersticas ms profundas o de latencia baja, respectivamente. En estudios de la germinacin, los cultivos susceptibles a la brotacin (Alba, Dan' - kowskie Zote y Bogo) muestran mayor porcentajes de germinacin que los resistentes a la brotacin (Elena, Amilo y Ugo). El contenido de cido fenlico (es decir, libres, liberado a partir de steres solubles, y liberado de glicsidos solubles) en caripside fueron determinados por un Mtodo de HPLC. Cafeico, p-cumrico, ferlico y sinpico fueron los cidos fenlicos dominantes detectados. La mayora de los cidos fenlicos se encuentra en la forma de steres solubles. Para todas las especies examinadas, los niveles de cidos fenlicos solubles liberados a partir de steres y el contenido total de cidos fenlicos en caripsides que muestran una latencia poco profunda fue mayor que en los que muestran ms profunda dormancia. Se muestran pequeas diferencias en los espectros UV de extractos de compuestos fenlicos a partir de caripsides. Se tom nota de la latencia superficial o ms profunda.

Palabras clave: cidos fenlicos, trigo, centeno triticale, latencia.

Introduccin Un fenmeno generalizado y econmicamente negativo asociado a la latencia en los cereales es la brotacin en la pre-cosecha [1, 2]. Puede producirse la germinacin precoz, especialmente en caripsides elsticos como el centeno, triticale y trigo, ya a las 2-3 semanas despus de la floracin, hasta la cosecha [3-5]. La interrupcin de la latencia de cariopsis de cereales de estimuladores de crecimiento [3, 4, 6] y las bajas temperaturas [3], as como la "latencia" demostrado de embriones en desarrollo aislados [3, 4, 7], han indicado que un papel decisivo puede ser jugado por fitohormonas, tales como cidos giberlico y abscsico [1, 8], y/o inhibidores, tales como compuestos fenlicos, en la germinacin. Varios experimentos han demostrado que los compuestos fenlicos, especialmente cidos fenlicos, pueden actuar como inhibidores de la germinacin [9-11]. La presencia de catecol, clorognico, cidos saliclico y sirngico

puede causar letargo en pequeas semillas de Atriplex triangularis. Sin embargo, estos cidos fenlicos no estaban presentes en las semillas ms grandes [10]. Una correlacin positiva entre la duracin de la latencia y el contenido de compuestos fenlicos se destac por el desarrollo y la maduracin de cariopses de la cebada [11]. Se encontr la aplicacin exgena de fenoles para recortar y semillas de malezas para inhibir la germinacin de semillas [10, 12] y embriones [11]. Se encontr disminucin en los niveles de cidos fenlicos libres, esterificados y glicosilada para el centeno, triticale, cebada y avena durante varios meses de almacenamiento en estado seco [13]. Los cidos ferlico y sinpico a una concentracin de 1 mM retrasaron la germinacin de embriones de cereales [14]. El objetivo de este estudio fue comparar la composicin de los cidos fenlicos, incluyendo formas libres, esterificados y glicosilada, en dos variedades diferentes (con ms profunda o superficial latencia) de tres especies de cereales (trigo, centeno y triticale).

Materiales y Mtodos El estudio se realiz en caripsides de trigo con la latencia ms profunda y superficial (cv. Elena y cv. Alba), centeno (cv. Amilo y cv. Dan' kowskie Zote) y triticale (cv. Ugo y cv. Bogo) cultivadas en un campo experimental de la Universidad de Agricultura y Tecnologa en Olsztyn, Polonia. Para la prueba de germinacin, caripsides frescas se lavaron con agua, seguido por 70% (v/v) de metanol. Se realizaron entonces estudios de germinacin mediante la incubacin de las caripsides en papel de filtro humedecido en placas de petri (12015 mm) a 21-22 C durante 14 das. Todas las operaciones se llevaron a cabo en una campana laminar. Hubo seis rplicas por fecha de muestra. Inmediatamente despus de la cosecha de las caripsides, los compuestos fenlicos se extrajeron dos veces con 80% (v/v) de metanol durante 15 min a 80 C [15]. Despus de evaporar el disolvente orgnico en un evaporador rotatorio a 45 C, la solucin acuosa restante se liofiliz. La concentracin de compuestos fenlicos en el extracto se determin usando el reactivo de Folin-Ciocalteu [16] y (+) catequina fue utilizada como un estndar. Los espectros UV de los extractos se registraron con un espectrofotmetro de matriz de diodos Beckman DU 7500. Los cidos fenlicos (es decir, liberados de los steres solubles y de glucsidos solubles) se aislaron a partir del extracto de acuerdo con un mtodo descrito anteriormente

