Luftveisinfeksjoner - PCR-basert diagnostikk

Anne-Marte Bakken Kran

Overlege, førsteamanuensis

Mikrobiologisk avd. UOS Ullevål

Temaer

• PCR-basert mikrobiologisk diagnostikk

• Klinisk betydning av funn/fravær av funn

• Når teste? For hva?

• Hva med hurtigtester?

Sekvens

Arvemateriale

Mikroorganisme

Dobbeltrådet DNA

Arvemateriale Bakterier, Sopp, parasitter: DNA

Virus: DNA eller RNA Retrovirus: RNA → cDNA

Dobbelttrådet DNA

Hydrogenbindinger

Cytosine (C)

Adenine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

Deoxyribose Fosfatgruppe

Cytosine (C)

Adenine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

Dobbelttrådet DNA

Adenine (A) = Thymine (T)

Guanine (G) = Cytosine (C)

Hydrogenbindinger mellom de komplementære basene:

Bindingen er reversibel, styrken avhengig av:

• Temperatur

• Nukleinsyretrådenes

lengde og basesammensetning

• Komplementaritet

PCR

• Isolering/rensing av DNA/RNA

• Oppformering av et område av DNA med PCR

• Påvisning av PCR-produkt

Primere: Spesifikke for mikroben man skal påvise

• Primersekvensene må være unike for mikroorganismen

• Primere må binde seg til et område av DNA som ikke varierer innen mikroorganismen

PCR

No. No. kopier av syklus målsekvensen

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

20 1,048,576

30 1,073,741,824

1 cycle = 2 Amplicon

2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle = 8 Amplicon

4 cycle = 16 Amplicon

5 cycle = 32 Amplicon

6 cycle = 64 Amplicon

7 cycle = 128 Amplicon

PCR syklus

1) DNA-trådene separeres

2) Primere bindes til hver sin målsekvens

3) DNA syntese

4) Påvisning av PCR produkt

Pasientprøver

PCR kurve

Direktepåvisning, PCR

• Amplifikasjon av mikrobens arvemateriale

• Rask diagnostikk

• God spesifisitet

• Bedre sensitivitet enn dyrkning

• Pris ca 100 kr pr analyse (reagenser) ?

• NB Redusert sensitivitet pga:

– Prøve tatt sent i forløpet

– Ikke representativ prøve

Agens påvist med PCR: Klinisk betydning

• Behøver ikke være årsak til sykdom – påviser også latente virus, kolonisering,

bærerskap

• Behøver ikke være smitteførende – påviser også arvematerialet fra døde

mikroorganismer

• Husk: Ett påvist agens utelukker ikke et annet

• Falsk positiv PCR (kontaminasjon: ved prøvetaking / i lab.)

Absence of detection

is NOT

Detection of absence

Negativ PCR utelukker ikke infeksjon

• Prøven

– Valg av prøvemateriale og riktig prøvetaking (Prøven må tas fra der smittestoffet er)

– Tidspunkt i forhold til infeksjonsforløpet (Prøven må tas når smittestoffet er der)

– Prøvevolum

– Oppbevarings-tid og -temperatur (degradering av RNA og DNA)

• Primer-/probesekvenser (eks. ny Chlamydia-variant i

Sverige 2001-2007)

• Hemming av PCR reaksjonen

Hvor dyp er egentlig en dyp neseprøve?

Foto: ArcDia Ltd

PCR ANALYSER VED LUFTVEISINFEKSJON

PCR analyser ved luftveisinfeksjon: Analyser ved mikrobiologisk avd OUS

• Luftveisvirus:

– Influensavirus A, B • subtyping A(H1 el.H3)

– Parainfluensavirus 1, 2, 3, 4

– Respiratorisk syncytialvirus (RS)

– Humant metapneumovirus

– Adenovirus

– Rhinovirus

– (Enterovirus D68)

• Luftveisbakterier:

– Mycoplasma pneumoniae

– Chlamydophila pneumoniae

– Bordetella pertussis

– Legionella (ved RH)

Luftveis PCR – < 2 uker etter symptomdebut (virus)

– < 4 uker etter symptomdebut (bakt)

• Materiale:

– Nasopharynxaspirat eller dyp neseprøve + halspensel (virustransportmedium, UTM)

– Prøve fra nedre luftveier

• Virusinfeksjon: Avtagende sensitivitet av PCR etter 1. sykdomsuke (adenovirus trolig positiv lenger)

Nytteverdi ? Betydningen av positivt PCR-funn?

• Årsak til infeksjon?

• Asymptomatisk bærerskap/lett klinisk ”kolonisering” i perioder, spesielt i sesongen?

• Langvarig utskillelse etter infeksjon?

• Husk: Ett påvist agens utelukker ikke et annet. Ofte påvises flere agens samtidig

Flere ulike agens påvist i samme prøve

• Klinisk betydning?

• Semikvantitativ” PCR:

– Positive funn graderes internt hos oss (sterk, moderat og svak reaksjon)

– Veiledning ved vurdering av flere funn samtidig?

Når er det aktuelt å ta prøve?

• Sykehistorien er kort (< 2 uker)

OG

• Pasienten har luftveissymptomer

OG

• Svaret får klinisk betydning

Når har svaret klinisk betydning?

• Behandlingskonsekvenser?

– Influensa (i sesong), Mycoplasma/chlamydophila (klinikk/målgruppe), Kikhoste

• Risikogrupper?

• Differensialdiagnostisk ?

– Foreskriver man mindre antibiotika hvis virus påvises? Ett agens utelukker ikke et annet…

• Annet?

Kliniske opplysninger på rekvisisjonen er avgjørende for god

diagnostikk

Hvilke agens er av interesse?

• Influensa

• Mycoplasma/chlamydophila

– Svært få tilfeller utenom mini-epidemier

• Kikhoste

• Andre?

Funn luftveissesongen hittil i 2015

Funn luftveissesongen 2014/2015

http://www.oslo-universitetssykehus.no/omoss_/avdelinger_/mikrobiologi_

http://www.oslo-universitetssykehus.no/omoss_/avdelinger_/mikrobiologi_

Hva med hurtigtester??

• Høy spesifisitet, lavere sensitivitet sammenliknet med molekylære metoder/dyrkning

• Relativt dyre

• Egnethet må vurderes mot hvor hyppig den aktuelle infeksjonssykdommen opptrer

Agens Sensitivitet Spesifisitet Materiale

S. pyogenes (GAS) ag. 65 – 80 % > 98% Hals

Pneumokokk ag. 50 – 80% 97 % Urin

Legionella pneumophila ag.

92 % > 99% Urin

Influensavirus ag. 60 – 80 % >95% Nasoph.

RS-virus ag. 50 - 85% 90-98% Nasoph.

Hurtigtester, luftveisagens

• PCR: man finner bare det man leter etter

• Manglende påvisning utelukker ikke infeksjon

• Prøve må tas tidlig i sykdomsforløpet

• Klinisk indikasjon

• K ommunikasjon med laboratoriet (rekvisisjon, telefon, prøvesvar, nettsider)