LTM BIOMOL : Analisis Asam Nukleat

Ada beberapa metode yang dapat digunakan untuk menganalisis asam nukleat, yaitu :

1. Secara Kualitatif Elektroforesis gel

Elektroforesis adalah metode yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul, khususnya protein dan asam nukleat, berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis dalam skala besar digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu.

Prinsip kerja elektroforesis gel yaitu memisahkan molekul (contoh : DNA, RNA, dan protein) berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terisi atas molekul DNA dengan panjang yang sama.

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu : a. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida

dan menganalisis hasil ekstensi primer.Digunakan juga untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran kecil.

b. Gel alkalin agarose, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. c. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan system

elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari :1. Comb, digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.2. Tray, digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.3. Chamber, digunakan sebagai wadah gel agarose. 4. Sumber listrik, digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis

Tahapan-tahapan proses pada elektroforesis gel :1. Asam nukleat yang akan dianalisis dimasukkan ke dalam sumur (well) pada gel yang

ditempatkan di dalam larutan penyangga. Gel yang digunakan akan berperan sebagai matrix untuk menampung dan memisahkan molekul-molekul asam nukleat. Larutan penyangga dibutuhkan untuk meminimalisir perubahan PH yang diakibatkan medan listrik dan untuk mencegah gel agar tidak menjadi terlalu panas akibat adanya arus listrik.

2. Mengalirkan arus listrik ke dalam sumur. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektrode positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Prinsip pergerakannya yaitu molekul yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dan karena itu jaraknya akan lebih jauh dari gel. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus.

3. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) untuk memudahkan penampakan molekul asam nukleat. Pewarna ini dibutuhkan karena

molekul asam nukleat tidak memiliki warna. Beberapa pewarna yang dapat digunakan adalah bromophenol blue dan ethidium bromida.

4. Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama.

Stanning : - etidium bromide – SYBR gold – SYBR safe – SYBR green – eva green

Sequencing DNA sequencing adalah metode yang digunakan untuk menentukan urutan basa

nukleotida (adenine, guanine, sitosin, dan timin) pada molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA. Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetik dari molekul DNA.

Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA. Metode Maxam-Gilbert dan metode Sanger. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA yang diperiksa. Tekhnik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid pendenaturasi (denaturing polyacrylamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai tunggal dan tetap dalam keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi mengandung urea dan dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut mendorong terjadinya pemisahan kedua rantai molekul DNA.Metode Maxam-Gilbert

Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.

Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A

dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

Gambar 3. Target DMS dan Hidrazin pada urutan basaDNA Metode Sanger

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.

Sekuensi DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama.

Hibridisasi Spektrofotometri IR Blotting : Southern bolt, northern bolt Mikroskop electron : untuk struktur kromosom Spektrofotometri XRD : untuk nentuin single helix/double helix PCR LCR

2. Secara Kuantitatif UV-VIS RTPCR