[17, 18]. Una suspensin acuosa del extracto (800 mg en 20 ml de agua) se ajust a pH 2 (HCl 6M), y cidos fenlicos libres se extrajeron 5 veces en 20 ml de ter de dietilo usando un embudo de separacin. El extracto de ter se evapor a secado con vaco a temperatura ambiente. La solucin acuosa se neutraliz y despus se liofiliz. El residuo se disolvi en 20 ml de NaOH 2 M y se hidroliza durante 4 h bajo una atmsfera de nitrgeno a temperatura ambiente. Despus de la acidificacin a pH 2 usando HCl 6M, cidos fenlicos liberados de steres solubles se extrajeron del hidrolizado de 5 veces en 30 ml de ter de dietilo usando un embudo de separacin. Para la solucin de agua, se aadieron 15 ml de HCl 6M, y la solucin obtenida se coloc en una atmsfera de nitrgeno y se hidroliza durante 1 h en un bao de agua a 100 C. Los cidos fenlicos liberados de glucsidos solubles se separan del hidrolizado 5 veces en 45 ml de ter dietlico. Despus de la evaporacin de ter, el residuo seco se disolvi en 10 ml de metanol y se filtr a travs de un filtro de nylon de 0,45 mm. La muestra obtenida se inyect en una columna de HPLC. Se emple un sistema Shimadzu HPLC (bomba LC-6A, SPD-6AV UV-VIS detector espectrofotomtrico, controlador del sistema SCL-6B y CR 501 Chromatopac). Las condiciones de las separaciones fueron los siguientes: pre-envasados LiChrospher 100 RP-18 columna (5 m, 4 mm 250; Merck); fase mvil, acetonitrilo- cido actico - agua (88:10:2, v/v/v) [19]; velocidad de flujo de 1 ml/min; volumen de inyeccin, 20 l; el detector se fij en 300 nm.

Discusin y Resultados El porcentaje de germinacin de las caripsides de dos cultivares de trigo, centeno y triticale se muestra en la Figura 1. Durante todo el perodo de la prueba, los cultivares susceptibles a la brotacin (Alba, Dan' kowskie Zote y Bogo) muestran un porcentaje de germinacin ms alto que el de brotacin resistente (Elena, Amilo y Ugo). Adems, el porcentaje de germinacin tambin fue diferente para las especies seleccionadas; por ejemplo, la germinacin de las caripsides centeno fue menor que el del trigo y triticale. Los cidos fenlicos libres que se encuentran en las caripsides investigadas fueron: cafeico, p-cumrico, ferlico y cidos sinpico. Masoveros, se detectaron trazas de cido sirngico libre (Tabla 1). Las concentraciones de cidos fenlicos libres en caripsides de trigo y de centeno con profundidad o poco profundo letargo eran prcticamente el mismo: 3,44 g/g (dm) en trigo cv. Elena, y 3,52 mg/g (d.m) en trigo cv. Alba; 15.01 mg / g (d.m) en el cv centeno. Amilo, y 14,62 g/g (d.m) en el cv centeno. Dan' kowskie Zote. La mayor concentracin de cidos fenlicos libres en caripsides de triticale cv. Ugo con latencia ms profunda en comparacin con la de triticale cv. Bogo con latencia superficial [5,71 y 8,38 mg / g (dm), respectivamente] era debido a un alto nivel de cido cafeico en la antigua [3,42 g/g (dm)].

Fig 1. La germinacin de trigo, centeno y triticale caripside Toda la caripside con latencia ms profunda posea una alta concentracin de cidos fenlicos en la forma de sus steres solubles (Tabla 2). Las diferencias ms notables eran para caripside centeno: 151,92 g/g (dm) para Amilo con latencia ms profunda, y 89.91 g/g (dm) para Dan' kowskie Zote con latencia superficial. Para los tres cereales, las concentraciones de los cidos ferlico y sinpico, y en el caso del trigo y el centeno tambin p-cumrico, fueron mayores en caripsides con latencia ms profunda que en caripsides con latencia superficial. Por ejemplo, la concentracin de los steres solubles de cido ferlico para trigo cv. Elena con la latencia ms profunda fue casi dos veces tan alta como la de trigo cv. Alba con latencia superficial; la concentracin de cido sinpico en triticale cv. Ugo con latencia ms profunda fue 43,06 g/g (dm), mientras que en Bogo con latencia superficial que era slo 27,36 g/g (dm). Tabla 1 Las concentraciones de cidos fenlicos libres [g/g (dm)] en cariopsis de cereales.

