HISTOCHIMIE SI HISTOENZIMOLOGIE

1

METODA FROTIURILOR se realizeazse realizeazăă intinderea celulelor intinderea celulelor îîn n

monostrat pe o lamelmonostrat pe o lamelăă de sticl de sticlăă.. Pot fi examinate :Pot fi examinate :1.1. celulele sangvinecelulele sangvine2.2. celulele epiteliale descuamate sau celulele epiteliale descuamate sau

exfoliateexfoliate3.3. sedimentele celularesedimentele celulare4.4. amprente de amprente de ţţesuturi sau organe esuturi sau organe

parenchimatoaseparenchimatoase2

TIMPII recoltarerecoltare întindere: întindere: se folosesc douse folosesc douăă lame de lame de

sticlsticlăă lama portobiect – cea pe care se lama portobiect – cea pe care se

efectueazefectueazăă frotiul frotiul lama executoare – cu care se lama executoare – cu care se

îîntinde frotiul , prin glisare la un ntinde frotiul , prin glisare la un unghi de 45unghi de 45..

uscareuscare3

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM pentru colorarea frotiului sangvin.pentru colorarea frotiului sangvin.

1.1. solutia May-Grunwald solutia May-Grunwald – con– conţţine ine EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic solubilizat in amestec de alcool metilic şşi i gliceringlicerinăă neutr neutrăă

2.2. solutia Giemsasolutia Giemsa – contine EOZINAT DE – contine EOZINAT DE AZUR DE METILEN solubilizat in amestec AZUR DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutrade alcool metilic si glicerina neutra

4

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

Frotiul trebuie sa fie :Frotiul trebuie sa fie : subsubţţire – cu un singur strat de celuleire – cu un singur strat de celule îîntins uniformntins uniform ambele margini pe lama ambele margini pe lama se terminse terminăă îîn franjuri pe lamn franjuri pe lamăă , ocup , ocupâând nd

cca. 2/3 din aceastacca. 2/3 din aceasta la margine se scrie numele pacientului la margine se scrie numele pacientului

sau un nr. sau un nr. dde ordinee ordine5

METODA PANOPTICA PAPPENHEIMREZULTATEREZULTATE nuclei – violetnuclei – violet citoplasmele agrcitoplasmele agraanulocitelor – albastru nulocitelor – albastru

citoplasmele granulocitelor – rozcitoplasmele granulocitelor – roz ggranularanulaţţiiii::

neutrofile – roneutrofile – roşşu- violetu- violetbazofile – albastru bazofile – albastru îînchis spre negrnchis spre negruueozinofile – roeozinofile – roşşu –portocaliu u –portocaliu

6

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

7

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

8

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

9

HISTOCHIMIA interpretarea biochimicinterpretarea biochimicăă a celulelor a celulelor

sau sau ţţesuturilor esuturilor îîn raport cu n raport cu oranizarea lor celularoranizarea lor celularăă..

PRINCIPIUPRINCIPIUSe bazeazSe bazeazăă pe afinitatea pe care o pe afinitatea pe care o au unii coloranau unii coloranţţi pentru anumite i pentru anumite grupgrupăări chimice pe care vrem sri chimice pe care vrem săă l lee localizlocalizăămm..

10

HISTOCHIMIA SubstanSubstanţţele chimice celulare ele chimice celulare şşi i

tisulare se identifictisulare se identificăă prin reac prin reacţţii ii chimice care duc la obchimice care duc la obţţinerea de inerea de compucompuşşi colorai coloraţţi , insolubili i , insolubili şşi i observabili la M.O.observabili la M.O.

HISTOFOTOMETRIA = HISTOFOTOMETRIA = analiză analiză cantitativă, în funcţie de intensitatea cantitativă, în funcţie de intensitatea culoriiculorii

11

Conditiile minime necesare unei reactii histochimice

substansubstanţţa analizata analizatăă ssăă se conserve “in situ” , se conserve “in situ” , fixarea utilizatfixarea utilizatăă trebuie s trebuie săă conserve conserve

structura celulei structura celulei şşi si săă îîmpiedice mpiedice deteriorarea componentelor celulare deteriorarea componentelor celulare

mmetoda folositetoda folosităă trebuie s trebuie săă fie specific fie specificăă pentru substanpentru substanţţa sau grupa sau grupăările chimice rile chimice care vor fi examinate. care vor fi examinate.

12

Conditiile minime necesare unei reactii histochimice

produsul de reacprodusul de reacţţieie - - insolubil – previne dispersia sau insolubil – previne dispersia sau difuzia produsului de reactiedifuzia produsului de reactie coloratcolorat – permite examinarea– permite examinarea

reactivul histochimicreactivul histochimic – trebuie s – trebuie săă fie fie

specificspecific. .

