Los Vectores de Clonaje

Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Mapa de Restricción de pUC18 y pUC19 ( se diferencian la secuencia de MCS )

Los pUC son vectores típicos de Clonaje. Vemos que su tamaño es de 2686 bp

Ori C

AmpicilinResistencia

MCSMulti Cloning Site

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GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC

5´ 396 3´ 455

Hind III Sph I Pst I Sal I Xba I BamH I Sma I Kpn I Sac I EcoR I

pUC18 MCS

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Supongamos que preparamos el vector para insertar un fragmento de DNA que tiene extremos Hind III y BamH I

GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC

CGGTTCGAACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG

GCCA AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC

CGGTTCGA ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG

GCCA GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC

CGGTTCGA GGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG

AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAG

ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAG

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Hind III BamH I

MCSMulti Cloning Site

CCGGG

GGCCCCTAG

AGCTTG

AC

Hind III BamH I

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Estamos linearizando el vector

CCGGG

GGCCCCTAG

AGCTTG

AC

Hind III BamH I

VECTOR LINEARIZADO

AGCTTG

AC

CCGGG

GGCCCCTAG

INSERTO DIGERIDO CON Hind III y BamH I

Hind III BamH I

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Ahora podemos unir Vector e inserto si ambos fueron digeridos con los mismos enzimas

CCGGG

GGCCCCTAG

AGCTTG

AC

VECTOR LINEARIZADO +AGCTTG

AC

CCGGG

GGCCCCTAG

INSERTO

LIGACIÓN

Ori C

INSERTO

AmpicilinResistencia

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Las Bacterias se transforman con el vector conteniendo el inserto

bacteria

Vector con inserto

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ampicilina

Al añadir el antibiótico solo resistirán y crecerán las bacterias antibiótico-resistentes, que tienen el vector con el gen de resistencia. A esto se le denomina selección.

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Una vez crecidas las bacterias, se lisan y se recoge el vector.

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Ahora tenemos “amplificado” el vector con el inserto. Tenemos un gran número de copias del inserto.

Al digerir con los enzimas de restricción adecuados ( Hind III y BamH I ) el vector, se libera un gran número de copias del inserto clonado.

HindIII BamH I

AGCTTG AC

CCGGGGGCCCCTAG

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Características de un vector de Clonaje

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