Tabla 2 Las concentraciones de cidos fenlicos solubles liberados a partir de steres [g/g(DM)] en cariopsis de cereales Tabla 3 concentraciones de cidos fenlicos liberados de glicsidos solubles [mg / g (dm)] en cariopsis de cereales

Un alto nivel de cidos fenlicos liberada de glucsidos solubles en correlacin con la latencia de caripsides slo para el trigo (Tabla 3). La concentracin en el trigo cv. Elena con la latencia ms profunda fue 9,83 g/g (dm), mientras que para Alba con latencia superficial que era slo 3,68 g/g (dm). Cariopsis de cv centeno. Dan' kowskie Zote y cv. Amilo mostr casi las mismas cantidades de cidos fenlicos en la forma de glucsidos solubles: 16,87 y 17,45 g/g (DM), respectivamente. La suma de los cidos fenlicos que estaban libres, liberados a partir de steres solubles, y liberado de glucsidos solubles fue mayor para cereales con la latencia ms profunda que la de latencia con poca profundidad (Fig 3). Para el trigo y el centeno estas diferencias fueron mayores que los de triticale. Sin embargo, las diferencias en las concentraciones de fenoles totales fueron menores para los cultivos de cereales con diferentes niveles de latencia (Fig. 4). Caripsides de trigo cv. Elena con latencia ms profunda mostr incluso una concentracin ligeramente inferior de fenoles totales que las de Alba con latencia superficial. Una comparacin de los resultados en las Figs. 3 y 4 mostraron que para caripside de ambos cultivos de centeno, triticale y trigo, los cidos fenlicos constituan aproximadamente el 10% de la fraccin total fenlico. Nuestra investigacin indica que los cidos fenlicos en forma de steres probablemente determinan el perodo de reposo vegetativo de trigo, centeno y triticale cariopsis. Weidner et al. [13] confirm el papel de los cidos fenlicos en la latencia de la cebada, avena, centeno y triticale, como las concentraciones de cidos fenlicos libres en caripsides latentes (en todas las especies examinadas) eran mucho ms altos que los de los nondormant, incluso cuando se analiza despus 6 meses de almacenamiento en estado seco. Durante este tiempo steres de cidos fenlicos podran haber sido hidrolizado enzimticamente para producir cidos libres. Los espectros UV de los compuestos fenlicos extrados de cariopsis de cereales se presentan en la fig. 2. Estos espectros se caracterizan por mximos o los hombros que van desde 313 hasta 324 nm (es decir, caracterstica de los cidos fenlicos [20, 21]) y por mximos a wavelenths ms cortos atribuidas a otros compuestos fenlicos. Se observaron ligeras diferencias en los espectros UV de los extractos de las caripsides con diferentes niveles de latencia. Para trigo cv. Elena con latencia ms profunda se observ el mximo a 324 nm, mientras que para el trigo cv. Alba con latencia superficial se observ slo un hombro en este avelength. El cambio en los mximos de los espectros UV entre cultivares con diferentes niveles de latencia fue de 2 y 3 nm para el centeno y triticale, respectivamente.

Fig 2. Espectros UV de extractos de caripside de trigo, centeno y triticale

Fig. 3 cidos fenlicos totales (libres, liberados de steres solubles y glicsidos) en cariopsis de cereales. S2 Los cultivares con latencia ms profunda (Amilo, Elena, Ugo), cultivares S1 con latencia poco profunda (Dan' kowskie Zote, Alba, Bogo)

Fig 4. Compuestos fenlicos totales en cariopsis de cereales. S2 cultivares con latencia ms profunda (Amilo, Elena, Ugo), cultivares S1 con dormancia superficial (Dakowskie Zote, Alba, Bogo) Al comparar nuestros resultados con los de la literatura es difcil debido a las concentraciones de cidos fenlicos en los granos de cereales que no se ha informado adecuadamente. Algunas variaciones en los resultados en la literatura podran haber sido causados por los diferentes mtodos utilizados para el anlisis [22]. P-hidroxibenzoico, protocatquico, sirngico, p-cumrico, ferlico, gentsico, cidos cafeico y isoferulico estuvieron presentes en el trigo, siendo el cido ferlico el ms abundante [23, 24]. Pussayanawin y Wenzel [25] informaron en concetrations de 500 g/g y 41 g/g en el trigo y su harina, respectivamente. Sosulski et al. [23] inform de cido ferlico en una concentracin de 64 g/g en la harina de trigo recin molido, mientras que Rybka et al. [24]

encontr tanto como 199 g/g en el mismo material. Rybka et al. [24] inform de que el cido fenlico dominante en grano de centeno fue el cido ferlico, aunque isoferulic, p-cumrico, sirngico, tambin se detectaron p-hidroxibenzoico y cidos cafeico en cantidades menores por TLC. Maga y Lorenz [26] encontraron p-hidroxibenzoico, saliclico, gentsico, protocatquico, vanlico, sirngico, p-cumrico, cidos ocoumaric, ferlico y isoferulic en todo el triticale y en el salvado, cortos, y la harina. Nuestro conocimiento sobre la composicin de la fraccin de flavonoides en los cereales es fragmentaria. Dos di-C-glycosylflavones se aislaron a partir del salvado de varias variedades de trigo [27]. En el salvado de trigo, la concentracin total de flavonoides vari desde 149 hasta 406 g/g [28]. Cianidina 3-glucsido y peonidina 3-glucsido se encontraron como los principales antocianinas de centeno [29] y el trigo [30].