13

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR

monozaharide monozaharide solubilesolubile oligozaharide oligozaharide ppolizaharideolizaharide - - libere libere sau sau combinate combinate

cu proteinecu proteine

14

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR METODA PAS ( per-iodic acid METODA PAS ( per-iodic acid

Schiff)Schiff) METODA CU CARMIN METODA CU CARMIN

AMONIACAL BESTAMONIACAL BEST BAZOFILIABAZOFILIA METACROMAZIAMETACROMAZIA

15

METODA PAS evidenevidenţţierea glicogenului, GAG, ierea glicogenului, GAG,

glicoproteinelor si glicolipidelor.glicoproteinelor si glicolipidelor.

PRINCIPIUPRINCIPIUgrupgrupăări glicolri glicol oxidare cu acid periodicoxidare cu acid periodic grupări grupări aldehidice + aldehidice + cu reactivul Schiff cu reactivul Schiff precipitat rosu violaceu vizibil la M.O.precipitat rosu violaceu vizibil la M.O.

16

METODA PAS- GLICOGEN

specificitatea metodei depinde de specificitatea metodei depinde de pretratamentul cu enzime pretratamentul cu enzime glicogenolitice de tipul amilazei glicogenolitice de tipul amilazei salivare. Se cosalivare. Se connsidersiderăă c căă structurile structurile colorate PAS care dispar colorate PAS care dispar îîn urma n urma pretratamentului cu amilazpretratamentului cu amilazăă con conţţin in glicogenglicogen

17

METODA PAS

18

CARMIN AMONIACAL BEST

evidenevidenţiazăţiază glicogenul glicogenul - - polimer cu polimer cu solubilitate redussolubilitate redusăă îîn apn apăă . Daca fixarea . Daca fixarea lui nu este promptlui nu este promptăă, enzimele hidrolitice , enzimele hidrolitice îîl descompun l descompun îîn glucozn glucozăă care este foarte care este foarte solubilsolubilăă îîn apn apăă şşi difuzeazi difuzeazăă..

REZULTATE :REZULTATE : granule ro granule roşşii ii îîn citoplasmn citoplasmăă

19

CARMIN AMONIACAL BEST

20

BAZOFILIA proprietatea substanproprietatea substanţţelor glucidice de elor glucidice de

a se colora cu colorana se colora cu coloranţţi bazici de tipul i bazici de tipul albastru alcian albastru alcian şşi albastru de metil.i albastru de metil.

poate fi utilizatpoate fi utilizatăă şşi pentru evideni pentru evidenţţierea ierea lipidelor lipidelor şşi proteinelor cu caracter acidi proteinelor cu caracter acid

21

ALBASTRU DE METIL

22

METACROMAZIA Capacitatea unui substrat de a se colora Capacitatea unui substrat de a se colora

îîntr-o altntr-o altăă culoare dec culoare decâât cea a t cea a colorantului.colorantului.

PRINCIPIU:PRINCIPIU:- existenţa unor - existenţa unor grupgrupăări anionice aflate la ri anionice aflate la

o distano distanţăţă foarte mic foarte micăă una de alta una de alta formformâând agregate cu proprietnd agregate cu proprietăţăţi de i de absorbabsorbţţie a luminii vizibile diferite de a ie a luminii vizibile diferite de a moleculelor neagregate.moleculelor neagregate.

23

METACROMAZIA

24

HISTOCHIMIA LIPIDELOR

PRINCIPIU:PRINCIPIU:colorantul trebuie colorantul trebuie

să fiesă fie mai solubil mai solubil în lipide decât în în lipide decât în propriul solventpropriul solvent

SUDANOFILIASUDANOFILIA ColoranColoranţţi Sudan :i Sudan : III – roIII – roşşu-portocaliuu-portocaliu IV – roIV – roşşuu B – negruB – negru BB – albastruBB – albastru

25

COLORAŢII SUDAN

26

HISTOCHIMIA PROTEINELOR detecteazdetecteazăă structura primar structura primarăă a a

proteinelor proteinelor

ReacReacţţii nespecifice ii nespecifice proteinele proteinele celulare celulare şşi tisulare sunt identificate i tisulare sunt identificate pe seama aminoacizilor pe seama aminoacizilor

ReacReacţţii specificeii specifice – folosite pentru – folosite pentru identificarea heteroproteinelor identificarea heteroproteinelor

27

HISTOCHIMIA PROTEINELORReacţii nespecifice

Tirozina – ReacTirozina – Reacţţia MILLONia MILLONArginina – ReacArginina – Reacţţia SAKAGUSHI ia SAKAGUSHI

– pentru studiul distributiei – pentru studiul distributiei proteinelor bazice in nucleu proteinelor bazice in nucleu

TriptofanTriptofan

28

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice folosite pentru identificarea folosite pentru identificarea

hheteroproteinelor de ex. eteroproteinelor de ex. nnucleoproteinele care se evidenucleoproteinele care se evidenţţiaziazăă pe seama acizilor nucleici. pe seama acizilor nucleici.

1.1. Metoda FEULGENMetoda FEULGEN2.2. BazofiliaBazofilia3.3. Metoda BRANCHETMetoda BRANCHET

29

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice

METODA FEULGENMETODA FEULGEN

Molecula AND Molecula AND hidroliza acida hidroliza acida dezoxiriboza dezoxiriboza + reactiv Schiff precipitat + reactiv Schiff precipitat roşu-violaceuroşu-violaceu

30

METODA FEULGEN

31

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice

METODA BRANCHET( verde metil-pironinMETODA BRANCHET( verde metil-pironinăă))

cercetacercetarearea bazofili bazofilieiei dat datăă de acidul fosforic de acidul fosforic din structura acizilor nucleicidin structura acizilor nucleici

verde de metilverde de metil – are afinitate pentru ADN- – are afinitate pentru ADN-ul nucleul nuclearar pe care pe care îîl coloreazl coloreazăă îîn verden verde

pironina pironina –– ARN-ul nucleolar si ARN-ul nucleolar si citoplasmaticcitoplasmatic,, pe care pe care îîl coloreazl coloreazăă îîn ron roşşuu

32

HISTOCHIMIA ENZIMELOR

evidenevidenţţiaziazăă localizarea localizarea şşi activitatea i activitatea enzimelor. enzimelor.

PRINCIPIU: PRINCIPIU:

- - reacreacţţii chimice care au ca rezultat un compus ii chimice care au ca rezultat un compus colorat colorat şşi insolubil. In cazul i insolubil. In cazul îîn care produsul n care produsul rezultat este solubil , se insolubilizeaza rezultat este solubil , se insolubilizeaza printr-printr-o o reacreacţţie de CAPTURie de CAPTURĂĂ..

33

ETAPELE OBŢINERII UNUI PREPARAT CITOENZIMOLOGIC recoltarea recoltarea fixarea – prin congelarea rapidfixarea – prin congelarea rapidăă la la

temparaturi foarte joasetemparaturi foarte joase secsecţţionarea ionarea incubarea –incubarea –într-într-un mediu care oferun mediu care oferăă

enzimei conditii cenzimei conditii câât mai apropiate de cele t mai apropiate de cele îîn n vivo.vivo.

montarea – se realizeaza montarea – se realizeaza îîn mediu n mediu hidrosolubil – glicerina sau sirop Apathyhidrosolubil – glicerina sau sirop Apathy

34

REACŢII CITOENZIMOLOGICE

METODA PEARSEMETODA PEARSE- - eevidenvidenţţiaziazăă dehidrogenazele dehidrogenazele

METODA GÖMÖRY ( captura de METODA GÖMÖRY ( captura de ioni metaliciioni metalici))-- evidentierea evidentierea hidrolazelorhidrolazelor

35

METODA PEARSE peroxidazeperoxidaze SSuccinatdehidrogenazuccinatdehidrogenazăă

APLICAŢII PRACTICEAPLICAŢII PRACTICE- SDH – enzima marker a - SDH – enzima marker a

mitocondriilormitocondriilor

36

METODA PEARSE

37

METODA GÖMÖRY( captura de ioni metalici) ppentru evidentierea fosfatazelor entru evidentierea fosfatazelor

PRINCIPIUPRINCIPIU o reacţie de precipitare a ao reacţie de precipitare a acidulciduluiui

fosforic eliberat de enzimfosforic eliberat de enzimăă de la nivelul de la nivelul substratului substratului

38

METODA GÖMÖRY

Compusul rezultat din acCompusul rezultat din acţţiunea iunea enzimei reacenzimei reacţţioneazioneazăă cu cu:: sulfura de amoniu pentru a sulfura de amoniu pentru a

produce un precipitat negruproduce un precipitat negrusulfura de cobalt pentru hidrolaza sulfura de cobalt pentru hidrolaza

alcalinalcalinăăsulfura de plumb pentru cea acidsulfura de plumb pentru cea acidăă

39

METODA GÖMÖRY

APLICAŢII PRACTICEAPLICAŢII PRACTICE- evidenţierea fosfatazei alcaline – enzimă - evidenţierea fosfatazei alcaline – enzimă

cu rol de transport cu rol de transport

40

METODA GÖMÖRY

41

42

43